專(zhuān)利名稱(chēng)：抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及用于檢測(cè)抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)的方法和(在一 些實(shí)施方案中)涉及不需要標(biāo)記細(xì)胞的以實(shí)時(shí)方式對(duì)ADCC進(jìn)行檢測(cè)的 方法。
背景技術(shù)：
ADCC是免疫應(yīng)答組成部分，其中IgG抗體結(jié)合到病原或致瘤靶細(xì) 胞表面的抗原上，標(biāo)識(shí)它們并通過(guò)NK效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行破壞。具有Fey 受體(FcyR)的效應(yīng)細(xì)胞識(shí)別結(jié)合到靶細(xì)胞的抗體的Fc區(qū)域并與之 結(jié)合。因此抗體給予了由效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞殺傷特異性，在兩種 細(xì)胞類(lèi)型之間形成一個(gè)橋梁并隨后釋放裂解顆粒。
一些治療性抗體通過(guò)增強(qiáng)ADCC來(lái)發(fā)揮其生物活性。例如， 一種用 于治療乳腺癌的人源化抗體Herc印tii^能通過(guò)結(jié)合癌細(xì)胞表面上的 HER-2抗原來(lái)增強(qiáng)ADCC。同樣， 一種用于治療非何杰金淋巴瘤 (non-Hodgkin's lymphoma)的嵌合抗體Rituxan。通過(guò)結(jié)合淋巴瘤細(xì) 胞表面上的CD20抗原來(lái)增強(qiáng)ADCC。
測(cè)定抗體是否誘導(dǎo)ADCC的技術(shù)通常涉及用放射性物質(zhì)(例如Cr51) 或熒光染料(例如Calcein AM)標(biāo)記靶細(xì)胞。被標(biāo)記的細(xì)胞與抗體和 效應(yīng)細(xì)胞(例如NK細(xì)胞或PBMC)孵育，并通過(guò)放射性或熒光的釋放 檢測(cè)通過(guò)ADCC進(jìn)行的乾細(xì)胞殺傷。在這種檢測(cè)中乾細(xì)胞的標(biāo)記需要使 貼壁細(xì)胞脫離來(lái)進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記后，用懸浮狀態(tài)的靶細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，
這對(duì)于貼壁細(xì)胞不是一種正常狀態(tài)。此外，通常只在將靶細(xì)胞與效應(yīng)
細(xì)胞和抗體混合數(shù)小時(shí)后的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)里測(cè)定ADCC介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷 的程度。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一種無(wú)標(biāo)記檢測(cè)，其中通過(guò)測(cè)定從裂解細(xì)胞的細(xì) 胞質(zhì)釋放到無(wú)細(xì)胞上清液中的乳酸脫氬酶(LDH)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞殺傷。但 是，LDH法不是一種實(shí)時(shí)的檢測(cè)，并且它不能將乾細(xì)胞的死亡和效應(yīng) 細(xì)胞的死亡區(qū)分開(kāi)，因?yàn)閮煞N類(lèi)型的細(xì)胞在溶胞中都將釋放LDH。
考慮到目前正在銷(xiāo)售的或正在開(kāi)發(fā)中的治療性抗體產(chǎn)品的數(shù)量， 存在著對(duì)能測(cè)定抗體ADCC活性的體外檢測(cè)方法的需求。尤其是，需要 一種高通量的、無(wú)標(biāo)記的ADCC檢測(cè)來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)ADCC，并且不需要讓 貼壁細(xì)胞脫離。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)?zhí)峁┝梭w外檢測(cè)ADCC的方法。方法是無(wú)標(biāo)記的或需要較低 水平標(biāo)記的，因此和需要標(biāo)記細(xì)胞的檢測(cè)相比更容易操作并且更安全。 在一些實(shí)施方案中，該方法還在貼壁細(xì)胞中進(jìn)行，而不是在懸浮細(xì)胞 中進(jìn)行。此外，該方法可以以實(shí)時(shí)方式進(jìn)行，能夠追蹤ADCC反應(yīng)的動(dòng) 力學(xué)，因此能夠比較不同抗體的ADCC動(dòng)力學(xué)。并且和標(biāo)準(zhǔn)ADCC檢測(cè) 相比此處提供的方法靈敏度更高，能夠檢測(cè)不同抗體ADCC動(dòng)力學(xué)的較 小的差別。此外，在一些實(shí)施方案中，此處所提供的方法的簡(jiǎn)單性意 味著比標(biāo)準(zhǔn)ADCC檢測(cè)更快速，并且具有為高通量篩選ADCC活性進(jìn)行 優(yōu)化的潛力。
此處提供的方法包括(a)監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的 非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極之間的阻抗；和(b)向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入效應(yīng)細(xì)胞 和結(jié)合乾細(xì)胞的一種抗體。加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后，基質(zhì)上的電極之 間的阻抗下降表明在檢測(cè)培養(yǎng)基中ADCC功能已經(jīng)生效。加入效應(yīng)細(xì)胞 和抗體后，基質(zhì)上的電極之間的阻抗增高或未改變，能夠表明在檢測(cè) 培養(yǎng)基中未發(fā)揮ADCC功能。
一方面，本申請(qǐng)描迷了 一種檢測(cè)抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)的方 法，包括(a)監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上
的電極之間的阻抗；和(b)向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入效應(yīng)細(xì)胞和結(jié)合乾細(xì)胞 的一種抗體；其中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后，基質(zhì)上的電極之間的阻抗 下降，表明在檢測(cè)培養(yǎng)基中ADCC功能已經(jīng)生效，而在加入效應(yīng)細(xì)胞和 抗體后，基質(zhì)上的電極之間的阻抗增高或未改變，能夠表明在檢測(cè)培 養(yǎng)基中未發(fā)揮ADCC功能。該方法包括在規(guī)則周期中檢測(cè)阻抗。包括從 每次阻抗測(cè)量中導(dǎo)出細(xì)胞指數(shù)(CI)并確定細(xì)胞指數(shù)是否發(fā)生變化， 其中使用下面的公式從每次阻抗測(cè)量中導(dǎo)出細(xì)胞指數(shù)，
其中Rb (f)和R ^胞(f)分別是在細(xì)胞存在或不存在情況下的頻率依 賴(lài)性電極電阻，N是阻抗檢測(cè)處的頻點(diǎn)(frequency points)數(shù)?？?以使用RT-CES頃系統(tǒng)進(jìn)行該方法?？梢悦?5分鐘檢測(cè)一次阻抗。
該方法可以進(jìn)一步鋪板靶細(xì)胞。在靶細(xì)胞鋪板18到24小時(shí)之后 加入抗體和效應(yīng)細(xì)胞。靶細(xì)胞在基質(zhì)上可以是單層。能以每孔2K到 100K的密度鋪板耙細(xì)胞(例如，每孔15K到25K之間，或大約每孔20K )。 效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的比例(E:T)可以是25:1。 E:T可以超過(guò)10:1、超 過(guò)50:1、或超過(guò)100:1。
可以以大約1和大約100 |Lig/ml之間、大約1和大約50 |Lig/ml 之間、或在大約2和大約8 Mg/ml之間的濃度加入抗體?？梢园ㄏ?檢測(cè)培養(yǎng)基中加入結(jié)合靶細(xì)胞的2種或2種以上的抗體，結(jié)合靶細(xì)胞 的3種或3種以上的抗體，或者結(jié)合靶細(xì)胞的的4種或4種以上的抗 體。抗體可以來(lái)自于自身免疫性疾病患者.
靶細(xì)胞可以表達(dá)頂端抗原。該方法可以包括才艮據(jù)頂端抗原表達(dá)篩 選把細(xì)胞的預(yù)先步驟。靶細(xì)胞可以是癌細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞。癌細(xì) 胞可以來(lái)自于一種細(xì)胞系，癌細(xì)胞可以是SKBR3細(xì)胞或MG63細(xì)胞。
效應(yīng)細(xì)胞可以包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、 單核細(xì)胞、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞或中性粒細(xì)胞。30.方法的步驟(b)可以 包括向粑細(xì)胞中加入已經(jīng)部分富集效應(yīng)細(xì)胞的全血。方法的步驟(b) 可以包括向效應(yīng)細(xì)胞中加入全血，其中所述全血包含效應(yīng)細(xì)胞。
在另 一方面，本申請(qǐng)描述了 一種根據(jù)誘導(dǎo)針對(duì)靶細(xì)胞的ADCC的能
力篩選候選抗體的方法，包括(a)監(jiān)測(cè)支持靼細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中 生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極之間的阻抗；和(b)向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入效 應(yīng)細(xì)胞和結(jié)合靶細(xì)胞的候選抗體；其中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后，基質(zhì) 上的電極之間的阻抗下降，表明了候選抗體具有影響針對(duì)乾細(xì)胞的 ADCC功能的能力，而在加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后，基質(zhì)上的電極之間的 阻抗增高或未改變，表明了候選抗體不具有影響針對(duì)乾細(xì)胞的ADCC 功能的能力。
在另一方面，本申請(qǐng)描述了一種鑒定適合接受候選抗體治療的、 患有和靶細(xì)胞相關(guān)疾病的病人的方法，該方法包括(a)監(jiān)測(cè)支持和 疾病相關(guān)的靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極之間的 阻抗；和(b)向把細(xì)胞中加入分離自患者的PBMC和候選抗體；和(c) 測(cè)定在加入PBMC和抗體后，基質(zhì)上的電極之間的阻抗是否存在變化， 其中基質(zhì)上的電極之間的阻抗下降，表明病人適合接受該抗體治療， 而在加入PBMC和抗體后，基質(zhì)上的電極之間的阻抗增加或沒(méi)有變化， 表明病人缺乏接受該抗體治療的適合性。
在另 一個(gè)方面，本申請(qǐng)描述了 一種根據(jù)調(diào)節(jié)ADCC的能力篩選候選 化合物的方法，包括(a)監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非 導(dǎo)電基質(zhì)上的電極之間的阻抗；和(b)在存在或不存在候選化合物的情 況下，向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入效應(yīng)細(xì)胞和一種抗體，其中所述抗體和靶 細(xì)胞結(jié)合；和(c)比較存在候選化合物時(shí)加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后基質(zhì)上
胞和抗體后基質(zhì)上的電極之i':i的阻抗出、現(xiàn)的任何變化，其中存在^選
化合物時(shí)阻抗的變化大于不存在候選化合物時(shí)阻抗的任何變化，表明 該候選化合物具有調(diào)節(jié)ADCC的能力。篩選的化合物能夠調(diào)節(jié)自身免疫 相關(guān)的ADCC。
本申請(qǐng)還描述了如此處所述的一種高通量檢測(cè)方法，其中非導(dǎo)電 基質(zhì)包含兩個(gè)或多個(gè)微量滴定孔(well)，每個(gè)孔包含至少兩個(gè)電極， 并監(jiān)測(cè)每個(gè)孔中的電極之間的阻抗。
在另一個(gè)方面，本申請(qǐng)描述了一種用于抗體的質(zhì)量控制檢測(cè)，包
括(a)監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極之 間的阻抗；和(b)向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體，其中所述抗體 和靶細(xì)胞結(jié)合；其中在加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后基質(zhì)上的電極之間的阻 抗下降，表明該抗體適合被釋放用于ADCC誘導(dǎo)，而在加入效應(yīng)細(xì)胞和 抗體后基質(zhì)上的電極之間的阻抗上升或不變，表明抗體不適合被釋放 用于ADCC誘導(dǎo)。
