專利名稱：用于利用光電流特異性地檢測受檢物質(zhì)的含有電解質(zhì)的片、使用該片的檢測方法、傳感器 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用光電流特異性地檢測核酸、外源性內(nèi)分泌干擾物 質(zhì)、抗原等具有特異性結(jié)合性的受檢物質(zhì)時可以代替電解液作為電解質(zhì) 介質(zhì)的含有電解質(zhì)的片，使用該含有電解質(zhì)的片的檢測方法、傳感器單 元以及測定裝置。
背景技術(shù)：
對生物體樣品中的DNA進行分析的基因診斷方法被認為有望作為 各種疾病的新型預防和診斷方法。作為簡便且準確地進行這種DNA分 析的技術(shù)，已知有使受檢DNA和具有與其互補的堿基序列且用熒光物 質(zhì)進行了標記的DNA探針雜交、檢測此時的熒光信號的DNA分析方法 (例如參照專利文獻1和專利文獻2)。上述方法中，利用色素的熒光來 檢測雜交引起的雙鏈DNA的形成。
此外，還提出了利用通過敏化色素的光激發(fā)而產(chǎn)生的光電流特異性 地檢測受檢物質(zhì)(DNA、蛋白質(zhì)等生物分子)的方法(例如參照專利文獻3 和非專利文獻i)。這種檢測方法使用充滿電解液的傳感器單元來進行。
另 一方面，已知在使用將酶的增減轉(zhuǎn)換為電信號的氧電極的微型生 物傳感器中，使用瓊脂糖等凝膠作為電解液含有體(例如參照專利文獻 4)。
專利文獻1:日本特開平7-107999號公報 專利文獻2:日本特開平11-315095號公報 專利文獻3:日本特開2006-119111號公報 專利文獻4:日本特7>平5-84860號公報
非專利文獻1:中村他《光電変換K:J^新LV、DNA二本鎖検出法》(日本化 學會講演預稿集Vol. 81STN0.2 (2002)第947頁)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人最近發(fā)現(xiàn)，在利用通過敏化色素的光激發(fā)而產(chǎn)生的光電流特異性地檢測受檢物質(zhì)時，可以使用含有電解質(zhì)的片來代替電解液作為 電解質(zhì)介質(zhì)，由此可以大幅簡化裝置結(jié)構(gòu)和檢測步驟。另外還發(fā)現(xiàn)，通 過使用這樣的含有電解質(zhì)的片，可以以高靈敏度和精確度檢測光電流。
因此，本發(fā)明的目的在于，提供在利用通過敏化色素的光激發(fā)而產(chǎn) 生的光電流特異性地檢測受檢物質(zhì)時，可以大幅簡化裝置結(jié)構(gòu)和檢測步 驟，并且能以高靈敏度和精確度檢測光電流的電解質(zhì)介質(zhì)。
即，本發(fā)明的含有電解質(zhì)的片包括含水性基材和包含在該含水性基 材中的電解質(zhì)，其在利用通過敏化色素的光激發(fā)而產(chǎn)生的光電流特異性 地檢測受檢物質(zhì)時被用作電解質(zhì)介質(zhì)。
此外，本發(fā)明利用光電流特異性地檢測受檢物質(zhì)的方法包括
使作用電極和對電極與上述含有電解質(zhì)的片接觸，其中所述作用電 極在表面具有直接或間接地特異性結(jié)合了受檢物質(zhì)的探針物質(zhì)，并且通 過該結(jié)合固定有敏化色素，
對上述作用電極進行光照使上述敏化色素被光激發(fā)，對由電子從該 光激發(fā)的敏化色素向上述作用電極移動而引起的、在上述作用電極與上 述對電才及之間流過的光電流進4亍才企測。
進一步地，通過本發(fā)明的第一實施方式提供的、利用通過敏化色素 的光激發(fā)而產(chǎn)生的光電流特異性地檢測受檢物質(zhì)時使用的傳感器單元 具有
作用電極、
與上述電極對置的對電極、和
>解質(zhì)的片； 解質(zhì)的片 接觸。
此外，通過本發(fā)明的第二方式提供的、利用通過敏化色素的光激發(fā) 而產(chǎn)生的光電流特異性地檢測受檢物質(zhì)時使用的傳感器單元具有 作用電極和對電極構(gòu)圖而成的電極單元、 與上述電極單元對置的對置部件、和
解質(zhì)的片
接觸,
進一步地，通過本發(fā)明提供的、利用通過敏化色素的光激發(fā)而產(chǎn)生
8的光電流特異性地檢測受檢物質(zhì)時使用的測定裝置具有 上述傳感器單元、
用于對上述作用電極進行光照的光源、和
測定在上述作用電4及和上述對電才及之間流過的電流的電流計。


表示本發(fā)明第一實施方式提供的傳感器單元和測定裝置組裝
前后的一個例子，(a)表示組裝后的截面圖，(b)表示組裝前的分解圖。表示本發(fā)明第二實施方式提供的傳感器單元和測定裝置組裝 前后的一個例子，(a)表示組裝后的截面圖，(b)表示組裝前的分解圖。表示本發(fā)明第二實施方式提供的傳感器單元和測定裝置組裝 前后的另一個例子，(a)表示組裝后的截面圖，(b)表示組裝前的分解圖。表示本發(fā)明笫二實施方式提供的傳感器單元和測定裝置組裝 前后的另一個例子，(a)表示組裝后的截面圖，(b)表示組裝前的分解圖。表示受檢物質(zhì)為單鏈核酸、探針物質(zhì)為與上述核酸具有互補 性的單鏈核酸時將受檢物質(zhì)固定到探針物質(zhì)上的步驟，(a)表示受檢物質(zhì) 預先用敏化色素標記的情況，(b)表示在雙鏈核酸中添加可以嵌入的敏化 色素時的情況。表示受檢物質(zhì)為配體、介質(zhì)物質(zhì)為受體蛋白質(zhì)分子、探針物 質(zhì)為雙鏈核酸時將受檢物質(zhì)固定到探針物質(zhì)上的步驟。 [圖7]表示電極單元的一個例子。表示具有相互竟爭的特異性結(jié)合性的受檢物質(zhì)和第二受檢物 質(zhì)為抗原、探針物質(zhì)為抗體時將受檢物質(zhì)固定到探針物質(zhì)上的步驟。表示例Al中得到的、在使用凝膠片(1%瓊脂糖凝膠)的情況 和使用電解液(水溶液)的情況下，在各四丙基碘化銨(NPr4I)濃度下測定 的光電流值。表示例A2中得到的、在10nM和100nM的各若丹明標記 ssDNA濃度下凝膠濃度(瓊脂糖濃度)與光電流值的關(guān)系。表示例A3中得到的、在10nM和100nM的各若丹明標記 ssDNA濃度下凝膠片的厚度與光電流值的關(guān)系。表示例A4中得到的、在0nM、 10nM和100nM的各若丹明 標記ssDNA濃度下、通過混合制備制造凝膠片的情況與通過浸漬制備制20
造凝膠片的情況下的光電流值。為例A5中使用的"流變儀CR200D" (SUN SCIENTIFIC CO.,
LTD.生產(chǎn))的示意圖。為說明例A5中進行的膠凝強度的測定方法的圖。為表示例A5中得到的凝膠濃度(瓊脂糖濃度)與膠凝強度的
關(guān)系的圖。表示例A6中得到的、在0nM、 10nM和100nM的各若丹明 標記ssDNA濃度下，使用含1重量％瓊脂糖的凝膠片的情況與使用含 7.5重量％丙烯酰胺的凝膠片的情況下的光電流值。表示例A7中得到的、在OnM、 10nM和100nM的各若丹明 標記ssDNA濃度下，使用各種電解質(zhì)時的光電流值。表示例A8中得到的、使用完全一致(PM)探針、單堿基突變 鏈(SNP)探針以及完全不一致(MM)探針的情況下，粑DNA濃度為lpm 的光電流值。表示例A8中得到的、使用完全一致(PM)探針、單堿基突變 鏈(SNP)探針以及完全不 一致(MM)探針的情況下，靶DNA濃度為1 OOnM 的光電流值。表示例B1中得到的、使用含有電解質(zhì)的吸收性片(濾紙)時， 在100nM的ssDNA和100nM的若丹明標記ssDNA中，在各四丙基硤 化銨(NPr4I)濃度下測定的光電流值。表示例B2中得到的、在OnM、 10nM和100nM的各若丹明 標記ssDNA濃度下，使用各種電解質(zhì)時的光電流值。表示例B3中得到的、在100nM和lpM的各若丹明標記 ssDNA濃度下，含有電解質(zhì)的吸收性片的厚度與光電流值的關(guān)系。表示例B5中得到的、含有電解質(zhì)的吸收性片的含水率與光 電流值的關(guān)系。表示例B6中得到的、使用完全一致(PM)探針、單堿基突變 鏈(SNP)探針以及完全不一致(MM)探針時，各電解質(zhì)的光電流值。表示例B7中得到的、使用單堿基突變鏈(SNP)探針以及完
10全不一致(MM)探針時，使吸水性基材在即將測定前浸漬在電解液中來
制造的情況與使吸水性片浸漬在電解液中后干燥并在即將使用前滴加
水的情況下的光電流。為流動池型測定用池之一例的截面圖。為圖27所示的流動池型測定用池的分解透視圖。表示例B8中得到的、使用單堿基突變鏈(SNP)探針以及完
全不 一 致(MM)探針時，使用水系電解液的情況與使用含有電解質(zhì)的吸
收性片的情況下的光電流。
具體實施例方式
含有電解質(zhì)的片
本發(fā)明的含有電解質(zhì)的片是在利用通過敏化色素的光激發(fā)而產(chǎn)生 的光電流特異性地檢測受檢物質(zhì)時用作電解質(zhì)介質(zhì)的片狀電解質(zhì)含有 體。而且，該含有電解質(zhì)的片包括含水性基材和包含在含水性基材中的 電解質(zhì)。電解質(zhì)可以在含水性基材中自由地移動，參與敏化色素、作用 電極和對電極之間的電子授受。因此，預先將含有電解質(zhì)的片夾持在作 用電極和對電極之間，使各電極表面與含有電解質(zhì)的片接觸，由此可以 在作用電極與對電極之間流過通過敏化色素的光激發(fā)而產(chǎn)生的光電流。 該含有電解質(zhì)的片雖然在所謂電解質(zhì)介質(zhì)方面與以往使用的電解液相 同，但由于是可以單獨操作的片狀物，可以容易地夾入作用電極與對電 極之間、拆卸或4般運，從而可以大幅簡化裝置結(jié)構(gòu)和^r測步驟。在作用 電極與對電極之間填充電解液的現(xiàn)有方法中，必需輸送電解液的結(jié)構(gòu)(例 如泵、閥以及它們的控制結(jié)構(gòu))、防止液體泄漏的結(jié)構(gòu)(例如密封墊)以及 電解液的廢液處理等復雜的結(jié)構(gòu)或步驟，因此導致成本的增大以及裝置 的大型化。與上述的情況相比，本發(fā)明的含有電解質(zhì)的片具有極大的優(yōu) 點。此外，由于通過使用凝膠片無需用于輸送電解液的時間，僅通過將 凝膠片夾在作用電極與對電極之間，就可以立即實施測定，所以測定時 間也縮短。
本發(fā)明中，電解質(zhì)只要是可以在含水性基材中自由地移動、并能參 與敏化色素、作用電極和對電極之間的電子授受的電解質(zhì)，則可以不限 定地使用寬范圍種類的電解質(zhì)。優(yōu)選的電解質(zhì)是可以發(fā)揮對通過光照射 而激發(fā)的色素供給電子的還原劑(供電劑)的功能的物質(zhì)，作為這種物質(zhì)
ii的例子，可以舉出碘化鈉(NaI)、碘化鉀(KI)、碘化鈣(CaI。、碘化鋰(LiI)、 碘化銨(NHJ)、四丙基碘化銨(NPr41)、硫代硫酸鈉(Na2S203)、亞硫酸鈉 (Na2S03)、氫醌、K4[Fe(CN)6] . 3H20、 二茂鐵國l,r -二羧酸、二茂鐵羧 酸、硼氬化鈉(NaBKU)、三乙胺、硫氰酸銨、肼(N2H4)、乙醛(CH3CHO)、 N,N,N， ，N，-四甲基對苯二胺二鹽酸鹽(TMPD)、 L-抗壞血酸、亞碲酸鈉 (Na2Te03)、氯化鐵(II)四水合物(FeCl2 . 4H20)、 EDTA、半胱氨酸、三 乙醇胺、三丙胺、含碘的碘化鋰(I/Lil)、三(2-氯乙基)磷酸鹽(TCEP)、 二 硫蘇糖醇(DTT)、 2-巰基乙醇、2-巰基乙醇胺、二氧化硫脲、(COOH)2、 HCHO以及它們的組合，更優(yōu)選為Nal、 KI、 Cal2、 Lil、 NH4I、四丙基 碘化銨(NPr41)、硫代硫酸鈉(Na2S203)、亞硫酸鈉(Na2S03)以及它們的混 合物，進一步優(yōu)選為四丙基碘化銨(NPr41)。 (1)凝膠片
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，優(yōu)選含水性基材是含有選自天然凝膠 和合成凝膠中的至少 一種的凝膠基質(zhì)，在該凝膠基質(zhì)中分散上述電解 質(zhì)。即，在該實施方式中，含有電解質(zhì)的片為凝膠片。而且，使用凝膠 片作為電解質(zhì)介質(zhì)時，與使用電解液的情況相比，對于相同的受^r物質(zhì) 濃度的樣品，能得到更高的檢測電流，并且在更寬的受檢物質(zhì)濃度范圍 內(nèi)得到檢測電流的濃度依賴性。即，通過使用凝膠片，可以大幅提高光 電流的檢測靈敏度和精確度。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，凝膠片優(yōu)選具有100g/cn^以上的膠凝 強度，更優(yōu)選為120g/cn^以上，進一步優(yōu)選為150g/cm2以上。若為這 種膠凝強度，則由于易單獨操作凝膠片，可以容易地夾入作用電極與對 電極之間或拆卸，從而可以大幅簡化傳感器單元的結(jié)構(gòu)和檢測步驟。
