專利名稱：一種檢測(cè)孔雀石綠的分子印跡聚合物微球的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分子印跡檢測(cè)技術(shù)，具體地，涉及一種利用分子 印跡技術(shù)的快速檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠的方法，本發(fā)明還涉及用于該 檢測(cè)方法的分子印跡聚合物微球。
背景技術(shù)：
眾所周知，孔雀石綠在水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗菌效果較好，價(jià)格低廉，目 前對(duì)其危害性的宣傳力度較弱，從而使得被不少水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)戶廣泛使 用?；诖?，我國(guó)制定了《無(wú)公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量(NY5070-2002 )》標(biāo)準(zhǔn)，其中規(guī)定水產(chǎn)品中不得檢出孔雀石綠等危 害性物質(zhì)?！?000年度中國(guó)出口動(dòng)物源性食品中有毒有害物質(zhì)殘留監(jiān)控計(jì) 劃》首次將出口鰻魚中孔雀石綠殘留量的監(jiān)控列入年度計(jì)劃，并延續(xù) 至今。2002年5月歐盟曾向我國(guó)通報(bào)在2批浙江舟山向德國(guó)出口的鰻魚 中檢出孔雀石綠。2005年6月5日，英國(guó)食品標(biāo)準(zhǔn)局在英國(guó)一家知名 的超市連鎖店出售的鮭魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種名為"孔雀石綠"的成分，有 關(guān)方面將此事迅速通報(bào)給歐洲國(guó)家所有的食品安全機(jī)構(gòu)，發(fā)出了食品 安全警報(bào)。英國(guó)食品標(biāo)準(zhǔn)局發(fā)布消息說(shuō)，任何魚類都不允許含有孔雀 石綠，并且這種化學(xué)物質(zhì)不應(yīng)該出現(xiàn)在任何食品中。2005年7月7曰農(nóng) 業(yè)部辦公廳發(fā)布了《關(guān)于組織查處"孔雀石綠"等禁用獸藥的緊急通 知》，要求各地盡快組織開展孔雀石綠等禁用藥物的專項(xiàng)整治工作。 農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局馬上組織調(diào)查組奔赴各地調(diào)查孔雀石綠問(wèn)題，并組織專 家商討對(duì)策。2005年以來(lái)歐盟、日本、韓國(guó)等國(guó)加大了對(duì)我國(guó)出口鰻 魚中孔雀石綠的檢驗(yàn)力度。日本從2005年7月1日起，開始對(duì)來(lái)自我國(guó) 的鰻魚產(chǎn)品強(qiáng)制檢測(cè)孔雀石綠。同時(shí)，香港、新加坡等地也加強(qiáng)了水 產(chǎn)品檢驗(yàn)，檢出多批大陸水產(chǎn)品中含有孔雀石綠殘留?？兹甘G別名堿性綠、鹽基塊綠、孔雀綠，其分子式為C23H25C1N2，分子量為364.92，屬于三苯甲烷類染料，是一分子苯 甲醛與兩分子二甲基苯胺在濃硫酸或氯化鋅存在的條件下聚合而形 成的深綠色晶體，具有金屬光澤?？兹甘G極易溶于水，水溶液呈蘭 綠色(4.0g/100ml)，也能溶于乙醇、甲醇或戌醇?？兹甘G在細(xì)胞分 裂時(shí)，抑制細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡念惣跋嚓P(guān)產(chǎn)物，從而抑制細(xì)胞分 裂，達(dá)到抗菌效果(HECHTT等.JApplIchth， 1998, 14(3-4):213-221.)?？兹甘G有強(qiáng)烈的致癌作用，由于其為脂溶性化合物，在魚體內(nèi) 和環(huán)境中殘留時(shí)間長(zhǎng)，且代謝緩慢，在人體殘留時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)人體的危 害是積蓄式的(劉峰延等.中國(guó)水產(chǎn)，2006 (1): 58 - 59.)。有時(shí)雖然 攝入量不多，不會(huì)有很明顯的中毒癥狀，但當(dāng)體內(nèi)的孔雀石綠堆積到 一定程度，就可能引發(fā)各種疾病。孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無(wú)色孔雀石綠具有高殘留性、高致癌性、 高致畸性、致突變性、高毒性等特性。研究發(fā)現(xiàn)孔雀石綠能導(dǎo)致大鼠 肝細(xì)胞空泡化，使甲狀腺濾泡上皮大量凋亡，抑制雄鼠甲狀腺激素的 釋放；抑制血漿膽堿脂酶的作用，進(jìn)而造成乙酰膽堿的蓄積有出現(xiàn)神 經(jīng)癥狀的可能性(MUSASO等.JAquatSci， 1999,14:37-42.)。此外， 它還能通過(guò)溶解足夠的鋅(Srivastava S等.Aquat Toxicol, 2004, 66: 319-3291; SVOBODOVAZ等.Acta Vet Brno， 1997， 66(2):111-116 ),導(dǎo) 致水生動(dòng)物急性鋅中毒，引起水生生物消化道、鰓和皮膚輕度炎癥， 從而影響其正常攝食和生長(zhǎng)，還可阻礙腸道酶(如胰蛋白酶、oc-淀 粉酶)的活性，影響水生動(dòng)物的消化吸收功能(SRIVASTAVAK等.Acta Hydrobiol， 1995,37(2):113-119; SRIVASTAVAS J等.J Adv Zool, 1998, 19(l):46-49 )。目前檢測(cè)孔雀石綠方法包括同時(shí)檢測(cè)孔雀石綠和無(wú)色孔雀石錄 殘留《無(wú)公害食品水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的測(cè)定液相色譜法》(SC/T 3021—2004)標(biāo)準(zhǔn)。2005年9月5日中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)發(fā)布《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫 殘留量的測(cè)定》，規(guī)定將高效液相色譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜作為孔雀 石綠檢測(cè)的國(guó)標(biāo)方法。國(guó)外還釆用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、薄層色譜法和毛細(xì)管電泳法等進(jìn)行孔雀石綠的檢測(cè)(Tumipseed S B等.J AOAC Int， 1995，78(4):971-977; Matysik FM. 1998， 802(2): 349; Tarbin J A等.J the analyst Int, 1998,123(12): 2567-2571 )。但這些檢測(cè)方法都要依賴復(fù) 雜精密儀器，對(duì)樣品分離凈化的步驟也相對(duì)繁瑣。分子印跡技術(shù)是為獲得在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合點(diǎn)位上與某一分子(通 常稱為模板分子)完全匹配的聚合物的實(shí)驗(yàn)制備技術(shù)。其工作原理一 般分三個(gè)步驟使印跡分子與功能單體相互作用形成復(fù)合物；加交聯(lián) 劑和聚合引發(fā)劑，發(fā)生聚合反應(yīng)；除去聚合物中的印跡分子后即獲得 分子印跡聚合物。分子印跡聚合物具有制作簡(jiǎn)單、成本低廉、功能可 設(shè)計(jì)、堅(jiān)固耐用、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，被譽(yù)為"萬(wàn)能的分子識(shí)別材料"。 其中分子印跡聚合物微球使用更方便、識(shí)別效率更高，應(yīng)用前景也更 加廣闊。主要應(yīng)用于色譜分離、抗體和受體模擬物、固相萃取、生物 傳感器敏感材料、催化作用等?？兹甘G的分子結(jié)構(gòu)屬三苯甲烷類，其分子中含有三個(gè)苯環(huán)，一 個(gè)二甲基氨和一個(gè)次二甲基氨，分子結(jié)構(gòu)本身具有足夠的空間特征， 易與不同的功能單體形成有特異性的空間結(jié)構(gòu)空穴。此外孔雀石綠的 親水基團(tuán)次二甲基氨，可與功能單體很好地作用，形成強(qiáng)烈的氫鍵， 這無(wú)論在制備印跡分子還是在吸附模板分子中都是強(qiáng)有力的因素。