專利名稱：Asia 1型口蹄疫抗體水平檢測試紙及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測用的檢測物，具體講是一種用于偶蹄類動物Asia 1 型口蹄疫抗體水平進(jìn)行快速檢測的試紙條，這種試紙條的制備，以及用這種紙 條對偶蹄類動物Asial型口蹄疫抗體水平進(jìn)行具體檢測的方法。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Foot-and-Mouth， FMD)是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、 高度接觸傳染性和可快速遠(yuǎn)距離傳播的動物疫病。侵染對象是豬、牛、羊等主 要畜種及其他家養(yǎng)和野生偶蹄動物，易感動物多達(dá)70余種。口蹄疫的發(fā)病率為 100%，爆發(fā)可使農(nóng)場破產(chǎn)，發(fā)病地區(qū)和國家的畜牧業(yè)乃至整個國民經(jīng)濟(jì)遭受巨 大打擊。因此，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列在15個A類動物疫病之首， 我國政府也將口蹄疫排在14個一類動物傳染病的第一位。鑒于口蹄疫可造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失和社會影響，各國政府都非常重視口蹄 疫的防治研究，我國也有專門的機構(gòu)研究口蹄疫。但口蹄疫病毒的變異性極強， 目前有7個血清型，Asia I型被發(fā)現(xiàn)的最晚，因其血清型病毒分離于亞洲而得 以冠名。盡管Asia I型口蹄疫在世界已流行近50年，但基本只流行于亞洲較 貧窮國家，由于這些國家的經(jīng)濟(jì)實力與科技水平較低，對AsiaI型的流行傳播 特點及病毒生物學(xué)特征研究較少，有參考價值的資料缺乏。目前Asial型口蹄 疫的流行呈現(xiàn)上升趨勢，簡單、快速、有效的免疫抗體水平監(jiān)測方法，是防治 口蹄疫爆發(fā)和流行的保障，也是制定口蹄疫免疫程序的重要依據(jù)。由于口蹄疫 病毒7種血清型間不能交叉免疫，等于面對7種不同的傳染病。同型內(nèi)不同的 病毒株的抗原性也不同，而新毒株又不斷出現(xiàn)，這就使得口蹄疫的防治包括疫 苗防治工作產(chǎn)生極大的困難?，F(xiàn)采用的抗體檢測方法主要有CFT、 VNT、凝集試驗、免疫擴(kuò)散和ELISA 等，其中最常用于FMDV抗體檢測的方法是VNT和ELIS A方法。VNT診斷FMD 方法準(zhǔn)確、可靠，但要動用活毒，需要在專門的實驗室進(jìn)行試驗，而且工作量 大、實驗周期長。液相阻斷ELISA具有與VNT相同的靈敏度和特異性，且重復(fù) 性好，尤其適合于大批量血清樣品的檢測。是國際認(rèn)可的一種標(biāo)準(zhǔn)化診斷技術(shù)。但該方法同樣操作繁復(fù)，而且需要相應(yīng)的檢測設(shè)備才能判定結(jié)果，面對我國基 層檢測機構(gòu)及廣大的畜禽養(yǎng)殖場缺少檢測設(shè)備與專業(yè)技術(shù)人員的現(xiàn)狀，發(fā)展一 種快速、簡便、無需專業(yè)人員和儀器，可在野外、田間進(jìn)操作的新型診斷方法 已成為一項急需解決的課題。中國發(fā)明專利申請200610043143.6公開了一種口蹄疫病毒定型試紙條及其 制備和使用方法。