作為本發(fā)明的凝膠片的形態(tài)，優(yōu)選與各電極的接觸部分為平滑平面 以確保與作用電極和對電極的良好的密合性。因此，夾入作用電極與對 電極之間來使用時，優(yōu)選具有均勻厚度的形態(tài)以便不影響密合性。另一 方面，^使用作用電^_和對電才及在同一平面上構(gòu)圖而成的電才及單元時，仫、 僅是至少與電極單元接觸的 一面形成平滑平面即可，厚度或厚度的均勻 性不會成為特別的問題。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，凝膠片優(yōu)選具有0.1 ~ 10mm的厚度， 更優(yōu)選具有0.5~3mm、進一步優(yōu)選具有1 ~ 3mm的厚度。若為這種厚 度，則由于易得到適于單獨操作凝膠片的強度，可以容易地夾入作用電極與對電極之間或拆卸，或可以搬運，/人而可以大幅簡化傳感器單元的 結(jié)構(gòu)和檢測步驟。此外，對光電流測定也無不良影響。
本發(fā)明中，凝膠基質(zhì)只要是含有選自天然凝膠和合成凝膠中的至少 一種、且表現(xiàn)出適當?shù)膹姸群团c電極的密合性的凝膠，則沒有限定。這 種凝膠可以與通常的凝膠同樣地通過膠凝劑與水等溶劑 一起凝膠化來 形成。凝膠基質(zhì)中的膠凝劑的濃度由于對光電流測定無大的影響，可以 從確保能單獨操作的強度方面考慮，根據(jù)膠凝劑的種類適當決定。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，凝膠基質(zhì)優(yōu)選含有以多糖類和蛋白質(zhì) 為主要成分的天然凝膠。作為這種天然凝膠的優(yōu)選例子，可以舉出瓊脂 糖、藻酸、卡拉膠、刺槐豆莢膠(口一7卜匕、、一y力厶)、結(jié)冷膠(-工，y方厶)、 明膠及它們的混合物，更優(yōu)選為瓊脂糖的凝膠。優(yōu)選的瓊脂糖的添加量
為0.5-25重量％。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式，優(yōu)選凝膠基質(zhì)含有合成凝膠。作 為優(yōu)選的合成凝膠的例子，可以舉出聚丙烯酰胺、聚乙烯基吡咯烷酮、 聚丙烯酸鈉、添加PVA的聚丙烯酰胺、聚環(huán)氧乙烷、N-烷基改性(曱基) 丙烯酰胺衍生物、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、丙烯酰 基嗎啉、N-曱基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N-(異)丙基丙烯酰胺、N-丁基丙烯酰胺、N-羥基甲基丙烯酰胺、N-羥基乙基丙烯酰胺、N-羥基丙 基丙烯酰胺、N-羥基丁基丙烯酰胺、(曱基)丙烯酸、(曱基)丙烯酰胺磺 酸叔丁酯、(甲基)丙烯酸磺基丙基酯、(曱基)丙烯酸、衣康酸、(聚)烷撐 二醇(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸羥基乙基酯、聚乙二醇(曱基)丙烯 酸酯、(曱基)丙烯酸羥基丙基酯、聚丙二醇(曱基)丙烯酸酯、甘油(曱基) 丙烯酸酯、亞曱基二(甲基)丙烯酰胺、亞乙基二(甲基)丙烯酰胺、(聚)乙 二醇二(曱基)丙烯酸酯、(聚)丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、甘油二(甲基)丙 烯酸酯、甘油三(曱基)丙烯酸酯、四烯丙氧基乙烷以及它們的混合物的 凝膠，更優(yōu)選為聚丙烯酰胺的凝膠。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的凝膠片可以通過下述(1) 或(2)的方法制造(l)向水中加入電解質(zhì)和膠凝劑并加熱溶解制備凝 膠后，加工成所需的片形狀的方法；(2)僅用膠凝劑形成凝膠并加工成所 需的片形狀后，浸漬在電解質(zhì)溶液中使電解質(zhì)分散到凝膠中的方法制 備。特別是膠凝劑根據(jù)與所用電解質(zhì)的組合，有時通過混合、加熱或冷 卻不形成凝膠，即使這種情況下通過上述(2)的方法也可以制造凝膠片。(2)吸水性片
根據(jù)本發(fā)明的另 一優(yōu)選實施方式，含水性基材優(yōu)選為吸水性基材。 即，該實施方式中，含有電解質(zhì)的片為吸水性片。而且，使用吸水性片 作為電解質(zhì)介質(zhì)時，得到與使用電解液的情況同等的檢測靈敏度和檢測 精確度。即，通過使用吸水性片，可以優(yōu)異的精確度檢測光電流。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，吸水性片優(yōu)選具有20%以上的含水 率，更優(yōu)選為30%以上，進一步優(yōu)選為40%以上。若為這種含水率則檢 測光電流時可以檢測出高的光電流，檢測靈敏度得到提高。含水率通過 (每lmm3的含水量)/(吸水性基材的密度)求得。這里所說的含水率為檢 測光電流時的吸水性片的含水率，如下所述，保存時也可以不滿足上述 含水率。
本發(fā)明的吸水性片的形態(tài)，優(yōu)選與各電極的接觸部分為平滑平面以 確保與作用電極和對電極的優(yōu)異的密合性。因此，夾入作用電極與對電
極之間來使用時，優(yōu)選具有均勻厚度的形態(tài)以便不影響密合性。另一方 面，使用作用電極和對電極在同一平面上構(gòu)圖而成的電極單元時，僅僅 是至少與電極單元接觸的 一 面形成平滑平面即可，厚度或厚度的均勻性 不會成為特別的問題。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，吸水性片優(yōu)選具有0.01 ~ 10mm的厚 度，更優(yōu)選具有0.1 ~3mm的厚度。若為這種厚度則由于易得到適于單 獨操作吸水性片的強度，可以容易地夾入作用電極與對電極之間或拆 卸，或可以搬運，/人而可以大幅簡化傳感器單元的結(jié)構(gòu)和才企測步驟。此 外，對光電流測定也無不良影響。
本發(fā)明中，吸水性基材優(yōu)選含有選自棉、麻、羊毛、絲、纖維等天 然纖維，濾紙、造紙等中使用的紙漿纖維，人造纖維等再生纖維，濾紙 等中使用的玻璃纖維，氈、海綿等中使用的合成纖維中的至少一種纖維， 只要是表現(xiàn)出適當?shù)膹姸?、含水量、與電極的密合性的吸水性基材，則 不限定。另外，本發(fā)明的吸水性基材中使用的纖維的加工方法不限定于 特定的加工方法。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，作為吸水性基材的優(yōu)選例子，可以舉 出濾紙、濾膜、玻璃過濾器、濾布等，更優(yōu)選為濾紙、濾膜。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的含有電解質(zhì)的吸水性片可以 (l)加工成所需的片形狀、浸漬在以水為基質(zhì)的電解液中后使用，或(2)加工成所需的片形狀、浸漬在電解液中、進行干燥后，即將使用之前滴 加水后使用。
傳感器單元和測定裝置
通過使用本發(fā)明的含有電解質(zhì)的片，可以構(gòu)建結(jié)構(gòu)大幅簡化、廉價 且小型的傳感器單元或測定裝置。這是由于通過使用含有電解質(zhì)的片， 在作用電極與對電極之間填充電解液來進行的現(xiàn)有方法中視為必要的 輸送電解液的結(jié)構(gòu)(例如泵、閥以及它們的控制結(jié)構(gòu))、防止液體泄漏的 結(jié)構(gòu)(例如密封墊)以及電解液的廢液處理等復雜的結(jié)構(gòu)或步驟變得不必 要。
本發(fā)明第一實施方式提供的傳感器單元具有作用電極、與電極對置 的對電極和夾持在作用電極和對電極之間的含有電解質(zhì)的片，作用電極 和對電極的各電極表面與含有電解質(zhì)的片接觸。即，作用電極的表面一 側(cè)(固定有受檢物質(zhì)的一側(cè))與對電極的導電面(鉑等)對置，配置成與含有 電解質(zhì)的片接觸。圖1表示第一實施方式提供的傳感器單元的截面圖和
分解圖。圖1所示的傳感器單元10中，作用電極11位于對電極12的 上方，在作用電極11與對電極12之間夾持有含有電解質(zhì)的片13 。此外， 傳感器單元10具有支撐對電極12的支撐基材14。在傳感器單元10的 最上部設(shè)置朝著支撐基材14向下方壓緊以使作用電極11、含有電解質(zhì) 的片13和對電極12相互密合的壓緊部件15。本發(fā)明的傳感器單元中， 各部件堆放順序不限定于圖示例，也可以以與圖l所示的順序相反的順 序上下顛倒來堆放，此時可以為進一步設(shè)置支撐作用電極的支撐基材， 和向著支撐基材壓緊以使對電極、含有電解質(zhì)的片和作用電極相互密合 的壓緊部件的結(jié)構(gòu)。此外，圖示例中各部件水平配置，但是各部件也可 以以立式的狀態(tài)配置。壓緊部件15中優(yōu)選進一步具有為了通過用于光 激發(fā)的光而設(shè)置的開口部或透光部。
本發(fā)明第二實施方式提供的傳感器單元，具有作用電極和對電極在 同一平面上構(gòu)圖而成的電極單元、和與作用電極及對電極的各電極表面 接觸設(shè)置的含有電解質(zhì)的片。圖2~4表示第二實施方式提供的傳感器 單元的截面圖和分解圖。圖2所示的傳感器單元20中，與電極單元21 對置設(shè)置對置部件22，在電極單元21與對置部件22之間夾持凝膠片 23。即，在置于對置部件22上的含有電解質(zhì)的片23上，以使固定有受 檢物質(zhì)的一側(cè)朝下的方式來配置電極單元21。此外，在傳感器單元20
15中，設(shè)置向著對置部件22壓緊以使電極單元21和含有電解質(zhì)的片23 相互密合的壓緊部件24。另一方面，在圖3所示的傳感器單元30中， 在電極單元31中進一步設(shè)置支撐電極單元的支撐基材34,對置部件32 發(fā)揮向著支撐基材34壓緊以使含有電解質(zhì)的片33和電極單元31相互 密合的壓緊部件的功能。即，在支撐基材34上以使固定有受檢物質(zhì)的 一側(cè)朝上的方式來配置電極單元31,在電極單元31上配置含有電解質(zhì) 的片33。本發(fā)明的傳感器單元中，各部件的堆放順序不限定于圖示例， 也可以以與圖2和圖3所示的順序相反的順序上下顛倒來堆;改。此外， 圖示例中各部件水平配置，但是各部件也可以以立式的狀態(tài)配置。壓緊 部件24、 32優(yōu)選進一步具有為了通過用于光激發(fā)的光而設(shè)置的1個以 上的開口部或透光部。另外，圖3所示的傳感器單元30中由于照射光 通過含有電解質(zhì)的片，優(yōu)選適當調(diào)整光源或電解質(zhì)濃度使得使用具有著 色性的電解質(zhì)等時光強度的衰減不會成為問題。另一方面，圖4所示的 傳感器單元40中，在電極單元41中設(shè)置支撐電極單元的支撐基材44, 并且設(shè)置向著支撐基材44壓緊以使電極單元41密合的壓緊部件42。該 壓緊部件42優(yōu)選如下構(gòu)成其僅覆蓋電極單元41的端部或其附近，從 而在電極單元41上確保足夠的開放部分，由此含有電解質(zhì)的片43容易 載置到電極單元41上。此外，優(yōu)選由接觸探針47構(gòu)成壓緊部件42與 電極單元41接觸的部分。在這樣通過壓緊部件42保持的電極單元41 上的優(yōu)選未被壓緊部件42覆蓋的開放部分上載置含有電解質(zhì)的片43 。
第一實施方式和第二實施方式中，都可以在傳感器單元10、 20、 30、 40中進一步設(shè)置用于對作用電極進行光照的光源16、 26、 36、 46和測 定在作用電極與對電極之間流過的電流的電流計(未圖示)，構(gòu)建為測定 裝置。電流計優(yōu)選可以檢測nA水平。在這種結(jié)構(gòu)中，來源于光源的光 照射到作用電極的表面上。另外，圖1和圖4所示的傳感器單元10、 40 中，來源于光源16、 46的光從作用電極11或電極單元41的背側(cè)照射， 透過透明的作用電極11或電極單元41照射到作用電極11或電極單元 41的表面上。另一方面，圖2和圖3所示的傳感器單元20、 30中，來 源于光源26、 36的光通過壓緊部件24、 32的開口部到達電極單元21、 31的表面上。通過利用如此到達作用電極的光進行的敏化色素的光激發(fā) 而產(chǎn)生的光電流值可以用電流計沖全測。對于將作用電才及和對電^L與電流 計連接的方法不加以限定，例如，可以采用直接連接導線、或如圖示例所示通過接觸探針17、 27、 37、 47連接等方法。特別是對于每次測定