分 子中的兩個(gè)疏水基團(tuán)苯環(huán)和二甲基氨可互相作用，且與溶劑作用，形 成結(jié)合位點(diǎn)。鑒于對(duì)孔雀石綠分子式的研究和性質(zhì)的考慮，釆用懸浮 聚合分子印跡法較適合制備以孔雀石綠為模板的印跡分子聚合物微 球。因?yàn)榭兹甘G是水溶性分子，而水會(huì)削弱功能單體與模板分子之 間或分子印跡聚合物微球與模板分子之間的非共價(jià)鍵作用，從而影響 復(fù)合物的形成或分子印跡聚合物微球的識(shí)別效果。如何在水溶性的環(huán)境中合成并識(shí)別模板分子，是一個(gè)新的挑戰(zhàn)。所以本發(fā)明選用懸浮乳 液聚合法，利用分散劑使親水性表面和親脂性表面隔開，使得親水基 團(tuán)朝著同 一個(gè)方向，這樣有利于孔雀石綠分子和功能單體的結(jié)合。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)出現(xiàn)了 一些檢測(cè)孔雀石綠的檢測(cè)方法，有些已經(jīng) 申請(qǐng)了專利，國(guó)內(nèi)相關(guān)的專利有水產(chǎn)品中孔雀石綠間接竟?fàn)嶦LISA檢測(cè)試劑盒(專利號(hào)申請(qǐng)為200510060995.1 )、孔雀石綠快速檢測(cè)方法 及快速檢測(cè)試劑盒(專利申請(qǐng)?zhí)枮?00710068348.4)和一種水及水產(chǎn) 品中孔雀石綠殘留的快速檢測(cè)試劑盒(專利申請(qǐng)?zhí)枮?200620113227.8),美國(guó)有兩項(xiàng)利用免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)孔雀石綠的專利 (專利申請(qǐng)?zhí)枮?0070254323和20070072242 ),其檢測(cè)原理均不是利 用分子印跡技術(shù)。迄今為止，我國(guó)還沒(méi)有穩(wěn)定可靠的快速檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠殘 留的檢測(cè)方法，所以目前迫切想找到一種新的、快速的檢測(cè)方法，其 既能避免繁瑣的操作步驟和冗長(zhǎng)的檢測(cè)過(guò)程，又能做到靈敏度高，檢 出限低。發(fā)明內(nèi)容為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種利用分子印跡技 術(shù)、操作簡(jiǎn)單，吸附、濃縮和分離效果好的快速檢測(cè)孔雀石綠的方法。 該方法除可檢測(cè)樣品中的孔雀石綠外，還可以對(duì)其進(jìn)行濃縮，降低了 檢測(cè)的檢出限，對(duì)低含量樣品的檢測(cè)尤為有效。本發(fā)明的另一個(gè)目的 在于提供一種用于該檢測(cè)方法的分子印跡聚合物微球，該微球特別適 合對(duì)水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留的檢測(cè)。本發(fā)明分子印跡聚合物微球是以孔雀石綠為模板制備獲得。具體地說(shuō)，通過(guò)如下步驟制備獲得(1) 潛兩種功能單體以一定比例混合；(2) .將孔雀石綠模板與單體以一定比例混合，然后依次加入交聯(lián) 劑、引發(fā)劑、乳化劑和親脂溶劑，乳化，熱聚合；(3).微球洗滌、烘干，過(guò)篩。其中，所述兩功能單體按物質(zhì)的量比1~8: l-8混合；孔雀石綠 模板與混合單體的物質(zhì)的量比為1:1~8。其中，所述交聯(lián)劑優(yōu)選為乙二醇二甲基丙稀酸酯，其物質(zhì)的量是 總功能單體的2 10倍；引發(fā)劑偶優(yōu)選為氮二異丁腈，其質(zhì)量是單體 的1~8倍；乳化劑選可為十二烷基硫酸鈉、聚乙烯醇、羥磺基甜菜堿、 谷氨酸鈉或吐溫80,按蒸餾水體積的1 10%;親脂溶劑可為氯仿、 石油醚、三氯甲烷或甲醇，親脂溶劑與水的體積比是1: 5~20;反應(yīng) 體系的水油比是5 40: 1。在制備分子印跡微球的過(guò)程中，為使體系穩(wěn)定，釆用超聲波或分 散乳化機(jī)先對(duì)混合溶液進(jìn)行乳化，為保持溶液穩(wěn)定的乳化狀態(tài)，對(duì)乳 化液進(jìn)行攪拌，攪拌的速度為0~200rpm;攪拌時(shí)間為0 24h;引發(fā) 熱聚合溫度為50-7(TC。