而在另一個(gè)方面，本申請(qǐng)描述了一種用于抗體的質(zhì)量控制檢測(cè)， 包括(a)監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極 之間的阻抗；和(b)向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體，其中所述抗 體和靶細(xì)胞結(jié)合；和(c)比較加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后基質(zhì)上的電極之 間的阻抗出現(xiàn)的任何變化和加入效應(yīng)細(xì)胞和對(duì)照抗體后對(duì)照樣品的阻 抗的任何變化；其中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后基質(zhì)上的電極之間的阻抗 的下降大于加入效應(yīng)細(xì)胞和對(duì)照抗體后對(duì)照樣品的阻抗的下降，表明 抗體適合被釋放用于ADCC誘導(dǎo)，而其中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后基質(zhì)上 的電極之間的阻抗的下降不大于加入效應(yīng)細(xì)胞和對(duì)照抗體后對(duì)照樣品 的阻抗的下降，表明抗體不適合被釋放用于ADCC誘導(dǎo)。在質(zhì)量控制檢 測(cè)中，在加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后阻抗的下降比加入效應(yīng)細(xì)胞和對(duì)照抗 體后對(duì)照樣品的阻抗的下降至少大25°yi，表明該抗體適合被釋放用于
ADCC誘導(dǎo)。
本申請(qǐng)還描述了一種篩選用于治療自身免疫病的候選化合物的方 法，包括(a)監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的 電極之間的阻抗，其中所述靶細(xì)胞是健康的細(xì)胞；(b)在存在或不存在 候選化合物的情況下向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體，其中所述 抗體和耙細(xì)胞結(jié)合，并且其中效應(yīng)細(xì)胞是來(lái)自于被診斷有自身免疫病 的受試者的PBMC;和(c)比較存在候選化合物時(shí)阻抗的任何變化與不 存在候選化合物時(shí)阻抗的任何變化，其中不存在候選化合物時(shí)阻抗的 下降大于存在候選化合物時(shí)阻抗的任何下降，表明該候選化合物適合 作為治療自身免疫疾病的試劑，而其中不存在候選化合物時(shí)阻抗的下 降不大于存在候選化合物時(shí)阻抗的任何下降，表明該候選化合物不適
合作為治療自身免疫疾病的試劑，
在另一個(gè)方面，本申請(qǐng)描述了確定候選抗體是否適合治療患有自
身免疫疾病的接受者的方法，包括(a)監(jiān)測(cè)支持和自身免疫疾病相 關(guān)的靶細(xì)胞生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極之間的阻抗；和(b)向把細(xì)胞中 加入候選抗體和分離自接受者的PBMC;和(c)測(cè)定在加入PBMC和候選 抗體后基質(zhì)上的電極之間的阻抗是否改變，其中電極間的阻抗下降， 表明抗體適合用于治療接受者，而其中電極間的阻抗不下降，表明抗 體不適合用于治療接受者。
在另一個(gè)方面，本申請(qǐng)描述了一種確定誘導(dǎo)ADCC響應(yīng)的抗體的最 適濃度的方法，包括(a)監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞的兩種或兩種以上樣品在檢 測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極之間的阻抗；和(b)向靶細(xì)胞的 兩種或兩種以上樣品中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體，其中所述抗體和靶細(xì)胞 結(jié)合，并且其中向靶細(xì)胞的兩種或兩種以上樣品中加入不同濃度的抗 體；其中在加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后基質(zhì)上的電極間的阻抗下降，表明 在檢測(cè)培養(yǎng)基中ADCC功能受到影響，并測(cè)定導(dǎo)致阻抗最大下降的抗體 濃度，作為最適濃度。
在另一方面，本申請(qǐng)描述了一種測(cè)定抗體是否結(jié)合靶細(xì)胞上的頂 端抗原的方法，包括(a)監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo) 電基質(zhì)上的電極之間的阻抗；和(b)向耙細(xì)胞中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體； 其中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后基質(zhì)上的電極間的阻抗下降，表明抗體結(jié) 合耙細(xì)胞上的頂端抗原。
除非另外定義，此處所用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有和這個(gè)發(fā) 明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的正常理解相同的含義。雖然可以使用和 此處描述相似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧蟻?lái)實(shí)踐發(fā)明，但是下面描述了合適 的方法與材料。此處提到的所有的出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和其它參 考都被完整引用作為參考。在矛盾的情況下，以本說(shuō)明書(shū)、包括定義 為準(zhǔn)。此外，所述的材料。方法和實(shí)施例僅僅是例示性的不用于限定。
在下面的附圖和說(shuō)明中對(duì)發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)進(jìn)行 了闡明。本發(fā)明的其他特征、對(duì)象和優(yōu)點(diǎn)在說(shuō)明書(shū)和附圖以及權(quán)利要
求中是很顯然的。 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明


圖1，描繪了如所示以40K、 20K、 IOK或5K每孔的2倍系列稀釋 鋪板的SKBR3細(xì)胞的細(xì)胞指數(shù)(Cell Index)對(duì)時(shí)間的曲線(xiàn)。
圖2描繪了鋪板的SKB R3細(xì)胞的細(xì)胞指數(shù)對(duì)時(shí)間的曲線(xiàn)，所述 細(xì)胞在20小時(shí)后被加入的新鮮培養(yǎng)基("單獨(dú)細(xì)胞，，)、或Triton X-100 ("細(xì)胞+Triton")處理來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
圖3描繪了鋪板的SKBR3細(xì)胞的細(xì)胞指數(shù)對(duì)時(shí)間的曲線(xiàn)，所述細(xì) 胞在20小時(shí)后被新鮮培養(yǎng)基("單獨(dú)的靶")、曲妥珠單抗("靶+ 曲妥珠單抗，，)、或IgG對(duì)照抗體("靶+IgG")所處理。
圖4描繪了單獨(dú)的SKBR3細(xì)胞("靶")或PBMC("效應(yīng)物") 的細(xì)胞指數(shù)對(duì)時(shí)間的曲線(xiàn)。
圖5描繪了單獨(dú)的SKBR3細(xì)胞、單獨(dú)的PBMC或在20小時(shí)后被PMBC 處理的SKBR3細(xì)胞的細(xì)胞指數(shù)對(duì)時(shí)間的曲線(xiàn)。
圖6描繪了單獨(dú)的SKBR3細(xì)胞、20小時(shí)后被PBMC處理的SKBR3 細(xì)胞、或20小時(shí)后被PBMC和Herceptin'處理的SKBR3細(xì)胞的細(xì)胞指 數(shù)對(duì)時(shí)間的曲線(xiàn)。
圖7描繪了 SKBR3靶細(xì)胞(T)被PBMC效應(yīng)物(E)裂解的時(shí)間曲 線(xiàn)，如所示E: T比例為50: 1或12. 5: l，帶有和不帶有Herceptin*mAB。
圖8A描繪了使用此處描述的方法測(cè)定的，被單獨(dú)的PBMC處理的 SKBR3粑細(xì)胞、被PBMC加標(biāo)明濃度的Herceptii^處理的SKBR3靶細(xì)胞、 或被PBMC加對(duì)照IgG處理的SKBR3乾細(xì)胞的裂解百分比曲線(xiàn)。
圖8B描繪了使用標(biāo)準(zhǔn)Calcein-AM檢測(cè)測(cè)定的，被單獨(dú)的PBMC 處理的SKBR3耙細(xì)胞、被PBMC加標(biāo)明濃度的HercepUn"處理的SKBR3 靶細(xì)胞、或被PBMC加對(duì)照IgG處理的SKBR3靶細(xì)胞的裂解百分比曲線(xiàn)。
圖9描繪了 SKBR3和MG63細(xì)胞的細(xì)胞指數(shù)對(duì)時(shí)間的曲線(xiàn)。
圖1 OA描繪了在18-20小時(shí)被單獨(dú)的PBMC、PBMC和RX1靶特異性 抗體、或PMBC和IgG對(duì)照抗體處理的MG63細(xì)胞的細(xì)胞指數(shù)對(duì)時(shí)間的曲線(xiàn)。
圖10B描繪了在18-20小時(shí)被單獨(dú)的PBMC、 PBMC和Herceptin* 靶特異性抗體、或PMBC和IgG對(duì)照抗體處理的SKBR3細(xì)胞的細(xì)胞指數(shù) 對(duì)時(shí)間的曲線(xiàn)。
發(fā)明詳述
本申請(qǐng)?zhí)峁┝送ㄟ^(guò)測(cè)量電極之間的阻抗來(lái)檢測(cè)ADCC的材料和方 法，所述電極位于其上鋪有細(xì)胞的表面上?？梢允褂萌魏魏线m的檢測(cè) 阻抗設(shè)備。在一些實(shí)施方案中，可以使用具有非導(dǎo)電基質(zhì)的、其上定 位有眾多電極陣列的、所述陣列與阻抗分析器相連接的設(shè)備來(lái)檢測(cè) ADCC,例如，可以使用在下腔基質(zhì)上定位有電極陣列的設(shè)備檢測(cè)ADCC， 利用膜將下腔和上腔分割開(kāi)。還可以使用這種設(shè)備檢測(cè)細(xì)胞從上腔向 下腔的遷移，通過(guò)下腔中的陣列中的電極之間的阻抗的增加來(lái)檢測(cè)出 對(duì)下腔基質(zhì)的粘附。這種設(shè)備已經(jīng)被公開(kāi)，例如在專(zhuān)利WO2004/010103 和W02004/010102中。
這種設(shè)備還能用于評(píng)價(jià)化合物對(duì)其中的細(xì)胞的細(xì)胞毒性。例如， 可以將化合物加入到正在含有電極的基質(zhì)上生長(zhǎng)的細(xì)胞中，可以監(jiān)測(cè) 化合物對(duì)電極之間的阻抗的影響，其中電極之間阻抗的下降表明細(xì)胞 死亡。參見(jiàn)，例如，W02005/77104和W02005/047482。并參見(jiàn)美國(guó)>^ 開(kāi)號(hào)2005/0112544 (U.S. Publication No. 2005/0112544 )，其公 開(kāi)的方法包括通過(guò)檢測(cè)阻抗來(lái)評(píng)價(jià)它莫西芬(Tamox i f en)誘導(dǎo)的細(xì)胞 毒性。
上面的參考都沒(méi)有公開(kāi)使用其公開(kāi)的設(shè)備評(píng)價(jià)ADCC。和簡(jiǎn)單的涉 及向乾細(xì)胞中加入候選化合物的常規(guī)細(xì)胞毒檢測(cè)不同，ADCC涉及加入 (a)—種結(jié)合乾細(xì)胞的抗體，和(b)結(jié)合該抗體的效應(yīng)細(xì)胞。不要期望 阻抗檢測(cè)提供ADCC檢測(cè)中靶細(xì)胞數(shù)量的準(zhǔn)確指征，因?yàn)轭A(yù)期把細(xì)胞、 效應(yīng)細(xì)胞和抗體都將粘附到基質(zhì)上。因此，高阻抗讀數(shù)有可能歸因于
i) 粘附到基質(zhì)上的靶細(xì)胞，因?yàn)榭贵w和效應(yīng)細(xì)胞沒(méi)有誘導(dǎo)ADCC;或者
ii) 通過(guò)ADCC殺死耙細(xì)胞后粘附到基質(zhì)上的效應(yīng)細(xì)胞和抗體。因此不 能期望例如上面公開(kāi)的那些設(shè)備能用于ADCC檢測(cè)。
但是令人驚訝的是，發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)例如在W02005/77104和 W02005/047482中公開(kāi)的設(shè)備能被用于ADCC檢測(cè)。尤其是，發(fā)明者已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)，效應(yīng)細(xì)胞沒(méi)有明顯的粘附到含電極的基質(zhì)上，并且在合適的 靶細(xì)胞數(shù)量、效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞(E: T)的比例以及抗體濃度下，基質(zhì)上 的電極間的阻抗變化能提供靶細(xì)胞數(shù)量的準(zhǔn)確指征。
通過(guò)檢測(cè)其上生長(zhǎng)有靶細(xì)胞的基質(zhì)中的電極之間的阻抗的變化來(lái) 檢測(cè)ADCC具有一些明顯優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)ADCC檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。和多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)ADCC 檢測(cè)不同，在一些實(shí)施方案中此處提供的方法是無(wú)標(biāo)記的。在一些實(shí) 施方案中，該方法不涉及用放射性或其它標(biāo)記物標(biāo)記細(xì)胞，使得該檢 測(cè)較需要標(biāo)記細(xì)胞的檢測(cè)更加容易并且更加安全。此外，如上面討論 的，在標(biāo)準(zhǔn)ADCC檢測(cè)中要讓粘附細(xì)胞從其生長(zhǎng)表面上脫離，使其能夠 被標(biāo)記，并且ADCC檢測(cè)在懸浮液中進(jìn)行。因?yàn)榇颂幪峁┑姆椒ㄊ菬o(wú)標(biāo) 記的，不需要使細(xì)胞脫離，因此去除了潛在的因粘附細(xì)胞的干擾導(dǎo)致 的誤差來(lái)源。相反，ADCC檢測(cè)在粘附在基質(zhì)上的細(xì)胞中進(jìn)行。