時要裝卸的作用電極而言，通過使用接觸探針具有作用電極易裝卸的優(yōu) 點。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，光源可以為能根據(jù)敏化色素的種類照 射不同波長的光的光源。或根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式，可以進一 步具有預先設(shè)置多個光源且測定裝置切換該多個光源進行照射的結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，優(yōu)選如下構(gòu)成在光源和/或傳感器單 元中安裝XY移動結(jié)構(gòu)(未圖示)，使光源和傳感器單元在XY方向上相 對移動，從而使光源可以在X Y方向上掃描移動的同時照射到作用電極 上。由此，可以個別地照射作用電極上的受檢物質(zhì)固定點。特別是本發(fā) 明的傳感器單元由于無需電解液的輸送，結(jié)構(gòu)被簡化，所以傳感器單元 本身的XY移動也可以容易地進行。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，XY移動結(jié)構(gòu)優(yōu)選如下構(gòu)成通過組 裝到計算機或裝置中的軟件，可以指定移動速度、移動路徑等。此時， 優(yōu)選可以用電流計測定伴隨著光照射產(chǎn)生的電流值，其結(jié)果輸送到計算 機或裝置內(nèi)的存儲器中，依次保存數(shù)據(jù)。這樣保存在存儲器內(nèi)的光電流 值可以以數(shù)值或?qū)崟r顯示的經(jīng)時變化圖的形式顯示在顯示器上。通過得 到的數(shù)據(jù)，由適當?shù)臄?shù)據(jù)點讀取光不照射時和光照射時的電流值，使用 其差可以進行樣品中的物質(zhì)濃度定量或有無SNPs的檢測。此外，從這 些數(shù)據(jù)的讀取到定量或SNPs的判定(顯著差異檢測)也可以在軟件上自 動處理。
使用光電流特異性地檢測受檢物質(zhì)
產(chǎn)生的光電流特異性地檢測i二物質(zhì)。對于該利用i過敏化色素的光激 發(fā)而產(chǎn)生的光電流特異性地檢測受檢物質(zhì)的方法，以下進行具體的說 明。
該方法中，首先準備含有受檢物質(zhì)的樣品液、作用電極和對電極。 本發(fā)明中使用的作用電極是在表面上具有可以直接或間接地與受檢物 質(zhì)特異性結(jié)合的探針物質(zhì)的電極。即，探針物質(zhì)不僅可以是與受檢物質(zhì) 直接、特異性結(jié)合的物質(zhì)，還可以是能與使受檢物質(zhì)與受體蛋白質(zhì)分子
等介質(zhì)物質(zhì)特異性結(jié)合得到的結(jié)合體特異性結(jié)合的物質(zhì)。接著，在敏化 色素的共存下，使樣品液與作用電極接觸，從而使受檢物質(zhì)直接或間接
17地與探針物質(zhì)特異性結(jié)合，通過該結(jié)合將敏化色素固定在作用電極上。 敏化色素是可以響應光激發(fā)向作用電極釋放電子的物質(zhì)，可以對受檢物 質(zhì)或介質(zhì)物質(zhì)預先進行標記，或在受檢物質(zhì)和探針物質(zhì)的結(jié)合體中使用 可嵌入的敏化色素時僅添加到樣品液中。
然后，若使作用電極和對電極在傳感器單元內(nèi)與電解質(zhì)介質(zhì)接觸 后，對作用電極進行光照，使敏化色素光激發(fā)，則發(fā)生電子從光激發(fā)的 敏化色素向電子接受物質(zhì)的移動。通過檢測該電子移動引起的在作用電 極和對電極之間流過的光電流，可以以高靈敏度和精確度檢測受檢物 質(zhì)。此外，該檢測電流由于與樣品液中的受檢樣品濃度具有高的相關(guān)關(guān) 系，可以基于測定的電流量或電量進行受檢樣品的定量測定。
(1)受檢物質(zhì)和探針物質(zhì)
作為本發(fā)明中的受檢物質(zhì)，只要是具有特異性結(jié)合性的物質(zhì)則不限 定，可以為各種物質(zhì)。若為這樣的受檢物質(zhì)，則通過將可以與受檢物質(zhì) 直接或間接地特異性結(jié)合的探針物質(zhì)預先負載在作用電極表面上，可以 使受檢物質(zhì)與探針物質(zhì)直接或間接地特異性結(jié)合并進行檢測。
即，本發(fā)明中，作為受檢物質(zhì)和探針物質(zhì)，可以選擇能相互特異性 結(jié)合的物質(zhì)。即，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，優(yōu)選以具有特異性結(jié)合 性的物質(zhì)作為受檢物質(zhì)，以與受檢物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)作為探針物質(zhì) 并負載在作用電極上。由此，可以使受檢物質(zhì)直接、特異性結(jié)合在作用 電極上并進行檢測。作為該實施方式中的受檢物質(zhì)和探針物質(zhì)組合的優(yōu) 選例子，可以舉出單鏈核酸和與核酸具有互補性的單鏈核酸的組合、以 及抗原和抗體的組合。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，優(yōu)選受檢物質(zhì)為單鏈核酸、探針物質(zhì)
為與核酸具有互補性的單鏈核酸。探針物質(zhì)更優(yōu)選與核酸具有15bp以
上的互補性部分。該實施方式中的受檢物質(zhì)與作用電極的特異性結(jié)合步
驟如圖5(a)和(b)所示。如這些圖所示，作為受檢物質(zhì)的單鏈核酸121與 負載在作用電極123上的作為探針物質(zhì)的具有互補性的單鏈核酸124雜 交，形成雙鏈核酸127。
作為受檢物質(zhì)的含有單鏈核酸的樣品液，可以通過公知的方法，從 末梢靜脈血等血液、白細胞、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養(yǎng)細胞、 各種器官細胞等組織細胞等含有核酸的各種檢體樣品中提取核酸來制 備。此時，；險體樣品中的細胞的破壞例如可以通過由外部施加振動、超聲波等物理作用使載體振動來進行。此外，也可以使用核酸提取溶液， 使核酸從細胞游離。作為核酸洗脫溶液的例子，可以舉出含有SDS、
Triton-X、吐溫-20等表面活性劑、急角苦、EDTA、蛋白酶等的溶液。 使用這些溶液洗脫核酸時，可以通過在37。C以上的溫度下保溫來促進反應。
根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實施方式，作為受檢物質(zhì)的基因含量為微量 時，優(yōu)選通過公知的方法擴增基因后進行檢測。作為擴增基因的方法， 代表性的是使用聚合酶鏈反應(PCR)等使用酶的方法。其中，作為基因 擴增法中使用的酶的例子，可以舉出DNA聚合酶、Taq聚合酶等DNA 依賴型DNA聚合酶，RNA聚合酶I等DNA依賴型RNA聚合酶，QP 復制酶等RNA依賴型RNA聚合酶，從僅通過調(diào)節(jié)溫度即可以連續(xù)地反 復擴增的方面考慮，優(yōu)選為使用Taq聚合酶的PCR法。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，上述擴增時可以將核酸用敏化色素特 異性地標記。通?？梢酝ㄟ^在DNA中摻入氨基烯丙基修飾的dUTP來 進行。該分子可以與未修飾的dUTP以同樣的效率摻入。在后續(xù)的偶聯(lián) 階段中，通過N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide)活化的焚光色素 與修飾dUTP特異性地反應，可以得到用敏化色素均勻地標記了的受檢 物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，如上得到的核酸的粗提液或純化的核 酸溶液可以首先在90~98°C、優(yōu)選在95。C以上的溫度下實施熱變性， 制備單鏈核酸。
本發(fā)明中，受檢物質(zhì)與探針物質(zhì)也可以間接地特異性結(jié)合。即，根 據(jù)本發(fā)明的另外的優(yōu)選實施方式，優(yōu)選以具有特異性結(jié)合性的物質(zhì)作為 受檢物質(zhì)，以與該受檢物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)作為介質(zhì)物質(zhì)，使其共存， 以可以與該介質(zhì)物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)作為探針物質(zhì)并負載在作用電 極上。由此，即使是不能與探針物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)，也可以通過介 質(zhì)物質(zhì)間接地特異性結(jié)合在作用電極上并進行檢測。作為該實施方式中 的受檢物質(zhì)、介質(zhì)物質(zhì)和探針物質(zhì)的組合的優(yōu)選例子，可以舉出配體、 可以接受該配體的受體蛋白質(zhì)分子、以及可以與該受體蛋白質(zhì)分子特異 性結(jié)合的雙鏈核酸的組合。作為配體的優(yōu)選例子，可以舉出外源性內(nèi)分 泌干擾物質(zhì)(環(huán)境激素)。外源性內(nèi)分泌干擾物質(zhì)指的是通過受體蛋白質(zhì) 分子與DNA結(jié)合、對該基因的表達產(chǎn)生影響并產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，根據(jù)
19本發(fā)明的方法，可以簡便地監(jiān)測由受檢物質(zhì)導致的受體等蛋白質(zhì)與DNA 的結(jié)合性。該實施方式中的受檢物質(zhì)與作用電極的特異性結(jié)合步驟如圖 6所示。如圖6所示，作為受檢物質(zhì)的配體130首先與作為介質(zhì)物質(zhì)的 受體蛋白質(zhì)分子131特異性結(jié)合。然后，結(jié)合有配體的受體蛋白質(zhì)分子 133與作為探針物質(zhì)的雙鏈核酸134特異性結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，受檢物質(zhì)可以為兩種以上。根據(jù)本發(fā) 明的方法，通過使用多種敏化色素、對各敏化色素分別照射不同的激發(fā) 波長的光，可以分別檢測多種受檢物質(zhì)。
(2)敏化色素
本發(fā)明中，為了通過光電流檢測受檢物質(zhì)的存在，在敏化色素的共 存下使受檢物質(zhì)直接或間接地與探針物質(zhì)特異性結(jié)合，通過該結(jié)合，使 敏化色素固定在作用電極上。因此，本發(fā)明中，如圖5(a)和圖6所示， 可以預先對受檢物質(zhì)121或介質(zhì)物質(zhì)131用敏化色素122、 132進行標 記。此外，如圖5(b)所示，受檢物質(zhì)與探針物質(zhì)的結(jié)合體127(例如雜交 后的雙鏈核酸)中使用可以嵌入的敏化色素128時，通過向樣品液中添加 敏化色素，可以使敏化色素固定在探針物質(zhì)上。
子的物質(zhì)，只要可以通過光源的照射躍遷到光激發(fā)狀態(tài)且可以由激發(fā)狀 態(tài)獲得可以向作用電極注入電子的電子狀態(tài)即可。因此，所使用的敏化 色素只要是可以在作用電極、特別是電子接受層之間獲得上述電子狀態(tài) 即可，可以使用多種敏化色素，無需使用昂貴的色素。
作為敏化色素的具體例，可以舉出金屬絡合物或有機色素。作為金 屬絡合物的優(yōu)選例子，可以舉出銅酞菁、鈦氧基酞菁等金屬酞菁，葉綠 素或其衍生物，氯化高鐵血紅素、日本特開平1-220380號公報或日本特 表平5-504023號公報中記載的釕、鋨、鐵和鋅的絡合物(例如順式-二氰 酸-二(2,2，-聯(lián)二吡啶-4,4， -二羧酸)釕(II))。作為有機色素的優(yōu)選例子， 可以舉出無金屬的酞菁、9-苯基H占噸類色素、花青類色素、金屬花青類 色素、P占噸類色素、三苯基曱烷類色素、吖啶類色素、哺嗪類色素、香 豆素類色素、部花青類(乂口、xr二^系)色素、若丹菁類(口夕'夕7-乂系)
色素、聚曱炔類色素、靛類色素等。
作為可以嵌入到雙鏈核酸中的敏化色素的優(yōu)選例子，可以舉出吖啶 橙、溴乙啶。使用這種敏化色素時，僅通過在核酸雜交后添加到樣品液中即可以形成用敏化色素標記的雙鏈核酸，因此無需預先對單鏈核酸進 行標記。
(3)作用電極及其制造