在對(duì)制備的微球進(jìn)行洗滌的過(guò)程中可用超聲波洗滌和索式提取 洗滌方法，洗滌液可為蒸餾水、酒精、20~80%的乙腈-乙酸胺溶液。 洗滌后利用分子篩對(duì)制備的微球進(jìn)行均質(zhì)篩選，IOO目篩下，200目 篩上，得到直徑為50 200^im微球。利用分子印跡微球進(jìn)行水產(chǎn)品的檢測(cè)時(shí)，按照孔雀石綠國(guó)標(biāo)方法 先將樣品研磨勾漿后浸泡、攪拌、過(guò)濾，將濾液通過(guò)由分子印跡微球 填滿的過(guò)濾柱，再使用80~98%的乙腈緩沖溶液對(duì)微球進(jìn)行洗脫， 利用分光光度計(jì)在620nm條件下檢測(cè)洗脫液中孔雀石綠的含量。隨 后對(duì)分子印跡微球的吸附效果進(jìn)行作了評(píng)價(jià)，結(jié)果得出產(chǎn)量最高的單 體組等比例丙烯酰胺和甲基丙烯酸組成的功能單體對(duì)孔雀石綠再吸 附能力最強(qiáng)，靜態(tài)分布系數(shù)達(dá)到3.96，證實(shí)了對(duì)最佳單體的選擇。利用分子印跡技術(shù)快速檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠的技術(shù)方案，優(yōu)選 為，以等比例的丙烯酰胺和甲基丙烯酸作為功能單體，混合單體與模 板分子摩爾比為8 : 1，以石油醚為溶劑，體積比為3%的吐溫-80為乳化劑，加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙稀酸酯和引發(fā)劑偶氮丁異二腈，分散乳化機(jī)對(duì)混合溶液分散乳化3min, 65'C水洛熱聚合24h，索式提 取洗脫過(guò)夜，收集100~200目篩之間的微粒，即可得到分散性好、 顆粒均勻且產(chǎn)量高的孔雀石綠分子印跡微球，回收率在60%以上。將樣品濾液通過(guò)由微球填滿的過(guò)濾柱，再使用80%的乙腈緩沖 溶液對(duì)微球進(jìn)行洗脫，利用分光光度計(jì)在620nm條件下檢測(cè)洗脫液 中孔雀石綠的含量。檢出限為0.63 ±0.07 jug/kg,回收率為102±1.4。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單易行，有良好的重現(xiàn)性，可反復(fù)使用，并能進(jìn)行 工業(yè)化生產(chǎn)，成本低廉， 一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行，不需要復(fù)雜昂貴的設(shè) 備。檢測(cè)效果基本達(dá)到GB水平，同時(shí)具有可再生、操作方法簡(jiǎn)便快 速、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例1孔雀石綠分子印跡聚合物微球的制備在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石綠、8 mmol丙烯酰胺和 8mmo1甲基丙烯酸，再加入15mL石油醚。量取蒸餾水150mL，加 入4.5mL吐溫-80 (按蒸餾水體積的3 %添加)，加熱使完全溶解， 冷卻至常溫。將蒸餾水倒入三角瓶中，并加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙 稀酸酯(40mmo1, 7.56mL)，引發(fā)劑偶氮丁異二腈(200mg)。超聲 脫氣5min，分散乳化機(jī)乳化3min, 65。C水洛聚合24h。所得聚合物 用蒸餾水洗滌至澄清后，以80%的乙腈-乙酸胺緩沖液為洗滌液進(jìn)行 索氏提取。最后在固相萃取裝置中用80%的乙腈-乙酸胺緩沖液沖洗， 直至流出液在紫外-可見光譜檢測(cè)無(wú)孔雀石綠檢出為止。所得微球烘 干，用篩子篩選微球(100目篩下，200目篩上)。得到分散性好、顆 粒均勻的孔雀石綠分子印跡微球，回收率為63%。 實(shí)施例2孔雀石綠印跡分子聚合物微球的制備'在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石綠、4mmol丙烯酰胺和4mmol4-乙烯基吡P定，再加入15mL氯仿，量取蒸餾水150mL，加 入7.5mL吐溫-80 (按蒸餾水體積的3 %添加)，加熱使完全溶解， 冷卻至常溫。