專利名稱：檢測人血型的電化學方法及系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及檢測人類血型的方法及系統(tǒng)，特別是涉及使用電化學手段檢測人 類ABO血型所使用的電化學檢測方法和系統(tǒng)。
背景技術：
血液分型是將人血液分成A、 B、 AB和O四種不同類型的常規(guī)方法。目前， 血液分型方法都是根據(jù)紅血細胞懸液的細胞聚集完成的。該方法是首先從病人血 清中分離紅細胞。將適量的紅細胞與引入試管中或玻片上的試驗溶液(含有抗A 血清、抗B血清)或其稀釋液混和，可以再加入利于免疫反應進行的試劑并保 溫、離心和攪拌。然后在顯微鏡下肉眼觀察，確定細胞是否發(fā)生了聚集。 -
如果樣品在抗A試劑存在下發(fā)生細胞聚集，而在抗B存在下不發(fā)生集聚即 鑒定為A型血。樣品在抗B試劑存在下發(fā)生細胞聚集，但在抗A存在下不發(fā)生 聚集則鑒定為B型血。樣品與抗A和抗B試劑均有聚集，樣品為AB型血。樣 品與抗A和B血清均不發(fā)生反應則定為O型血。
目前檢測ABO血型的技術可以分為兩類， 一類為檢測細胞膜上結合血型抗 原的技術，包括紅細胞鹽水凝集法、中和實驗、吸收實驗、解離實驗和混合凝集 反應等。另一類直接檢測游離血型抗原，包括協(xié)同凝集反應、放射免疫反應等。
紅細胞鹽水凝集法是通過已知的IgM型抗體結合新鮮紅細胞表面的血型抗 原，導致紅細胞凝集，來判斷被檢血液的血型。此方法廣泛用于臨床輸血前的血 型檢驗(配型)，但只能用于檢測新鮮紅細胞的血型，而且試劑均需低溫保存。
其他血型檢測方法也都存在各自的缺點，例如中和實驗費時較長，而且靈 敏度比較低。解離實驗和混合凝集反應操作要求高，每次實驗需要反復摸索條件， 其靈敏度也不高；協(xié)同凝結反應是用IgG型抗體致敏SPA蛋白，通過葡萄球菌 的凝集是否判斷血型，但對試劑保存要求較高，使其應用受到一定限制；放射免 疫和酶聯(lián)免疫方法雖然靈敏度高，但是不適合單人份檢測，也無法實現(xiàn)現(xiàn)場檢測。
上述這些血型分析和判斷方法需要由有經(jīng)驗的技術人員手工完成的，所以常常受到技術人員經(jīng)驗和工作疲勞程度等囚素影響，導致結果判斷錯誤。另外，傳 統(tǒng)方法需要使用載玻片、蓋玻片和吸管等物件及抗人球蛋白抗體。如果使用不慎， 在實驗過程中很可能對人員或環(huán)境造成嚴重污染?？梢姡壳俺Ｓ玫呐R床血型鑒 定方法存在檢定時間長、手工勞動強度大，以及結果受主觀偏差影響較大和存在 污染的可能等問題。因此，有必要對傳統(tǒng)的血型檢測方法做出實質性的改進。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了利用電化學阻抗分析技術檢測人ABO血型的檢測系統(tǒng)，該系 統(tǒng)是以化學交聯(lián)法在電極表面固定的紅細胞ABO血型抗體，與待檢紅細胞發(fā)生 免疫結合反應，引起工作電極的交流阻抗的改變來達到對血型的鑒定，所說的檢
測系統(tǒng)包括(l)檢測電極為絲網(wǎng)印刷的三電極，其中包括石墨工作電極、石 墨對電極和銀/氯化銀參比電極，其中工作電極表面固定有ABO血型抗體；(2) 交流阻抗分析裝置為能夠檢測由于紅細胞與其抗體的結合所導致的工作電極交 流阻抗的變化，從而借以判斷紅細胞表面抗原的類型。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的交流阻抗法血型檢測系統(tǒng)是利 用電極表面固定的紅細胞ABO血型抗體與紅細胞發(fā)生免疫結合反應，引起電極
之間交流阻抗的改變來達到對血型的鑒定。
本發(fā)明的交流阻抗法血型檢測系統(tǒng)包括(l)檢測電極為絲網(wǎng)印刷的三電 極。三電極包括石墨工作電極、石墨對電極和銀/氯化銀參比電極，其中工作電 極表面固定有ABO血型抗體；(2)檢測裝置為具有檢測交流阻抗功能的電化 學分析裝置，在紅細胞與相應抗體反應后，其能夠檢測出由于特定血型紅細胞的 存在所導致的工作電極交流阻抗的改變，從而可借以判斷紅細胞表面血型抗原的 類型。
本發(fā)明是利用紅細胞與紅細胞ABO血型抗體發(fā)生免疫反應前后電極表面顯