該專利申請是由O、 A、 Asia I、 C四種血清型檢測試紙條組 成，試紙條由PVC襯板、硝酸纖維素膜、吸收墊、金標(biāo)墊、樣品墊部分組成， 所述PVC襯板設(shè)在最底部，襯板上部中段設(shè)有硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上 部左端貼有吸收墊，硝酸纖維素膜上部右端設(shè)有金標(biāo)墊，金標(biāo)墊的上部右端設(shè) 有樣品墊。該試紙條可以用于確定口蹄疫病毒的O、 A、 Asia I、 C型四種血清 型抗原，以確定被檢動物是否感染口蹄疫病毒。該試紙條操作快速簡便，判定 直觀容易，結(jié)果敏感特異，費用低廉，運輸保存方便，非常適用于基層人員在 田間檢測使用。但這一專利申請所公開的試紙條卻無法檢測被檢動物經(jīng)人工免 疫或自然免疫產(chǎn)生抗體的水平，以及免疫動物抗體與保護(hù)力的關(guān)系。由于FMD流行帶來的嚴(yán)重危害性，目前發(fā)達(dá)國家大多采取撲殺銷毀的措施， 而發(fā)展中國家以疫苗免疫接種為主要手段。FMDV抗原變異頻繁，亞型之間的 抗原差異性也很大，因此往往造成診斷困難。制備診斷抗原應(yīng)近可能與FMDV 的分子流行病學(xué)的研究為基礎(chǔ)。為避免口蹄疫病毒的大面積流行，對人工飼養(yǎng)的偶蹄類動物進(jìn)行人工免疫 是現(xiàn)發(fā)展中國家多采用的方法。經(jīng)人工免疫后，被免疫動物是否產(chǎn)生抗體，能 否有效抵抗病毒的感染，需要提供一種有效快捷的手段進(jìn)行檢測?？谔阋咭呙缑庖邉游镅蹇贵w效價與攻毒保護(hù)具有相關(guān)性，己在國內(nèi)外許 多實驗室得到驗證，數(shù)十年前就證實了免疫動物中和抗體滴度與攻毒保護(hù)有很 好的相關(guān)性，其最高的相關(guān)性在免疫后3-4周的牛和豬血清抗體檢測中得到驗 證，后期要達(dá)到與前期相同的保護(hù)程度，則需要加強免疫，獲得更高的抗體滴 度。因此確定免疫動物抗體效價與保護(hù)力的關(guān)系，對于田間動物的免疫效力評 價具有實際意義。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術(shù)不足，可以以對偶蹄類動物亞洲1型(Asia1) 口蹄疫抗體水平進(jìn)行快速檢測的試紙條，同時提供這種試紙條的制備方法和 使用方法。本發(fā)明的檢測試紙條是在一不透水材料的底板上呈線性排列固定于其上 的用多孔纖維材料構(gòu)成的加樣吸收墊、位于加樣吸收墊尾端并與加樣吸收墊相 連的免疫金標(biāo)層、與免疫金標(biāo)層的尾端相連由硝酸纖維膜構(gòu)成的檢測段和位于 檢測段尾端與檢測段相連的用吸水材料構(gòu)成的吸收段，檢測段上包被有用抗Asia 1型口蹄疫病毒的兔或豚鼠IgG抗體形成的質(zhì)控線，檢測段上處于質(zhì)控線的 上游包被有Asia 1型口蹄疫病毒形成的檢測線，檢測段的檢測線和免疫金標(biāo)層 吸附的膠體金標(biāo)記的Asia 1型口蹄疫病毒是天然病毒，或者是基因重組表達(dá)口 蹄疫病毒，或者是口蹄疫病毒的分解抗原。本發(fā)明的檢測試紙條的檢測線和免疫金標(biāo)層的Asia 1型口蹄疫病毒最好是 天然全病毒。本發(fā)明的檢測Asial型口蹄疫抗體水平檢測試紙條的制備方法是首先制 備出15 50納米的膠體金溶液，然后1) 制備免疫金標(biāo)層先將膠體金溶液的pH值調(diào)至8.0 8.4，再在其中按每100ml膠體金溶液加 入0.1 0.4mg經(jīng)純化處理的Asial型口蹄疫全病毒，攪拌均勻后，再在溶液中 按0.2 lg/100ml加入動物血清蛋白，4。