將蒸餾水倒入三角瓶中，并加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙 稀酸酯(40mmo1， 7.56mL)，引發(fā)劑偶氮丁異二腈(200 mg )。超聲 脫氣10min,分散乳化機(jī)乳化5min， 70。C水浴聚合4h。所得聚合物 用蒸餾水洗滌至澄清后，以80%的乙腈-乙酸胺緩沖液為洗滌液進(jìn)行 索氏提取。最后在固相萃取裝置中用60%的乙腈-乙酸胺緩沖液沖洗， 直至流出液在紫外-可見光譜檢測(cè)無(wú)孔雀石綠檢出為止。所得微球烘 干，用篩子篩選微球(100目篩下，200目篩上)。得到分散性好、顆 粒均勾的孔雀石綠分子印跡微球，回收率為57%。 實(shí)施例3孔雀石綠印跡分子聚合物微球的制備在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石綠、4 irnnol甲基丙烯酸 和4 mmol 4-乙烯基吡嗖，再加入15mL三氯甲烷。量取蒸餾水150 mL，加入6.0mL十二烷基硫酸鈉(按蒸餾水體積的4%添加)，加熱 使完全溶解，冷卻至常溫。將蒸餾水倒入三角瓶中，并加入交聯(lián)劑乙 二醇二甲基丙稀酸酯(40mmo1, 7.56 mL)，引發(fā)劑偶氮丁異二腈(200 mg)。超聲脫氣2min，分散乳化機(jī)乳化5 min, 6CTC水浴聚合12h。 所得聚合物用蒸餾水洗滌至澄清后，以50%的乙腈-乙酸胺緩沖液為 洗脫液進(jìn)行超聲波洗脫。最后在固相萃取裝置中用60%的乙腈-乙酸 胺緩沖液沖洗，直至流出液在紫外-可見光譜檢測(cè)無(wú)孔雀石綠檢出為 止。所得微球烘干，用篩子篩選微球(100目篩下，200目篩上)。得 到分散性好、顆粒均勻的孔雀石綠分子印跡微球，回收率為44%。 實(shí)施例4孔雀石綠印跡分子聚合物微球的制備在250mL三角瓶中加入2mmol孔雀石綠、4 mmol甲基丙烯酸 和4mmol丙烯酰胺，再加入15mL谷氨酸鈉。量取蒸餾水150mL， 加入3.0mL十二烷基硫酸鈉(按蒸餾水體積的2%添加)，加熱使完 全溶解，冷卻至常溫。將蒸餾水倒入三角瓶中，并加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙稀酸酯(40 mmol， 7.56 mL ),引發(fā)劑偶氮丁異二腈(200 mg )。 超聲脫氣5min,分散乳化機(jī)乳化3min， 65'C水洛聚合24h。所得聚 合物用蒸餾水洗滌至澄清后，以60%的乙腈-乙酸胺緩沖液為洗脫液 進(jìn)行超聲波洗脫。最后在固相萃取裝置中用50%的乙腈-乙酸胺緩沖 液沖洗，直至流出液在紫外-可見光譜檢測(cè)無(wú)孔雀石綠檢出為止。所 得微球烘干，用篩子篩選微球(100目篩下，200目篩上)。得到分散 性好、顆粒均勻的孔雀石綠分子印跡微球，回收率為51%。 實(shí)施例5孔雀石綠分子印跡聚合物微球的制備在250mL三角瓶中加入2mmo1孔雀石綠、8 mmol丙烯酰胺和 8mmo1甲基丙烯酸，再加入15mL石油醚。量取蒸僧水150mL，加 入4.5 mL吐溫-80 (按蒸僧水體積的3 %添加)，加熱使完全溶解， 冷卻至常溫。將蒸餾水倒入三角瓶中，并加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙 稀酸酯(40mmo1， 7.56mL)，引發(fā)劑偶氮丁異二腈(200 mg )。超聲 脫氣5min，分散乳化機(jī)乳化3min, 65。C水浴、攪拌速度為200rpm、 聚合24h。所得聚合物用蒸餾水洗滌至澄清后，以80%的乙腈-乙酸 胺緩沖液為洗滌液進(jìn)行索氏提取。最后在固相萃取裝置中用80%的乙 腈-乙酸胺緩沖液沖洗，直至流出液在紫外-可見光譜檢測(cè)無(wú)孔雀石綠 檢出為止。所得微球烘干，用篩子篩選微球(100目篩下，200目篩 上)。得到分散性好、顆粒均勻的孔雀石綠分子印跡微球，回收率為 530/0。實(shí)施例6水產(chǎn)樣品中孔雀石綠的快速檢測(cè)取2.00g孔雀石綠分子印跡微球(實(shí)施例l)裝入的固相萃取小 柱內(nèi)，輕擊柱壁填實(shí)。用80%乙腈-乙酸胺溶液反復(fù)沖洗至洗出液在 紫外-可見分光光度計(jì)下檢測(cè)620nm處無(wú)讀數(shù)。