專利名稱：：Cyp2c9基因擴增用引物對、含有其的cyp2c9基因擴增用試劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于擴增CYP2C9基因的引物對，含有該引物對的CYP2C9基因擴增用試劑及其用途。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞色素P450是被分類為超家族的酶類，存在多個亞家族(例如，CYP1A、CYP1B、CYP2C、CYP2D、CYP2E、CYP3A等)。這其中，現(xiàn)已闡明編碼人CYP2C亞家族的同工酶CYP2C9的基因(CYP2C9基因)的突變對CYP2C9的底物藥物-苯妥英(抗癲癇劑)和華法林(抗凝血藥)的處置和效果有影響。已知CYP2C9基因的多態(tài)性CYP2CW3是氨基酸第359位(外顯子7)的異亮氨酸變?yōu)榱涟彼岬耐蛔?非專利文獻(xiàn)l)。而且，存在該CYP2C9*3的氨基酸第359位是底物藥物的識別位點，由于該氨基酸改變、立體結(jié)構(gòu)(P-鏈)變化，因此對藥物代謝相關(guān)的酶的功能有影響。因此，為了預(yù)測藥物所產(chǎn)生的副作用、確定顯示更好效果的給藥條件，研究CYP2C9基因的多態(tài)性CYP2CW3十分重要。另外，作為在基因水平解析所有疾病的原因、個體間的疾病易感性(易患疾病)、個體間的藥效的差異等的方法，廣泛地進(jìn)行點突變、所謂的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測。點突變的通常檢測方法可以舉出(1)利用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴增試樣的目的DNA的相當(dāng)于檢測對象序列的區(qū)域，再對其全基因序列進(jìn)行解析的直接測序法；(2)利用PCR擴增試樣的目的DNA的相當(dāng)于才企測對象序列的區(qū)域，通過隨上述才企測對象序列有無目的突變而切斷作用不同的限制酶，將該擴增產(chǎn)物切斷，進(jìn)行電泳從而進(jìn)行分型的RFLP解析；(3)使用目的突變位于3，末端區(qū)域的引物進(jìn)行PCR，通過有無擴增判斷突變的ASP-PCR法等。但是，這些方法例如必須進(jìn)行由試樣提取的DNA的精制、電泳、限制酶處理等，因此需要功夫和成本。另外，進(jìn)行PCR后，有必要暫時開啟反應(yīng)容器，因此有上述擴增產(chǎn)物混入到之后的反應(yīng)體系內(nèi)、解析精度降低的顧慮。而且，由于自動化困難，因此無法解析大量的樣品。另外，上述(3)的ASP-PCR法還存在特異性低的問題。由該問題出發(fā)，近年來作為點突變的檢測方法，正在實施對由目的核酸和探針形成的雙鏈核酸的融解溫度(Tm)進(jìn)行分析的方法。這種方法由于通過Tm分析或上述雙鏈的融解曲線的分析來進(jìn)行，因此稱作融解曲線分析。其為如下的方法。即，首先使用與含有檢測目的的點突變的檢測對象序列互補的探針，形成檢測試樣的目的單鏈DNA與上述探針的雜交體(雙鏈DNA)。對該雜交產(chǎn)物實施加熱處理，通過吸光度等信號的變動檢測隨著溫度上升的雜交體的解離(融解)。然后，根據(jù)該檢測結(jié)果確定Tm值，從而判斷有無點突變。在雜交產(chǎn)物的同源性越高時Tm值越高、同源性越低時Tm值越低。因此，對于含有點突變的檢測對象序列和與其互補的探針形成的雜交產(chǎn)物，預(yù)先求得Tm值(評價標(biāo)準(zhǔn)值)，測定4企測試樣的目的單鏈DNA和上述探針的Tm值(測定值)。上述測定值與評價標(biāo)準(zhǔn)值相同時，則可以判斷為匹配、即目的DNA存在點突變，測定〗直4氐于評1"介標(biāo)準(zhǔn)值時，則可以判斷為錯配、即目的DNA不存在點突變。而且，通過該方法還可以實現(xiàn)基因解析自動化。但是，對于這種利用Tm分析的檢測方法而言，存在著在PCR中，必須特異且高效地擴增含有檢測目的位點的區(qū)域的問題。尤其是，CYP存在許多同工酶，編碼這些酶的序列又極為類似，因此就有這樣的擔(dān)憂，即在PCR中連CYP2C9之外的同工酶的編碼基因也^皮擴增。而且，這種連其它同工酶的編碼基因也被擴增的情形，也成為例如使分析結(jié)果的可信度降低的原因。而且，這樣一來，由于分析l個樣本時伴隨過多勞動力，因此存在著實際上不能實現(xiàn)分析大量試樣的問題。非專利文獻(xiàn)PMID:8873220Pharmacogenetics.1996Aug;6(4):341-9。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的在于提供通過基因擴增法能夠特異且高效地擴增CYP2C9基因的目的區(qū)域的引物對。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的引物對，其特征在于，其為用于通過基因擴增法擴增CYP2C9基因的引物對，含有以下引物對(1):引物對(1):包括含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對(Fl):與序列號1的堿基序列中的、以第52466位的腺嘌呤堿基(A)作為第1個堿基向著5'方向直至第14~18個堿基的區(qū)域序列相同的至少一段寡核苷酸，該寡核苷酸以上述腺噤呤堿基(A)作為3'末端(Rl):與序列號1的堿基序列中的、以第52631位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1個堿基向著3'方向直至第19~36個堿基的區(qū)域互補的至少一段寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第52631位的胸腺嘧啶堿基(T)互補的腺噤呤堿基(A)作為3，末端而且，本發(fā)明的基因擴增用試劑，其特征在于，其是一種用于通過基因擴增法擴增CYP2C9基因的試劑，含有上述本發(fā)明的CYP2C9基因擴增用引物對。本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制備方法，其特征在于，其是一種通過基因擴增法制備CYP2C9基因的擴增產(chǎn)物的方法，含有下述(I)步驟(I)以試樣中的核酸作為模板，使用本發(fā)明的CYP2C9基因擴增用引物對，在反應(yīng)液中擴增上述CYP2C9基因的步驟。本發(fā)明的多態(tài)性分析方法，其特征在于，其是分析CYP2C9基因中的檢測對象位點的多態(tài)性的方法，包括以下步驟(i)~(W)。