C靜置2 4小時，再將上述膠體金溶液 離心去除沉淀物，得上清液，將上清液再經(jīng)離心處理得沉淀物，所得沉淀物按4 10ml/100ml溶于含重量比0.2 0.6%的動物血清蛋白和0.01 0.06%疊氮鈉的 0.02M pH7.4 Tris-Hcl的緩沖液中得到膠體金標(biāo)記的病毒溶液，將膠體金溶液浸 入玻璃纖維至液體開始滲出為止，或者采用噴膜機將前述的Asial型口蹄疫全 病毒與動物血清蛋白和疊氮鈉的緩沖液噴在玻璃纖維上，形成金標(biāo)抗體層，將 金標(biāo)抗體層進(jìn)行干燥處理后待用；2) 制備檢測段用噴膜機在硝酸纖維素膜中段噴檢測線，再取兔抗或鼠抗Asia 1型口蹄疫 IgG調(diào)濃度為1.5 2.5mg/ml，，用噴膜機在纖維素膜中段，距檢測線0.5 lcm 處，噴質(zhì)控線，噴膜量按10 15ul/lcm設(shè)置，然后干燥處理，再用0.01mPH7.0 含小牛血清的磷酸緩沖液在37r下封閉30分鐘，O.Olml pH7.0的PBS漂洗后再次進(jìn)行干燥處理，得到檢測段待用； 3)試紙組裝將不透水材料的底板材料、金標(biāo)抗體層、檢測段及吸收墊材料和吸收段材 料分別按設(shè)計長度裁取，依次將金標(biāo)抗體層、檢測段及吸收墊材料和吸收段固 定于底板材料上，制成試紙條。組裝時應(yīng)注意使檢測段的檢測線靠近試紙條的 加樣吸收墊一側(cè)。本發(fā)明的試紙條制備方法中采用蔗糖密度梯度離心來純化口蹄疫病毒。 本發(fā)明的Asia 1型口蹄疫抗體水平檢測試紙條的使用方法是是取牛、羊、 豬等偶蹄類動物血液或血清，將血液或血清用磷酸緩沖液稀釋，再將經(jīng)稀釋的 血液或血清滴于加樣端樣品吸收墊，或者將加樣端吸收墊插入被檢動物的血液 或血清稀釋液中，然后觀察檢測線和質(zhì)控線的陽性結(jié)果，得到被檢測動物是否 具有抗體的結(jié)果。本發(fā)明的檢測Asia 1型口蹄疫抗體水平檢測試紙條使用中，如果是取牛、 羊、豬等偶蹄類動物血液或血清用pH7.4 0.02M磷酸緩沖液稀釋，將經(jīng)稀釋的 血液或血清滴于加樣端樣品吸收墊，或者將加樣端吸收墊插入被檢動物的血液 或血清稀釋液中，如果血清在^1:16稀釋后，檢測層硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控 線和檢測線雙線陽性結(jié)果，則表示該檢測血清該檢測血清Asia l型口蹄疫抗體 水平達(dá)到99%保護(hù)范圍，被檢動物能耐受同源強毒攻擊，不需要進(jìn)行免疫；如 果被檢測血清在《1:4稀釋后，則表示該檢測血清Asial抗體水平屬于不保護(hù)范 圍，被檢動物不能耐受同源強毒攻擊，需要進(jìn)行基礎(chǔ)免疫；如被檢測血清在1:4 ~1:16之間稀釋后，檢測層硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線和檢測線雙線陽性結(jié)果， 則表示該檢測血清Asia 1型口蹄疫抗體抗體水平屬于50%保護(hù)范圍，被檢動物 不能完全耐受同源強毒攻擊，需要進(jìn)行加強免疫。由前述內(nèi)容可知，本發(fā)明的試紙條中，檢測段的檢測線和免疫金標(biāo)層吸附 的膠體金標(biāo)記的Asia 1型口蹄疫病毒可以是基因重組表達(dá)口蹄疫病毒，或者是 口蹄疫病毒的分解抗原。采用基因重組表達(dá)抗原具有如下優(yōu)點重組DNA技術(shù) 生產(chǎn)的抗原較之從其他生物源分離的抗原有諸多的優(yōu)越性，如純度高，特異性 強。