此外，和多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)ADCC檢測(cè)不同，在一些實(shí)施方案中此處提供的 方法能夠通過(guò)在加入抗體和效應(yīng)細(xì)胞后的不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)阻抗來(lái)實(shí)時(shí) 跟蹤細(xì)胞數(shù)量。因此，此處提供的方法能跟蹤ADCC反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，因此 能比較不同抗體的ADCC動(dòng)力學(xué)。在一些實(shí)施方案中，該方法比標(biāo)準(zhǔn) ADCC檢測(cè)更靈敏，能檢測(cè)出不同抗體的ADCC動(dòng)力學(xué)的較小差別。此 外，此處提供的方法的簡(jiǎn)單性意味著比標(biāo)準(zhǔn)ADCC檢測(cè)快很多，并且具 有為ADCC活性高通量篩選進(jìn)行優(yōu)化的潛力。
可以4吏用在W02004/010102、 W02004/010103、 WO2005/077104或 W02005/047482中描述的設(shè)備或基于這些設(shè)計(jì)的設(shè)備來(lái)實(shí)施此處提供 的方法。在一些實(shí)施方案中，可以4吏用ACEABiosciences (SanDiego， CA)生產(chǎn)的RT-CES"系統(tǒng)實(shí)施此處提供的方法。RT-CES'系統(tǒng)包括三個(gè)組 件 一個(gè)電子傳感器分析器， 一個(gè)設(shè)備站和一個(gè)16孔的微量滴定板。 閱讀者將能理解，這個(gè)系統(tǒng)的微小車(chē)間變異將屬于儀器接收技術(shù)人員 的范圍之內(nèi)。例如，該設(shè)備可以裝備有96孔微量滴定板或256孔微量 滴定板，而不是16孔微量滴定板，使其能同時(shí)進(jìn)行更多檢測(cè)。
可以使用光刻微加工法在玻璃片上構(gòu)建微電極傳感器陣列，并且 可以將含有電極的玻片組裝到塑料托板上形成含電極的孔。
設(shè)備站可以接收微量滴定板(例如，16孔、256孔或96孔微量滴 定板)，并能夠向傳感器分析器電子地開(kāi)關(guān)任意一個(gè)孔來(lái)進(jìn)行阻抗檢 測(cè)。在操作中，帶有細(xì)胞(在孔中培養(yǎng)的)的設(shè)備可以連接到設(shè)備站 上并放置于保溫箱中。電纜可以將設(shè)備站連接到傳感器分析器上。使 用RT-CES'軟件控制，傳感器分析器能夠自動(dòng)選擇待檢測(cè)的孔，并能持 續(xù)地指導(dǎo)阻抗的檢測(cè)。來(lái)自于分析器的阻抗數(shù)據(jù)能被傳送到計(jì)算機(jī)中， 被分析，并被集成軟件處理。
在單個(gè)孔中的電極之間檢測(cè)的阻抗很典型地依賴(lài)于電極幾何、孔 中地離子濃度和是否有細(xì)胞粘附到電極上。在沒(méi)有細(xì)胞時(shí)，電極阻抗 主要由電極/溶液界面處和總體容液中的離子環(huán)境所決定。在存在細(xì)胞 時(shí)，粘附到電極傳感器表面上的細(xì)胞能夠改變電極/溶液界面處的局部 離子環(huán)境，導(dǎo)致阻抗上升。電極上的細(xì)胞越多，細(xì)胞-電極阻抗增加 的越多。
為了根據(jù)檢測(cè)的細(xì)胞-電極阻抗對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量，根據(jù)如下公式 推導(dǎo)參數(shù)"細(xì)胞指數(shù)(CI)":
其中Rb(f)(第12頁(yè)，函數(shù))是無(wú)細(xì)胞時(shí)的頻率依賴(lài)的電極電阻 (阻抗的一個(gè)組成部分)，IU胞(f)是有細(xì)胞時(shí)的頻率依賴(lài)的電極電阻， N是檢領(lǐng)'J阻抗時(shí)的頻點(diǎn)(frequency points)數(shù)。
因此，細(xì)胞指數(shù)是對(duì)含電極孔中細(xì)胞的定量檢測(cè)。在相同的生理 條件下，更多細(xì)胞粘附到電極上導(dǎo)致更大的^Uw^V值，導(dǎo)致更大的細(xì) 胞指數(shù)值。
此處提供的方法可以包括在有規(guī)則的間隔中檢測(cè)阻抗并根據(jù)上面 給出的公式從這些阻抗測(cè)量中推導(dǎo)出細(xì)胞指數(shù)，因此能夠跟蹤ADCC 反應(yīng)。阻抗檢測(cè)所采用的間隔可以依賴(lài)于期望在多近程度上跟蹤反應(yīng) 動(dòng)力學(xué)。例如，如果期望跟蹤一種已知能誘導(dǎo)ADCC的抗體的ADCC動(dòng) 力學(xué)，可以?xún)?yōu)選短間隔，而如果進(jìn)行檢測(cè)的主要目的只是確定一種給
定的抗體是否能夠誘導(dǎo)ADCC，較長(zhǎng)的間隔有可能是令人滿(mǎn)意的。該方 法可以包括在例如每30分鐘、每15分鐘、每10分鐘、每9、 8、 7、 6、 5、 4、 3或2分鐘、每l分鐘或比每分鐘更頻繁的時(shí)間點(diǎn)中進(jìn)行阻 抗的檢測(cè)。
此處描述的方法可以進(jìn)一步包括在加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體之前將把 細(xì)胞鋪板到基質(zhì)上。例如，可以將靶細(xì)胞鋪板到基質(zhì)上并使其生長(zhǎng)一 段時(shí)間，再加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體。在加入抗體和效應(yīng)細(xì)胞前鋪板乾細(xì) 胞能使靶細(xì)胞粘附到基質(zhì)上并生長(zhǎng)，導(dǎo)致阻抗上升，可以有利于檢測(cè) 加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后出現(xiàn)的阻抗下降。但是，典型的，不應(yīng)該使把 細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)，因?yàn)?，粘附到基質(zhì)上的靶細(xì)胞有可能因?yàn)槠渖嫌屑?xì)胞 生長(zhǎng)而無(wú)法接觸抗體。在這種情況下，不可能檢測(cè)ADCC。技術(shù)人員完
最優(yōu)時(shí)間長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，可以在加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體之前 的10-30小時(shí)在基質(zhì)上鋪板乾細(xì)胞。例如，可以在加入效應(yīng)細(xì)胞和抗 體之前的18-24小時(shí)(例如，19-21小時(shí))在基質(zhì)上鋪板靶細(xì)胞。
乾細(xì)胞鋪板密度依賴(lài)于細(xì)胞大小及其生長(zhǎng)率。檢測(cè)系統(tǒng)典型地具 有最大極限，高于它就不能檢測(cè)細(xì)胞的進(jìn)一步的生長(zhǎng)。因此應(yīng)該以低 于該極限的密度鋪板靶細(xì)胞，使因細(xì)胞死亡導(dǎo)致的阻抗變化能夠被檢 測(cè)到。但是，還應(yīng)該以足夠高的密度鋪板靶細(xì)胞，使細(xì)胞在生長(zhǎng)初始 階段就對(duì)阻抗有影響，這樣在加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后阻抗出現(xiàn)的任何 下降就都能被檢測(cè)到。在一些實(shí)施方案中，可以在19. 6 mm2標(biāo)準(zhǔn)孔中 以2K和IOOK的密度鋪板靶細(xì)胞(例如，在19.6咖2標(biāo)準(zhǔn)孔中以10K 和60K之間的密度，在19. 6 mm'標(biāo)準(zhǔn)孔中以15K和25K之間的密度， 或在19. 6 mi^標(biāo)準(zhǔn)孔中以20K的密度)。
進(jìn)行阻斷測(cè)量的時(shí)間長(zhǎng)度，即，檢測(cè)長(zhǎng)度，可以根據(jù)靶細(xì)胞鋪板 和加入效應(yīng)細(xì)胞與抗體之間的時(shí)間而變化。通常能在加入抗體和效應(yīng) 細(xì)胞后的幾個(gè)小時(shí)中檢測(cè)到因ADCC出現(xiàn)的阻抗減小。但是在一些情況 下，希望在ADCC導(dǎo)致的細(xì)胞殺傷出現(xiàn)后繼續(xù)檢測(cè)阻抗一段時(shí)間，來(lái)測(cè) 定細(xì)胞死亡程度，來(lái)確定任何是否有任何細(xì)胞發(fā)生了再生長(zhǎng)以及何時(shí)
發(fā)生的。因此此處提供的方法可以包括在鋪板把細(xì)胞后進(jìn)行無(wú)限制的
24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、100小時(shí)、200小時(shí)或超過(guò)200 小時(shí)的阻抗檢測(cè)。
此處提供的方法可以使用如上述提供的任何數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞和任 何數(shù)量的靶細(xì)胞，靶細(xì)胞的數(shù)量不能太高以至于妨礙了 ADCC的準(zhǔn)確檢 測(cè)。該方法可以使用比把細(xì)胞更多的效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞對(duì)乾細(xì)胞的 比例(E: T)可以，例如，超過(guò)10:1、超過(guò)20:1、超過(guò)50:1、超過(guò)100: 1或大約為25:1。
可以以任何濃度將抗體加入到把細(xì)胞中。例如，加入抗體的濃度 可以是，例如，大約1到大約1000 pg/ml之間、大約l到大約500 p g/ml之間、大約1到大約100 pig/ml之間、大約l到大約75 p g/ml 之間、大約1到大約50 yg/ml之間、大約1到大約25 ing/ml之間、 大約I到大約IO jig/ml之間、大約2到大約8 jag/ml之間、大約4 到大約6 jig/ml之間。
在一些實(shí)施方案中，可以使用此處描述的方法，通過(guò)比較使用不 同的抗體濃度所獲得的ADCC響應(yīng)，測(cè)定誘導(dǎo)ADCC響應(yīng)的抗體最適濃 度。例如，方法可以包括(a)檢測(cè)支持兩種或兩種以上(例如，2、 3、 4、 5或超過(guò)5種)靶細(xì)胞樣品在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的 電極之間的阻抗；和(b)向兩種或兩種以上靶細(xì)胞樣品中加入效應(yīng)細(xì)胞 和抗體，其中抗體結(jié)合靶細(xì)胞，并且其中以不同濃度將抗體加入到兩 種或兩種以上靶細(xì)胞樣品中；其中在加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后基質(zhì)上的 電極間的阻抗下降，表明在檢測(cè)培養(yǎng)基中ADCC功能得到發(fā)揮，并測(cè)定 導(dǎo)致阻抗最大下降的抗體濃度，作為最適濃度。
可以將效應(yīng)細(xì)胞和抗體同時(shí)或分別加入到靶細(xì)胞培養(yǎng)基中。例如， 可以在抗體之前將效應(yīng)細(xì)胞加入到培養(yǎng)基中，或者在效應(yīng)細(xì)胞之前加 入抗體。此處描述的方法可以使用靶細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞和抗體的任意組 合，并且在方法中對(duì)把細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞和抗體進(jìn)行的選擇可以依賴(lài)于 檢測(cè)的目的。在下面討論了適合在此處提供的方法中使用的靶細(xì)胞、 效應(yīng)細(xì)胞和抗體的范例，以及使用這些靶細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞和抗體的檢
測(cè)的可能應(yīng)用。
在一些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞適粘附細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，把 細(xì)胞表達(dá)頂端抗原。許多細(xì)胞是極化的，并且在其頂端和基底外側(cè)表
面表達(dá)不同的抗原(Nelson等人(2003) Nature 422:766-774)。例 如，上皮細(xì)胞表達(dá)不同的頂端和基底外側(cè)抗原。當(dāng)在懸浮液中進(jìn)行標(biāo) 準(zhǔn)ADCC檢測(cè)時(shí)，抗體可以結(jié)合到頂端和基底外側(cè)抗原上。但是在此處 提供的方法中，細(xì)胞粘附在基質(zhì)上，抗體只能結(jié)合到頂端抗原上。因 此抗體誘導(dǎo)ADCC的能力表明了抗體能結(jié)合靶細(xì)胞上的頂端抗原。因此
:原。例如，方法可以包括:'(a)監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng) 的非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極之間的阻抗；和(b)向靶細(xì)胞中加入效應(yīng)細(xì)胞 和抗體；其中在加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后基質(zhì)上的電極間的阻抗下降， 表明抗體結(jié)合到耙細(xì)胞的頂端抗原上。 一些治療性抗體在體內(nèi)只能接 近頂端抗原。例如， 一些抗體只能接近并結(jié)合到腫瘤表面表達(dá)的頂端 抗原上。因此，抗體通過(guò)結(jié)合頂端抗原誘導(dǎo)ADCC的能力提示著該抗體 在體內(nèi)具有治療效果。
此處提供的方法可以包括篩選表達(dá)頂端抗原的靶細(xì)胞預(yù)步驟。這 個(gè)預(yù)步驟可以使用，例如，RT-PCR或FACS來(lái)鑒別出表達(dá)頂端抗原的、 適用于此處提供的方法的靶細(xì)胞。
可以使用任何合適的耙細(xì)胞。表達(dá)頂端抗原的細(xì)胞的例子包括(不 限于)，腫瘤細(xì)胞和上皮細(xì)胞，例如本領(lǐng)域已知的那些。例如，糖蛋 白(例如DF3抗原和MUC1 )在上皮細(xì)胞的表面表達(dá)，并且在上皮腫瘤 的頂端表面過(guò)量表達(dá)(Snijdewint等人 (2001) Int. J. Cancer 93: 97- 106;和Hayes等人(1990) J. Immunol. 145: 962- 970)。
此外，許多種腫瘤細(xì)胞在其頂端表面表達(dá)對(duì)葉酸具有高親和力的細(xì)胞 表面受體(Lu 等人(2002) Cancer Immunol. Immunother.