著變化，導致的工作電極的交流阻抗發(fā)生變化的這一特性，達到對血型的指示。 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，其特征在于所說的檢測電極是絲網(wǎng)印刷的三電 極，其中包括石墨工作電極，銀/氯化銀參比電極以及石墨對電極。檢測時，該 檢測電極被插入在檢測裝置前端的凹槽內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，特征是采用化學交聯(lián)法將抗A抗體或抗B抗
體固定在工作電極表面，并使所說的抗體直接在電極表面上與待檢紅細胞發(fā)生免
疫反應。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，其特征是利用交流阻抗的電化學分析裝置直接 測量絲網(wǎng)印刷電極的交流阻抗變化，并分析所說變化的幅度。
可以將經(jīng)過稀釋的待檢血液樣品加至電極表面并覆蓋整個電極的工作區(qū)域，
靜置一段時間(5分鐘左右)，待發(fā)生免疫結合反應后，用5mM磷酸鹽緩沖液 (PBS)進行沖洗，然后利用具有交流阻抗檢測功能的電化學分析裝置檢測電極 的交流阻抗。由于紅細胞的存在而顯著地改變了工作電極的交流阻抗，所以可根 據(jù)工作電極的交流阻抗的改變判斷紅細胞表面抗原的類型。
本發(fā)明電化學免疫分析檢測ABO血型，是用已知特異性抗體與血型抗原反 應，利用血型物質在電極表面發(fā)生免疫反應前后的電化學信號改變來判斷血型類 型，故具有較高的靈敏度。同時，本發(fā)明的方法操作簡單方便、可避免現(xiàn)有普通 交叉配血實驗的各種缺陷。傳統(tǒng)的凝集法則通常需要加入抗人球蛋白抗體使紅細 胞凝集以便用肉眼觀察。本發(fā)明方法的檢測原理利用的是免疫結合反應，即利用 紅細胞的電化學特性，而無需使其凝集，所以不需要加入抗人球蛋白抗體。儀器 操作軟件具有數(shù)據(jù)處理及識別分析功能，可以避免人為的主觀干擾。特別適合采 血現(xiàn)場ABO血型的快速檢測以及血型的家庭自檢，也適用于血站系統(tǒng)對批量血 液樣品的ABO血型快速鑒定。
圖1顯示本發(fā)明血型檢測方法中使用的整體反應檢測系統(tǒng)模式圖。其中1 為檢測裝置，2為固定了血型抗體的電極系統(tǒng)。電極系統(tǒng)2被插入在檢測裝置1 上顯示的凹槽3內(nèi)。
圖2顯示本發(fā)明血型檢測方法中使用的三電極工作電極區(qū)域免疫反應后的 模式圖。其中1為免疫反應的紅細胞；2為電極上固定的ABO血型抗體；3為 工作電極。
圖3顯示本發(fā)明血型檢測方法中最后的結果判讀原理圖。其中1為B型血 樣和固定有抗B抗體的電極反應的檢測結果阻抗圖;2為A型血樣和固定有抗A抗體的電極反應的檢測結果阻抗圖；3為B型血樣和固定有抗A抗體的電極反 應的檢測結果阻抗圖；4為A型血樣與固定有抗B抗體的電極反應的檢測阻抗 圖。即曲線1和曲線2為未凝集的結果，曲線3和曲線4為發(fā)生凝集的結果。
具體實施例方式
實施例l:交流阻抗法檢測血型 (1)在電極上固定血型抗體(抗A和抗B抗體)
稱取殼聚糖固體0.01g ，以0.2M醋酸溶液稀釋到lml，終濃度為1% 。以 微量移液器吸取lnl上述殼聚糖溶液，滴加在4.5mn^的石墨工作電極上，室溫
自然晾干。
在處理好的工作電極表面滴加0.05%的戊二醛溶液過夜，5 mM磷酸鹽緩沖 液(PBS)沖洗后泡入濃度為5mg/ml的血型抗體(抗A、抗B抗體)溶液中， 交聯(lián)24小時。取出，用5mMPBS洗去游離的血型抗體(抗A、抗B抗體)，最 后用濃度為5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉2小時。最后干燥后密封保存。
(2) 加入紅細胞待檢樣品進行免疫反應 血樣用生理鹽水或其它等張稀釋液稀釋到2%—5%濃度，移取20fil至電極
表面，室溫反應5分鐘左右，用lOmMPBS沖洗除去未結合在電極表面的紅細 胞。
(3) 檢測電極交流阻抗信號 在滴加待檢血樣之前先在電極表面加入20^1生理鹽水，將電極插入檢測儀
器前端電極插槽內(nèi)檢測電極表面溶液的交流阻抗值；滴加待檢血樣免疫反應后， 用生理鹽水沖洗除去未結合在電極表面的紅細胞，在電極表面加入20jxl生理鹽 水，相同參數(shù)下檢測電極表面溶液的交流阻抗值。根據(jù)反應前后交流阻抗大小的 差值，判斷是否有紅細胞結合到電極表面。