本發(fā)明中使用的作用電極是表面上具有上述探針物質(zhì)的電極，并且 是可以接受通過探針物質(zhì)固定的敏化色素響應光激發(fā)而釋放的電子的 電極。因此，作用電極的結(jié)構(gòu)和材料只要是在與所用的敏化色素之間產(chǎn) 生上述電子移動的結(jié)構(gòu)和材料則不限定，可以是各種結(jié)構(gòu)和材料。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，優(yōu)選作用電極具有電子接受層，該電 子接受層含有可以接受敏化色素響應光激發(fā)而釋放的電子的電子接受 物質(zhì)，并且該電子接受層的表面上具有探針物質(zhì)。此外，根據(jù)本發(fā)明更 優(yōu)選的實施方式，優(yōu)選作用電極進一步含有導電性基材，在該導電性基 材上形成電子接受層。該實施方式的電極如圖5和圖6所示。圖5和圖 6所示的作用電極123具有導電性基材125、形成在該導電性基材上并 含有電子接受物質(zhì)的電子接受層126。而且，電子接受層126的表面上 負載有探針物質(zhì)。
本發(fā)明中的電子接受層含有電子接受物質(zhì)，該電子接受物質(zhì)可以接 受通過探針物質(zhì)固定的敏化色素響應光激發(fā)而釋放的電子。即，電子接 受物質(zhì)可以是能取得可以由光激發(fā)的標記色素注入電子的能級的物質(zhì)。 其中，可以由光激發(fā)的標記色素注入電子的能級(A)，例如在使用半導體 作為電子接受性材料時指的是導帶(CB, conduction band),使用金屬作 為電子接受性材料時指的是費米能級，使用有機物或C60等分子狀無機 物作為電子接受性材料時指的是最低空軌道(Lowest Unoccupied Molecular Orbital: LUMO)。即，本發(fā)明中使用的電子接受物質(zhì)只要是 該A能級具有比敏化色素的LUMO能級賤的能級即可，換句話說，具 有比敏化色素的LUMO的能級低的能級即可。
作為電子接受物質(zhì)的優(yōu)選例子，可以舉出，硅、鍺等單質(zhì)半導體， 鈥、錫、鋅、鐵、鴒、鋯、鉿、鍶、銦、鈰、釔、鑭、釩、鈮、鉭等的 氧化物半導體，鈦酸鍶、鈦酸鈣、鈦酸鈉、鈦酸鋇、鈮酸鉀等鈣鈦礦型 半導體，鎘、鋅、鉛、銀、銻、鉍等的石克化物半導體，鎘、鉛的硒化物 半導體，鎘的碲化物半導體，鋅、鎵、銦、鎘等的磷化物半導體，鎵砷、 銅-銦-硒化物、銅-銦-硫化物的化合物半導體，金、柏、銀、銅、鋁、銠、 銦、鎳等金屬，聚噻吩、聚苯胺、聚乙炔、聚吡咯等有機物聚合物，C60、C70等分子狀無機物，更優(yōu)選為硅、Ti02、 Sn02、 Fe203、 W03、 ZnO、 Nb205、鈦酸鍶、氧化銦、CdS、 ZnS、 PbS、 Bi2S3、 CdSe、 CdTe、 GaP、 InP、 GaAs、 CuInS2、 CuInSe、 C60，進一步優(yōu)選為Ti02、 ZnO、 Sn02、 Fe203、 W03、 Nb205、鈦酸鍶、CdS、 PbS、 CdSe、 InP、 GaAs、 CuInS2、 CuInSe2,最優(yōu)選為Ti02。而且，上述舉出的半導體可以為純半導體和 雜質(zhì)半導體中的任意一種。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，電子接受物質(zhì)優(yōu)選為半導體，更優(yōu)選 為氧化物半導體，進一步優(yōu)選為金屬氧化物半導體，最優(yōu)選為n型金屬 氧化物半導體。根據(jù)該實施方式，通過利用半導體的帶隙，可以由色素 有效地釋放電子。此外，通過使用具有多孔體或表面為凹凸形狀等結(jié)構(gòu) 的半導體，可以制造大表面積的作用電極，從而可以增加探針的固定量。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，半導體的導帶的電位優(yōu)選比敏化色素 的LUMO的電位低，更優(yōu)選為滿足敏化色素的LUMO半導體的導帶〉 電解質(zhì)的氧化還原電位〉敏化色素的HOMO的關(guān)系的電位。通過滿足這 種關(guān)系，可以有效地釋放電子。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，電子接受層由半導體構(gòu)成時，可以對 層表面進行陽離子化處理。通過陽離子化，可以使探針物質(zhì)(DNA、蛋 白質(zhì)等)高效地吸附在電子接受層上。陽離子化例如可以通過使氨基硅烷 等硅烷偶聯(lián)劑、陽離子聚合物、季銨化合物等作用于電子接受層表面來 進行。
此外，根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式，作為電子接受物質(zhì)，可以 使用銦-錫復合氧化物(ITO)或摻雜氟的氧化錫(FTO)。ITO和FTO不但具 有電子接受層的功能，而且還具有發(fā)揮導電性基材的功能的性質(zhì)，因此， 通過使用這些材料，無需使用導電性基材，僅通過電子接受層即可以發(fā) 揮作用電極的功能。
使用半導體或金屬作為電子接受物質(zhì)時，該半導體或金屬可以是單 晶和多晶中的任意一種，優(yōu)選為多晶體，與致密的晶體相比進一步優(yōu)選 具有多孔性的晶體。由此，可以使比表面積增大，更多地吸附受檢物質(zhì) 和敏化色素，從而能以更高的靈敏度和精確度檢測受檢物質(zhì)。因此，根 據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，優(yōu)選電子接受層具有多孔性，各孔的直徑為 3 ~ lOOOnm,更優(yōu)選為10 ~ lOOnrn。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，在導電性基材上形成了電子接受層的
22狀態(tài)下，優(yōu)選表面積相對于投影面積為10倍以上，進一步優(yōu)選為100 倍以上。對該表面積的上限不特別限定，但是通常為1000倍左右。構(gòu)
成電子接受層的電子接受物質(zhì)的微粒粒徑，按照使用將投影面積換算成
圓時的直徑的平均粒徑計，作為一次粒徑優(yōu)選為5~200nm，更優(yōu)選為 8~100nm,進一步優(yōu)選為20 ~ 60nm。此外，作為分散物中的電子接受 性物質(zhì)的微粒(二級粒子)的平均粒徑優(yōu)選為0.01 ~ 100 jum。此外，為了 使入射光散射提高光捕獲率，還可以并用粒徑尺寸大的例如300nm左右 的電子接受物質(zhì)的微粒來形成電子接受層。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，優(yōu)選作用電極進一步含有導電性基材，電 子接受層形成在導電性基材上。作為可以在本發(fā)明中使用的導電性基 板，不僅可以是象鈦等金屬那樣的支撐體本身具有導電性的導電性基 板，還可以是在玻璃或塑料的支撐體表面上具有導電材料層的導電性基 板。使用具有該導電材料層的導電性基板時，電子接受層形成在該導電 層上。作為構(gòu)成導電材料層的導電材料的例子，可以舉出，柏、金、銀、 銅、鋁、銠、銦等金屬，碳、碳化物、氮化物等導電性陶資，以及銦-錫復合氧化物、在氧化錫中摻雜氟得到的物質(zhì)、在氧化錫中摻雜銻得到 的物質(zhì)、在氧化鋅中摻雜鎵得到的物質(zhì)、或在氧化鋅中摻雜鋁得到的物 質(zhì)等導電性金屬氧化物，更優(yōu)選為銦-錫復合氧化物(ITO)、在氧化錫中 摻雜氟得到的金屬氧化物(FTO)。但是，如上所述，電子接受層本身也 發(fā)揮導電性基材的功能時，導電性基材可以省略。此外，本發(fā)明中，導 電性基材只要是可以確保導電性的材料則不限定，也包含其本身不具有 作為支撐體的強度的薄膜狀或點狀的導電材料層。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，導電性基材實質(zhì)上透明，具體地說， 優(yōu)選光的透射率為10%以上，更優(yōu)選為50%以上，進一步優(yōu)選為70%以 上。此外，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，導電材料層的厚度優(yōu)選為0.02-10jLim左右。進一步地，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，優(yōu)選導電性基材 的表面電阻為100Q/cm2以下，進一步優(yōu)選為40Q/cn^以下。對導電性 基材的表面電阻的下限不特別限定，通常為0.1D/cn^左右。
作為在導電性基材層上形成電子接受層的優(yōu)選方法的例子，可以舉 出在導電性支撐體上涂布電子接受物質(zhì)的分散液或膠體溶液的方法，在 導電性支撐體上涂布半導體微粒的前體、通過空氣中的水分進行水解獲 得微粒膜的方法(溶膠-凝膠法)，濺射法，CVD法，PVD法，氣相沉積法等。制備作為電子接受物質(zhì)的半導體微粒的分散液的方法，除了上述 溶膠-凝膠法之外，還可以舉出用乳缽磨碎的方法、使用磨粉碎的同時分 散的方法、或在合成半導體時在溶劑中以微粒的形式析出并直接使用的 方法等。作為此時的分散介質(zhì)，可以舉出水或各種有機溶劑(例如曱醇、 乙醇、異丙醇、二氯甲烷、丙酮、乙腈、乙酸乙酯等)。分散時可以根據(jù) 需要使用聚合物、表面活性劑、酸或螯合劑等作為分散助劑。
作為電子接受物質(zhì)的分散液或膠體溶液的涂布方法的優(yōu)選例子，可 以舉出，作為涂布系統(tǒng)的輥涂法、浸涂法，作為計量系統(tǒng)的氣刀法、刮
板法等，此外，作為使涂布與計量以同一部分完成的日本特公昭58-4589 號公報中公開的繞線棒法、美國專利2681294號、美國專利2761419號、 美國專利2761791號等中記載的滑動漏斗法，擠出法、幕涂法、旋涂法、 噴涂法等。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，電子接受層含有半導體微粒時，優(yōu)選 電子接受層的膜厚為0.1~200nm,更優(yōu)選為0.1~100jum，進一步優(yōu) 選為l 30jum,最優(yōu)選為2~25jum。由此，可以4吏每單位投影面積的 探針物質(zhì)以及固定的敏化色素量增加，使光電流量增大，同時降低由于 電荷再結(jié)合所導致的電子的損失。此外，每ln^的導電性基材的半導體 -微粒的涂布量優(yōu)選為0.5 ~ 400g,更優(yōu)選為5 ~ 100g。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，電子接受物質(zhì)含有銦-錫復合氧化物 (ITO)或在氧化錫中摻雜氟得到的金屬氧化物(FTO)時，電子接受層的膜 厚優(yōu)選為lnm以上，更優(yōu)選為10nm~ 1 |u m。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，優(yōu)選在導電性基材上涂布半導體微粒 后實施加熱處理。由此，使粒子之間電接觸，此外，可以提高涂膜的強 度或提高與支撐體的密合性。優(yōu)選的加熱處理溫度為40~700°C,更優(yōu) 選為100~600°C。此外，優(yōu)選的加熱處理時間為10分^7-10小時左右。
此外，根據(jù)本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方式，使用聚合物膜等熔點或軟 化點低的導電性基材時，為了防止由于熱所導致的老化，優(yōu)選通過不使 用高溫處理的方法形成膜，作為這種膜形成方法的例子，可以舉出加壓、 低溫加熱、電子射線照射、微波照射、電泳、濺射、CVD、 PVD、氣相 沉積等方法。
在如此得到的作用電極的電子接受層表面上負載探針物質(zhì)。在作用 電極上負載探針物質(zhì)可以通過公知方法進行。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，使用單鏈核酸作為探針物質(zhì)時，可以通過在作用電極表面上預先形 成氧化層，通過該氧化層使核酸探針與作用電極結(jié)合來進行負載。此時， 可以通過向核酸的末端導入官能團來將核酸探針固定到作用電極上。由 此，導入了官能團的核酸探針可以直接通過固定化反應固定在載體上。