51 :153-162)。
把細(xì)胞可以是疾病細(xì)胞，例如，癌細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞。這些 靶細(xì)胞可以是來(lái)自于細(xì)胞系庫(kù)的細(xì)胞系。此外，細(xì)胞可以獲自于患有
疾病或紊亂的個(gè)體。例如，靶細(xì)胞可以來(lái)自于癌癥患者的腫瘤活組織 取樣。
可以被用作靶細(xì)胞的癌細(xì)胞包括，但不限于，何杰金氏病相關(guān)細(xì)
胞、非何杰金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤、惡性淋巴瘤、淋巴肉瘤 非白血性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髄瘤、慢性髄細(xì) 胞樣白血病、慢性骨髄單核細(xì)胞性白血病、骨髄增生異常綜合征、骨 髄增生病、嗜酸細(xì)胞過(guò)多綜合征、嗜酸細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髄瘤、 伴X染色體的淋巴增生性障礙、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、 胰腺癌和膽嚢癌、腎上腺皮質(zhì)癌、產(chǎn)生ACTH的腫瘤、膀胱癌、腦癌(例 如、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤)、尤因氏肉瘤、頭頸癌(例如、口腔 癌和喉癌)、腎癌(例如、腎細(xì)胞癌)、肝癌、肺癌(例如、小和非小細(xì) 胞肺癌)、惡性腹水、惡性胂瘤性胸腔積液、皮狀癌(例如、惡性黑色 素瘤、人皮膚角質(zhì)化細(xì)胞的進(jìn)行性腫瘤、上皮細(xì)胞癌、鱗狀上皮細(xì)胞 癌、基底細(xì)胞癌)、間皮瘤、卡波濟(jì)氏肉瘤、骨癌(例如、骨瘤和肉瘤 例如纖維肉瘤和骨肉瘤)、女性生殖道癌(例如、子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、 卵巢癌、和子宮頸癌)、乳腺癌、前列腺癌、視網(wǎng)膜成神經(jīng)細(xì)胞瘤、睪 丸癌和甲狀腺癌。
可以被用作靶細(xì)胞的癌細(xì)胞系可以是獲得的永生粘附細(xì)胞系，例 如，來(lái)自于細(xì)胞庫(kù)。合適的粘附永生細(xì)胞系的范例包括，但不限于 SKBR3、 MG63、 CCD- 1070Sk、 hTERT-HMEl [ ME16C ]、 BJ、 ATRFL0X [Mutatect〗、KEL FIB、 HT-1197、 LL 97A (AlMy) 、 NCI-H510A [H510A; NCI-H510]、 HT-29、 SW756、 293、 IMR-90 [IMR90]、 HIAE-55 [Wistar Special Collection的部分]、SW1417 [SW-1417] 、 Hs 737. T、 NCI-H661 [H661]、 CCD 841 CoN、 Hs 792(C).M、 Per Sel、 NCI-H810 [H810]、 Pane 05.04、 ZR-75-30、 T-47D、 WISH、 HBE135-E6E7、 ARPE-19/HPV-16、 10.014 pRSV-T、 GH354、 MDA-MB-436、 T98G [T98-G]、 Calu-6、 BEAS-2B、 G-292 、克隆A141B1 、 Detroit 539 、 MNNG/H0S Cl #5 [R-1059-D]、 BT-549、 NCI-H1915 [H1915]、 Hs 181.Sk、 Hs 839, T、 RD、 SK-N—MC、 20B8、 NCI-H292 [H292] 、 Hs 863. T、 Hs 181.Tes、 Malme- 3M、 Hs 617. Mg、 JAR、 Hs 144. We、 Hs 742. Sk、 Hs 875. T、 TE 161. T、 Hs 738.St/Int、 Hs 895.T、 RWPE-1、 TE 130.T、 TE 84.T、 HCC1008、 Hs 894 (E)Lu、 SK-LMS-1、 HFF-1、 MRC-5 [MRC5] 、 IRR-MRC-5 [ATCC X-55; ATCCX55;受輻照的MRC-5]、 WI-38 [WI 38] 、 HeLa、 HEKOOl、 FHs 74 Int、 Detroit 548、 Detroit 573、 SW-13、 293T/17、 C211、 Amdur II、 IMR-32、 HeLa [Chang Liver] 、 CHP 3 (M. W.) 、 CHP 4、 LL 47 (MaDo)、 HEL 299、 Detroit 562、 CCD-llLu、 KB、 A549 [A-549] 、 MDA-MB-134-VI、 HLF-a、 TE 354. T、 HeLa 229、 HeLa S3、 COLO 320DM、克隆l-5c-4 [Chang 結(jié)膜的Wong-Kilbourne衍生物(D)]、 CCD-13Lu、 CCD-8Lu、 CCD-19Lu、 CCD-16Lu、 AV3、 Hs888Lu、 CCD-25Lu、 C0L0 320HSR [C0L0 320 HSR]、 DLD-1、 C0L0 205、 C0L0 201、 HCT-15、 SW837 [SW-837]、 LoVo、 SW48 [SW-48]、 SW1463 [SW 1463; SW-1463] 、 SW 1353 [SW 1353; SW-1353]、 1205U [Wistar Special Collection的部分]、HCT-8 [HRT-18] 、 AGS、 HCT 116、 T84、 SNU-C2B、 SNU-C2A、 NCI-H716 [H716] 、 NCI-H747 [H747]、 NCI-H498 [H498]、 LS123、 NCI-H1688 [H1688]、 CFPAC-l、 L-132、 TE 353. Sk、腸407、 FL、 Detroit 525、 Detroit 510、 C32、 WI-38 VA—13 subline 2RA [Wistar Special Collection的部分]、瓜氨酸血癥、 Cri du Chat、 WI-26 VA4 [Wistar Special Collection的部分]、BeWo、 WM35 [Wistar Special Collection的部分]、MST0-211H、 WRL 68、 NCI-H295 [H295]、 MCF 10A、 MCF 10F、 RWPE2-W99、 SV-HUC-l、 HCC202、 C3A [HepG2/C3A; Hep G2 (ATCC HB-8065)的衍生物]、MCF-10-2A、 293 c18、 F. thy 62891、 Lei Cap、 Sal Mat、 HCE-2 [50.B1]、 A2058、 RWPE-2、 Am Ric、 Lo Ren、 Ron Har、 H69AR、 hF0B 1.19、 Mar Vin、 SCC-4、 Be Sal、 Hs27、 B-3、 U Vin、 Ma San、 El Don、 SK-N-AS、 NCI-H1734 [H-1734; H1734 ]、 LNZTA3WT4 [LNZTA3p53WT4; WT4 ]、 LNZTA3WT11 [LNZTA3p53WTl1; WTll]、 Lo Wen、 NCI-H2227 [H2227]、 COLO 829、 HKB-ll、 CeAr、 90.74、 HRT-18G、 BeAr、 EmAr、 WinMec、 Ce Geg、 T0V-21G、 T0V-112D、 0V-90、 Ja Bos、 Fe Bos、 La Bel、 Bo Gin、 HS-5、 Le Ana、 Mel Neg、 LaBelII、 HEPG2/2. 2.1、 ProPakA. 6 [PPA.6 ; ProPak-A, 6]、 LNCaP克隆FGC [LNCaP. FGC] 、 HCN-1A、 HX [HT1080 xeno]、 HP [HT1080 poly]、 2A、 Ne Loc、 Jay Sen、 Bi Fin、 和Ray Hot。
可以用作靶細(xì)胞的病毒感染細(xì)胞包括，例如，被EB病毒、人類(lèi)免 疫缺陷病毒、流感病毒、脊髄灰質(zhì)炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎 病毒、丙型肝炎病毒、水痘-帶狀皰滲病毒、風(fēng)滲病毒、麻滲病毒、單 純皰滲病毒、登革熱病毒、乳頭狀瘤病毒、呼吸道合胞病毒或狂犬病 病毒感染的細(xì)胞。
在此處提供的方法中使用的靶細(xì)胞還可以是健康的細(xì)胞。在自身 免疫疾病患者中ADCC有可能涉及殺傷健康細(xì)胞，所述自身免疫疾病包 括自身免疫的甲狀腺疾病、重癥肌無(wú)力、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅 斑狼瘡、免疫溶血性貧血(盤(pán)尼西林誘導(dǎo)的)、自身免疫性肝炎 (AIH)、格雷夫斯氏眼病、HIV[CD4缺失]、自身免疫性腸病、腹部疾 病、重癥肌無(wú)力(MG)、貝切特(氏)病、甲狀腺關(guān)聯(lián)的眼病、自身免疫 性曱狀腺炎、病毒性心肌炎、自身免疫性心臟病、炎性腸病、潰瘍性 結(jié)腸炎、南美洲錐蟲(chóng)病、白斑病、克隆(氏)病、特發(fā)性血小板減少性 紫癜、自身免疫性中性粒細(xì)胞減少癥、兒童期癲癇、川畸病(Kawasaki disease)、自身免疫性慢性活動(dòng)性肝炎、糖尿病、多發(fā)性硬化癥、抗 腎小球基底膜(GBM)腎炎、慢性活動(dòng)性肝病(CALD)、腎小球腎炎(從 免疫復(fù)合物)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、無(wú)解釋的男性不育癥， 和移植排斥。因此，在此處提供的方法中使用健康細(xì)胞作為靶細(xì)胞可 用于研究在自身免疫疾病活移植注射中抗體和效應(yīng)細(xì)胞是如何通過(guò) ADCC殺傷健康細(xì)胞的。其中靶細(xì)胞是健康的細(xì)胞，它們可以是，例如， 獲自于細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞系，或是獲自于患有自身免疫疾病個(gè)體的組織的 細(xì)胞。
在一些情況下，可以聯(lián)合使用超過(guò)一種類(lèi)型的靶細(xì)胞來(lái)，例如， 更接近地復(fù)制體內(nèi)環(huán)境，其中抗體針對(duì)的可能是包含數(shù)種細(xì)胞類(lèi)型的 靶器官和組織。因此靶細(xì)胞可以包括一種以上的細(xì)胞系，或者可以包 括來(lái)自于一種以上組織的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，耙細(xì)胞包括兩種
或兩種以上或三種或三種以上的細(xì)胞類(lèi)型。
此處描述的方法可被用于篩選具有誘導(dǎo)ADCC響應(yīng)的能力的任意 抗體。因此本應(yīng)用提供了篩選具有誘導(dǎo)針對(duì)靶細(xì)胞的ADCC的能力的候 選抗體的方法。該方法包括(a)監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的 非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極之間的阻抗；和(b)向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入效應(yīng)細(xì)胞 和抗體(例如，結(jié)合把細(xì)胞的抗體)；其中在加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后 基質(zhì)上的電極間的阻抗下降，表明候選抗體具有影響針對(duì)靶細(xì)胞的 ADCC的能力。
如此處所用，"阻抗下降"指的是其上鋪有細(xì)胞的基質(zhì)上的電極 之間的阻抗的任何下降。阻抗的下降可以是，例如，和以前測(cè)定的阻 抗相比阻抗下降了大約1%或更多、大約5%或更多、大約10%或更多、 大約15%或更多、大約20%或更多、大約25%或更多、大約40%或更多、 大約50%或更多、大約60°/?；蚋唷⒋蠹s75%或更多、大約80%或更多、 大約90%或更多、或大約100%。
在此處提到的方法中使用的抗體或候選抗體可以是，例如，單克 隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在此處提到的方法中可以 使用的抗體還包括已經(jīng)確定具有治療潛力的抗體(例如，已經(jīng)經(jīng)過(guò)臨 床試驗(yàn)的抗體)。
如此處使用，術(shù)語(yǔ)"抗體"指的是完整的分子及其片斷，例如Fab、 F(ab0 2合Fv，其能結(jié)合靶細(xì)胞。通過(guò)"結(jié)合靶細(xì)胞"的意思是，抗 體對(duì)靶細(xì)胞的抗原是免疫特異性的，例如，靶細(xì)胞上的頂端抗原。
術(shù)語(yǔ)"免疫特異性的"的意思是，和對(duì)其它蛋白質(zhì)(例如，其它 相關(guān)蛋白)的親和性相比，對(duì)于靶細(xì)胞上的抗原抗體具有大得多的親 和性。
"基本上更大的親和性"的意思是，和對(duì)已知的含免疫球蛋白結(jié) 構(gòu)域細(xì)胞表面識(shí)別分子的親和性相比，抗體對(duì)靶細(xì)胞上的抗原具有可 測(cè)定的更大的親和性。例如，和對(duì)已知的含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域細(xì)胞表 面識(shí)別分子的親和性相比，對(duì)靶細(xì)胞上的抗原的親和性可以比前者大 至少l. 5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106 倍。
此處提供的方法還可以被用于釋放或穩(wěn)定性檢測(cè)，所述檢測(cè)用于