稱取5.00g巿售鮮鰻 魚置于50mL離心管內(nèi)，按照孔雀石綠國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)處理樣品，將樣品研 磨勻漿后浸泡、攪拌、過(guò)濾，將濾液通過(guò)由微球填滿的過(guò)濾柱，再使 用80%的乙腈緩沖溶液對(duì)微球進(jìn)行洗脫，利用分光光度計(jì)在620nm條件下檢測(cè)洗脫液中孔雀石綠的濃度，從而得到受檢水產(chǎn)品中孔雀石綠的含量為0.29ppm。實(shí)施例7水產(chǎn)樣品中孔雀石綠的快速檢測(cè)取2.00g孔雀石綠分子印跡微球裝入的固相萃取小柱內(nèi)，輕擊柱 壁填實(shí)。用90%乙腈-乙酸胺溶液反復(fù)沖洗至洗出液在紫外-可見分光 光度計(jì)下檢測(cè)620nm處無(wú)讀數(shù)。稱取5.00g巿售鮮八寶魚置于50 mL 離心管內(nèi)，按照孔雀石綠國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)處理樣品，稱取5.00g已搗碎樣品 于50mL離心管中，加入200|xL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入llmL乙腈， 超聲波振蕩提取2min，8000r/min勻漿提取30s,4000r/min離心5min, 上清液轉(zhuǎn)移至25mL比色管中；另取一50mL離心管加入llmL乙腈， 洗滌勻漿刀頭10s，洗滌液移入前一離心管中，用坡棒搗碎離心管中 的沉淀，漩渦混勻器上振蕩30s，超聲波振蕩5min， 4 000r/min離心 5min，上清液合并至25mL比色管中，用乙腈定容至25.0mL,搖勻 備用，將樣品處理液通過(guò)由微球填滿的過(guò)濾柱，再使用60%的乙腈 緩沖溶液對(duì)微球進(jìn)行洗脫，利用分光光度計(jì)在620nm條件下檢測(cè)洗 脫液中孔雀石綠的含量。從而得到受檢水產(chǎn)品中孔雀石綠的含量為 0.14ppm。實(shí)施例8水產(chǎn)樣品中孔雀石綠的快速檢測(cè)取2.00 g孔雀石綠分子印跡微球裝入的固相萃取小柱內(nèi)，輕擊柱 壁填實(shí)。用80%乙腈-乙酸胺溶液反復(fù)沖洗至洗出液在紫外-可見分光 光度計(jì)下檢測(cè)620nm處無(wú)讀數(shù)。稱取5.00g巿售鮮鮭魚置于50 mL 離心管內(nèi)，按照孔雀石綠國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)處理樣品，稱取5.00g已搗碎樣品 于50mL離心管中，加入200pL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入llmL乙腈， 超聲波振蕩提取2min, 8000r/min勻漿提取30s,4000 r/min離心5min, 上清液轉(zhuǎn)移至25mL比色管中；另取一50mL離心管加入llmL乙腈， 洗滌勻漿刀頭10s,洗滌液移入前一離心管中，用玻棒搗碎離心管中 的沉淀，漩渦混勾器上振蕩30s，超聲波振蕩5min， 4 000r/min離心5min，上清液合并至25rnL比色管中，用乙腈定容至25.0mL，搖勻 備用，將樣品液通過(guò)由微球填滿的過(guò)濾柱，再使用98%的乙腈緩沖 溶液對(duì)微球進(jìn)行洗脫，利用分光光度計(jì)在620nm條件下檢測(cè)洗脫液 中孔雀石綠的含量。從而得到受檢水產(chǎn)品中孔雀石綠的含量為 0.17ppm。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳 盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本 領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ) 上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1、一種分子印跡聚合物微球，其特征在于，它是通過(guò)如下方法制備(1).將兩種功能單體以一定比例混合；(2).將孔雀石綠模板與單體以一定比例混合，然后加入交聯(lián)劑、引發(fā)劑、乳化劑和親脂溶劑，乳化，熱聚合；(3).微球洗滌、烘干，過(guò)篩。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的分子印跡聚合物微球，其特征在于，所 釆用的功能單體選自丙烯酰胺、甲基丙烯酸和4-乙烯基吡啶。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分子印跡聚合物微球，其特征在于， 所釆用的功能單體為丙烯酰胺、甲基丙烯酸。