向核酸末端導入官能團可以通過酶反應或使用DNA合成儀來進行。作 為酶反應中使用的酶，可以舉出例如，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶、聚腺普 酸聚合酶、多核苷酸激酶、DNA聚合酶、多核苷酸腺普酸轉(zhuǎn)移酶 (polynucleotide adenyl transferase) 、 RNA連接酶。》匕夕卜，也可以通過 聚合酶鏈反應(PCR法)、切口平移法、隨機引物法導入官能團。官能團 可以導入到核酸的任意部分，可以導入到3，末端、5，末端或隨機位置。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，作為用于將核酸探針固定在作用電極 上的官能團，可以優(yōu)選使用胺、羧酸、磺酸、硫醇、羥基、磷酸等。此 外，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，為了將擴散探針牢固地固定在作用電 極上，可以使用將作用電極與擴散探針之間交聯(lián)的材料。作為這種交聯(lián) 材料的優(yōu)選例子，可以舉出硅烷偶聯(lián)劑、鈦酸酯偶聯(lián)劑或聚噻吩、聚乙 炔.聚吡咯.聚苯胺等導電性聚合物。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，通過所謂的物理吸附這樣更簡單的操 作即可以有效地固定核酸探針。將核酸探針物理吸附在電極表面上例如 可以如下進行。首先，使用超聲波洗滌器，用蒸餾水和醇洗滌電極表面。 然后將電極插入到含有核酸探針的緩沖液中，使核酸探針吸附在載體表 面上。
此外，吸附核酸探針后，可以通過添加封閉劑來抑制非特異性吸附。 作為可以使用的封閉劑，只要是可以包埋未吸附核酸探針的電子接受層 表面的位置、并且可以通過化學吸附或物理吸附等吸附到電子接受物質(zhì) 上的物質(zhì)則不限定，但是優(yōu)選具有可以通過化學結(jié)合吸附的官能團的物 質(zhì)。例如，使用氧化鈦作為電子接受層時，作為優(yōu)選的封閉劑的例子， 可以舉出具有羧酸基、磷酸基、磺酸基、羥基、氨基、吡啶基、酰胺基 等可以吸附在氧化鈦上的官能團的物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，優(yōu)選在作用電極上，探針物質(zhì)被分別 分開負載在相互分離的多個區(qū)域上，利用光源的光照射可以對各區(qū)域分 別進行。由此，可以在一片作用電極上測定多個樣品，因此可以實現(xiàn) DNA芯片的集成化等。根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實施方式，優(yōu)選探針物質(zhì)負
25載在作用電極上的互相分離的多個區(qū)域形成圖案，用從光源照射的光進行掃描的同時以 一次性操作對各區(qū)域的樣品連續(xù)地進行受檢物質(zhì)的檢測或定量。
根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實施方式，可以使多種不同的探針物質(zhì)負載在作用電極上互相分離的多個區(qū)域的各個區(qū)域上。由此，可以同時進行區(qū)域的個數(shù)乘以各個區(qū)域探針物質(zhì)的種類數(shù)得到的數(shù)目的多種樣品的觀'J定。
根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實施方式，可以在作用電極上的互相分離的多個區(qū)域的各個區(qū)域上負載不同的探針物質(zhì)。由此，可以負載與所劃分的區(qū)域數(shù)相當?shù)姆N類數(shù)的探針物質(zhì)，因此可以同時進行多種受檢物質(zhì)的測定。該實施方式可以在各個區(qū)域內(nèi)對不同的受檢物質(zhì)進行分析，因此可
以優(yōu)選用于單核苷酸多態(tài)性的分析(SNPs)的多項目分析。
(4) 對電極
本發(fā)明中使用的對電極只要是在和電解液接觸時與作用電極之間有電流流過的對電極則不特別限定，可以使用氣相沉積有金屬或?qū)щ娦匝趸锏牟Ａ?、塑料、陶瓷等。此外，作為對電極的金屬薄膜可以通過氣相沉積或濺射等方法形成，4吏膜厚為5 ium以下、優(yōu)選為3nm 3 jnm。作為對電極中可以使用的材料的優(yōu)選例子，可以舉出鉑、金、鈀、鎳、碳、聚噻吩等導電性聚合物，氧化物、碳化物、氮化物等導電性陶瓷等，更優(yōu)選為鉑、碳，最優(yōu)選為鈿。這些材料可以通過與電子接受層形成方法同樣的方法形成薄膜。
(5) 電極單元
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，可以使用作用電極和對電極在同 一平面上構(gòu)圖而成的電極單元。優(yōu)選的電極單元具有絕緣基板、作用電極和對電極，其中所述作用電極局部設(shè)置在絕緣基板上，并且具有電子接受層，該電子接受層含有可以接受敏化色素響應光激發(fā)而釋放的電子的電子接受物質(zhì)，所述對電極和絕緣基板的作用電極在同一平面上與作用電極分離設(shè)置。這種電極單元的一例如圖7所示。圖7所示的電極單元71具有絕緣基板72、作用電極73和對電極74。絕緣基板72是具有絕緣性從而使作用電極72和對電極73不短路的基板。作用電極73被局部設(shè)置在絕緣基板72上，具有電子接受層，該電子接受層含有可以接受敏化色素響應光激發(fā)而釋放的電子的電子接受物質(zhì)。對電極74和絕緣基板72的作用電極73在同一平面上與作用電極73分離設(shè)置。而且，分別設(shè)置分別從作用電極72和對電極74延伸的導線72' 、 74'。
如此，電極單元為在同一平面上具有作用電極與對電極的一體型的電極部件，通過使用該電極單元，傳感器單元的設(shè)計和材料選擇的自由度顯著變大，可以大幅改善傳感器單元的生產(chǎn)性、性能、使用容易程度。即，本發(fā)明的電極單元由于是一體型的電極部件而無需使兩片電極對置，可以容易采用使光源與電極單元的表面對置的結(jié)構(gòu)。從而，由于作用電極不限于透明材料，還可以由陶瓷或塑料等不透明的材料構(gòu)成，電極材料的選擇自由度也變大。此外，由于通過從光源直接照射到作用電極表面上，可以使從電極背面照射時產(chǎn)生的由于透明電極材料的透光度所導致的光損失消失，因此也可以期待精確度更高的測定。進一步地，本發(fā)明的電極單元由于是一體型的電極部件，可以通過一步的導通構(gòu)圖形成作用電極、對電極以及導線，電極的生產(chǎn)性提高。此外，由于與電極單元對置的材料無需具有導電性，可以使用透明塑料、玻璃等常用的材料，電池的生產(chǎn)性也提高。
(6)測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明使用傳感器單元的測定方法中，首先，在敏化色素的共存下，使樣品液與作用電極接觸，使受檢物質(zhì)與探針物質(zhì)直接或間接地特異性結(jié)合，通過該結(jié)合使敏化色素固定在上述作用電極上。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，以用敏化色素預先標記的單鏈核酸作為受檢物質(zhì)時，可以和作為探針物質(zhì)的單鏈核酸之間進行雜交反應。雜交反應的優(yōu)選溫度為37~72°C,其最適溫度根據(jù)所用探針的堿基序列或長度等不同而不同。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式，在受檢物質(zhì)和探針物質(zhì)的結(jié)合體(例如雜交后的雙鏈核酸)中使用可以嵌入的敏化色素時，通過向樣品液中添加敏化色素，可以將結(jié)合體用敏化色素特異性地標記。
使這樣固定了受檢物質(zhì)與敏化色素的作用電極和對電極一起與電解液接觸，對作用電極進行光照使敏化色素光激發(fā)，對電子從光激發(fā)的
1電流i:檢測。作為此時的傳感器單元，利用使;了本發(fā)明的凝膠片的傳感器單元。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，使用可以用互相不同的光波長激發(fā)的兩種以上敏化色素分別檢測多種受檢物質(zhì)時，通過波長選擇裝置由光源照射特定波長的光，由此可以分別激發(fā)多種色素。作為波長選擇裝置的例子，可以舉出分光器、玻璃濾色器、干涉濾光器、帶通濾光器等。此外，還可以根據(jù)敏化色素的種類而使用可以照射不同波長的光的多個光源，作為此時優(yōu)選的光源的例子，可以使用照射特定波長光的激光或
LED。此外，為了有效地對作用電極進行光照，可以使用石英、玻璃、液體光導管等進行導光。
由光照而引起的在體系內(nèi)流過的光電流通過電流計測定。由此可以檢測受檢物質(zhì)。此時的電流值反映了被捕獲在作用電極上的敏化色素的量。例如，受檢物質(zhì)為核酸時，具有互補性的核酸之間形成的雙鏈的量反映為電流值。因此，可以由得到的電流值對受檢物質(zhì)進行定量。因此，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，優(yōu)選電流表進一步具有由得到的電流量或電量計算樣品液中的受檢物質(zhì)濃度的裝置。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，檢測光電流的步驟中，可以測定電流值，由得到的電流值或電量計算樣品液中的受檢物質(zhì)濃度。該受檢物質(zhì)濃度的計算可以通過將預先制作的受檢物質(zhì)濃度和電流值或電量的標準曲線、與得到的電流值或電量進行對比來進行。本發(fā)明的方法中，電
流值反映了捕獲在作用電極上的敏化色素的量，因此，由于獲得與受檢物質(zhì)濃度對應的準確的電流值，適于進行定量測定。
根據(jù)本發(fā)明的另 一優(yōu)選實施方式，可以使用預先用敏化色素標記的受檢物質(zhì)作為竟爭物質(zhì)，對未用敏化色素標記的可以與探針物質(zhì)特異性結(jié)合的第二受檢物質(zhì)進行定量。第二受檢物質(zhì)優(yōu)選具有比已標記的受檢物質(zhì)更容易與探針物質(zhì)特異性結(jié)合的性質(zhì)。若使這兩種受檢物質(zhì)竟爭與探針物質(zhì)特異性結(jié)合，則得到檢測出的電流值與第二受檢物質(zhì)的濃度之間的相關(guān)關(guān)系。即，隨著未被色素標記的第二受^r物質(zhì)數(shù)量的增加，與探針物質(zhì)特異性結(jié)合的竟爭物質(zhì)數(shù)量減少，因此可以得到隨著第二受檢物質(zhì)濃度的增加、檢測電流值減少的標準曲線。因此，可以進行未一皮敏化色素標記的笫二受檢物質(zhì)的檢測和定量。
根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實施方式，優(yōu)選受檢物質(zhì)和第二受檢物質(zhì)為抗原、探針物質(zhì)為抗體。該實施方式中的受檢物質(zhì)和第二受檢物質(zhì)固定到探針物質(zhì)上的步驟如圖8所示。如圖8所示，用敏化色素標記的抗原141和未被敏化色素標記的抗原142竟爭性地與抗體143特異性結(jié)合。因此，
28隨著未#:色素標記的抗原142的增加，與抗體特異性結(jié)合的纟皮色素標記
的抗原143減少，因此，可以得到隨著第二受檢物質(zhì)濃度的增加、檢測電流值減少的標準曲線。
實施例
例A1:使用凝月交片測定光電流
(1) 固定有色素標記DNA的作用電極的制造
作為作用電極用玻璃基材，準備摻雜有氟的氧化錫(F-Sn02: FTO)涂層玻璃OnT^特殊硝子社制、U膜、片電阻12Q/口、形狀50mmx26mm)。將該玻璃基材在丙酮中實施15分鐘的超聲波洗滌，隨后在超純水中實施15分鐘的超聲波洗滌，除去污垢和殘留有機物。將該玻璃基材在5M的氬氧化鈉水溶液中振蕩15分鐘。然后，為了除去氫氧化鈉，在超純水中振蕩5分鐘，換水，進行三次。取出玻璃基材，吹空氣，使殘留水分揮散后，將玻璃基材浸漬在無水曱醇中脫水。
用95%曱醇5%超純水作為溶劑，以2vol。/。濃度加入3-氨基丙基三曱氧基硅烷(APTMS),在室溫下攪拌5分鐘制備偶聯(lián)處理用溶液。將上述玻璃基材浸漬在該偶聯(lián)處理用溶液中，緩慢振蕩15分鐘。接著，取出玻璃基材，在曱醇中振蕩10次左右除去剩佘的偶聯(lián)處理用溶液，換三次甲醇進行該操作。然后將玻璃基材在11(TC下保持30分鐘，使偶聯(lián)劑與玻璃基材結(jié)合。在室溫下冷卻玻璃基材后，載置形成有9個直徑為3mm大小的開口部的粘合性密封片(厚度0.5mm)并密合。接著，將調(diào)節(jié)過濃度(100nM)的若丹明標記ssDNA(25mer)在95。C下保持10分鐘后，立即轉(zhuǎn)移到水上保持IO分鐘使DNA變性。向之前準備的玻璃上的密封片的9個開口部中各填充5 p 1該變性DNA,在95。C保持10分鐘使溶劑蒸發(fā)。然后，用UV交聯(lián)儀(UVP公司CL-1000型)照射120mJ的紫外光，將標記ssDNA固定在玻璃基材上。從玻璃基材剝離密封片，將玻璃基材在0.2%的SDS溶液中振蕩15分鐘x 3次，更換三次超純水進行洗滌。將該玻璃基材在沸水中浸漬2分鐘后取出，然后吹空氣，使殘留水分揮散。接著，將玻璃基材浸漬在4。C的無水乙醇中l(wèi)分鐘進行脫水，吹空氣，使殘留乙醇揮散。如此，得到固定有色素標記DNA的作用電極。
(2) 凝膠片的制造