由于蛋白是在遺傳修飾實驗室生長細(xì)胞中合成的，故每批蛋白制品與前一 次制備是相同的，可以保證各批次質(zhì)量一致。自然抗原很少有完全純凈的，往往會產(chǎn)生針對污染多肽的抗體，而導(dǎo)致產(chǎn)生假陽性結(jié)果，而采用基因重組表達(dá) 病毒能完全避免這些問題。本發(fā)明認(rèn)為最好使用Asia 1型口蹄疫全病毒純化抗原作為中和抗體水平的 檢測抗原。資料顯示FMDV的免疫原性主要取決于完整的病毒粒子。在FMDV 粒子表面的抗原位點有線性位點和構(gòu)象位點兩種。前者主要與表位的一級結(jié)構(gòu) (氨基酸序列)有關(guān)，而后者主要與病毒結(jié)構(gòu)有關(guān)，對FMDV抗原位點的研究 表明，F(xiàn)MDV的結(jié)構(gòu)蛋白均參與抗原位點的構(gòu)成，其線性位點少，構(gòu)象位點多。 而表達(dá)抗原多選用FMDV某一段基因序列，使用的是其線性位點。同時利用原 核或真核系統(tǒng)表達(dá)，產(chǎn)生的蛋白與天然蛋白構(gòu)象差異很大，特別是抗原決定簇 重要的糖基化位點不能得到很好的修飾，使其免疫原性較差，不能很好的產(chǎn)生 中和抗體，這也是現(xiàn)在多數(shù)重組抗原不能替代全病毒抗原作為疫苗生產(chǎn)的原因。 而作為診斷動物免疫或感染產(chǎn)生中和抗體水平的檢測抗原，其必須具備充分的 抗原決定簇和完整構(gòu)象位點才能更好的捕獲血清中的抗體，并與其進(jìn)行特異性 反應(yīng)，以提高其檢測的靈敏度。另一方面，Asial型口蹄疫天然全病毒純化生產(chǎn)工藝簡單，大規(guī)模細(xì)胞培 養(yǎng)技術(shù)成熟穩(wěn)定，純化過程簡單易行，得到的抗原效價穩(wěn)定。由于本專利使用 了蔗糖密度梯度離心來純化病毒，使診斷抗原具有較好的特異性和敏感性，同 時保存方便。本發(fā)明制備診斷抗原即采用了近可能與國內(nèi)FMDV的分子流行病學(xué)的研究 為基礎(chǔ)的Asial型口蹄疫全病毒，克服了FMDV抗原變異頻繁，亞型之間的抗 原差異性大，易造成診斷困難的不足。其次，本發(fā)明的試紙條不僅可以半定量 檢測出免疫或感染動物的(免疫)抗體水平，同時可確定免疫動物抗體效價與 保護(hù)力的關(guān)系，這是現(xiàn)有技術(shù)不能勝任的。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1、 本發(fā)明首次用口蹄疫天然全病毒標(biāo)記膠體金顆粒，建立了可檢測Asial 型口蹄疫抗體水平的試紙條，可對血液或血清中的Asial型口蹄疫抗體水平進(jìn)行 快速檢測。2、 本發(fā)明與目前監(jiān)測抗體水平的病毒中和試驗，正向間接血凝試驗，及液相阻斷ELISA相比，檢測樣品僅需15分鐘即可判定結(jié)果。具有檢測過程迅速、 快捷、方便，無須配備專門儀器設(shè)備和技術(shù)人員，結(jié)果判定直觀容易等優(yōu)點。 非常適于獸醫(yī)基層工作人員進(jìn)行臨床檢驗、流行病學(xué)調(diào)查和場地檢疫等多種場 合，同時還可在口岸通關(guān)大批量快速檢驗時使用。3、 本發(fā)明特異性、再現(xiàn)性好，結(jié)果穩(wěn)定。可應(yīng)用于豬、牛群等O型口蹄疫 抗體水平監(jiān)測，了解整個豬、牛群口蹄疫抗體的狀況，為決定是否開展免疫， 選擇制定Asial型口蹄疫疫苗適宜的免疫劑量、程序提供依據(jù)。4、 本發(fā)明使用安全，無放射性同位素與苯二胺等有害物質(zhì)參與，沒有生物 安全隱患。，不會污染環(huán)境。5、 本發(fā)明質(zhì)量穩(wěn)定，具有可在常溫運輸保存的優(yōu)點。6、 本發(fā)明制備方法簡便、成本低廉，檢測費用低。