質(zhì)量控制(QC)的目的。例如，可以使用如此處所述的方法檢測(cè)抗體產(chǎn) 物，其中使用ADCC活性的存在或ADCC活性的水平來(lái)確定抗體產(chǎn)物符 合質(zhì)量控制方針(例如，GMP(藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范)或其它標(biāo)準(zhǔn))。 在 一 些情況下，僅僅ADCC活性的存在就可以被用作抗體符合質(zhì)量控制 方針并且適合釋放的質(zhì)量判定。因此這種方法在確定存在檢測(cè)抗體時(shí) 阻抗下降以外可以不需要解釋。在一些實(shí)施方案中，待驗(yàn)證ADCC抗體 的樣品可以被故意降解并用作陰性對(duì)照，用于和待釋放的抗體進(jìn)行比 較?？梢员容^兩種樣品的實(shí)時(shí)ADCC讀出曲線(xiàn)，并且可以建立定量的或 定性的取舍點(diǎn)用于質(zhì)量控制驗(yàn)證。可以通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)來(lái)確定確切的濃 度依賴(lài)性響應(yīng)和檢測(cè)參數(shù)。
相似的，此處描述的方法可被用于驗(yàn)證小分子或其它ADCC活性抑 制劑的QC和穩(wěn)定性，通過(guò)監(jiān)測(cè)其加入到靶細(xì)胞中后出現(xiàn)響應(yīng)-實(shí)時(shí) ADCC信號(hào)減小。
可以通過(guò)ADCC發(fā)生作用的可用抗體的例子包括，但不限于，用于 治療變態(tài)反應(yīng)和哮喘的抗體，例如，Daclizumab (Protein Design Labs/Roche)和CAT-354 (Cambridge Antibody Technology);用于治 療自身免疫性疾病的抗體，例如MDX- H210 (Medarex/Novartis)、 Campath* alemtuzumab (ILEX Oncology)和 Daclizumab (Protein Design Labs/Roche);用于治療癌癥的抗體，例如Campath" (ILEX Oncology), R1550 (hu訓(xùn)FGl， Therex， Antisome/Roche)， Herceptin* (Genentech)， 0mnitarg (Genentech)， Tastuzu咖b-DMll (Genentech/Immunogen)， MDX-OIO (Medarex)， Avastin* (Genentech), Mab-17-I (edrecolomab-IGN101， Igeneon, EDR或Panorex- GSK), labetuzumab， (I隱105) (Immunomedics)， Tarvacin (Peregrine), Theragyn, Therevex (Pemtumomab) (Antisoma/Roche)， TheraCIM hR3 (YM Biosciences/0ncoscience)，HuMax-EGFr (Genmab), SGN-40 (Seattle Genetics),SGN-30 (Seattle Genetics), Rituxan*
(Rituzan⑧Ge織tech/Biogenldec) ， HuMax-CD4 (Ge腿b) ， MDX-060 (Medarex)， Siplizumab (Medlmmune)， AME- 133 (Applied Molecular Evolution/Ully) ， galiximab (Anti-CD80 Mab Biogenldec)， 腿ax-DC20 (隨ax cd20) (Genmab) ， LymphoCide (epratuzumab， Im隠omedics)， MDX-010+gp 100肽(Medarex)， MDX- 010 +/-化療 (Medarex)， MDX-010 +黑色素瘤肽(Medaex) ， AHM (Roche/Chugai)， OvaRex (AltaRex/Unither Pharma-ceuticals) ， J59I (Biovation/Millennium)， Rencarex (WX-G250)
(Wilex/Centocor〃ohnson & Johnson), WX-G250+IL-2/IFN (Wilex)， TRAIL-RlmAb (HGS-ETR1 Cambridge Antibody Technology/Human Genome Sciences), TRAIL-R2mAb (HGS-ETR2Cambridge Antibody Technology/HumanGenomeSciences), Vitaxin (MEDI—522 Medlmmune)， WX-K931 (Wilex)， MT201 (Micromet/Serano), MDX-214 (Medarex), Erbitux (cetuximab, IMC-C255 Imclone， Bristol-Myers Squibb) ， MEDI-507 (Medimmune)， TRU-015 ( —種抗體衍生物， Trubion), Matuzumab (EMD-72000， EMD Pharmaceuticals/ Merck KGaA)， Mab ICR62, CHIR-12. 12 (Chiron/X0MA) ， huGl-M195 (NCI) MOR102 (MorphoSys)， Remitogen (IDIO， II型抗-MHC， Protein Design Labs)和IGN312 (Igeneon);用于治療心血管疾病的抗體，例 如ABC-48 (AERES);用于治療感染性疾病的抗體，例如MDX-010 (Medarex);用于治療炎性疾病的抗體，例如Humira (Cambridge Antibody Technology/ Abbott), Anti- CDlla MAb (Biovation)， MLN02(Millennium/Genentech/Roche),Daclizumab (Protein Design Labs), Enbrel (TNF受體和IgGl的融合物(Amgen/Wyeth)， Remicade (Centocor)，和TRU-016 (—種抗體衍生物，Trubion);用 于治療腎病的抗體，例如HumiraTM (Cambridge Antibody Technology/ Abbott)和Rituxan* (Ge雄tech/BiogenIdec) ，和其它抗體，例如的 AMG162 (A邁gen)(用于治療骨質(zhì)疏松)，Erbitux - C255， BTI-322, Etanercept和Infliximab。
其中此處提供的方法被用于研究在自身免疫性疾病中的ADCC響 應(yīng)，抗體可以是，例如，獲自于患有自身免疫性疾病的個(gè)體的自身抗 體?？梢允褂美绫绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如，親和純化)獲 得這種抗體。
在一些情況下，有可能希望向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入一種以上的抗體 來(lái)檢測(cè)，例如，抗體是否發(fā)生協(xié)同作用或者它們是否相互干擾其誘導(dǎo) ADCC的能力。因此此處提供的方法可以包括向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入2、 3、 4、 5或5種以上的抗體。
在此處提供的方法中使用的效應(yīng)細(xì)胞典型的是表達(dá)一種或多種 Fcv受體的細(xì)胞。合適的效應(yīng)細(xì)胞包括，但不限于，外周血單核細(xì)胞 (PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。
存在一些Fcy受體家族，并且不同的受體細(xì)胞表達(dá)不同的Fc受 體。例如，中性粒細(xì)胞通常表達(dá)Fc yRI (CD64)、 FcyRII (CD32)和 FcyRIII的脂錨定異型體(CD16)，而天然殺傷(NK)細(xì)胞只表達(dá)Fc y RIII的跨膜異型體。此外，在Fc受體中存在多態(tài)性。例如，M細(xì)胞 上的FcyRIII在位置158含有一個(gè)Phe/Val多態(tài)性，已經(jīng)顯示影響 IgG結(jié)合。在此處描述的方法中使用的效應(yīng)細(xì)胞可以根據(jù)其表達(dá)的Fc 受體進(jìn)行選擇，并且在一些實(shí)施方案中它們表達(dá)多態(tài)性形式的Fc受 體。因此，此處描述的方法可用于測(cè)定抗體和表達(dá)已知Fcy受體(例 如，具有特定多態(tài)性的)的效應(yīng)細(xì)胞的特定組合是否能夠通過(guò)ADCC 殺傷靶細(xì)胞。這種實(shí)驗(yàn)可用于IgG被Fc受體結(jié)合的機(jī)制的廣泛研究， 并且能夠確定Fc受體和IgG Fc區(qū)域中對(duì)結(jié)合起關(guān)鍵作用的殘基。并 且，這種實(shí)驗(yàn)可以開(kāi)發(fā)擁有Fc區(qū)域序列的治療性抗體，所述Fc區(qū)域 序列顯示和效應(yīng)細(xì)胞上的Fc受體最優(yōu)結(jié)合，因此使ADCC最大化。這 種實(shí)驗(yàn)還可用于測(cè)定對(duì)于已有治療性抗體的最適效應(yīng)細(xì)胞基因型，使 能夠誘導(dǎo)出ADCC響應(yīng)，因此可以檢測(cè)預(yù)期患者是否具有最適基因型的 Fc受體。
在一些實(shí)施方案中，在此處描述的方法中使用的效應(yīng)細(xì)胞是 PBMC。 PBMC是單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的混合物，可以使用例如本領(lǐng)域中
以及在下面實(shí)施例中描述的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)步驟從全血中提取PBMC。在PBMC
抗讀數(shù)的混亂。但是令人吃驚的是，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在加入抗體和 PBMC后阻抗或者細(xì)胞指數(shù)的變化是乾細(xì)胞ADCC的準(zhǔn)確指征。在此處 提供的方法中，全血，或至少部分純化的血(這樣它富集了或部分富 集了效應(yīng)細(xì)胞(例如PBMC))也是有用的。
此處提供的方法具有多種臨床用途。如上面討論的，在人Fc受體 中存在多態(tài)性，對(duì)效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合抗體的能力有影響，并且可能影響效 應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)ADCC的能力。效應(yīng)細(xì)胞在個(gè)體中結(jié)合治療性抗體的能力， 可以對(duì)抗體的臨床效果有較大的影響。例如，在B惡性淋巴增生治療 中使用的抗-CD20 IgG抗體Rituxar^在Fc y RIII158V純合基因型患者 中能夠產(chǎn)生比在FcYRIII158F純合基因型患者中更好的臨床結(jié)果，有 可能是因?yàn)閹в蠪c y RIII158V的NK細(xì)胞能更有效率地結(jié)合Rituxan。 的Fc區(qū)域。
能夠使用來(lái)自于個(gè)體(例如，患者)的PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞，意味 著此處提供的方法可用于確定特定的治療性抗體是否適合治療特定的 患有和乾細(xì)胞相關(guān)的疾病或紊亂的患者。相應(yīng)的，在一些實(shí)施方案中， 效應(yīng)細(xì)胞可以是獲自于患有和靶細(xì)胞相關(guān)的疾病的患者的PBMC，并且 抗體可以是用于治療患者的候選的治療性抗體。因此，本文提供了確 定患有靶細(xì)胞相關(guān)疾病的接受者適合接受候選抗體治療的方法。該方 法可以包括(a)監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上 的電極之間的阻抗；和(b)向靶細(xì)胞中加入分離自患者的PBMC和候選 抗體；和(c)測(cè)定加入PBMC和抗體后基質(zhì)上的電極之間的阻抗是否出 現(xiàn)變化，其中電極之間的阻抗下降，表明出現(xiàn)ADCC，因此患者適合接 受該抗體的治療。
在一些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞可以是和B惡性淋巴增生相關(guān)的細(xì)胞， 并且候選抗體可以是RUuxai^。才艮據(jù)這個(gè)實(shí)施方案，此處提供的方法 可用于測(cè)定B惡性淋巴增生患者是否適合接受R i tuxan"臺(tái)療。當(dāng)然， 該方法可以使用來(lái)自于特定患者的PBMC和此處描述的其它任意抗體
與靶細(xì)胞，來(lái)確定用于治療患者的最適抗體。此外，當(dāng)已經(jīng)確定PBMC 和特定抗體能誘導(dǎo)ADCC時(shí)，可以測(cè)定PBMC的基因型，并使用標(biāo)準(zhǔn)基 因分型方法檢測(cè)其他個(gè)體的PBMC，來(lái)確定他們是否適合接受該抗體的 治療。
當(dāng)使用來(lái)自于個(gè)體的PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，乾細(xì)胞也可以是來(lái)自 于個(gè)體的細(xì)胞(例如，從活組織檢查樣本中獲得的癌細(xì)胞)，因此該 方法是一種測(cè)定特定候選抗體與接受者的PBMC聯(lián)用是否能夠通過(guò) ADCC殺傷患者中的靶細(xì)胞的個(gè)體化方法。因?yàn)榭梢允褂酶嗟目贵w產(chǎn) 品了 ，所以此處提供的方法能夠選擇最佳的抗體產(chǎn)品來(lái)優(yōu)化在特定患 者中的臨床結(jié)果。