(i)通過本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制備方法，在反應(yīng)液中擴增CYP2C9基因中含有檢測對象位點的區(qū)域的步驟(ii)準(zhǔn)備含有上述步驟(i)中的擴增產(chǎn)物和能夠與上述檢測對象位點雜交的探針的反應(yīng)液的步驟(iii)改變上述反應(yīng)液的溫度，測定上述擴增產(chǎn)物和上述探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號值的步驟(iv)根據(jù)伴隨溫度變化的上述信號值的變動，確定上述檢測對象位點的多態(tài)性的步驟根據(jù)本發(fā)明的引物，能夠在反應(yīng)液中特異且高效地擴增CYP2C9基因中的含有發(fā)生檢測目的多態(tài)性CYP2C"3的位點的目的區(qū)域。因此，與上述的現(xiàn)有方法不同，能夠減少功夫和成本。另外，由于如此特異地擴增含有發(fā)生CYP2C^3的檢測對象位點的區(qū)域，再通過使用例如與含有纟企測對象位點的才企測對象序列互補的探針，能夠使用上述反應(yīng)液直接進(jìn)行Tm分析、將上述多態(tài)性分型。另外，由于能在一個反應(yīng)液中進(jìn)行上述目的區(qū)域的擴增和多態(tài)性的分型，因此還能夠?qū)崿F(xiàn)操作的自動化。而且，當(dāng)使用本發(fā)明的引物對時，例如即便是含有雜質(zhì)的試樣(例如全血或口腔粘膜等)，也能省略預(yù)處理、更為迅速且筒單地進(jìn)行擴增反應(yīng)。另外，當(dāng)使用本發(fā)明的引物對時，能以優(yōu)于以往的擴增效率進(jìn)行擴增反應(yīng)，因此還能夠縮短擴增反應(yīng)。因此，通過本發(fā)明的引物對、含有其的試劑以及使用它們的擴增產(chǎn)物的制備方法和多態(tài)性分析方法，能迅速且簡單地分析CYP2C9基因的多態(tài)性，在醫(yī)療領(lǐng)域是非常有效的。圖1是表示本發(fā)明的實施例1中Tm分析的結(jié)果的圖。圖2是表示本發(fā)明的上述實施例1中Tm分析的結(jié)果的圖。圖3是表示本發(fā)明的實施例2中Tm分析的結(jié)果的圖具體實施例方式<CYP2C9基因擴增用引物對>本發(fā)明的CYP2C9基因擴增用引物對，如上所述，其特征在于，其含有上述引物對(1)。根據(jù)該引物對(1),如上所述，能夠特異且高效地擴增含有CYP2C9*3發(fā)生的檢測對象位點的目的區(qū)域。因此，使用本發(fā)明的引物對擴增該區(qū)域，能比以往更高效地進(jìn)行CYP2C9基因多態(tài)性的分析。另外，以下有時將正向引物稱為F引物，將反向引物稱為R引物。上述引物對(1)，如上所述，是包含含有下述(Fl)的寡核香酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對。(Fl):與序列號1的堿基序列中的、以第52466位的腺嘌呤堿基(A)作為第1個堿基向著5'方向直至第14-18個堿基的區(qū)域序列相同的至少一段寡核苷酸，該寡核苦酸以上述腺噤呤堿基(A)作為3'末端(Rl):與序列號1的堿基序列中的、以第52631位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1個堿基向著3'方向直至第19~36個堿基的區(qū)域互補的至少一段寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第52631位的胸腺嘧啶堿基(T)互補的腺噤呤堿基(A)作為3，末端序列號1所示的堿基序列是人細(xì)胞色素P450家族第2亞家族C多肽9(CYP2C9)的全長序歹'J，例如，NCBI登錄號No.AY702706所登錄的序歹'j。上述引物對(1)是用于擴增序列號l中的、含有第52467位~52630位的區(qū)域的DNA鏈及其互補鏈的引物對。已知該區(qū)域內(nèi)第52521位的堿基(序列號1中第52521位的石威基)存在對CYP2C9的功能產(chǎn)生影響的點突變(52521A、52521C),這種多態(tài)性就是上述的CYP2C9*3。如果第52521位的i咸基為A,則CYP2C9基因被翻譯為蛋白質(zhì)時，氨基酸第359位為異亮氨酸(Ile)，第52521位的堿基如果為C,則顯示氨基酸第359位為亮氨酸(Leu)的多態(tài)性。本發(fā)明中，在純合子時該位點的多態(tài)性可以用52521A/A、52521C/C表示，在為雜合子時該位點的多態(tài)性可以用52521A/C來表示。以下，也將該引物對(l)稱為"CYP2C9承3用引物對"。在本發(fā)明中，引物對(1)的F1引物和R1引物只要決定DNA聚合酶擴增起始點的3，末端的堿基滿足上述條件即可。這樣一來，通過固定上述引物的3，末端的堿基，能夠充分防止引物對(1)與例如類似的其它同工酶的基因(例如CYP2C8、CYP2C17、CYP2C18、CYP2C19基因等)結(jié)合。這樣一來，由于只要F1引物和R1引物3，末端的堿基被固定即可，因此各引物的長度自身沒有特別的限制，可以適當(dāng)調(diào)整到通常的長度。作為引物長度的一例，例如在13~50mer的范圍內(nèi)，優(yōu)選1445mer,更優(yōu)選1540mer。作為具體例子，上述F1引物優(yōu)選如下與序列號l的石成基序列中的、以第52466位的腺。票呤》咸基(A)作為第1個堿基向著5，方向直至第1418個堿基(優(yōu)選第14~17個堿基，更優(yōu)選第15~17個堿基)的區(qū)域序列相同的至少一段寡核苷酸。而且，上述R1引物優(yōu)選如下與序列號l的堿基序列中的、以第52631位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第l個堿基向著3，方向直至第19~36個(優(yōu)選第22~30個堿基，更優(yōu)選第23~29個堿基)的區(qū)域互補的至少一段寡核苷酸。而且，由于F1引物和R1引物的3，末端被固定，由引物延伸出的區(qū)域如上所述是例如序列號1中第52467位~第52630位的區(qū)域，獲得的擴增產(chǎn)物的總長根據(jù)所使用的引物長度而變化。而且，Rl引物可以是不與序列號l所示的堿基序列完全互補的寡核苷酸，F(xiàn)l引物也可以是不與上述石咸基序列的互補鏈完全互補的寡核苷酸。即，前述各引物中，除3，末端的堿基以外的部分可以與完全互補的寡核苷酸有l(wèi)~5個石成基不同。以下，列舉F1引物和R1引物的具體例子，本發(fā)明不限于此。而且，這些F1引物和R1引物的組合沒有任何限制，這其中，特別優(yōu)選包括含有序列號2或序列號4的寡核苷酸的F1，引物、和含有序列號14或序列號17的寡核苷酸的R1，引物的引物對(1，)。另外，下表中"Tm(。C)"是下表的序列和與其完全互補的序列雜交時的Tm(。C),是用MELTCALC軟件(http:〃www.meltcalc.com/)、將參iU殳為寡核普酸濃度0.2jiM、鈉當(dāng)量(Naeq.)50mM而計算的值。