制備含有O.IM、 0.2M和0.5M的四丙基碘化銨(NPr4I)的水溶液。向該水溶液中加入最終濃度為1%的瓊脂糖(電泳用瓊脂糖標準Low-mr、 BIO-Rad公司)，在12rC下于高壓釜中加熱20分鐘，使瓊脂糖溶解。 使瓊脂糖已溶解的狀態(tài)的液體流入夾有厚度1.0mm的密封墊的2塊玻璃 板之間，在室溫下放冷并固化，得到凝膠片。將得到的凝膠片用切割機 裁成適當?shù)某叽?，加工成光電流測定用尺寸。 (3)光電流測定
(i) 使用凝膠片的測定
準備上述(l)中制造的固定有色素標記DNA的作用電極和在玻璃板 上氣相沉積鉑得到的對電極。在兩電極間夾入上述(2)中制造的凝膠片， 使其密合。此時，使作用電極的固定ssDNA的面和對電極的鉑氣相沉積 面對置配置。在兩電極與電化學分析器連接的狀態(tài)下，對作用電極照射 激光光源(輸出功率60mW、照射區(qū)域的直徑為lmm、波長530nm的綠 色激光)，記錄此時觀察到的電流值。
(ii) 使用電解液的測定(比較)
為了進行比4支，使用電解液來代替凝膠片，進行與上述(i)同樣的測 定。具體地說，準備上述(1)中得到的固定有色素標記DNA的作用電極 和在玻璃板上氣相沉積鉑得到的對電極。在兩電極間夾入厚度lmm的 墊片，向其空隙中填充上述(l)中制備的0.2M的NPrl4溶液。此時，使 作用電極的固定ssDNA的面和對電極的鉑氣相沉積面對置配置。在兩電 極與電化學分析器連接的狀態(tài)下，對作用電極照射激光光源(輸出功率 60mW、照射區(qū)域的直徑為lmm、波長530nm的綠色激光)，記錄此時 觀察到的電流值。
結(jié)果如圖9所示。如圖9所示，使用凝膠片時，在0.1 0.5M的電 解質(zhì)濃度的全部區(qū)域，與使用電解液時相比檢測出特別高的光電流。
例A2:凝膠濃度的影響
(1) 固定有色素標記DNA的作用電極的制造
除了使所固定的ssDNA濃度為10nM和100nM兩種濃度之外，與 例1同樣地操作制造固定有色素標記DNA的作用電極。
(2) 凝膠片的制造
除了使瓊脂糖濃度變?yōu)?.5%、 4%、 8%以及10%之外，與例1同樣 地操作制造凝膠片。 C3)光電流測定
30制造的瓊脂糖濃度不同的各凝膠片，與例1同樣地操作測定光電流。
結(jié)果如圖IO所示。如圖IO所示，在0.5%~ 10%的瓊脂糖濃度的全
部區(qū)域，幾乎未發(fā)現(xiàn)瓊脂糖濃度對光電流值的影響。因此推測即使從得 到充分強度方面考慮而使用比較多的凝膠，也對光電流檢測無不良影響。
例A3:凝膠片的厚度的影響
(1) 固定有色素標記DNA的作用電極的制造
除了使固定的ssDNA濃度為10nM和100nM兩種濃度之外，與例1 同樣地操作制造固定有色素標記DNA的作用電極。
(2) 凝膠片的制造
除了使瓊脂糖濃度固定為1%,使凝膠片的厚度為lmm、 2mm以及 3mm之外，與例1同樣地操作制造凝膠片。
(3) 光電流測定
制造的厚度不同的各凝膠、;，與^i"i、同樣地5操作測定光電流。；
結(jié)果如圖11所示。如圖11所示，在lmm 3mm的凝月交片厚度的 全部區(qū)域，幾乎未發(fā)現(xiàn)凝膠片厚度對光電流值的影響。因此推測即使從 得到充分強度方面考慮而增大凝膠片厚度，也對光電流檢測無不良影響。
例A4:凝膠片的制造方法的研究
研究向水中加入電解質(zhì)和膠凝劑(瓊脂糖)并加熱溶解制備凝膠的情 況(以下稱為混合制備)和僅用膠凝劑形成凝膠后浸漬在電解質(zhì)溶液中并 使電解質(zhì)分散在凝膠中的情況(以下稱為浸漬制備)對光電流測定的影 響。具體地說，混合制備時，與例1同樣地操作制造厚度為lmm的凝 膠片，并裁成適當?shù)某叽纭Ａ硪环矫?，浸漬制備時，除了不使用電解質(zhì) 之外與例1同樣地操作制造厚度為lmm的凝膠片，裁成適當?shù)某叽绾螅?在0.2M的NPr41溶液中將凝膠片于室溫下浸漬一夜。接著，從溶液中 取出該凝膠片后，用純水沖洗附著的殘留還原劑溶液后除去水分。將各 凝膠片夾入作用電極與對電極之間，與例1(3)同樣地操作進行光電流測 定。此外，制造使用若丹明標記ssDNA濃度為0nM以及10nM的各溶 液制造的作用電極，與上述同樣地進行光電流測定。，通過浸漬制備制造的凝膠片 檢測出與通過混合制備制造的凝膠片同等程度的光電流、即得到同樣的 性能。因此，即使在電解質(zhì)與膠凝劑的組合不適于混合制備的情況(例如
聚丙烯酰胺凝膠與NPr41的組合等難以加熱溶解固化的情況)下，通過膠 凝后進行浸滲的浸漬制備也可以容易地制造凝膠片。 例A5:凝膠片的膠凝強度的研究
(1) 不含電解質(zhì)的凝膠片的制造
除了不使用電解質(zhì)且瓊脂糖的最終濃度為0.1%、 0.5%、 0.8%、 1%、 2%、 4%、 8%、 15%之外，與例1同樣地操作制造凝膠片。
(2) 凝膠片的強度測定
所得到的凝膠片的膠凝強度(g/m"通過"流變儀CR200D" (SUN SCIENTIFIC CO., LTD.制)的MODE-2測定。圖13表示該"流變儀CR200D" 的簡圖。如圖13所示，該測定裝置具有工作臺81和棒狀接頭(adapter)82。 使用的棒狀接頭82為丙烯酸樹脂制的廿y科學社生產(chǎn)的接頭NO. 25-15mm,與凝膠片接觸的面的直徑為15mm。如圖14所示，在該測定 中，在工作臺81上設(shè)置形狀為30mmx30mm、厚度為lmm的凝膠片， 棒狀接頭82以100mm/min的速度進入至0.8mm的深度并壓縮凝膠，測 定此時的最大負荷(負荷設(shè)定為HOLD)。此時，設(shè)置凝膠片使棒狀接頭 不從凝膠片露出。更換凝膠片各進行3次該測定，將其平均值換算為單 位表面積的負荷，得到膠凝強度(g/m2)。
結(jié)果如圖15所示。如圖15所示可知，瓊脂糖添加量越多則膠凝強 度越大。此外，瓊脂糖濃度為0.1%時不膠凝，但是瓊脂糖濃度為0.5% 時得到可以單獨操作的凝膠片，此時的膠凝強度為169.9g/cm2。由此可 知，為了形成可以單獨操作的凝膠片，優(yōu)選膠凝強度至少為100g/cm2 以上。
例A6:使用聚丙烯酰胺的凝膠片
將7.5%聚丙烯酰胺凝膠(厚度lmm)裁成適當?shù)某叽?，于室溫下?0.2M的NPr4I溶液中浸漬一夜，浸滲還原劑。用純水沖洗殘留的還原劑 溶液并除去水分后，與例1同樣地操作測定光電流。此外，為了參考， 使用1重量％瓊脂糖制造相同厚度的凝膠片，同樣地于室溫下在0.2M的 NPr41溶液中浸漬一夜，浸滲還原劑后使用，與例1同樣地操作進行光 電流的測定。固定有色素標記DNA的作用電極的制造與例1同樣地操
32作進行，制造使用若丹明標記ssDNA濃度為0nM以及10nM的各溶液 制造的作用電極，與上述同樣地進行光電流測定。
結(jié)果如圖16所示。如圖16所示，使用丙烯酰胺的凝膠片中，測得 與使用瓊脂糖的凝膠片同等程度的光電流。
例A7:各種電解質(zhì)的研究
使用各種電解質(zhì)進行光電流測定。具體地說，使用1重量％瓊脂糖 作為膠凝劑，將各還原劑的濃度固定為0.2M,制造凝膠片。作為電解質(zhì)， 使用Nal、KI、Cal2、Lil、麗4l、四丙基碘化銨(NPr4l)、硫代硫酸鈉(Na2S203) 和亞硫酸鈉(Na2S03)。向水中加入瓊脂糖和電解質(zhì)，與例1同樣地將置 于高壓釜中加熱溶解的溶解物在室溫下放冷固化，裁成適當?shù)某叽?，?造凝膠片。光電流的測定與例1同樣地操作進行。固定有色素標記DNA 的作用電極的制造與例1同樣地操作進行，制造使用若丹明標記ssDNA 濃度為0nM以及10nM的各溶液制造的作用電極，與上述同樣地進行光 電流測定。
結(jié)果如圖17所示。研究的任意一種還原劑中，都發(fā)現(xiàn)光電流的增 加依賴于ssDNA的固定量，明確了這些還原劑可以使用。 例A8:單核苷酸多態(tài)性(SNPs)檢測
本例中，將凝膠片用于檢測p53基因的單核普酸多態(tài)性。在作用電 極一側(cè)上固定完全一致的探針、單堿基突變鏈探針和完全不一致的探 針。各堿基序列如下所述。
完全一致(PM)探針5，陽NH2-AGGATGGGCCTCAGGTTCATGCC GC-3，(序列號3)
單堿基突變鏈(SNP)探針5，國NH2國AGGATGGGCCTCGGGTTCAT GCCGC-3，(序列號4)
完全不一致(MM)探針5，畫麗2-GCGGCATGAACCGGAGGCCCA TCCT-3，(序列號5)
與這些探針雜交的靶DNA的堿基序列如下所述。
耙DNA: 5，-若丹明-0。00。八丁0八八。01:0八00(3(:0八丁(:0:丁國3，(序 列號6)
作為作用電極用玻璃基材，準備摻雜有氟的氧化錫(F-Sn02: FTO) 涂層玻璃(工^7Y特殊硝子社制、U膜、片電阻12Q/口、形狀50mm x26mm)。將該玻璃基材在丙酮中實施15分鐘的超聲波洗滌、接著在超純水中實施15分鐘的超聲波洗滌，除去污垢和殘留有機物。將該玻璃
基材在5M的氫氧化鈉水溶液中振蕩15分鐘。然后，為了除去氫氧化鈉， 在超純水中振蕩5分鐘，換水進行三次。取出玻璃基材，吹空氣，使殘 留水分揮散后，將玻璃基材浸漬在無水甲醇中進行脫水。
用95%曱醇5%超純水作為溶劑，以2vol。/Q濃度加入3-氨基丙基三 甲氧基硅烷(APTMS),在室溫下進行5分鐘的攪拌來制備偶聯(lián)處理用溶 液。將上述玻璃基材浸漬在該偶聯(lián)處理用溶液中，緩慢振蕩15分鐘。 然后，取出玻璃基材，在甲醇中振蕩10次左右，除去剩余的偶聯(lián)處理 用溶液，更換三次甲醇進行上述操作。然后將玻璃基材在ll(TC下保持 30分鐘，使偶聯(lián)劑與玻璃基材結(jié)合。將玻璃基材在室溫下冷卻后，載置 形成有9個直徑為3mm大小的開口部的粘合性密封片(厚度0.5mm)并 密合。接著，將制備為lyM的完全一致鏈、單堿基突變鏈、完全不一 致鏈的探針DNA (25mer)在95。C下保持10分鐘，然后立即轉(zhuǎn)移到水上 保持10分鐘，使DNA變性，在之前準備的玻璃上的密封片的9個開口 部中各填充5 p 1該變性DNA,在95°C下保持10分鐘使溶劑蒸發(fā)。然后， 用UV交聯(lián)儀(UVP公司CL-1000型)照射120mJ的紫外光，將探針DNA 固定在玻璃基材上(各探針各固定3個樣點)。從玻璃基材剝離密封片， 將玻璃基材在0.2%SDS溶液中振蕩15分鐘x 3次，更換三次超純水進 行洗滌。將該玻璃基材在沸水中浸漬2分鐘，取出后，吹空氣，使殘留 水分揮散。接著，將玻璃基材在4。C的無水乙醇中浸漬l分鐘進行脫水， 吹空氣，使殘留乙醇揮散。如此，得到固定有探針DNA的作用電極。
然后，將含有靶DNA的5 x SSC、 0.5%SDS溶液載置到固定有探針 的電極上，用蓋玻片密閉，在該密閉狀態(tài)下于37。C保溫10小時。然后， 將電才及立在支架上，在63。C的加入有0.2xSSC、 0.2。/。SDS溶液5L的水 槽中浸漬l分鐘后，用水洗滌2次，使電極干燥。
將如此得到的作用電極組裝到測定池中，在測定池上安裝光源自動 移動用XY臺座。池部分的結(jié)構(gòu)為在使用凝膠片時使作用電極與鉑對 電極對置，在兩電極之間夾入凝膠片防止因兩電極接觸而導致的短路。 使用電解液時，使作用電極與鉑對電極對置，為了防止兩電極之間因接 觸導致的短路、并空出用于填充電解液的空間，插入膜厚為500|um的 硅片。硅片上開有可裝入全部樣點的足夠大的孔，在其中存留送入的電 解液，形成使其與固定在作用電極上的DNA接觸的結(jié)構(gòu)。作用電極與對電極一起，通過電連接的彈簧探針與高靈敏度電流計連接。
接著，通過固定在自動移動用XY臺座上的光源，從作用電極背面 的上方照射光，經(jīng)時測定在作用電極與鉑對電極之間流過的電流。在作
用電極的上方設(shè)置與FTO基板上的樣點相同形狀的遮光部件，以防止對 鄰接的樣點照射光，同時還設(shè)置了未照射光的樣點。測定時，依次對樣 點進行掃描，同時通過與計算機連接的高靈敏度電流計，將樣點的電流 輸出存儲在計算機中。
革巴DNA濃度為lpM時的結(jié)果如圖18所示，乾DNA濃度為lOOnM 時的結(jié)果如圖19所示。如圖18和圖19所示，靶濃度為lpM時，電解 液和凝膠片的任意一種實施方式都可以以光電流值的差的形式片全測單 核普酸多態(tài)性(SNPs),但是濃度為100nM時，^又凝月交片的實施方式可以 以光電流值的差的形式才全測SNPs。
例B1:使用含有電解質(zhì)的吸水性片測定光電流
(l)固定有色素標記DNA的作用電極的制造
作為用于作用電極的玻璃基材，準備摻雜有氟的氧化錫(F-Sn02: FTO)涂層玻璃(工^7^r特殊硝子社制、U膜、片電阻12Q/口、形狀 50mmx26mm)。將該玻璃基材在丙酮中實施15分鐘的超聲波洗滌、接 著在超純水中實施15分鐘的超聲波洗滌，除去污垢和殘留有機物。將 該玻璃基材在5M的氫氧化鈉水溶液中振蕩15分鐘。然后,為了除去氫 氧化鈉在超純水中振蕩5分鐘，換水進行三次。取出玻璃基材，吹空氣， 使殘留水分揮散后，將玻璃基材浸漬在無水曱醇中進行脫水。