此處提供的方法還適合于篩選化合物增強(qiáng)或減弱不同效應(yīng)細(xì)胞和 抗體的組合誘導(dǎo)的ADCC的能力。相應(yīng)的，本文提供了篩選化合物調(diào)節(jié) ADCC能力的方法。該方法可以包括(a)監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基 中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極之間的阻抗；(b)向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入化 合物、效應(yīng)細(xì)胞和結(jié)合乾細(xì)胞的抗體；和(c)通過(guò)比較存在化合物時(shí)加 入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后基質(zhì)上的電極之間的阻抗的任何變化和不存在化
來(lái)測(cè)定該化合物是否調(diào)節(jié)ADC(C ' 57 、
如此處討論的，加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后阻抗的下降表明在檢測(cè)培 養(yǎng)基中ADCC受到了影響。在存在被篩選化合物時(shí)觀察到阻抗出現(xiàn)進(jìn)一 步下降表明該化合物增強(qiáng)ADCC。相反的，在存在被篩選化合物時(shí)觀察 到阻抗出現(xiàn)增長(zhǎng)表明該化合物減弱ADCC。在一些情況下，有可能希望 鑒定出增強(qiáng)ADCC的化合物。例如，可使用該方法鑒定能增強(qiáng)治療性抗 體和針對(duì)癌細(xì)胞的PBMC所誘導(dǎo)的ADCC反應(yīng)的化合物。在其它情況下， 有可能希望鑒定出減弱ADCC的化合物。例如，可使用該方法鑒定能減 弱抗體和來(lái)自于自身免疫性疾病患者的PBMC所誘導(dǎo)的針對(duì)健康靶細(xì) 胞的ADCC反應(yīng)的化合物。在一些情況下，發(fā)現(xiàn)化合物沒(méi)有調(diào)節(jié)ADCC 的作用也可能是有用的，因?yàn)檫@表明該化合物(其有可能具有其它的 治療目的)不會(huì)干擾特定的效應(yīng)細(xì)胞-抗體組合誘導(dǎo)ADCC的能力。
該方法可以使用此處描述的任何靶細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞和抗體。在一 些實(shí)施方案中，使用的效應(yīng)細(xì)胞-抗體組合可以是已經(jīng)被確認(rèn)能夠誘導(dǎo)
出針對(duì)所談?wù)摪屑?xì)胞的ADCC反應(yīng)的組合。待篩選化合物可以和效應(yīng)細(xì) 胞與抗體一起加入到靶細(xì)胞中。此外，待篩選化合物可以在效應(yīng)細(xì)胞
和抗體之前加入到乾細(xì)胞中，或在效應(yīng)細(xì)胞和乾細(xì)胞之后。
在此處提供的方法中，可以根據(jù)調(diào)節(jié)ADCC的能力進(jìn)行篩選的化合 物包括，但不限于，肽、類(lèi)肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、金屬、有機(jī)小分子、 RNA適體、抗生素和其它已知的藥物制劑、多胺及其組合或衍生物。 有機(jī)小分子典型的分子量為大約50道爾頓到大約2， 500道爾頓(例如， 從大約300到大約800道爾頓)。
候選化合物可以來(lái)自巨大的合成或天然化合物庫(kù)。例如，可以從 MayBridge Chemical公司 (Revillet， Cornwall，英國(guó))或Aldrich公 司(Milwaukee, WI)購(gòu)買(mǎi)合成化合物庫(kù)。選擇性的，可以使用以細(xì)菌、 真菌、植物和動(dòng)物提取物形式存在的天然化合物庫(kù)。此外，候選化合 物可以是使用組合化學(xué)合成生產(chǎn)的，作為單獨(dú)的化合物或作為混合物。
在一些實(shí)施方案中，待篩選的化合物可以是已經(jīng)用于治療與靶細(xì) 胞相關(guān)的疾病的化合物，并且抗體可以是被開(kāi)發(fā)用于治療該疾病的抗 體。例如，當(dāng)靶細(xì)胞是癌細(xì)胞時(shí)，待篩選的化合物可以是化療試劑， 而抗體可以是被開(kāi)發(fā)用于治療癌癥的治療性抗體。因此此處提供的方 法可用于測(cè)定化療試劑是否增強(qiáng)或減弱抗體通過(guò)ADCC對(duì)靶細(xì)胞的殺 傷作用。相似的，待篩選的化合物可以是在自身免疫性疾病患者中調(diào) 節(jié)ADCC的化合物。在這種情況下，加入的抗體可以是在患有自身免疫 性疾病的個(gè)體中通過(guò)ADCC引起自身免疫活性的抗體。
在一些實(shí)施方案中，此處描述的方法可以是高通量方法，同時(shí)評(píng) 價(jià)抗體、效應(yīng)細(xì)胞和把細(xì)胞的多種組合產(chǎn)生ADCC反應(yīng)的能力，可選的， 在存在有可能調(diào)節(jié)ADCC反應(yīng)的化合物時(shí)進(jìn)行上述評(píng)價(jià)。在這種實(shí)施方 案中，把細(xì)胞可以鋪板于含有兩個(gè)或兩個(gè)以上孔的非導(dǎo)電基質(zhì)上，每 個(gè)孔至少包含兩個(gè)電極，并且該方法可以包括監(jiān)測(cè)每個(gè)單個(gè)孔中的電 極之間的阻抗的任何變化。此處描述的RT-CES'系統(tǒng)以及相關(guān)軟件適合
用于高通量檢測(cè)。
在一些實(shí)施方案中，加入到每個(gè)孔中的靶細(xì)胞、抗體和效應(yīng)細(xì)胞 可以是相同的或不同的，依賴(lài)于檢測(cè)的目的。在一些實(shí)施方案中，例 如，該方法可用于同時(shí)檢測(cè)多種候選治療性抗體在存在來(lái)自于一名患
者的PBMC或來(lái)自于多名患者的PBMC的情況下誘導(dǎo)針對(duì)多種把細(xì)胞的 ADCC的能力。這種高通量方法還可用于同時(shí)檢測(cè)單個(gè)候選抗體在存在 相同效應(yīng)細(xì)胞時(shí)在不同抗體濃度下誘導(dǎo)針對(duì)相同把細(xì)胞、或多種不同 靶細(xì)胞的ADCC的能力。此外，這種高通量方法可用于同時(shí)比較多種不 同的抗體的ADCC動(dòng)力學(xué)。高通量檢測(cè)還可用于根據(jù)調(diào)節(jié)ADCC反應(yīng)的 能力篩選化合物，如上面討論的。
此外，使用此處所述的方法作為高通量方法的一部分能夠并行進(jìn) 行對(duì)照實(shí)驗(yàn)和上述檢測(cè)ADCC的方法。例如，合適的對(duì)照檢測(cè)可包括鋪 板并生長(zhǎng)耙細(xì)胞，以及在沒(méi)有效應(yīng)細(xì)胞和抗體的情況下檢測(cè)阻抗。進(jìn) 一步的對(duì)照實(shí)驗(yàn)可包括向鋪板的靶細(xì)胞中單獨(dú)加入效應(yīng)細(xì)胞或單獨(dú)加 入抗體。
在下面的實(shí)施例中將進(jìn)一步描述發(fā)明，這些實(shí)施例不限制在權(quán)利 要求中描述的發(fā)明的范圍。 實(shí)施例 1.前言
ACEA Biosciences (San Diego， CA) RT-CES* (實(shí)時(shí)細(xì)胞電子傳 感器)系統(tǒng)使用了 一種阻抗的電子讀出器，以實(shí)時(shí)的方式非侵入地定量 細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞接種于E-Plate微孔板(ACEA Biosciences)中，和微
電極傳感器陣列整合。細(xì)胞和微電極表面的相互作用導(dǎo)致細(xì)胞-電極阻 抗反應(yīng)的產(chǎn)生，這指明了細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、粘附質(zhì)量和數(shù)量方面的狀態(tài)。 ACEA被用于開(kāi)發(fā)粘附細(xì)胞的實(shí)時(shí)ADCC檢測(cè)。使用了兩種細(xì)胞系 SKBR3 ( —種乳腺癌細(xì)胞系)；和MG63 ( —種成骨細(xì)胞細(xì)胞系)，SKBR3 是一種粘附細(xì)胞系，過(guò)量表達(dá)HER-2抗原。Herceptin"是一種針對(duì) HER-2的人源化IgGl抗體，在存在效應(yīng)細(xì)胞時(shí)介導(dǎo)通過(guò)ADCC的對(duì)SKB R3細(xì)胞的殺傷作用。MG63是一種粘附細(xì)胞系，過(guò)量表達(dá)M-SCF。 Chir-RXl是一種針對(duì)M-CSF的人源化抗體，在存在效應(yīng)細(xì)胞時(shí)介導(dǎo)針 對(duì)MG63細(xì)胞的ADCC。
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定ACEA系統(tǒng)是否能用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)由PBMC效應(yīng)細(xì)胞 和HercepUn'或RX-1介導(dǎo)的、通過(guò)ADCC對(duì)SKBR3和MG63乾細(xì)胞的 殺傷作用。
2. 靶細(xì)胞、抗體和PBMC制備
SKBR3細(xì)胞(ATCC， Manassas, VA;編號(hào)#HTB-30)在DME-15培 養(yǎng)基中培養(yǎng)。
在使用前用水重新溶解人源化抗體Herceptin8 ( Genentech Corporation, South San Francisco, CA; 商標(biāo)名 Trastuzumab)來(lái) 配制成21 mg/ml的儲(chǔ)備溶液。重新溶解后Herceptitf能穩(wěn)定存在30 天。
從來(lái)自于健康志愿者的人血中新鮮制備人PBMC。在黃頭檸檬酸銨 (ACD-A)管中收集人靜脈血樣品(8. 5ml)。將管倒轉(zhuǎn)10-15次，并從黃 頭管中移出全血到一個(gè)50 ml的圓錐形管中。按1: 3使血被2% FBS 的PBS稀釋。將12 ml的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque， Amersham Biosciences, Piscataway， NJ; cat #17- 1440-02 )緩慢沉降于血 液/PBS混合物的下面。在室溫下以2350 rpm離心樣品30分鐘，隨后 吸去上層(血漿/PBS)。用無(wú)菌移液管收集血沉棕黃層并收集到50ml 圓錐形管中。如果在血沉棕黃層下殘留有可見(jiàn)的WBC團(tuán)塊，收集所有 的WBC，小心不要移有過(guò)量的聚蔗糖-泛影葡胺。加入無(wú)菌的PBS-2% FBS 使體積達(dá)到30 ml,反轉(zhuǎn)混合混合物。在室溫下以250 x g (1046 rpm， Beckman GH3. 8轉(zhuǎn)子)離心稀釋的PBMC懸液17分鐘，收集細(xì)胞沉淀。 將PBMC沉淀懸于2.5 ml R-2培養(yǎng)基(含294熱滅活FBS的RPMI-1640 培養(yǎng)基)中，完全混合，并移到15 ml圓錐形管中。
用R-2培養(yǎng)基清洗PBMC —次，并用臺(tái)盼藍(lán)(Invitrogen cat. #15250-061或類(lèi)似產(chǎn)品)排斥法檢查活細(xì)胞的數(shù)量。
3. 檢測(cè)利用Herceptin'和PBMC的SKBR3的ADCC殺傷作用 在進(jìn)行ADCC檢測(cè)之前，進(jìn)行一些試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)單獨(dú)SKBR3細(xì)胞，和
Herceptirf抗體或和PBMC效應(yīng)細(xì)胞對(duì)RT-CES"系統(tǒng)中的細(xì)胞指數(shù)讀數(shù) 的效果。
以每孔40K、 20K、 10K或5K個(gè)SKBR3細(xì)胞的密度鋪板并置于 RT-CES"讀出器中。20小時(shí)后加入新鮮的培養(yǎng)基，并監(jiān)測(cè)100小時(shí)的細(xì) 胞指數(shù)。如圖1所示，當(dāng)SKBR3細(xì)胞增殖時(shí)細(xì)胞指數(shù)增加。細(xì)胞指數(shù) 的最大檢測(cè)限為60K到160K細(xì)胞每孔。
在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，以40K每孔鋪板SKBR3細(xì)胞。20小時(shí)后，在一組 孔中加入新鮮培養(yǎng)基，并在第二組孔中加入含Triton X-100的PBS， 并將板放回到讀出器中。如圖2所示，在加入Triton X-l00后細(xì)胞指 數(shù)出現(xiàn)下降，表明了細(xì)胞死亡。
在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，以20K每孔鋪板SKBR3細(xì)胞，并在20小時(shí)后 加入單獨(dú)的培養(yǎng)基、Herceptin"、或IgG對(duì)照抗體。和未加抗體的細(xì) 胞指數(shù)相比，單獨(dú)加入Hercepti『或IgG沒(méi)有顯著改變細(xì)胞指數(shù)(圖 3)。
以20K每孔鋪板SKBR3細(xì)胞所得到的細(xì)胞指數(shù)和以最終數(shù)量為5 X 105細(xì)胞每孔向單獨(dú)培養(yǎng)基中加入PBMC所得到的細(xì)胞指數(shù)進(jìn)行比較。 令人驚訝的是，PBMC對(duì)細(xì)胞指數(shù)沒(méi)有顯著影響(圖4)，表明在ADCC 檢測(cè)中使用PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞不會(huì)干擾SKBR3細(xì)胞死亡的精確檢測(cè)。 當(dāng)向含有以20K每孔鋪板的SKBR3細(xì)胞的孔中加入PBMC時(shí)，細(xì)胞指數(shù) 下降(圖5 )，表明單獨(dú)的PBMC效應(yīng)物具有針對(duì)SKBR3靶細(xì)胞的NK 殺傷效果。