圖l為本發(fā)明的試紙條整體示意圖。圖2為試紙條縱向結(jié)構(gòu)的示意圖，其 中的4端位于圖1中的2的位置。圖3為試紙條結(jié)果判定圖。圖4為120頭免 疫牛金標(biāo)試紙條檢測抗體效價與同源強毒攻毒保護(hù)/發(fā)病分布圖；圖中空條表 示發(fā)?。稽c狀條表示部分保護(hù)；實條表示完全保護(hù)。
具體實施方式
以下提供發(fā)明的具體實施例。(一)試紙條的制備 1)制備免疫金標(biāo)層i膠體金的制備取100mg氯金酸溶于1000ml三蒸水中，加入20ml濃度 為1%的檸檬酸三鈉，煮沸15分鐘，冷卻后得到40納米的膠體金溶液；ii膠體金標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)口蹄疫病毒，取100ml膠體金溶液，用0.2mol/L碳 酸鉀溶液調(diào)PH8.0，加入0.15mgAsial型口蹄疫全病毒，攪拌20分鐘，再加入 500mg牛血清蛋白，繼續(xù)攪拌15分鐘，4。C靜置2小時，這里所用的Asia 1型 口蹄疫全病毒可以是經(jīng)純化的天然病毒，也可以是基因重組表達(dá)Asia 1型口蹄 疫病毒再經(jīng)過差速離心或蔗糖密度梯度離心純化；iii將上述膠體金溶液經(jīng)2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，去沉淀物，得上清液；iv將上清液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心60分鐘，得沉淀物；v將沉淀物按6ml/100ml溶于0.02M PH7.4 Tris-Hcl緩沖液得到膠體金溶 液，該緩沖液中含0.25%的牛血清白蛋白和0.02%疊氮鈉；vi將膠體金溶液浸入玻璃纖維或無紡布至液體開始滲出為止，在37'C下2 小時干燥而形成免疫金標(biāo)層。免疫金標(biāo)層的制備也可以采用在玻璃纖維上用噴膜機噴膜的方法，其噴膜 量應(yīng)保證膠金溶液的最終濃度符合要求。2) 檢測層制備這一階段主要是制備形成檢測段8的質(zhì)控線6和檢測線7的包被。所述的 檢測段8是在纖維膜上形成基因表達(dá)口蹄疫病毒構(gòu)成的檢測線和抗口蹄疫病毒 兔lgG抗體形成的質(zhì)控線6。其制備方法是取基因表達(dá)口蹄疫全病毒，調(diào)整濃度 為0.1mg/ml，用噴膜機在纖維素膜中段噴檢測線7;再取兔抗口蹄疫IgG調(diào)濃度 為1.5mg/m1，，用噴膜機在纖維素膜中段，距檢測線0.5cm處，噴質(zhì)控線6，按 噴膜量10pl/lcm進(jìn)行噴膜，噴膜溫度為37'C。噴膜后干燥2小時，再用O.Olm PH7.0含小牛血清的PBS，在37。C下封閉30分鐘，用0.01ml PH7.0的PBS漂 洗，再在37"C干燥處理。3) 試紙條組裝本階段是在襯板IO上組合口蹄疫病毒金標(biāo)層和檢測段，最終形成試紙條。 將不透水材料的底板材料、金標(biāo)抗體層、檢測段及吸收墊材料和吸收段材 料分別按設(shè)計長度裁取，依次將金標(biāo)抗體層、檢測段及吸收墊材料和吸收段固 定于底板材料上，組裝成試紙條。組裝中所采用的不透水材料為PVC塑料板， 加樣吸水層采用玻璃纖維。