上述Tm值，可以用例如目前已知的MELTCALC軟件(http:〃www.meltcalc.com/)等計算，而且，還可以用臨接法(NearestNeighborMethod)確定(以下相同)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>而且，為了提高擴增反應(yīng)的反應(yīng)溫度，上述引物對(l)的各引物例如可以在5，末端添加目前已知的4壬意序列。含有這種引物對(1)的本發(fā)明的CYP2C9基因擴增用引物對優(yōu)選在擴增全血試樣等生物試樣中的CYP2C9基因時使用。尤其是，本發(fā)明的CYP2C9基因擴增用引物對在與后述的多態(tài)性檢測用探針一起使用時，基因擴增用反應(yīng)液中的全血試樣的添加比例優(yōu)選為O.l~0.5體積％。對于這點，后文有述。〈CYP2C9基因擴增用試劑〉本發(fā)明的CYP2C9基因擴增用試劑，如上所述，其特征在于，其是用于通過基因擴增法擴增CYP2C9基因的試劑，含有本發(fā)明的CYP2C9基因擴增用引物對。本發(fā)明的基因擴增用試劑的特征在于含有本發(fā)明的引物對，此外的組成等沒有任何限定。為了對使用本發(fā)明的引物對、通過基因擴增法獲得的擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，本發(fā)明的CYP2C9基因擴增用試劑，還可以含有探針。如上所述，使用本發(fā)明的引物對，通過基因擴增法能獲得含有出現(xiàn)CYP2C9*3的檢測對象位點的目的區(qū)域的擴增產(chǎn)物。因此，同時存在有與上述目的區(qū)域的檢測對象序列互補的探針，由此能夠使用后述的方法檢測例如擴增的有無、檢測對象位點的基因型(多態(tài)性)等。對于這種探針及其利用方法，在之后的多態(tài)性分析方法中說明。而且，本發(fā)明的CYP2C9基因擴增用試劑優(yōu)選在擴增全血等生物試樣中的CYP2C9基因時使用。尤其是，本發(fā)明的CYP2C9基因擴增用試劑在與上述的探針一起使用時，基因擴增用反應(yīng)液中的全血試樣的添加比例優(yōu)選為O.l~0.5體積％。而且，在本發(fā)明中，所謂"檢測對象序列"是指含有多態(tài)性發(fā)生位點(檢測對象位點)的序列。本發(fā)明的CYP2C9基因擴增用試劑的形態(tài)沒有特別限定，例如可以是含有本發(fā)明的CYP2C9基因擴增用引物對的液體試劑，也可以是使用前用溶劑懸浮的干燥試劑。而且，CYP2C9基因擴增用引物對的含量也沒有特別的限制。<擴增產(chǎn)物的制備方法〉本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制備方法，如上所述，，其特征在于，其是通過基因擴增法制備CYP2C9基因的擴增產(chǎn)物的方法，含有下述步驟(1)。(I)以試樣中的核酸作為模板，使用本發(fā)明的CYP2C9基因擴增用引物對在反應(yīng)液中擴增上述CYP2C9基因的步驟這樣一來，通過使用本發(fā)明的引物對進(jìn)行擴增反應(yīng)，如上所述，能夠特異且高效地擴增CYP2C9基因中含有多態(tài)性CYP2C"3的檢測對象位點的目的區(qū)域。而且，本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制備方法，特征在于使用本發(fā)明的引物對，對基因擴增法的種類、條件等沒有任何限制。上述基因擴增法如上所述并無特別限定，例如可以舉出PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶鏈反應(yīng))法、NASBA(Nucleicacidsequencebasedamplification,基于斗亥酸序歹寸的擴增)法、TMA(Transcriptionmediatedamplification,轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增)法、SDA(StrandDisplacementAmplification,鏈置換擴增)法等，優(yōu)選PCR法。另外，以下以PCR法為例說明本發(fā)明，但并非局限于此。作為使用本發(fā)明的試樣，例如只要含有成為模板的核酸即可，并無特別限定，例如優(yōu)選應(yīng)用于含有雜質(zhì)的試樣。作為上述含有雜質(zhì)的試樣例如可以舉出全血、口腔內(nèi)細(xì)月包(例如口腔粘膜)、指曱或毛發(fā)等體細(xì)胞、生殖細(xì)胞、吐出的痰液、羊水、石蠟包埋組織、尿、胃液(例如胃洗滌液)等、它們的懸浮液等。通過使用本發(fā)明引物對的擴增產(chǎn)物的制備方法，例如即便是含有各種雜質(zhì)的試樣(特別是全血或口腔細(xì)胞等生物試樣)，也不易受雜質(zhì)影響、能夠特異地擴增CYP2C9基因的上述目的區(qū)域。因此，通過本發(fā)明，即便是通過以往方法較難測定的全血等雜質(zhì)多的試樣，例如也可以不進(jìn)行精制等預(yù)處理直接使用。因此，從試樣的預(yù)處理的觀點出發(fā)，可以較以往方法更為迅速地制備擴增產(chǎn)物。上述反應(yīng)液中的試樣添加比例并無特別限定。作為具體例，當(dāng)上述試樣為生物試樣(例如全血試樣)時，上述反應(yīng)液中的添加比例的下限例如優(yōu)選為0.01體積％以上、更優(yōu)選為0.05體積%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為0.1體積％以上。上述添加比例的上限并無特別限定，例如優(yōu)選為2體積％以下、更優(yōu)選為1體積％以下、進(jìn)一步優(yōu)選為0.5體積％以下。另外，以后述的光學(xué)檢測為目的時，特別是使用標(biāo)記探針進(jìn)行光學(xué)^r測時，全血試樣這類生物試樣的添加比例例如優(yōu)選設(shè)定為O.l~0.5體積％。在PCR反應(yīng)中，通常為了使DNA變性(解離成單鏈DNA)而實施加熱處理，^旦由于該加熱處理，試沖羊所含的糖、蛋白質(zhì)等變性，有產(chǎn)生不溶沉淀物、混濁等的顧慮。因此，在利用光學(xué)方法確認(rèn)擴增產(chǎn)物的有無、檢測對象位點的基因型(多態(tài)性)時，這種沉淀物、混濁的發(fā)生有可能對測定精度造成影響。但是，通過將反應(yīng)液中的全血試樣的添加比例設(shè)定在上述范圍內(nèi)，雖然原理不明，但能充分防止變性所產(chǎn)生的沉淀物等，因此能夠提高光學(xué)方法的測定精度。另外，由于還可充分地抑制全血試樣中的雜質(zhì)對PCR的干擾，因此能夠進(jìn)一步提高擴增效率。因而，在使用本發(fā)明的引物對的基礎(chǔ)上，通過進(jìn)一步將全血試樣等試樣的添加比例設(shè)定在上述范圍內(nèi)，可以進(jìn)一步排除試樣預(yù)處理的必要性。另夕卜，上述反應(yīng)液中的全血試樣的比例不僅可以用上述體積比例(例如O.l~0.5體積％)，還可以用血紅蛋白(以下稱作"Hb")的重量比例表示。