結果如圖3所示。其中橫坐標表示交流阻抗檢測時的溶液電阻，縱坐標表示 交流阻抗檢測時的電容電阻。簡而言之，交流阻抗的大小可以根據(jù)阻抗弧度的大 小來直觀表示。結合本檢測結果，阻抗弧半徑小的表示紅細胞和相應的血型抗體 沒有發(fā)生免疫結合反應，弧半徑大的表示紅細胞和相應的血型抗體發(fā)生了免疫結 合反應。圖3中，曲線1為A型血液樣本與固定有抗B抗體的電極反應的檢測曲線；曲線2為B型血液樣本和固定有抗A抗體的電極反應的檢測曲線；曲線 3為A型血液樣本和固定有抗A抗體的電極反應的檢測曲線；曲線4為B型血 液樣本和固定有抗B抗體的電極反應的檢測曲線。通過多個樣品檢測，目前可 以判定溶液阻抗不大于250歐的即可以確定為沒有發(fā)生免疫結合反應。
溶液阻抗大于250歐則發(fā)生了免疫結合，反之則未發(fā)生免疫結合。和固定有 抗A抗體以及抗B抗體都發(fā)生結合的為AB型血；和抗A抗體以及抗B抗體都 未發(fā)生結合的為O型血；和抗A抗體發(fā)生結合但是和抗B抗體未結合的為A血 型；和抗A抗體未結合但是和抗B抗體結合的為B血型。
實施例2:本發(fā)明血型檢測方法的實際應用
三電極交流阻抗法檢測血型檢測系統(tǒng)適合街頭采血以及家庭ABO血型自檢 等。通過預先修飾的電極，達到對血型快速簡單的鑒定。該方法操作簡單快速， 不需要額外添加抗人球蛋白等試劑，全部檢測過程不超過10分鐘即可完成，而 且易于普及。我們使用傳統(tǒng)的血型檢測方法和本發(fā)明的電化學血型檢測方法，對 普通人群100例個體(獻血員)同時進行血型檢測。結果顯示，本方法的檢測結 果和與已知的血球凝集方法相比較，符合率達到100%。同時本發(fā)明的電化學檢 測方法避免了目前常用的臨床血型鑒定方法存在檢定時間長、手工勞動強度大， 以及結果受操作者主觀偏差影響較大和存在污染的可能等各種問題。
權利要求
1、一種利用電化學阻抗分析技術檢測人ABO血型的檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)是以化學交聯(lián)法在電極表面固定的紅細胞ABO血型抗體，與待檢紅細胞發(fā)生免疫結合反應，引起工作電極的交流阻抗的改變來達到對血型的鑒定，所說的檢測系統(tǒng)包括(1)檢測電極為絲網(wǎng)印刷的三電極，其中包括石墨工作電極、石墨對電極和銀/氯化銀參比電極，其中工作電極表面固定有ABO血型抗體；(2)交流阻抗分析裝置為能夠檢測由于紅細胞與其抗體的結合所導致的工作電極交流阻抗的變化，從而借以判斷紅細胞表面抗原的類型。
2、 根據(jù)權利要求1的系統(tǒng)，其中檢測電極被插入到檢測裝置前端的電極插槽內(nèi)。
3、 根據(jù)權利要求1的系統(tǒng)，其特征是利用化學交聯(lián)法在絲網(wǎng)印刷電極的工 作電極表面固定紅細胞ABO血型抗體。
4、 根據(jù)權利要求1的系統(tǒng)，其中所說的檢測裝置是交流阻抗分析裝置，利 用具有檢測交流阻抗功能的交流阻抗分析裝置檢測絲網(wǎng)印刷電極發(fā)生免疫結合反應前后的交流阻抗變化。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測人類血型的方法，特別是涉及使用電化學手段檢測人類ABO血型的方法及所使用的檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)由電極系統(tǒng)、電流阻抗檢測系統(tǒng)組成。將待測血樣滴加在預先修飾好的電極上后，根據(jù)血樣中紅細胞與固定在電極表面的血型抗體反應后所帶來的交流阻抗的改變達到對血型的判斷。本方法操作簡單，結果明了，可以有效避免操作者的主觀影響等。
文檔編號G01N33/80GK101470120SQ20071030536
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月28日 優(yōu)先權日2007年12月28日
發(fā)明者文 楊, 汪大明, 王保丹, 肖江群 申請人:英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司