專利名稱：抗藥物抗體測定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明包含測定抗藥物抗體的方法，和用于這樣的測定法的試劑盒。
背景技術(shù)：
使用單克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)固相免疫測定法涉及在吸附在固相上的抗體 (捕獲抗體)、抗原、和針對抗原另一表位、綴合了酶或可檢測標(biāo)記的抗
體(示蹤抗體)之間形成復(fù)合物。由此形成夾心體固相-捕獲抗體-抗原-示蹤抗體。在夾心體中，抗體綴合的酶活性(或可檢測標(biāo)記的量)與孵育 介質(zhì)中的抗原濃度成比例。 一種夾心測定法為雙抗原橋聯(lián)免疫測定法 (double antigen bridging immunoassay )，其中捕獲和示蹤抗體與抗原的 不同表位結(jié)合。Hoesel， W，等人在J. Immunol. Methods 294 (2004) 101-110 中報道了抗EPO雙抗原橋聯(lián)測定法，使用了與氨基和與糖基偶聯(lián)的固定 化rhEPO的混合物。免疫測定法如雙抗原橋聯(lián)ELISA是在研究患者對于 抗體藥物的免疫原性反應(yīng)中所通常應(yīng)用的測定法類型。Mire-Sluis, A.R. 等人，在J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16中，總結(jié)了設(shè)計和優(yōu)化檢測 針對生物技術(shù)產(chǎn)品的宿主抗體的免疫測定法的建議。根據(jù)Mire-Sluis等人 所述，眾所周知的抗藥物抗體測定法形式顯示出不少缺點。抗藥物抗體測 定法在例如WO 2005/045058和WO 90/006515中有所提及?？躬毺匦涂?體測定法在例如US5，219，730、 WO 87/002778、 EP 0 139 389和EP 0 170 302中有所提及。Wadhwa， M.等人在J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17 中報道了檢測、測量和表征由治療性生物制品誘導(dǎo)的不必要抗體的方法。 PCT/EP2007/001935中描述了用雙抗原橋聯(lián)免疫測定法對樣品中針對藥物 抗體的抗體進(jìn);f亍免疫測定的免疫測定法。WO 2006/066912中描述了測定 猴中的人抗體的免疫測定法。本領(lǐng)域中(例如US 2003/0068664)能夠檢測活性治療性抗體的測定系統(tǒng)同樣公知。這樣的系統(tǒng)需要抗原與固相結(jié)合， 治療性抗體與此結(jié)合的抗原結(jié)合，及檢測通過抗原而與固相結(jié)合的治療性 抗體。
發(fā)明簡述
本發(fā)明提供了與食蟹猴(Cynomolgus ) IgG特異性結(jié)合、不與人IgG 結(jié)合的抗體。優(yōu)選所述抗體為單克隆抗體。
在優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體用細(xì)胞系3.25.12 (DSM ACC2799 ) 、 3.29.15 (DSM ACC2800 ) 、 4.38.30 (DSM ACC2801 ) 、 7.57.41 (DSMACC2802)或7.72.32 (DSM ACC2803 )生產(chǎn)。
本發(fā)明提供了用夾心測定法，即雙抗原橋聯(lián)免疫測定法對猴種的樣品 中藥物抗體(DA)和針對所述藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)的 免疫復(fù)合物進(jìn)行免疫測定的方法。
所述免疫復(fù)合物進(jìn)一步縮寫為DA/ADA復(fù)合物。
本發(fā)明提供了免疫測定樣品中DA/ADA復(fù)合物的方法，其使用包含捕 獲抗體和示蹤抗體的夾心型或雙抗原橋聯(lián)免疫測定法，特征在于所述抗體 之一，即示蹤抗體或捕獲抗體，是與食蟹猴IgG特異性結(jié)合的抗體，另一 抗體是與人免疫球蛋白特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，捕獲抗體為與人免疫球蛋白特異性結(jié)合 的抗人Ig抗體，示蹤抗體為與食蟹猴IgG特異性結(jié)合的抗食蟹猴IgG抗 體。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，捕獲抗體為與食蟹猴IgG特異性結(jié)合的 抗食蟹猴IgG抗體，示蹤抗體為與人Ig特異性結(jié)合的抗人Ig抗體。