此時，上述反應(yīng)液中的全血試樣的比例換算為Hb例如優(yōu)選為0.565~113g/L的范圍、更優(yōu)選為2.825~56.5g/L的范圍、進(jìn)一步優(yōu)選為5.65~28.25g/L的范圍。另夕卜，上述反應(yīng)液中的全血試樣的添加比例例如可以滿足上述體積比例和Hb重量比例兩者，也可以滿足任一者。作為全血，例如可以是溶血的全血、未溶血的全血、抗凝固全血、含有凝固部分的全血等的任一種。本發(fā)明中，試樣所含的目的核酸例如為DNA。上述DNA例如可以是生物試樣等試樣中原本含有的DNA,還可以是通過基因擴增法擴增出的擴增產(chǎn)物DNA。為后者時，可以舉出利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(例如RT-PCR,逆轉(zhuǎn)錄PCR)由上述試樣原本含有的RNA(總RNA、mRNA等)產(chǎn)生的cDNA。本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制備方法中，優(yōu)選在基因擴增反應(yīng)開始前，向上述反應(yīng)液中添加白蛋白。通過這種白蛋白的添加，例如能夠進(jìn)一步降低上述沉淀物、混濁的產(chǎn)生所帶來的影響，且能夠進(jìn)一步提高擴增效率。具體地說，優(yōu)選在上述(I)工序的擴增反應(yīng)或解離為單鏈DNA的工序前添加白蛋白。上述反應(yīng)液中白蛋白的添加比例例如為0.01~2重量％的范圍、優(yōu)選為0.1~1重量％、更優(yōu)選為0.2~0.8重量％。上述白蛋白并無特別限定，例如可以舉出牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、馬血清白蛋白等，這些物質(zhì)可以使用任一種，還可以并用兩種以上。然后，對于本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制備方法列舉如下的例子進(jìn)行說明，上述例子為對全血試樣，以DNA作為目的核酸，使用本發(fā)明的引物對，利用PCR制備CYP2C9基因的上述目的區(qū)域的擴增產(chǎn)物。本發(fā)明是以使用本發(fā)明的引物對為特征，對其它的構(gòu)成和條件沒有任何限定。首先，制備PCR反應(yīng)液。本發(fā)明的引物對的添加比例并無特別限定，優(yōu)選按照引物對(1)的F引物達(dá)到O.l~2pmol/L的方式進(jìn)行添加、更優(yōu)選為0.25~1.5|imol/L、特別優(yōu)選為0.5~l|imol/L。另外，優(yōu)選按照引物對(1)的R引物達(dá)到O.l~2pmol/L的方式進(jìn)4亍添加、更優(yōu)選為0.25~1.5pmol/L、特別優(yōu)選為0.5~l|imol/L。引物對中的F引物和R引物的添加比例(F:R,摩爾比)并無特別限定，例如優(yōu)選為l:0.25~1:4、更優(yōu)選為l:0.5~1:2。反應(yīng)液中全血試樣的比例并無特別限定，優(yōu)選上述的范圍。全血試樣可以直接添加在反應(yīng)液中，也可以預(yù)先用水或緩沖液等溶劑稀釋后添加至反應(yīng)液中。預(yù)先稀釋全血試樣時，其稀釋率并無特別限定，例如稀釋率可以4安照反應(yīng)液中最終全血添加比例達(dá)到上述范圍來進(jìn)行設(shè)定，例如設(shè)定為100~2000倍、優(yōu)選為200~IOOO倍。上述反應(yīng)液中的其它組成成分并無特別限定，可以舉出目前已知的成分，其比例也無特別限定。上述組成成分例如可以舉出DNA聚合酶、核苷酸(核苷三磷酸(dNTP))和溶劑。另外，如上所述，優(yōu)選上述反應(yīng)液中進(jìn)一步含有白蛋白。另外，上述反應(yīng)液中，各組成成分的添加順序并無任何限定。上述DNA聚合酶并無特別限定，例如可以4吏用目前已知的耐熱性細(xì)菌來源的聚合酶。具體例子有可以商業(yè)地荻得的來自棲熱水生菌(7Tzermwsa《M"〃cw)的DNA聚合酶(美國專利第4，889,818號以及美國專利第5,079，352號)(商品名Taq聚合酶)、來自極端嗜熱菌(7Tzwwwf/zerwop/2,7w)的DNA聚合酶(WO91/09950XrTthDNApolymerase)、來自強烈火球菌(尸戶coccws/w〃'oy^)的DNA聚合酶(WO92/9689)(PfuDNApolymerase:Stratagenes公司產(chǎn))、來自嗜熱球菌(T7ze削ococcws/"om/zi)的DNA聚合酶(EP-A455430)(商標(biāo)Vent:NewEnglandBiolabs公司產(chǎn))等，其中，優(yōu)選來自棲熱水生菌(T7zerww"《wa"cw)的耐熱性DNA聚合酶。上述反應(yīng)液中DNA聚合酶的添加比例并無特別限定，例如為l100U/mL、j尤選為5~50U/mL、更^尤選為20~30U/mL。另外，DNA聚合酶的活性單位(U)—般是將如下的活性作為1U:以活化鮭魚精子DNA為模板引物，在活性測定用反應(yīng)液中、74。C下、30分鐘內(nèi)，將10nmol的總核苷酸吸收到酸不溶性沉淀物中的活性。上述活性測定用反應(yīng)液的組成例如為25mMTAPSbuffer(pH9.3、25。C)、50mMKCl、2mMMgCl2、lmM巰基乙西事、200|iMdATP、200|iMdGTP、200|iMdTTP、100MM"a-32p，，dCTP、0.25mg/mL活化鮭魚精子DNA。上述核苦三磷酸通常可以舉出dNTP(dATP、dCTP、dTTP)。上述反應(yīng)液中的dNTP的添加比例并無特別限定，例如為0.01~lmmol/L、優(yōu)選為0.05~0.5mmol/L、更優(yōu)選為0.1~0.3mmol/L。上述溶劑例如可以舉出Tris-HCl、N-三(羥甲基)曱基甘氨酸(Tricine)、MES、MOPS、HEPES、CAPS等緩沖液，可以使用市售的PCR用緩沖液或市售的PCR試劑盒的緩沖液等。另外，上述PCR反應(yīng)液還可以含有肝素、甜菜,咸、KC1、MgCl2、MgS04、甘油等，它們的添加比例例如可以設(shè)定為不干擾PCR反應(yīng)的范圍。反應(yīng)液的總體積并無特別限定，例如可以根據(jù)所用機器(熱循環(huán)儀)等適當(dāng)?shù)卦O(shè)定，通常為l500iiL、優(yōu)選為10~100(iL。接著，進(jìn)行PCR。PCR循環(huán)條件并無特別限定，例如(l)全血來源的雙鏈DNA解離成單鏈DNA、(2)引物的退火、(3)引物的延伸(聚合酶反應(yīng))分別如下上述。另外，循環(huán)數(shù)也無特別限定，以下述(l)~(3)的3步驟為1個循環(huán)，例如優(yōu)選為30個循環(huán)。