隨后進(jìn)行一個(gè)檢測(cè)來(lái)測(cè)定在存在PBMC效應(yīng)物時(shí)通過(guò)靶抗體 Herceptin的SKBR3細(xì)胞ADCC殺傷作用。以20K每孔鋪板靶細(xì)胞，20 小時(shí)后開(kāi)始進(jìn)行ADCC檢測(cè)。在開(kāi)始進(jìn)行ADCC檢測(cè)時(shí)，從ACEA系統(tǒng)中 暫時(shí)取出板，來(lái)加入抗體和效應(yīng)細(xì)胞。
以25:1 (效應(yīng)物靶)的比例向SKBR3靶細(xì)胞中加入PBMC效應(yīng) 細(xì)胞，以及終濃度為5 jig/ml的Herceptii^抗體。隨后將細(xì)胞板放 回到ACEA系統(tǒng)中繼續(xù)監(jiān)測(cè)后續(xù)48小時(shí)的細(xì)胞指數(shù)。圖6顯示了單獨(dú) SKBR3細(xì)胞、SKBR3細(xì)胞和PBMC以及SKBR3細(xì)胞和Herceptir^抗體和
PBMC的細(xì)胞指數(shù)。在加入PBMC和Herceptir^后記錄到細(xì)胞指數(shù)的劇 烈下降，反映了 SKBR3細(xì)胞被ADCC殺傷。
重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用50: 1或12. 5 : 1 E: T比例的SKBR3細(xì)胞和 PBMC效應(yīng)物，帶有或不帶有濃度為5 ng/ml的HerceptiiT。圖7顯 示了在這些實(shí)驗(yàn)中的ADCC殺傷時(shí)間曲線(xiàn)，以細(xì)胞裂解百分比進(jìn)行測(cè) 量，根據(jù)下面的方程式進(jìn)行計(jì)算
%裂解=100 X (未用抗體處理的細(xì)胞指數(shù)-用抗體處理的細(xì) 胞指數(shù))/未用抗體處理的細(xì)胞指數(shù)
圖7的結(jié)果表明在存在Herceptina和PBMC時(shí)，作為ADCC的結(jié)果， 細(xì)胞裂解出現(xiàn)劇烈增加。
4.實(shí)時(shí)ADCC檢測(cè)和Calcein AM釋放ADCC檢測(cè)的比較
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)比較使用實(shí)時(shí)ADCC檢測(cè)測(cè)量到的％裂解和使用標(biāo)準(zhǔn)的 Calcein AM釋放ADCC檢測(cè)測(cè)量到的％裂解。
采用下面的流程進(jìn)行Calcein-AM檢測(cè)。融化一瓶在干燥DMSO中 的1 mg/ml Calcein AM溶液(Molecular Probes, Eugene, OR; 編 號(hào)# C-3099 )，并用移液器溫和混勻。
為了標(biāo)記SKBR3細(xì)胞，去除培養(yǎng)基并用10 ml單獨(dú)的PBS (不含 胎牛血清(FBS))清洗單層細(xì)胞。加入5 ml EDTA/PBS并在37E中 賻育10分鐘，使單層細(xì)胞脫離。加入IO ml新鮮的R10 (含有10%熱 滅活FBS、 Pen/Strep (最終100 n g/ml)和L-谷氨醜胺(最終2 mM) 的RPMI-1640培養(yǎng)基)。收集細(xì)胞，離心，并計(jì)數(shù)，將2. 5 X 106個(gè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的15 ml管中。在15 ml圓錐形管中使細(xì)胞懸浮于2. 5 ml R-10中，并在每管中加入12. 5 nl的Calcein AM (最終5pM)。將 管在37t;潮濕的5%0)2中孵育30分鐘，確保蓋是松的。每10分鐘溫 和混合細(xì)胞來(lái)避免沉降。用10 ml R-2(含有2%熱滅活FBS的RPMI-1640 培養(yǎng)基)清洗標(biāo)記的細(xì)胞兩次。細(xì)胞懸于R-10培養(yǎng)基中得到5X105細(xì) 胞/ml。
以20K每孔鋪板耙SKBR3細(xì)胞用于ADCC檢測(cè)。在開(kāi)始ADCC檢測(cè) 時(shí)，以25 : 1的比例將PBMC效應(yīng)細(xì)胞加入到靶細(xì)胞中，并加入如圖
8所示濃度的對(duì)照抗體IgG或Herceptin*。乾細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞和抗體 的混合物在3"7X:中孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束時(shí)沉淀細(xì)胞并檢測(cè)上清中 Calcein AM的釋放。
在分析前對(duì)于每種個(gè)別的靶細(xì)胞系都減去每種乾的平均背景培養(yǎng) 基對(duì)照，并使用下面的方程式計(jì)算最小(min)比最大(max)百分比
%最小最大=100 X平均自發(fā)釋放cpm/平均最大釋放cpm
如果最小釋放比最大釋放的百分比超過(guò)了 37%，該檢測(cè)被認(rèn)為是 無(wú)效的。使用下面的方程式根據(jù)三點(diǎn)平均值計(jì)算出特異性裂解百分比
%裂解=100 X (平均試驗(yàn)cpm -平均自發(fā)釋放cpm ) / (平 均最大釋放cpm -平均自發(fā)釋放cpm)
使用Calcein- AM assay檢測(cè)測(cè)量到的裂解百分比顯示于圖8B。 圖8 A顯示了使用RT-CES"系統(tǒng)進(jìn)行的平行檢測(cè)所測(cè)量到的裂解百分 比。SKBR3耙細(xì)胞鋪板18-20小時(shí)，隨后加入和Calcein-AM檢測(cè)相同 比例和濃度的PMBC效應(yīng)細(xì)胞和IgG或Herceptin"抗體。使用RT-CES 系統(tǒng)檢測(cè)到的裂解百分比是Calcein-AM標(biāo)記所檢測(cè)到的裂解百分比 的2倍。這有可能是因?yàn)槿缦率聦?shí)Calcein-AM檢測(cè)需要細(xì)胞懸浮起 來(lái)，而在RT-CES檢測(cè)中細(xì)胞是粘附的。
5.通過(guò)RX-1單克隆抗體和PBMC的MG63細(xì)胞的ADCC殺傷的檢
測(cè)
以20K細(xì)胞每孔鋪板MG63和SKBR3細(xì)胞，并監(jiān)測(cè)24小時(shí)的細(xì)胞 指數(shù)。SKBR3細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞指數(shù)具有線(xiàn)性關(guān)系，而MG63細(xì)胞的生 長(zhǎng)通常沒(méi)有這種關(guān)系(圖9)。但是，在大約7小時(shí)和大約17小時(shí)之 間，MG63細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞指數(shù)之間存在近似的線(xiàn)性關(guān)系，表明對(duì)于 MG63細(xì)胞應(yīng)該在該時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行ADCC檢測(cè)。
在以20K每孔鋪板的MG63靼細(xì)胞中進(jìn)行了 ADCC檢測(cè)。將單獨(dú)的 MG63細(xì)胞的細(xì)胞指數(shù)和在18-20小時(shí)后加入PBMC、 PBMC和IgG對(duì)照 抗體、或PBMC和RX1抗體的MG63細(xì)胞的細(xì)胞指數(shù)進(jìn)行了比較。在每 個(gè)實(shí)驗(yàn)中PBMC效應(yīng)物比MG63乾細(xì)胞的比例為50:1,加入的抗體的濃 度為5 jig/ml。如圖IOA所示，在加入PBMC和RX1后，因?yàn)镸G63細(xì)
胞的ADCC，細(xì)胞指數(shù)下降。但是，ADCC的動(dòng)力學(xué)和使用SKBR3細(xì)胞、 存在PBMC、 PBMC和IgG、或PBMC和Herceptina的情況下重復(fù)相同的 實(shí)驗(yàn)所觀察到的動(dòng)力學(xué)不同(圖10B)。這些結(jié)果證明了實(shí)時(shí)ADCC檢 測(cè)在提供ADCC動(dòng)力學(xué)詳細(xì)信息中的效果。 6.結(jié)論
此處描述的ADCC檢測(cè)比目前的檢測(cè)ADCC方法有所改進(jìn)。和標(biāo)準(zhǔn) 檢測(cè)不同，基于RT-CES。的檢測(cè)可用于實(shí)時(shí)跟蹤ADCC殺傷，并能詳細(xì) 跟蹤ADCC的動(dòng)力學(xué)。和目前已有的其它ADCC檢測(cè)相比該檢測(cè)更加靈 敏、更快速，并且具有為高通量篩選進(jìn)行優(yōu)化的潛力。此外，該檢測(cè) 是無(wú)標(biāo)記的和無(wú)放射性的，或者需要降低水平的標(biāo)記，使其比涉及放 射性標(biāo)記的檢測(cè)更加安全，例如。因?yàn)樵摍z測(cè)可以在粘附細(xì)胞上進(jìn)行， 不需要從基板上脫離，因此它們?cè)隗w內(nèi)能更精確的測(cè)定細(xì)胞的ADCC。 因此，此處描述的ADCC檢測(cè)將增強(qiáng)檢測(cè)候選治療性抗體ADCC活性的 能力。
此外，此處提供的ADCC檢測(cè)可用于鑒定適合接受特定抗體治療的 患者群體。如上面討論的，可使用PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行該檢測(cè)。在 PBMC效應(yīng)細(xì)胞上的Fc受體中存在多態(tài)性，能夠影響效應(yīng)細(xì)胞結(jié)合靶 特異性抗體的能力，并因此介導(dǎo)ADCC。此處提供的ADCC是快速并且 容易的檢測(cè)，可用于測(cè)定來(lái)自于特定患者的PBMC和治療性抗體聯(lián)用是 否能夠介導(dǎo)靶細(xì)胞的ADCC。
總之，在藥物開(kāi)發(fā)工業(yè)中和在用于研究抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的基 礎(chǔ)研究中，此處提供的ADCC檢測(cè)方法都具有改變ADCC檢測(cè)方式的潛 力。
其它的實(shí)施方案
可以理解的是，雖然結(jié)合對(duì)發(fā)明的詳細(xì)描述而對(duì)發(fā)明進(jìn)行了描述， 但是上面的描述是對(duì)發(fā)明的范圍的說(shuō)明而不是限制，發(fā)明的范圍被附 加的權(quán)利要求的范圍所定義。其它方面、優(yōu)點(diǎn)和變更都在下面的權(quán)利 要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種檢測(cè)抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)的方法，包括(a)監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極之間的阻抗；和(b)向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入效應(yīng)細(xì)胞和結(jié)合靶細(xì)胞的一種抗體；其中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后，基質(zhì)上的電極之間的阻抗下降，表明在檢測(cè)培養(yǎng)基中ADCC功能已經(jīng)生效；其中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后，基質(zhì)上的電極之間的阻抗增高或未改變，能夠表明在檢測(cè)培養(yǎng)基中未發(fā)揮ADCC功能。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，包括在有規(guī)則的間隔中測(cè)量阻抗。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，包括包括從每次阻抗測(cè)量中導(dǎo)出細(xì)胞指數(shù)(67)并確定細(xì)胞指數(shù)是否 發(fā)生變化，其中使用下面的公式從每次阻抗測(cè)量中導(dǎo)出細(xì)胞指數(shù)，其中^C和A^C分別是在細(xì)胞存在或不存在情況下的頻率依 賴(lài)性電極電阻，N是阻抗檢測(cè)處的頻點(diǎn)數(shù)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的方法，其中使用RT-CES"系統(tǒng) 進(jìn)4亍i亥方法。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的方法，其中每15分鐘進(jìn)行阻 抗測(cè)量。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的方法，其中該方法進(jìn)一步包括 鋪板靼細(xì)胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中靶細(xì)胞被鋪板18到24小時(shí)后加 入抗體和效應(yīng)細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的方法，其中乾細(xì)胞在基質(zhì)上是 單層的。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的方法，其中把細(xì)胞以2K和100K 每孔之間的密度鋪板。 11中任一項(xiàng)的方法, 11中任一項(xiàng)的方法: 11中任一項(xiàng)的方法, 15中任一項(xiàng)的方法:
10. 根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的方法，其中靶細(xì)胞以15K和 25K每孔之間的密度鋪板。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的方法，其中靶細(xì)胞以大約20K 每孔的密度鋪板。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1到11中任一項(xiàng)的方法，其中效應(yīng)細(xì)胞比靶細(xì) 胞(E:T)的比例為25: 1。