以95%甲醇5%超純水作為溶劑，以2vol。/Q濃度加入3-氨基丙基三 甲氧基硅烷(APTMS)，在室溫下攪拌5分鐘制備偶聯(lián)處理用溶液。將上 述玻璃基材浸漬在該偶聯(lián)處理用溶液中，緩慢振蕩15分鐘。接著，取 出玻璃基材，在甲醇中振蕩10次左右，除去剩余的偶聯(lián)處理用溶液， 更換三次曱醇進行該操作。然后將玻璃基材在11(TC下保持30分鐘，使 偶聯(lián)劑與玻璃基材結(jié)合。在室溫下冷卻玻璃基材后，載置形成了9個直 徑為3mm大小的開口部的粘合性密封片(厚度0.5mm)并密合。接著， 將濃度調(diào)節(jié)為100nM的5，末端若丹明標記ssDNA(25mer)和濃度調(diào)整 為100nM的非標記ssDNA(24mer)在95。C下保持10分鐘后，立即轉(zhuǎn)移 到水上保持IO分鐘使DNA變性。向之前準備的玻璃上的密封片的9個 開口部中各填充5]Lil該變性DNA,在95。C下保持IO分鐘蒸發(fā)溶劑。然后，用UV交聯(lián)儀(UVP公司CL-1000型)照射120mJ的紫外光，將標記 ssDNA固定在玻璃基材上。從玻璃基材剝離密封片，將玻璃基材在0.2% 的SDS溶液中振蕩15分鐘x3次，更換三次超純水進行洗滌。將該玻 璃基材在沸水中浸漬2分鐘后取出，然后吹空氣，使殘留水分揮散。接 著，將玻璃基材浸漬在4C的無水曱醇中1分鐘進行脫水，吹空氣，使 殘留乙醇揮散。如此，得到固定有色素標記DNA的作用電極。這里使 用的探針DNA的堿基序列如下所述。
5 ，末端若丹明標記 ssDNA(探針1) :5 ， 國Rho-GCGGCATGAACCTGAGGCCCATCCT畫3，(序列號1)
非標記ssDNA(探針2): 5， -TTGAGCAAGTTCAGCCTGGTTAAG-3' (序列號2)
(2) 含有電解質(zhì)的吸收性片的制造
制備含有0.2M、 0.4M和0.6M的四丙基碘化銨(NPr4I)的水溶液。 在該水溶液中浸漬切成26mmx20mm、厚度0.9mm的吸墨用濾紙 (CB-13A; 7卜一抹式會社)，輕輕除去水分，得到含有電解質(zhì)的吸收性片。
(3) 使用含有電解質(zhì)的吸收性片測定光電流
準備上述(l)中制造的固定有色素標記DNA的作用電極和在玻璃板 上氣相沉積鉑形成的對電極。在兩電極間夾入上述(2)中制造的含有電解 質(zhì)的吸收性片，并使其密合。此時，使作用電極的固定有ssDNA的面和 對電極的柏氣相沉積面對置配置。在兩電極與電化學分析儀連接的狀態(tài) 下，對作用電極照射激光光源(輸出功率60mW、照射區(qū)域的直徑為lmm、 波長530nm的綠色激光)，記錄此時觀察到的電流值。
結(jié)果如圖20所示。如圖20所示可知，發(fā)現(xiàn)光電流的增加依賴于四 丙基碘化銨的濃度，明確了任意一種濃度的四丙基碘化銨都可以用于測 定。
例B2:各種電解質(zhì)的研究
使用各種電解質(zhì)進行光電流測定。具體地說，使用濾紙作為吸水性 基材，將各還原劑的濃度固定為0.2M,制造含有電解質(zhì)的吸收性片。作 為電解質(zhì)，使用Nal、 KI、 Cal2、 Lil、麗41、四丙基碘化銨(NPr41)、硫 代硫酸鈉(Na2S203)和亞硫酸鈉(Na2S03)。制備含有上述各種電解質(zhì)和水 的電解液，浸漬切成26mmx20mm、厚度為0.9mm的吸墨用濾紙 (CB-13A; ATTO Corporation),輕輕除去水分，得到含有電解質(zhì)的吸收性
36片。光電流的測定與例B1同樣地操作進行。固定有色素標記DNA的作 用電極的制造與例Bl同樣地操作進行，制造使用若丹明標記ssDNA濃 度為10nM以及沒有若丹明標記的ssDNA濃度為lOOnM的各溶液制造 的作用電極，也與上述同樣地進行光電流測定。
結(jié)果如圖21所示。如圖21所示，所研究的電解質(zhì)中都發(fā)現(xiàn)光電流 的增加依賴于ssDNA固定量，明確了它們都可以用于測定。
例B3:含有電解質(zhì)的吸收性片的厚度的影響
(1) 固定有色素標記DNA的作用電極的制造
除了使固定的ssDNA濃度為100nM和l|iM兩種濃度之外，與例 Bl(l)同樣地操作制造固定有色素標記DNA的作用電極。
(2) 含有電解質(zhì)的吸收性片的制造
用0.2M濃度的四丙基碘化銨(NPr4l)和水制備電解液，將厚度為 0.9mm的吸墨用濾紙(CB-13A; ATTO Corporation"張、重疊2張、重疊 3張分別浸漬在電解液中，制造含有電解質(zhì)的吸收性片。
。)光電流測定
使用上述(l)中制造的具有不同固定濃度的樣點的作用電極和上述 (2)中制造的厚度不同的各含有電解質(zhì)的吸收性片，與例1同樣地操作測 定光電流。
結(jié)果如圖22所示。如圖22所示，在0.9mm 2.7mm的含有電解質(zhì) 的吸收性片厚度的全部區(qū)域，幾乎未見厚度對光電流值的影響。因此推 測即使從得到充分強度方面考慮而增大含有電解質(zhì)的吸收性片的厚度， 對光電流纟企測也無不良影響。
例B4:各吸收性基材的研究
除了使用厚度為0.9mm的吸墨用濾紙(CB-13A; 7卜一抹式會社)、氈 (厚度lmm、密度0.00049g/mm3)、卡紙(厚度0.5mm、密度 0.00071g/mm3)、玻璃纖維濾紙(GF/D; Whatman:厚度0.68mm)、含紙 漿纖維和合成纖維的涂布紙(厚度0.14mm、密度0.0011 lg/mm3)、主 要含有氟樹脂的濾膜(JCWP09025; MILLIPORE:厚度O.lmm)作為吸 水性基材之外，與例1同樣地操作進行光電流的測定。固定有色素標記 DNA的作用電極的制造與例B1同樣地操作進行，制造使用若丹明標記 ssDNA濃度為100nM以及l(fā)pM的各溶液和非標記ssDNA濃度為100nM 制造的作用電極，與例Bl同樣地進行光電流測定。電解液使用含有0.2M的四丙基碘化銨(NPr4)的水溶液。
結(jié)果如圖23所示。如圖23所示，在全部含有電解質(zhì)的吸水性片中， 都發(fā)現(xiàn)光電流的增加依賴于ssDNA固定化量，明確了這些片都可以使 用。
例B5:含有電解質(zhì)的吸收性片的含水率的研究
(1) 含水率的測定
首先，向切割成26mmx20mm、厚度為0.9mm的吸墨用濾紙 (CB-13A; ATTO Corporation)上滴加含有0.4M的四丙基碘化餒(NPr4I)的 水溶液500jul，將濾紙完全浸漬在電解液中。如此，制造6張浸滲有電 解液的濾紙。接著，在50。C下使各浸滲的濾紙分別干燥0小時、0.25小 時、0.5小時、l小時、1.25小時、1.5小時。測定干燥后的濾紙的重量， 除去四丙基碘化銨的重量后，計算每lmmS的含水量。然后，計算(每 lmm3的含水量)/(濾紙密度)的比率作為含有電解質(zhì)的吸收性片的含水 率。吸墨用濾紙的密度為0.00049g/mm3。
(2) 光電流測定
用(l)中制造的各含水率的含有電解質(zhì)的吸收性片，與例1同樣地操 作才全測光電流。
結(jié)果如圖24所示。如圖24所示可知，含有電解質(zhì)的吸收性片的含 水率越高則光電流越高。此外，含水率為2.2%時不能檢測出光電流，但 是含水率為25.3%時可以檢測出光電流。由此可知，可以檢測出光電流 的含有電解質(zhì)的吸收性片優(yōu)選含水率至少為20°/。以上。
例B6..使用各種電解質(zhì)檢測單核苷酸多態(tài)性(SNPs)
本例中，將含有電解質(zhì)的吸收性片用于檢測p53基因的單核苷酸多 態(tài)性。在作用電極一側(cè)固定完全一致探針、單堿基突變鏈探針和完全不 一致的探針。各堿基序列如下所述。
完全一致(PM)探針5， -AGGATGGGCCTCAGGTTCATGCCGC-3' (序列號3)
單堿基突變鏈(SNP)探針5， -AGGATGGGCCTCGGGTTCAT GCCGC-3，(序列號4)
完全不 一 致(MM)探針5 ， -GCGGCATGAACCGGAGGCCCA TCCT-3，(序列號5)
與這些探針雜交的靶DNA的堿基序列如下所述。草巴DNA: 5，-若丹明-0。00。八丁0八八。001^^^0^\1^01-3，(序 列號6)
作為用于作用電極的玻璃基材，準備摻雜有氟的氧化錫(F-Sn02: FTO)涂層玻璃(工一7^特殊硝子社制、U膜、片電阻12Q/口、形狀 50mmx26mm)。將該玻璃基材在丙酮中實施15分鐘的超聲波洗涂，接 著在超純水中實施15分鐘的超聲波洗滌，除去污垢和殘留有機物。將 該玻璃基材在5M的氫氧化鈉水溶液中振蕩15分鐘。然后，為了除去氫 氧化鈉，在超純水中振蕩5分鐘，換水進行三次。取出玻璃基材，吹空 氣使殘留水分揮散后，將玻璃基材浸漬在無水曱醇中進行脫水。
將95%甲醇5%超純水作為溶劑，以2vol。/Q濃度加入3-氨基丙基三 曱氧基硅烷(APTMS)，在室溫下進行5分鐘的攪拌制備偶聯(lián)處理用溶液。 將上述玻璃基材浸漬在該偶聯(lián)處理用溶液中，緩慢振蕩15分鐘。然后， 取出玻璃基材，在曱醇中振蕩10次左右除去剩余的偶聯(lián)處理用溶液， 更換三次甲醇進行上述操作。然后將玻璃基材在110。C下保持30分鐘， 使偶聯(lián)劑與玻璃基材結(jié)合。將玻璃基材在室溫下冷卻后，載置形成有9 個直徑為3mm大小的開口部的粘合性密封片(厚度0.5mm)并密合。接 著，將制備為ljuM的完全一致鏈、單堿基突變鏈、完全不一致鏈的探 針DNA (25mer)在95。C下保持10分鐘，然后立即轉(zhuǎn)移到水上保持10分 鐘，使DNA變性。在之前準備的玻璃上的密封片的9個開口部中各填 充5 ju 1該變性DNA,在95°C下保持10分鐘使溶劑蒸發(fā)。然后，用UV 交聯(lián)儀(UVP公司CL-1000型)照射120mJ的紫外光，將探針DNA固定(各 探針各固定3個樣點)在玻璃基材上。從玻璃基材剝離密封片，將玻璃基 材在0.2%SDS溶液中振蕩15分鐘x 3次，更換三次超純水進行洗滌。 將該玻璃基材在沸水中浸漬2分鐘后取出，然后吹空氣，使殘留水分揮 散。接著，將玻璃基材在4"C的無水乙醇中浸漬1分鐘進行脫水，吹空 氣使殘留乙醇揮散。如此，得到固定有探針DNA的作用電極。
然后，將含有制備成濃度為100nM的靶DNA的5 x SSC、 0.5%SDS 溶液載置在固定有探針的電極上，用蓋玻片密閉，在該密閉狀態(tài)下于37 。C保溫10小時。然后，在2xSSC(室溫)中剝離蓋玻片，將電極立在支 架上，在設(shè)定為40。C的2 x SSC/0.2%SDS溶液中振蕩30分鐘后，用水 洗涂，干燥電極。
將如此得到的作用電極和含有電解質(zhì)的吸收性片組裝到測定池中，
39在測定池上安裝光源自動移動用XY臺座。池部分的結(jié)構(gòu)為使作用電 極與柏對電極對置，防止兩電極之間因接觸導致的短路，作用電極與對 電極一起通過電連接的彈簧探針與高靈敏度電流計連接。含有電解質(zhì)的 吸收性片使用濾紙作為吸水性基材，各還原劑的濃度固定為0.4M,制造 含有電解質(zhì)的吸收性片。使用四丙基碘化銨(NPrJ)、硫代硫酸鈉(Na2S203) 和亞硫酸鈉(Na2S03)作為電解質(zhì)。制造方法為制備含有各種電解質(zhì)和 水的電解液，浸漬切成26mmx20mm、厚度為0.9mm的吸墨用濾紙(與 例l相同)，輕輕除去水分，得到含有電解質(zhì)的吸收性片。
接著，通過固定在自動移動用XY臺座上的光源，從作用電極背面 的上方照射光，經(jīng)時測定作用電極與柏對電極之間流過的電流。在作用 電極的上方設(shè)置與FTO基板上的樣點相同形狀的遮光部件，在防止對鄰 接的樣點照射光的同時，還設(shè)置了未照射光的樣點。測定時，依次對樣 點進行掃描，同時通過與計算機連接的高靈敏度電流計，將樣點的電流 輸出存儲在計算機中。
結(jié)果如圖25所示。由結(jié)果可知，使用任意一種電解質(zhì)時，都可以 以光電流值的差的形式檢測出單核普酸多態(tài)性(SNPs)。
例B7:使用干燥的含有電解質(zhì)的吸收性片檢測單核苷酸多態(tài)性 (SNPs)
除了在制造含有電解質(zhì)的吸收性片后，在50。C下干燥2小時，將作 用電極和干燥的含有電解質(zhì)的吸收性片組裝到測定池中后、在即將進行 光電流檢測之前向含有電解質(zhì)的吸收性片上滴加300nl的水之外，與例 B6同樣地操作，檢測光電流(干燥型)。作為比較，使用與例B6同樣地 在即將進行光電流檢測之前使吸水性基材浸漬在電解液中制造的含有 電解質(zhì)的吸收性片(浸漬型)。
結(jié)果如圖26所示。由結(jié)果可知，使用干燥的含有電解質(zhì)的吸收性 片時，也可以以光電流值的差的形式檢測出單核普酸多態(tài)性(SNPs)。