上限并無特別限定，例如共計100個循環(huán)以下、優(yōu)選70個循環(huán)以下、更優(yōu)選50個循環(huán)以下。各步驟的溫度變化例如可以使用熱循環(huán)儀等自動地控制。使用本發(fā)明的引物對時，如上所述由于擴增效率優(yōu)異，因此與利用以往方法時50個循環(huán)需要3小時左右相比，利用本發(fā)明能夠在約l小時左右(優(yōu)選l小時以內(nèi))完成50個循環(huán)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>按上述方式，能夠制備與CYP2C9基因中含有CYP2C^3的檢測對象位點的區(qū)域互補的擴增產(chǎn)物。本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制備方法還可以包括檢測通過上述擴增反應(yīng)而得的上述擴增產(chǎn)物的步驟。通過該步驟，能夠檢測擴增產(chǎn)物的有無、CYP2C9基因的上述目的區(qū)域的基因型(多態(tài)性CYP2CW3)。擴增產(chǎn)物的有無可以按照目前已知的方法來確認(rèn)。具體來說，在上述(I)工序中，在上述反應(yīng)液中預(yù)先添加作為能夠與上述目的區(qū)域的檢測對象序列互補的序列的焚光標(biāo)記探針，進(jìn)而，可以通過(II)工序，即對于上述反應(yīng)液測定上述探針的熒光標(biāo)記的熒光強度來確認(rèn)。而且，下文將CYP2C9基因中的CYP2C^3的檢測作為本發(fā)明的一個方式來進(jìn)行說明?！碈YP2C9基因的多態(tài)性分析方法>本發(fā)明的CYP2C9基因的多態(tài)性分析方法，其特征在于，其是分析CYP2C9基因中的檢測對象位點的多態(tài)性(CYP2C9*3)的方法，含有以下步驟(i)~(iv)。(i)通過本發(fā)明的擴增產(chǎn)物的制備方法，在反應(yīng)液中擴增CYP2C9基因中含有才企測對象位點的區(qū)域的步驟(ii)準(zhǔn)備含有上述步驟(i)中的擴增產(chǎn)物和能夠與上述檢測對象位點雜交的探針的反應(yīng)液的步驟(iii)改變上述反應(yīng)液的溫度，測定上述擴增產(chǎn)物和上述探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號值的步驟(iv)根據(jù)伴隨溫度變化的上述信號值的變動，確定上述檢測對象位點的多態(tài)性的步驟這樣，通過使用本發(fā)明的引物對來制備擴增產(chǎn)物，如上所述，能夠擴增CYP2C9基因中的含有多態(tài)性CYP2C^3的檢測對象位點的目的區(qū)域。上述步驟(ii)中的探針沒有特別的限定，可以列舉例如與含有多態(tài)性CYP2C9*3的發(fā)生位點的檢測對象序列互補的探針(以下也稱為"CYP2CW3用探針")。該探針優(yōu)選為與含有上述檢測對象位點的檢測對象序列互補的探針。用于^r測上述多態(tài)性的探針，沒有特別的限定，可以通過目前已知的方法i殳定。例如，可以將CYP2C9基因的正義鏈的序列作為含有多態(tài)性的檢測對象位點的檢測對象序列，基于此設(shè)計探針；或?qū)⒎戳x鏈的序列作為含有多態(tài)性的檢測對象位,$、的檢測對象序列，基于此設(shè)計探針。而且，多態(tài)性的檢測對象位點的石咸基可以才艮據(jù)多態(tài)性的種類適當(dāng)確定。即，CYP2C9*3已知序列號1中第52521位的堿基有"A"和"C"的多態(tài)性，據(jù)此可以列舉例如與第52521位為A的檢測對象序列和第52521位為C的檢測對象序列中的任一條序列互補的探針(正義鏈的檢測用這樣，不論在設(shè)計探針時將發(fā)生多態(tài)'性的檢觀']對象位,泉的堿基設(shè)定為上述那樣的哪一種堿基，都可以通過后述的方法判斷CYP2C9基因的檢測對象位點呈現(xiàn)哪種多態(tài)性。上述探針可以在上述步驟(i)后，即對CYP2C9基因的目的區(qū)域進(jìn)行擴增反應(yīng)后，添加到擴增反應(yīng)液中，但為了容易且迅速地進(jìn)行分析，優(yōu)選在上述步驟(i)的擴增反應(yīng)前預(yù)先添加到反應(yīng)液中。上述反應(yīng)液中纟采針的添加比例并無特別限定，例如優(yōu)選按照探針達(dá)到10~400nmol/L的范圍的方式進(jìn)4亍添加，更優(yōu)選為20~200nmol/L。另夕卜，使用熒光染料作為4笨針的標(biāo)記時，例如為了調(diào)整所檢測的熒光強度，可以同時使用與標(biāo)記探針序列相同的未標(biāo)記揮:4十，該未標(biāo)記纟笨針可以在其3'末端添加有磷酸。此時，標(biāo)記探針與未標(biāo)記探針的摩爾比例如優(yōu)選為l:10-10:1。上述探針的長度并無特別限定，例如為550mer、優(yōu)選為10~30mer。對于Tm值進(jìn)行說明。當(dāng)持續(xù)加熱含有雙鏈DNA的溶液時，260nm的吸光度上升。這是由于雙鏈DNA雙鏈間的氬4建通過加熱而打開，解離成單鏈DNA(DNA的融解)。而且，當(dāng)全部雙鏈DNA解離、變?yōu)閱捂淒NA時，其吸光度顯示為加熱開始時的吸光度(僅雙《連DNA時的吸光度)的約1.5倍左右，由此可以判斷融解結(jié)束。根據(jù)該現(xiàn)象，融解溫度Tm—般定義為吸光度到達(dá)吸光度總上升量的50%時的溫度。在上述(iii)工序中，測定上述擴增產(chǎn)物與上述探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號，既可以是上述260nm的吸光度的測定，還可以是標(biāo)記物的信號的測定。具體地i兌，優(yōu)選如下使用被標(biāo)記物標(biāo)記的標(biāo)記探針作為上述探針，測定上述標(biāo)記物的信號。上述標(biāo)記探針例如可以舉出單獨顯示信號、由于雜交而不顯示信號的標(biāo)記探針；或者單獨不顯示信號、由于雜交而顯示信號的標(biāo)記探針。為前者的探針時，在與檢測對象序列形成雜交體(雙鏈DNA)時不顯示信號，通過加熱而使探針游離時，則顯示信號。另外，為后者的探針時，在與檢測對象序列形成雜交體(雙鏈DNA)時顯示信號，通過加熱而使探針游離時，則信號減少(消失)。因此，通過利用信號特有的條件(吸收波長等)^r測該標(biāo)記所產(chǎn)生的信號，可以與上述260nm的吸光度測定同樣，在融解進(jìn)行的同時確定Tm值等。上述標(biāo)記探針的標(biāo)記物的具體例子，例如可以舉出熒光染料(熒光團)。上述標(biāo)記探針的具體例子例如優(yōu)選用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記、單獨顯示熒光、且由于雜交熒光減少(例如猝滅)的#笨4十。