在塑料墊板10的兩端分別粘貼玻璃纖維的加樣端吸 收墊4和吸水層9;在其中段粘貼包被有檢測線7和質(zhì)控線6的硝酸纖維膜層8，' 在加樣端吸水層4與硝酸纖維素膜層8的交接部位，夾貼含免疫金標(biāo)層5的玻 璃纖維的一端沿其長度的1/5部分應(yīng)與加樣端吸水紙層4相重疊，其另一端沿其 長度的1/5應(yīng)與纖維素膜層8相重疊，以保證免疫金標(biāo)層與其兩端的所設(shè)的加樣 層4、檢測段8間有良好的接觸。然后按4mm寬、8cm長規(guī)格切條，再組裝在 塑料盒內(nèi)。盒蓋上加樣孔2正對測試條的加樣端吸水紙層4，觀察孔3正對纖維 素膜的檢測層8。所制成的試紙條結(jié)構(gòu)參見附圖1和附圖2。本發(fā)明的試紙條制備方法中對天然病毒建議采用蔗糖密度梯度離心來進(jìn)行 純化處理。本發(fā)明的試紙條采用疫苗效力檢驗的國際標(biāo)準(zhǔn)方法PD5o測定法，采用國際標(biāo)準(zhǔn)攻毒方法攻毒，測定了 Asia 1型口蹄疫金標(biāo)試紙條檢測抗體效價與保護(hù)力 的關(guān)系。試驗所用疫苗為免疫用口蹄疫Asia l型疫苗，為蘭州獸醫(yī)研究所生物制品 廠生產(chǎn)，攻毒用口蹄疫Asial型毒株為疫苗同源強毒株。1 Asia 1型口蹄疫抗體檢測試紙條操作步驟及判定標(biāo)準(zhǔn)1. 2待檢樣品的處理將待檢血清用0.02 mol/LPBS作對倍稀釋， 分別稀釋1:4、 1:8、 1:16三個稀釋度。1. 2樣品檢測將Asia l型抗體檢測試紙條插入到每個稀釋度樣品中。 注意將試紙條有標(biāo)志線的一端插入待檢樣品中，樣品液面不可超過標(biāo)志線。當(dāng) 液體全部浸濕硝酸纖維素膜后，取出試紙條，平放于干凈的桌面上，5-15分鐘 內(nèi)觀察結(jié)果。1. 3單支試紙條結(jié)果判定陽性質(zhì)控帶與檢測帶都出現(xiàn)清晰可見紅色條帶。血清中的抗體水平越高， 檢測帶紅色帶顏色越深。(++:強陽性清晰可見的紅色；+:肉眼可見的紅色) 陰性只有質(zhì)控帶出現(xiàn)清晰可見紅色條帶?？梢少|(zhì)控帶出現(xiàn)一條顏色清晰可見的紅色線，而在檢測帶出現(xiàn)一條顏色 很淺，若隱若顯的紅色帶。無效質(zhì)控帶不出現(xiàn)紅色條帶。 以上參見附圖3。2. 4血清效價判定試紙條抗體效價^稀釋度試紙條在該抗體稀釋度顯示陽性結(jié)果。 試紙條抗體效價《稀釋度試紙條在該抗體稀釋度顯示陰性或可疑結(jié)果。 試紙條抗體效價=無效試紙條在該抗體稀釋度顯示無效結(jié)果。 2攻毒試驗所用動物為牛。對120頭免疫用牛在免疫前用液相阻斷ELISA進(jìn)行了檢測， 均為口蹄疫Asial型和O型抗體陰性牛。血清樣品及試驗方法120份不同劑量免疫牛血清樣品，采自4批疫苗PD50測定免疫21日牛。 疫苗PDso測定疫苗免疫劑量分別為2ml (全劑量)，0.67ml (1/3劑量)， 0.22ml (1/9劑量)。每個劑量5頭牛，肌肉注射，免疫第21日采血，然后用同 源強毒10000ID5。攻毒，舌面注射2點，O.lml/點。觀察12日，以蹄部出現(xiàn)水泡 等臨床癥狀判為發(fā)病。按Karber法計算50%保護(hù)劑量(PD50)。 3結(jié)果120份不同劑量免疫牛第21日血清樣品試紙要抗體滴度和同源強毒 10000IDs。攻毒后免疫牛保護(hù)與發(fā)病狀況見圖4。圖4顯示了動物免疫后21日，用同源強毒10000ID5o攻擊，ELISA滴度各個 范圍內(nèi)保護(hù)與未保護(hù)數(shù)。由圖4.4可見，試紙條抗體滴度^1:16時，免疫動物能 耐受同源強毒10000ID5。