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分子印跡聚合物微球，其特征在于， 兩功能單體按物質(zhì)的量比1 8 : 1~8混合；孔雀石綠模板與混合單體 的物質(zhì)的量比為l : 1 ~8。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分子印跡聚合物微球，其特征在于， 兩功能單'體按物質(zhì)的量比i : 1混合。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l-5任一項(xiàng)所述的分子印跡聚合物微球，其特征 在于，交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙稀酸酯，其物質(zhì)的量是總功能單體的 2~10倍；引發(fā)劑偶為氮二異丁腈，其質(zhì)量是單體的1 8倍；乳化劑選 自十二烷基硫酸鈉、聚乙烯醇、羥磺基甜菜堿、谷氨酸鈉和吐溫80， 按蒸餾水體積的i~io %添加。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的分子印跡聚合物微球，其特征在于，所 述親脂溶劑選自氯仿、石油醚、三氯甲烷和甲醇，親脂溶劑與水的體 積比是l: 5~20;反應(yīng)體系的水油體積比是5 ~ 40 : 1。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的分子印跡聚合物微球，其特征在于，熱 聚合溫度為50 70。C。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的分子印跡聚合物微球，其特征在于,使用超聲波洗脫和索式提取洗脫對(duì)微球進(jìn)行洗滌，洗滌液為蒸餾水、 酒精或20~ 80%的乙腈-乙酸胺溶液。
10、 根據(jù)權(quán)利要求l-9任一項(xiàng)所述的分子印跡聚合物微球，其特 征在于，微球直徑為50-200pm。
11、 一種快速檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠的方法，其包括如下步驟(1) .將樣品研磨勻漿后浸泡、攪拌、過(guò)濾；(2) .將濾液通過(guò)由權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的分子印跡微球填滿 的過(guò)濾柱，再使用緩沖溶液對(duì)微球進(jìn)行洗脫；(3) .利用分光光度計(jì)在620nm條件下檢測(cè)洗脫液中孔雀石綠的含量。
12、 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于，緩沖溶液為80-98%的乙腈溶液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于快速檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠的分子印跡聚合物微球，其是通過(guò)下述方法制備將兩種功能單體以一定比例混合，再將孔雀石綠模板與單體以一定比例混合，按一定順序加入交聯(lián)劑、引發(fā)劑、乳化劑和親脂溶劑，制備分子印跡聚合物微球。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了檢測(cè)樣品中的孔雀石綠的方法，該方法包括對(duì)處理的水產(chǎn)樣品進(jìn)行識(shí)別、吸附和濃縮，并利用分光光度法檢測(cè)其中孔雀石綠的濃度。還可以對(duì)其進(jìn)行濃縮，降低了檢測(cè)的檢出限，對(duì)低含量樣品的檢測(cè)尤為有效。
文檔編號(hào)G01N30/50GK101216464SQ20071030475
公開日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2007年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月29日
發(fā)明者何計(jì)國(guó), 曹冬冬, 茅文璽, 袁長(zhǎng)梅, 車會(huì)蓮 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)