這種利用焚光摔滅i見象(Quenchingphenomenon)的神笨針中，特別優(yōu)選將寡核苷酸設(shè)計成3，末端或5，末端為C、且當(dāng)其末端的C與G靠近時發(fā)光減弱的被熒光染料標(biāo)記的探針。這種探針一般被稱作鳥。票呤猝滅探針，已知有所謂的QProbe(注冊商標(biāo))。使用這種探針時，利用信號的變動能夠容易地確認(rèn)雜交和解離。上述熒光染料并無特別限定，例如可以舉出熒光染料、磷光體、羅丹明、聚甲炔染料衍生物等，作為市售的熒光染料例^口可以舉出BODIPYFL(商才示、manufacturedbyMolecularProbeInc.牙土制)、FluorePrime(商品名、AmershamPharmacia制)、Fluoredite(商品名、Milipore社制)、FAM(ABI社制)、Cy3和Cy5(AmershamPharmacia制)、TAMRA(manufacturedbyMolecularProbeInc.社制)等。才全測條件沒有特別限定，可以根據(jù)所用的熒光染料適當(dāng)確定，例如太平洋藍(lán)(PacificBlue)的斗企測波長為450~480nm、TAMRA的4全測波長為585~700nm、BODIPYFL的4全測波長為515~555nm。以下，列舉用于檢測CYP2C9*3的探針序列的具體例子，但本發(fā)明不限于此。下述探針是用于檢測正義鏈的探針。探針與序列號1中的、以第52516位的鳥嘌呤i咸基(G)作為第1個堿基向著3'方向直至第17~22個堿基的區(qū)域互補的至少一段寡核苷酸，該寡核苷酸以上述鳥。票呤堿基作為3'末端在上述探針中，與序列號l的第52521位互補的堿基用k表示，上述k是G或T。進(jìn)而，上述探針的具體例子示于下表。而且，下表中"Tm(°C)"是下表的序列和與其完全互補的序列雜交時的Tm(°C),是用MELTCALC軟件(http:〃www.meltcalc.com/)、將參數(shù)設(shè)為寡核苷酸濃度0.2[iM、鈉當(dāng)量(Na叫.)50mM而計算的值。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>上表中探針含有與序列號1中第52521位為C的區(qū)域互補的序列，大寫的堿基表示與序列號1第52521位的堿基互補的堿基。而且，在上述探針中，上述大寫的堿基可以被k替代，上述k可以是G和T的任意一個。本發(fā)明中探針的具體例子，例如還可以是上述表中所示的寡核苷酸的互補鏈。上述探針是一個例子，本發(fā)明不限于此。CYP2C9用探針?biāo)帷＠?，將上表中所示的探針制成鳥。票呤猝滅探針時，優(yōu)選用上述那樣的熒光染料(例如BODIPYFL、TAMRA等)標(biāo)記3，末端的胞嘧啶。而且，對于5，末端標(biāo)記了熒光染料的探針，例如為了防止探針自身伸長，可以在其3，末端上再添加磷酸基。然后，列舉一個例子來說明本發(fā)明的才全測方法，上述例子為使用下述探針來檢測CYP2C9基因中的多態(tài)性CYP2CW3。而且，本發(fā)明不限于此。(探針)CYP2C9"用探針5'-gggagaaggtcaaggtatc-(BODIPYFL)-3，(序歹'J號28),或5，-ggagaaggtcaaGgtatc-(BODIPYFL)-3，(序歹'j號29)首先，使用添加了上述標(biāo)記探針的反應(yīng)液，如上所述地進(jìn)行PCR,擴增CYP2C9基因的上述目的區(qū)域。上述反應(yīng)液含有例如本發(fā)明的CYP2C9基因擴增用引物對、DNA聚合酶、dNTP、含有作為模板的核酸的試樣和上述探針。此外還可含有可以用于核酸擴增的各種添加劑。接著，進(jìn)行所得的擴增產(chǎn)物的解離、以及通過解離獲得的單鏈DNA與上述標(biāo)記揮:針的雜交。這可以通過例如改變上述反應(yīng)液的溫度來進(jìn)行。上述解離工序的加熱溫度只要是上述擴增產(chǎn)物能夠解離的溫度則無特別限定，例如為8595。C。加熱時間也無特別限定，通常為1秒10分鐘、優(yōu)選1秒5分鐘。解離的單《連DNA和上述標(biāo)記纟笨^"的雜交例如可以在上述解離工序后，通過降低上述解離工序的加熱溫度來進(jìn)行。溫度條件例如為405(TC。然后，改變上述反應(yīng)液的溫度，測定上述擴增產(chǎn)物與上述標(biāo)記探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號值。具體地說，例如加熱上述反應(yīng)液(上述單鏈DNA與上述標(biāo)記探針的雜交產(chǎn)物)，測定隨溫度上升的信號值的變動。如上所述，當(dāng)使用末端的C堿基被標(biāo)記的探針(鳥嘌呤猝滅探針)時，在與單鏈DNA雜交的狀態(tài)下，熒光減少(或者猝滅)，在解離的狀態(tài)下發(fā)出熒光。因此，例如可以慢慢加熱熒光減少(或者猝滅)的雜交產(chǎn)物，測定隨溫度上升的焚光強度的增加。測定焚光強度變動時的溫度范圍并無特別限定，例如開始溫度為室溫85。C、優(yōu)選為2570。C,終止溫度例如為40105°C。另夕卜，溫度的上升速度并無特別限定，例如為O.l~20°C/秒、優(yōu)選為0.3~5"/秒。接著，分析上述信號的變動來確定Tm值。具體地說，可以從所得熒光強度求得各溫度下每單位時間的熒光強度變化量(-d熒光強度增加量/dt),將顯示最低值的溫度作為Tm值。另外，可以將每單位時間的熒光強度增加量(熒光強度增加量/t)最高的點作為Tm值。另外，不使用猝滅探針，而是使用單獨不顯示信號且由于雜交顯示信號的探針作為標(biāo)記探針時，相反地可以測定熒光強度的減少量。然后，由該Tm值確定才全測對象位點的基因型。Tm分析中，可以獲得如下的結(jié)果與有一個堿基不同的雜交體(錯配)相比，完全互補的雜交體(匹配)其表示解離的Tm值增高。因此，通過對上述探針預(yù)先確定完全互補的雜交體的Tm值和有一個石咸基不同的雜交體的Tm值，能夠確定前述才全測對象位點的基因型。例如，在將檢測對象位點的堿基假設(shè)為突變型(例如假定序列號1的第52521位堿基為C)、使用與含有其的檢測對象序列互補的探針時，所形成的雜交體的Tm值若與完全互補的雜交體的Tm值相同，則可判定上述擴增產(chǎn)物的多態(tài)性為突變型。另夕卜，所形成的雜交體的Tm值若與有一個堿基不同的雜交體的Tm值相同(低于完全互補的雜交體的Tm值)，則可判定上述擴增產(chǎn)物的多態(tài)性為野生型(例如序列號1的第52521位的堿基為A)。而且，當(dāng)4企測到兩種Tm值時，可以判斷為雜合子。如此，由與標(biāo)記探針相應(yīng)的Tm值，可以判斷CYP2C9*3的基因型。另外，本發(fā)明中，還可以測定雜交時的信號變動來代替如上所述的升高含有上述探針的反應(yīng)液的溫度(加熱雜交產(chǎn)物)、測定伴隨溫度上升的信號變動的方法。