攻擊，屬于全部保護(hù)范圍，ELISA抗體滴度《1:4時， 免疫動物不能耐受同源強毒lOOOOIDso攻擊，屬于不保護(hù)范圍；介于兩者之間， 即試紙條抗體滴度在1:4-1:16時，免疫動物不能完全耐受同源強毒100001050攻 擊，屬于不完全保護(hù)范圍。4 討論用PD5o進(jìn)行疫苗效力檢驗，是國際動物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法， 我們采用疫苗效檢PD5。試驗方法，通過對120份不同免疫劑量免疫牛血清樣品 的測定，確定了口蹄疫Asia 1型金標(biāo)試紙條抗體滴度與保護(hù)的關(guān)系。用同源強 毒10000ID5。攻擊，試紙條抗體滴度^1:16時免疫動物能耐受同源強毒10000ID50 攻擊，屬于全部保護(hù)范圍，試紙條抗體滴度《1:4時，免疫動物屬于不完全保護(hù) 范圍，免疫動物不能耐受同源強毒攻擊，需要進(jìn)行基礎(chǔ)免疫；試紙條抗體滴度 在l:4 kl6時，免疫動物既有發(fā)病，也有保護(hù)，不能完全耐受同源強毒攻擊， 需要加強免疫，這一區(qū)域?qū)儆诓煌耆Ｗo(hù)范圍，稱為50%以上保護(hù)區(qū)。
權(quán)利要求
1、一種Asia 1型口蹄疫抗體水平檢測試紙條，包括呈線性排列的固定于不透材料制成的底板上的用多孔纖維材料構(gòu)成的加樣吸收墊、位于加樣吸收墊尾端并與加樣吸收墊相連的免疫金標(biāo)層、與免疫金標(biāo)層的尾端相連由硝酸纖維膜構(gòu)成的檢測段和位于檢測段尾端與檢測段相連的用吸水材料構(gòu)成的吸收段，檢測段上包被有用抗Asia 1型口蹄疫病毒的兔或豚鼠IgG抗體形成的質(zhì)控線，其特征在于檢測段上處于質(zhì)控線的上游包被有Asia 1型口蹄疫病毒形成的檢測線，檢測段的檢測線和免疫金標(biāo)層吸附的膠體金標(biāo)記的Asia 1型口蹄疫病毒是天然病毒，或者是基因重組表達(dá)口蹄疫病毒，或者是口蹄疫病毒的分解抗原。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測Asia 1型口蹄疫抗體水平檢測試紙條，其特 征在于構(gòu)成檢測線和免疫金標(biāo)層的Asia 1型口蹄疫病毒是天然全病毒。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測Asia 1型口蹄疫抗體水平檢測試紙條的 制備方法，首先制備出15 50納米的膠體金溶液，其特征是1) 制備免疫金標(biāo)層先將膠體金溶液的pH值調(diào)至8.0 8.4，再在其中按每100ml膠體金溶液加 入0.1 0.4mgAsial型口蹄疫病毒，攪拌均勻后，再在溶液中按0.2 lg/100ml 加入動物血清蛋白，4"C靜置2 4小時，再將上述膠體金溶液離心去除沉淀物， 得上清液，將上清液再經(jīng)離心處理得沉淀物，所得沉淀物按4 10ml/100ml溶于 含重量比0.2 0.6%的動物血清蛋白和0.01 0.06%疊氮鈉的0.02M pH7.4 Tris-Hcl的緩沖液中得到膠體金標(biāo)記的病毒溶液，將膠體金溶液浸入玻璃纖維至 液體開始滲出為止，形成金標(biāo)抗體層，將金標(biāo)抗體層進(jìn)行干燥處理后待用；2) 制備檢測段用噴膜機在硝酸纖維素膜中段噴檢測線，再取兔抗或鼠抗Asia l型口蹄疫 IgG調(diào)濃度為1.5 2.5mg/ml，，用噴膜機在纖維素膜中段，距檢測線0.5 lcm 處，噴質(zhì)控線，噴膜量按10 15ul/lcm設(shè)置，然后干燥處理，再用0.01mPH7.0 含小牛血清的磷酸緩沖液在37i:下封閉30分鐘，O.Olml pH7.0的PBS漂洗后再 次進(jìn)行干燥處理，得到檢測段待用；3) 試紙組裝將不透水材料的底板材料、金標(biāo)抗體層、檢測段及吸收墊材料和吸收段材料分別按設(shè)計長度裁取，依次將金標(biāo)抗體層、檢測段及吸收墊材料和吸收段固 定于底板材料上。