例B8:水系電解液和含有電解質(zhì)的吸收性片的比較
對于含有0.4M的四丙基碘化銨(NPrJ)與水的電解液、與例B6同樣 地在即將進行光電流;險測之前使吸水性基材浸漬在上述電解液中制造 的含有電解質(zhì)的吸收性片，分別進行SNPs檢測，對使用水系電解液的 情況與使用含有電解質(zhì)的吸收性片的情況的檢測精確度進行比較。含有 電解質(zhì)的吸收性片的SNPs檢測與例B6同樣地進行。使用水系電解液檢測SNPs時，電極基板的制造方法與例B6同樣地操作進行，測定使用流 動池型的測定用池。圖27和圖28分別表示第一實施方式的流動池型測 定用池的截面圖和分解圖。
圖27和圖28所示的流動池型的測定用池如下形成在基才反57上 設(shè)置對電極53，在該基板57上形成電解液或洗滌液的供給孔62和排出 孔63，在對電極53上配置具有容納電解液的空間54的絕緣間隔體64, 在該絕緣間隔體64上設(shè)置作用電極52,在該作用電極52的面臨空間 54的面上分離形成多個電子接受層55。然后，以與對電極53不發(fā)生干 擾的方式貫穿上述基板57設(shè)置作用電極用接點58。通過該作用電極用 接點58進行光電流的釋放。此外，在上述作用電極52上設(shè)置壓緊部件 59,在該壓緊部件59上分別對應于上述多個電子接受層55的位置上形 成貫穿孔60。通過該貫穿孔60使來源于光源56的光照射到作用電極 52上。而且，在作用電極52和對電才及53之間連4妻電流計61,通過電 流計測定因光照射導致的在體系內(nèi)流過的光電流。
結(jié)果如圖29所示。由結(jié)果可知，使用含有電解質(zhì)的吸收性片時， 也可以與使用水系電解液時同樣，以光電流值的差的形式精確度優(yōu)異地 檢測出單核苦酸多態(tài)性(SNPs)。
權(quán)利要求
1. 含有電解質(zhì)的片，其包括含水性基材和包含在該含水性基材中的電解質(zhì)，在利用通過敏化色素的光激發(fā)而產(chǎn)生的光電流特異性地檢測受檢物質(zhì)時用作電解質(zhì)介質(zhì)。
2. 如權(quán)利要求1所述的含有電解質(zhì)的片，其中，所述電解質(zhì)是選自 碘化鈉(NaI)、碘化鉀(KI)、碘化釣(CaI》、碘化鋰(LiI)、碘化銨(NKa)、 四丙基碘化銨(NPr41)、硫代硫酸鈉(Na2S20g)、亞硫酸鈉(Na2S03)、氫醌、 K4[Fe(CN)6] .3H20、二茂鐵-U， -二羧酸、二茂鐵羧酸、硼氫化鈉(NaBH4)、 三乙胺、硫氰酸銨、肼(N2H4)、乙醛(CH3CHO)、 N,N,N， ，N，-四甲基對 苯二胺二鹽酸鹽(TMPD)、 L-抗壞血酸、亞碲酸鈉(Na2Te03)、氯化鐵(II) 四水合物(FeCl2 . 4H20)、 EDTA、半胱氨酸、三乙醇胺、三丙胺、含碘 的碘化鋰(I/Lil)、三(2-氯乙基)磷酸鹽(TCEP)、 二硫蘇糖醇(DTT)、 2-巰 基乙醇、2-巰基乙醇胺、二氧化硫脲、(COOH)2和HCHO中的至少一種。
3. 如權(quán)利要求1所述的含有電解質(zhì)的片，其中，所述電解質(zhì)是選自 Nal、 KI、 Cal2、 Lil、 NH4I、四丙基碘化銨(NPrJ)、硫代硫酸鈉^&23203) 和亞硫酸鈉(Na2S03)中的至少 一種。
4. 如權(quán)利要求1~3中任意一項所述的含有電解質(zhì)的片，其中，所 述含水性基材是含有選自天然凝膠和合成凝膠中的至少一種的凝膠基 質(zhì)，并且上述電解質(zhì)分散在該凝膠基質(zhì)中。
5. 如權(quán)利要求4所述的含有電解質(zhì)的片，其具有100g/cn^以上的 膠凝強度。
6. 如權(quán)利要求4或5所述的含有電解質(zhì)的片，其具有0.1 ~ 10mm的厚度。
7. 如權(quán)利要求4或5所述的含有電解質(zhì)的片，其具有1-3mm的厚度。
8. 如權(quán)利要求4~7中任意一項所述的含有電解質(zhì)的片，其中，所 述凝膠基質(zhì)含有以多糖類和蛋白質(zhì)為主要成分的天然凝膠。
9. 如權(quán)利要求8所述的含有電解質(zhì)的片，其中，所述天然凝膠是選 自瓊脂糖、藻酸、卡拉膠、刺槐豆莢膠、結(jié)冷膠和明膠中的至少一種凝膠。
10. 如權(quán)利要求8所述的含有電解質(zhì)的片，其中，所述天然凝膠為 瓊脂糖的凝膠。
11. 如權(quán)利要求1 ~ 10中任意一項所述的含有電解質(zhì)的片，其中，所述凝膠基質(zhì)含有上述合成凝膠，所述合成凝膠是選自聚丙烯酰胺、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酸鈉、添加PVA的聚丙烯酰胺、聚環(huán)氧乙烷、 N-烷基改性(甲基)丙烯酰胺衍生物、N,N-二甲基丙烯酰胺、N,N-二乙基 丙烯酰胺、丙烯?；鶈徇?、N-曱基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N-(異) 丙基丙烯酰胺、N-丁基丙烯酰胺、N-羥基甲基丙烯酰胺、N-羥基乙基丙 烯酰胺、N-羥基丙基丙烯酰胺、N-羥基丁基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸、(甲 基)丙烯酰胺磺酸叔丁酯、(甲基)丙烯酸磺基丙基酯、(甲基)丙烯酸、衣 康酸、(聚)烷撐二醇(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸羥基乙基酯、聚乙二 醇(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸羥基丙基酯、聚丙二醇(甲基)丙烯酸酯、 甘油(甲基)丙烯酸酯、亞曱基二(甲基)丙烯酰胺、亞乙基二(曱基)丙烯酰 胺、(聚)乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、(聚)丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、甘油 二(曱基)丙烯酸酯、甘油三(甲基)丙烯酸酯和四烯丙氧基乙烷中的至少一 種凝膠。
12. 如權(quán)利要求11所述的含有電解質(zhì)的片，其中，所述合成凝膠為 聚丙烯酰胺的凝膠。
13. 如權(quán)利要求1 ~3中任意一項所述的含有電解質(zhì)的片，其中，所 述含水性基材為吸水性基材。
14. 如權(quán)利要求13所述的含有電解質(zhì)的片，其具有20%以上的含水率。
15. 如權(quán)利要求13或14所述的含有電解質(zhì)的片，其具有0.01-10mm的厚度。
16. 如權(quán)利要求13或14所述的含有電解質(zhì)的片，其具有0.1-3mm的厚度。
17. 如權(quán)利要求13~16中任意一項所述的含有電解質(zhì)的片，其中， 所述吸水性基材含有選自天然纖維、紙漿纖維、再生纖維、玻璃纖維和 合成纖維中的至少一種纖維。
18. 如權(quán)利要求17所述的含有電解質(zhì)的片，其中，所述吸水性基材 是選自濾紙、濾膜、玻璃過濾器和濾布中的至少一種。
19. 如權(quán)利要求1 ~ 18中任意一項所述的含有電解質(zhì)的片，其中， 所述利用光電流特異性地檢測受檢物質(zhì)通過包含下述工序的的步驟進 行使作用電極和對電極與所述含有電解質(zhì)的片接觸，其中所述作用電 極表面具有直接或間接地特異性結(jié)合了受檢物質(zhì)的探針物質(zhì)，并且所述作用電極通過該結(jié)合固定有敏化色素；對所述作用電極進行光照從而使所述敏化色素光激發(fā)，對因電子從所述對電才及之間流過的光電流進行才全測。
20. 利用光電流特異性地;險測受檢物質(zhì)的方法，該方法包括 使作用電極和對電極與權(quán)利要求1 ~ 18中任意一項所述的含有電解質(zhì)的片接觸，其中所述作用電極表面具有直接或間接地特異性結(jié)合了受 檢物質(zhì)的探針物質(zhì)，并且所述作用電極通過該結(jié)合固定有敏化色素； 對所述作用電極進行光照從而使所述敏化色素光激發(fā)，對因電子從所述對電才及之間流過的光電流進行片全測。
21. 傳感器單元，其用于利用通過敏化色素的光激發(fā)而產(chǎn)生的光電 流特異性地檢測受檢物質(zhì)，具有作用電才及、與上述電極對置設(shè)置的對電極、和被夾持在所述作用電極與所述對電極之間的權(quán)利要求1~ 18中任意 一項所述的含有電解質(zhì)的片，接觸。
22. 如權(quán)利要求21所述的傳感器單元，其進一步具有 支撐所述對電極的支撐基材，和向著所述支撐基材壓緊以使所述作用電極、所述含有電解質(zhì)的片和 所述對電極相互密合的壓緊部件。
23. 如權(quán)利要求21所述的傳感器單元，其進一步具有 支撐所述作用電極的支撐基材，和向著所述支撐基材壓緊以使所述對電極、所述凝膠片和所述作用電 極相互密合的壓緊部件。
24. 如權(quán)利要求22或23所述的傳感器單元，其中，所述壓緊部件 進一步具有為了通過用于光激發(fā)的光而設(shè)置的開口部或透光部。
25. 傳感器單元，其用于利用通過敏化色素的光激發(fā)而產(chǎn)生的光電流特異性地檢測受檢物質(zhì)，具有作用電極和對電極在同一平面上構(gòu)圖而成的電極單元、 與所述作用電極和所述對電極的各電極表面接觸設(shè)置的權(quán)利要求1~ 18中意一項所述的含有電解質(zhì)的片。
26. 如權(quán)利要求25所述的傳感器單元，其進一步具有與所述電極單 元對置設(shè)置的對置部件，在所述電極單元和所述對置部件之間夾持所述 含有電解質(zhì)的片。
27. 如權(quán)利要求26所述的傳感器單元，進一步具有向著所述對置部 件壓緊以使所述電極單元和所述含有電解質(zhì)的片相互密合的壓緊部件。
28. 如權(quán)利要求26所述的傳感器單元，其進一步具有支撐所述電極 單元的支撐基材，并且所述對置部件發(fā)揮向著所述支撐基材壓緊以使所 述含有電解質(zhì)的片和所述電極單元相互密合的壓緊部件的功能。
29. 如權(quán)利要求25 -28中任意一項所述的傳感器單元，其中，所述 壓緊部件進一步具有為了通過用于光激發(fā)的光而設(shè)置的1個以上的開口 部或透光部。
30. 如權(quán)利要求25所述的傳感器單元，其進一步具有支撐所述電極 單元的支撐基材、和向著所述支撐基材壓緊以使所述電極單元密合的壓 緊部件，所述含有電解質(zhì)的片載置在所述電極單元上。
31. 測定裝置，其用于利用通過敏化色素的光激發(fā)而產(chǎn)生的光電流 特異性地檢測受檢物質(zhì)，具有權(quán)利要求21 ~ 30中任意一項所述的傳感器單元、用于對所述作用電極進行光照的光源、和測定在所述作用電才及和所述對電才及之間流過的電流的電流計。
32. 如權(quán)利要求31所述的測定裝置，其中，所述光源是可以根據(jù)敏 化色素的種類照射不同波長的光的光源。
33. 如權(quán)利要求31或32所述的測定裝置，其中，預先設(shè)置多個所 述光源，并且所述測定裝置進一步具有切換該多個光源進行照射的結(jié) 構(gòu)。
34. 如權(quán)利要求31 ~33中任意一項所述的測定裝置，其中，光源和 /或傳感器單元進一步具有使光源和傳感器單元在XY方向上相對移動 的XY移動結(jié)構(gòu)。
35. 權(quán)利要求1~18中任意一項所述的含有電解質(zhì)的片作為電解質(zhì)介質(zhì)的應用，其中所述電解質(zhì)介質(zhì)是利用通過敏化色素的光激發(fā)而產(chǎn)生 的光電流特異性地檢測受檢物質(zhì)時使用的電解質(zhì)介質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了在利用通過敏化色素的光激發(fā)而產(chǎn)生的光電流特異性地檢測受檢物質(zhì)時，可以大幅簡化裝置結(jié)構(gòu)和檢測步驟，并且以高靈敏度和精確度檢測光電流的含有電解質(zhì)的片。該含有電解質(zhì)的片包括含水性基材和包含在該含水性基材中的電解質(zhì)，在利用通過敏化色素的光激發(fā)而產(chǎn)生的光電流特異性地檢測受檢物質(zhì)時被用作電解質(zhì)介質(zhì)。作為含水性基材可以使用凝膠基質(zhì)或吸水性基材。
文檔編號G01N27/416GK101490541SQ20078002610
公開日2009年7月22日 申請日期2007年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月10日
發(fā)明者大原仁, 山名良正, 戶次允, 曾根崎修司 申請人:Toto株式會社