即，也可以在降低含有上述探針的反應(yīng)液的溫度以形成雜交產(chǎn)物時，測定伴隨上述溫度降低的信號變動。作為具體例，當(dāng)使用單獨顯示信號、且由于雜交而不顯示信號的標(biāo)記探針(例如鳥嘌呤猝滅探針)時，在單鏈DNA和探針解離的狀態(tài)下發(fā)出熒光，但由于溫度降低而形成雜交體時，上述熒光減少(或者猝滅)。因此，例如可以慢慢降低上述反應(yīng)液的溫度，測定伴隨溫度降低的熒光強度的減少。另外，使用單獨不顯示信號、且由于雜交而顯示信號的標(biāo)記探針時，在單鏈DNA和探針解離的狀態(tài)下不發(fā)出熒光，但由于溫度降低而形成雜交體時，則發(fā)出熒光。因此，例如可以慢慢降低上述反應(yīng)液的溫度，測定伴隨溫度降低的焚光強度的增加。下面，對本發(fā)明的實施例進(jìn)行說明。但是，本發(fā)明不受下述實施例限制。實施例1對9名待測者用肝素鋰采血管進(jìn)行采血(試樣1~9)。將10pL獲得的血液與90|iL蒸餾水混合，再將10jiL該混合液與90|aL蒸餾水混合。將10pL該混合液添力口到40pL的下述組成的PCR反應(yīng)液中，用熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR。PCR的條件為95。C處理60秒后，以95。C下1秒和52。C下10秒作為l個循環(huán)，重復(fù)50個循環(huán)，再于95。C處理1秒、4(TC處理60秒。接著，將溫度的上升速度設(shè)為l。C/3秒，將上述PCR反應(yīng)液由40。C加熱到95。C,測定隨著時間的熒光強度的變化。檢測波長為515~555nm(熒光染料BODIPYFL的檢觀'J)。而且，50個循環(huán)的PCR所需要的時間約為l個小時。表4(PCR反應(yīng)液單位pl)蒸餾水8.755%NaN30.520%BSA140%甘油18.7510xGeneTaqbuffer*52.5mMdNTPs45|iMCYP2C9*3用4笨針1lOOpMCYP2C9Fl引物0.5100(iMCYP2C9Rl引物0.255U/plGeneTaqFP*__總計40^1*商品名GeneTaqFP:Nippongene乂>司制(探針)CYP2C9*3用探針5,-gggagaaggtcaaggtatc-(BODIPYFL)-3，(序歹'J號28)(引物對)CYP2C9"Fl引物5，-gagcccctgcatgcaa陽3，(序歹'J號4)CYP2C9"Rl引物5，-gatactatgaatttggggacttcgaa-3，(序歹'J號17)與CYP2C9*3用探針匹配的雜交體的Tm值為59°C，錯配的雜交體的Tm值為54°C。試樣1~9的結(jié)果示于圖1和2。這些圖是表示伴隨溫度上升的熒光強度的變化的Tm分析的圖，縱軸的微分值表示"-d熒光強度增加量/dt"，橫軸表示溫度(以下相同)。如這些圖所示，根據(jù)信號的峰確定各試樣中的CYP2C9*3的基因型。為了支持這些實施例的結(jié)果，對9名待測者通過RFLP法確認(rèn)CYP2C9*3的基因型，獲得了與實施例相同的結(jié)果。這樣，通過使用本發(fā)明的引物對，可以使用未實施預(yù)處理的全血試樣，特異且高效地擴增CYP2C9基因中含有CYP2C9*3的檢測對象位點的目的區(qū)域，并且分析多態(tài)性。實施例2對2名待測者用EDTA采血管進(jìn)行采血(試樣1~2)。將10|iL獲得的血液與70jiL下述稀釋液A混合，再將IO^iL該混合液與70|iL下述稀釋液B混合。將IO^iL所得的混合液于95°C加熱處理5分鐘后，再添加到46|iL下述組成的PCR反應(yīng)液中，用熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR。PCR的條件為95。C處理60秒后，以95°C下1秒和58。C下15秒作為1個循環(huán)，重復(fù)50個循環(huán)，再于95°C處理1秒、40。C處理60秒。接著，將溫度的上升速度設(shè)為l°C/3秒，將上述PCR反應(yīng)液由40。C加熱到75°C,測定隨著時間的熒光強度的變化。4企測波長為515~555nm(焚光染料BODIPYFL的檢測)。(稀釋液A)10mMTris-HCl(pH8),O.lmMEDTA,0.05%NaN3,0.3%SDS(稀釋液B)10mMTris-HCl(pH8)，O.lmMEDTA,0.05%NaN3表5(PCR反應(yīng)液單位pi)蒸餾水185%NaN30.520%BSA0.540%甘油1510xGeneTaqbuffer*52.5mMdNTPs45jaMCYP2C9*3用探針2lOO^MCYP2C9Fl引物0.5lOO(iMCYP2C9Rl引物0.255U/>1GeneTaqFP*0.25總計46|_d*商品名GeneTaqFP:Nippongene公司制(探針)CYP2C9*3用探針5，-ggagaaggtcaaggtatc-(BODIPYFL)畫3，(序歹寸號29)(引物對)CYP2C9*3Fl引物5，-cggagcccctgcatgcaa國3，(序歹寸號2)CYP2C9"Rl引物5'-aatgatactatgaatttggggacttcgaa隱3，(序歹ll號14)與CYP2C9*3用探針匹配的雜交體的Tm值為56°C，錯配的雜交體的Tm值為50°C。試樣1~2的結(jié)果示于圖3。該圖是表示伴隨溫度上升的熒光強度的變化的Tm分析的圖，縱軸的微分值表示"-d熒光強度增加量/dt",橫軸表示溫度。如該圖所示，根據(jù)信號的峰確定上述試樣中的CYP2C9*3的基因型。為了支持該實施例的結(jié)果，對2名待測者通過RFLP法確認(rèn)CYP2C9*3的基因型，獲得了與實施例相同的結(jié)果。這樣，通過使用本發(fā)明的引物對，可以使用未實施預(yù)處理的全血試樣特異且高效地擴增CYP2C9基因中含有CYP2C9*3的檢測對象位點的目的區(qū)域，并且分析多態(tài)性。工業(yè)上利用的可能性如上所述，通過本發(fā)明的引物對，能夠特異且高效地擴增CYP2C9基因中含有多態(tài)性CYP2C9*3發(fā)生位點的區(qū)域。因此，與上述的以往的方法不同，能地減少麻煩和成本。而且，由于這樣特異性擴增出含有多態(tài)性的檢測對象位點的區(qū)域，通過使用例如與含有上述檢測對象位點的檢測對象序列互補的探針，則可以使用上述反應(yīng)液直接進(jìn)行Tm分析，能對上述多態(tài)性進(jìn)行分型。而且，由于能在一個反應(yīng)液中擴增和分型，因此能使操作自動化。再者，使用本發(fā)明的引物對，即使是例如含有雜質(zhì)的試樣(例如全血或口腔粘膜等)，也可以省略預(yù)處理，因此能夠更迅速且更簡便地進(jìn)行擴增反應(yīng)。而且，使用本發(fā)明的引物對，則能夠以比以往更優(yōu)異的擴增效率進(jìn)行擴增反應(yīng)，因此能夠縮短擴增反應(yīng)。