13. 根據(jù)權(quán)利要求l到
14. 根據(jù)權(quán)利要求l到
15. 根據(jù)權(quán)利要求l到
16. 根據(jù)權(quán)利要求l到 100pg/ml之間的濃度加入抗體。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的方法， 50pg/ml之間的濃度加入抗體。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1到15中任一項(xiàng)的方法， 8 ji g/ml之間的濃度加入抗體。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)的方法， 加入2種或2種以上的結(jié)合靶細(xì)胞的抗體。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)的方法 加入3種或3種以上的結(jié)合耙細(xì)胞的抗體。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)的方法， 加入4種或4種以上的結(jié)合乾細(xì)胞的抗體。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1到21中任一項(xiàng)的方法， 抗原。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22的方法，包括篩選表達(dá)頂端抗原的乾細(xì)胞的 預(yù)先步驟。
24. 根據(jù)權(quán)利要求1到23中任一項(xiàng)的方法，其中靶細(xì)胞是癌細(xì)胞 或病毒感染的細(xì)胞。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中靶細(xì)胞是癌細(xì)胞。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中癌細(xì)胞來(lái)自于細(xì)胞系。其中E:T大于10:1。 其中E:T大于50: 1。 其中E:T大于100: 1。 其中以大約1和大約其中以大約1和大約其中以大約2和大約包括向檢測(cè)培養(yǎng)基中包括向檢測(cè)培養(yǎng)基中包括向檢測(cè)培養(yǎng)基中其中靶細(xì)胞表達(dá)頂端
27. 根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中癌細(xì)胞是SKBR3細(xì)胞或MG63細(xì)胞。
28. 根據(jù)權(quán)利要求1到27中任一項(xiàng)的方法，其中效應(yīng)細(xì)胞包括外 周血單核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞或中性粒細(xì)胞。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中效應(yīng)細(xì)胞是PBMC。
30. 根據(jù)權(quán)利要求1到27中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(b)包括向 靼細(xì)胞中加入已經(jīng)部分富集效應(yīng)細(xì)胞的全血。
31. 根據(jù)權(quán)利要求1到27中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(b)包括向 效應(yīng)細(xì)胞中加入全血，并且其中全血包含效應(yīng)細(xì)胞。
32. —種才艮據(jù)誘導(dǎo)針對(duì)靼細(xì)胞的ADCC的能力篩選候選抗體的方 法，包括(a) 監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極 之間的阻抗；和(b) 向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入效應(yīng)細(xì)胞和結(jié)合靶細(xì)胞的候選抗體； 其中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后，基質(zhì)上的電極之間的阻抗下降，表明了候選抗體具有影響針對(duì)靶細(xì)胞的ADCC功能的能力，而其中在加入 效應(yīng)細(xì)胞和抗體后，基質(zhì)上的電極之間的阻抗增高或未改變，表明了候 選抗體不具有影響針對(duì)靶細(xì)胞的ADCC功能的能力。
33. —種鑒定患有和靶細(xì)胞相關(guān)疾病的病人的方法，其中所述靶 細(xì)胞適合接受候選抗體治療，該方法包括(a) 監(jiān)測(cè)支持和疾病相關(guān)的靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電 基質(zhì)上的電極之間的阻抗；(b) 向乾細(xì)胞中加入分離自患者的PBMC和候選抗體；和(c) 測(cè)定在加入PBMC和抗體后，基質(zhì)上的電極之間的阻抗是否存 在變化，其中基質(zhì)上的電極之間的阻抗下降，表明病人適合接受該抗體 治療，而在加入PBMC和抗體后，基質(zhì)上的電極之間的阻抗增加或沒(méi)有 變化，表明病人缺乏接受該抗體治療的適合性。
34. —種根據(jù)調(diào)節(jié)ADCC的能力篩選候選化合物的方法，包括 (a) 監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極 之間的阻抗；(b) 在存在或不存在候選化合物的情況下，向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入效 應(yīng)細(xì)胞和一種抗體，其中所述抗體和靶細(xì)胞結(jié)合；和(c) 比較存在候選化合物時(shí)加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后基質(zhì)上的電極體后基質(zhì)上的電極之間的阻抗出現(xiàn)的任何變化，其中存在候選化合物時(shí) 阻抗的變化大于不存在候選化合物時(shí)阻抗的任何變化，表明該候選化合 物具有調(diào)節(jié)ADCC的能力。
35. 權(quán)利要求34的篩選方法，其中待篩選的化合物調(diào)節(jié)自身免疫 相關(guān)的ADCC,
36. 根據(jù)以前任意權(quán)利要求的高通量檢測(cè)方法，并且其中非導(dǎo)電 基質(zhì)包含2個(gè)或2個(gè)以上的微量滴定孔，每個(gè)孔包含至少2個(gè)電極，并 且監(jiān)測(cè)每個(gè)孔中的電極之間的阻抗。
37. 權(quán)利要求l的方法，其中抗體來(lái)自于自身免疫性疾病患者。
38. —種抗體質(zhì)量控制檢測(cè)，包括(a) 監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極 之間的阻抗；和(b) 向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體，其中所述抗體和把細(xì)胞結(jié)合；其中在加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后基質(zhì)上的電極之間的阻抗下降，表 明該抗體適合被釋放用于ADCC誘導(dǎo)，而其中在加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后 基質(zhì)上的電極之間的阻抗上升或不變，表明抗體不適合被釋放用于ADCC 誘導(dǎo)。
39. —種抗體質(zhì)量控制檢測(cè)，包括(a) 監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極 之間的阻抗；(b) 向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體，其中所述抗體和乾細(xì)胞 結(jié)合；和 (C)比較加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后基質(zhì)上的電極之間的阻抗出現(xiàn)的 任何變化和加入效應(yīng)細(xì)胞和對(duì)照抗體后對(duì)照樣品的阻抗出現(xiàn)的任何變化；其中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后阻抗的下降大于加入效應(yīng)細(xì)胞和對(duì)照 抗體后對(duì)照樣品的阻抗的任何下降，表明該抗體適合被釋放用于ADCC 誘導(dǎo)，而其中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后阻抗的下降不大于加入效應(yīng)細(xì)胞和 對(duì)照抗體后對(duì)照樣品的阻抗的任何下降，表明該抗體不適合被釋放用于 ADCC誘導(dǎo)。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39的質(zhì)量控制檢測(cè)，其中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體 后阻抗的下降至少比加入效應(yīng)細(xì)胞和對(duì)照抗體后對(duì)照樣品的阻抗的下 降大25%,表明該抗體適合被釋放用于ADCC誘導(dǎo)。
41. 一種篩選用于治療自身免疫性疾病的候選化合物的方法，包括(a) 監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極 之間的阻抗，其中所述靶細(xì)胞是健康的細(xì)胞；(b) 在存在或不存在候選化合物的情況下向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入效 應(yīng)細(xì)胞和抗體，其中所述抗體和靶細(xì)胞結(jié)合，并且其中效應(yīng)細(xì)胞是來(lái)自 于被診斷有自身免疫性疾病的受試者的PBMC;和(c) 比較存在候選化合物時(shí)阻抗的任何變化與不存在候選化合物 時(shí)阻抗的任何變化，其中不存在候選化合物時(shí)阻抗的下降大于存在候選 化合物時(shí)阻抗的任何下降，表明該候選化合物適合作為治療自身免疫疾 病的試劑，而其中不存在候選化合物時(shí)阻抗的下降不大于存在候選化合 物時(shí)阻抗的任何下降，表明該候選化合物不適合作為治療自身免疫疾病 的試劑。
42. —種確定候選抗體是否適合治療患有自身免疫疾病的接受者 的方法，包括(a) 監(jiān)測(cè)在支持自身免疫疾病相關(guān)靶細(xì)胞生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的 電極之間的阻抗；和(b) 向靶細(xì)胞中加入候選抗體和分離自接受者的PBMC;和(c)測(cè)定在加入PBMC和候選抗體后基質(zhì)上的電極之間的阻抗是否 改變，其中電極間的阻抗下降，表明抗體適合用于治療接受者，而其中 電極間的阻抗不下降，表明抗體不適合用于治療接受者。
43. —種確定誘導(dǎo)ADCC響應(yīng)的抗體的最適濃度的方法，包括(a) 監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞的兩種或兩種以上樣品在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng) 的非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極之間的阻抗；和(b) 向乾細(xì)胞的兩種或兩種以上樣品中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體，其中 所述抗體和靶細(xì)胞結(jié)合，并且其中向靶細(xì)胞的兩種或兩種以上樣品中加 入不同濃度的抗體；其中在加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后基質(zhì)上的電極間的阻抗下降，表明 在檢測(cè)培養(yǎng)基中ADCC功能受到影響，并測(cè)定導(dǎo)致阻抗最大下降的抗體 濃度，作為最適濃度。
44. 一種測(cè)定抗體是否結(jié)合靶細(xì)胞上的頂端抗原的方法，包括(a) 監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極 之間的阻抗；和(b) 向靼細(xì)胞中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體；其中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后基質(zhì)上的電極間的阻抗下降，表明抗 體結(jié)合耙細(xì)胞上的頂端抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性(ADCC)的方法，該方法不需要標(biāo)記，并可以實(shí)時(shí)地對(duì)粘附的細(xì)胞進(jìn)行。該方法包括例如，(a)監(jiān)測(cè)支持靶細(xì)胞在檢測(cè)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的非導(dǎo)電基質(zhì)上的電極之間的阻抗；和(b)向檢測(cè)培養(yǎng)基中加入效應(yīng)的細(xì)胞和結(jié)合靶細(xì)胞的一種抗體；其中加入效應(yīng)細(xì)胞和抗體后，基質(zhì)上的電極之間的阻抗下降表明在檢測(cè)培養(yǎng)基中ADCC功能已經(jīng)生效。
文檔編號(hào)G01N33/50GK101395471SQ200780006549
公開(kāi)日2009年3月25日 申請(qǐng)日期2007年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月4日
發(fā)明者J·庫(kù)尼奇, 誠(chéng) 劉 申請(qǐng)人:諾華公司