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是采用蔗糖密度梯度離心純化 Asial型口蹄疫天然病毒。
5、 權(quán)利要求1或2所述的檢測Asia 1型口蹄疫抗體水平檢測試紙條的使用 方法，其特征是取牛、羊、豬等偶蹄類動物血液或血清，將血液或血清用磷酸 緩沖液稀釋，再將經(jīng)稀釋的血液或血清滴于加樣端樣品吸收墊，或者將加樣端 吸收墊插入被檢動物的血液或血清稀釋液中，然后觀察檢測線和質(zhì)控線的陽性 結(jié)果。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的使用方法，其特征是將采集的被檢動物血液或血 清用pH7.4 0.02M磷酸緩沖液稀釋，將經(jīng)稀釋的血液或血清滴于加樣端樣品吸 收墊，或者將加樣端吸收墊插入被檢動物的血液或血清稀釋液中，如果血清在 21:16稀釋后，檢測層硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線和檢測線雙線陽性結(jié)果，則表 示該檢測血清Asia 1型口蹄疫抗體水平達(dá)到99%保護(hù)范圍；如果被檢測血清在 3:4稀釋后，檢測層硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線單線陰性結(jié)果，則表示該檢測 血清抗體水平屬于不保護(hù)范圍；如被檢測血清在1:4 1:16之間稀釋后，檢測層 硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線和檢測線雙線陽性結(jié)果，則表示該檢測血清Asia 1 型口蹄疫抗體水平屬于50%保護(hù)范圍。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于對偶蹄類動物Asia 1型口蹄疫抗體水平進(jìn)行快速檢測的膠體金試紙條，這種試紙條的制備，以及其具體檢測的方法。試紙條的底板上固定有多孔纖維材料構(gòu)成的加樣吸收墊、位于加樣吸收墊尾端并與加樣吸收墊相連的免疫金標(biāo)層、和由硝酸纖維膜構(gòu)成的檢測段，以及位于檢測段尾端與檢測段相連的用吸水材料構(gòu)成的吸收段，質(zhì)控線為抗Asia 1型口蹄疫病毒的兔或豚鼠IgG抗體，檢測線包由Asia 1型口蹄疫病毒構(gòu)成，檢測段的檢測線和免疫金標(biāo)層吸附的膠體金標(biāo)記的Asia 1型口蹄疫病毒是天然病毒，或者是基因重組表達(dá)口蹄疫病毒，或者是口蹄疫病毒的分解抗原。
文檔編號G01N33/52GK101241138SQ20071019466
公開日2008年8月13日 申請日期2007年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月29日
發(fā)明者任維維, 劉在新, 劉湘濤, 劉西蘭, 衛(wèi)廣森, 軍 張, 才學(xué)鵬, 智曉瑩, 楊亞民, 仲 梁, 王超英, 祁光宇, 翟國元, 韜 蔣, 涓 陳 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所