因此，通過本發(fā)明的引物對和含有其的試劑、以及使用它們的擴增產(chǎn)物的制備方法，能夠快速且簡便地分析CYP2C9基因的多態(tài)性，因此可以認(rèn)為在醫(yī)療領(lǐng)域中極為有效。權(quán)利要求1.一種CYP2C9基因擴增用引物對，其特征在于，其為用于通過基因擴增法擴增CYP2C9基因的引物對，含有以下引物對(1)引物對(1)包括含有下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一對引物對，(F1)與序列號1的堿基序列中的、以第52466位的腺嘌呤堿基(A)作為第1個堿基向著5’方向直至第14～18個堿基的區(qū)域序列相同的至少一段寡核苷酸，該寡核苷酸以上述腺嘌呤堿基(A)作為3’末端，(R1)與序列號1的堿基序列中的、以第52631位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1個堿基向著3’方向直至第19～36個堿基的區(qū)域互補的至少一段寡核苷酸，該寡核苷酸以與上述第52631位的胸腺嘧啶堿基(T)互補的腺嘌呤堿基(A)作為3’末端。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP2C9基因擴增用引物對，上述(1)的引物對為下述(1，)的引物對引物對(l'):包括含有下述(Fl，)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl')的寡核苷酸的反向引物的一對引物對，(Fl，)含有序列號2的堿基序列的寡核苷酸或含有序列號4的堿基序列的寡核苷酸，(Rl，)含有序列號14的堿基序列的寡核苷酸或含有序列號17的堿基序列的寡核苷酸。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CYP2C9基因擴增用引物對，所述CYP2C9基因擴增用引物對是用于擴增生物試樣中的CYP2C9基因的引物對。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的CYP2C9基因擴增用引物對，所述生物試樣是全血。5.—種CYP2C9基因擴增用試劑，其特征在于，其為用于通過基因擴增法擴增CYP2C9基因的試劑，含有權(quán)利要求1所述的CYP2C9基因擴增用引物對。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的CYP2C9基因擴增用試劑，其還含有能夠與CYP2C9基因的檢測對象位點雜交的探針。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的CYP2C9基因擴增用試劑，所述探針是含有下述(Pl，)所示的寡核苷酸的探針(Pl，)含有序列號28的堿基序列的寡核苷酸和含有序列號29的堿基序列的寡核苷酸中的至少一個寡核苷酸。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的CYP2C9基因擴增用試劑，所述探針是熒光標(biāo)記探針。9.一種擴增產(chǎn)物的制備方法，其特征在于，其為通過基因擴增法制備CYP2C9基因的擴增產(chǎn)物的方法，含有下述步驟(I):(I)以試樣中的核酸作為模板，使用權(quán)利要求1所述的CYP2C9基因擴增用引物對，在反應(yīng)液中擴增所述CYP2C9基因的步驟。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的擴增產(chǎn)物的制備方法，其在所述步驟(I)中，還向所述反應(yīng)液中添加能夠與CYP2C9基因的檢測對象位點雜交的探針。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的擴增產(chǎn)物的制備方法，所述探針是含有下述(Pl，)所示的寡核苷酸的探針(Pl，)含有序列號28的堿基序列的寡核苷酸和含有序列號29的堿基序列的寡核苷酸中的至少一個寡核苷酸。12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的擴增產(chǎn)物的制備方法，所述探針是熒光標(biāo)記探針。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的擴增產(chǎn)物的制備方法，其還含有下述步驟(II):(II)對于所述反應(yīng)液，測定所述熒光標(biāo)記纟笨針的熒光標(biāo)記的焚光強度的步驟。14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的擴增產(chǎn)物的制備方法，所述試樣是生物試樣。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的擴增產(chǎn)物的制備方法，所述生物試樣是全血。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的擴增產(chǎn)物的制備方法，所述反應(yīng)液中全血試樣的添加比例為0.1~0.5體積％。17.—種多態(tài)性分析方法，其特征在于，其為分析CYP2C9基因中的檢測對象位點的多態(tài)性的方法，包括以下步驟(i)~(W):(i)通過權(quán)利要求9所述的擴增產(chǎn)物的制備方法，在反應(yīng)液中擴增CYP2C9基因中含有檢測對象位點的區(qū)域的步驟；(ii)準(zhǔn)備含有所述步驟(i)中的擴增產(chǎn)物和能夠與所述檢測對象位點雜交的探針的反應(yīng)液的步驟；(iii)改變所述反應(yīng)液的溫度，測定所述擴增產(chǎn)物和所述探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號值的步驟；(iv)根據(jù)伴隨溫度變化的所述信號值的變動，確定所述檢測對象位點的多態(tài)性的步驟。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的多態(tài)性分析方法，在所述步驟(i)中，在擴增反應(yīng)前向所述反應(yīng)液中添加能夠與所述斗企測對象位點雜交的探針。全文摘要提供用于通過基因擴增法擴增CYP2C9基因中的、含有CYP2C9*3的檢測目的位點的區(qū)域的引物對，該引物對能夠特異性擴增上述區(qū)域。使用包括含有序列號4的堿基序列的正向引物和含有序列號17的堿基序列的反向引物的1對引物對。通過使用該引物對，能夠特異且高效地擴增CYP2C9基因的含有多態(tài)性CYP2C9*3發(fā)生位點的目的區(qū)域。文檔編號G01N21/78GK101443448SQ200780017048公開日2009年5月27日申請日期2007年11月30日優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日發(fā)明者平井光春,間島智史申請人:愛科來株式會社