優(yōu)選抗人Ig抗體與人IgG特異性結(jié)合。優(yōu)選抗食蟹猴IgG抗體和/或 抗人Ig抗體為單克隆抗體。優(yōu)選所述特異性結(jié)合人免疫球蛋白的抗體不與 食蟹猴IgG結(jié)合。優(yōu)選所述結(jié)合人免疫球蛋白的抗體由細(xì)胞系DSM ACC2708生產(chǎn)。優(yōu)選所述結(jié)合食蟹猴IgG的抗體不與人IgG結(jié)合。優(yōu)選 所述結(jié)合食蟹猴IgG的抗體由細(xì)胞系3.25.12 (DSM ACC2799) 、 3.29.15 (DSM ACC2800 ) 、 4.38.30 (DSM ACC2801 ) 、 7.57.41 (DSM ACC2802 )或7.72.32 (DSM ACC2803 )生產(chǎn)。
在所述測定過程中，在抗食蟹猴IgG抗體、DA/ADA復(fù)合物和抗人Ig 抗體之間形成復(fù)合物，形成的復(fù)合物的量與DA/ADA復(fù)合物、DA和/或 ADA的濃度相關(guān)聯(lián)。
根據(jù)本發(fā)明，對于形成的DA/ADA復(fù)合物的檢測可以進(jìn)行直接的樣品 分析。在這樣的測定法中，只有樣品中含有藥物抗體和抗藥物抗體兩者才 能見到陽性信號。
根據(jù)本發(fā)明，可選地，樣品分析(可以)在與預(yù)定量的藥物抗體預(yù)孵 育之后進(jìn)行。在這樣的測定法中，如果樣品中含有抗藥物抗體，就可以見 到陽性信號，而不依賴于樣品中存在/不存在藥物抗體。
優(yōu)選捕獲抗體通過被動吸附與固相綴合，因此至少在兩個不同的抗體 位點與固相綴合。例如Butler, J.E.， Solid Phases in Immunoassay,于 Immunoassay, Diamandis， E.P.和Christopoulos， T.K.(編)學(xué)術(shù)出版社, 圣地亞哥(1996) ， 205-225頁中對被動吸附有所描述。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，捕獲抗體通過特異性結(jié)合對固定化。這 樣的結(jié)合對(第一組分/第二組分)為，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋 白/生物素、抗體/抗原(見例如Hermanson， G.T.等人，Bioconjugate Techniques,學(xué)術(shù)出版社，1996)、凝集素/多糖、類固醇/類固醇結(jié)合蛋白、 激素/激素受體、酶/底物、IgG/蛋白A和/或G等。優(yōu)選捕獲抗體與生物素 綴合，通過固定化抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素進(jìn)行固定。
優(yōu)選抗體與其綴合配偶體的綴合是通過化學(xué)結(jié)合實現(xiàn)，經(jīng)由N端和/ 或s-氨基(賴氨酸)、不同賴氨酸的s-氨基、抗體氨基酸骨架的氛基、巰 基、羥基和/或酚官能團(tuán)和/或抗體糖結(jié)構(gòu)的糖醇基進(jìn)行結(jié)合。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，示蹤抗體與可檢測的標(biāo)記綴合，優(yōu)選通 過特異性結(jié)合對綴合。這樣的結(jié)合對(第一組分/第二組分)為，例如抗生 蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白/生物素、抗體/抗原、凝集素/多糖、類固醇/類 固醇結(jié)合蛋白、激素/激素受體、酶/底物、IgG/蛋白A和/或G等。優(yōu)選示 蹤抗體通過洋地黃毒苷和針對洋地黃毒苷的抗體與可檢測的標(biāo)記綴合?？蛇x地，示蹤抗體與電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記綴合，如釕聯(lián)吡啶絡(luò)合物。
本發(fā)明的其它實施方案中提供了用夾心型或雙抗原橋聯(lián)免疫測定法免
疫測定猴種樣品中針對藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)的方法。
本發(fā)明提供了免疫測定樣品中ADA的方法，使用包含捕獲抗體和示 蹤抗體的夾心型或雙抗原橋聯(lián)免疫測定法，特征在于所述抗體之一是與食 蟹猴IgG特異性結(jié)合、不與人IgG結(jié)合的抗體，另一抗體為藥物抗體。
在免疫測定ADA的優(yōu)選實施方案中，捕獲抗體為藥物抗體，示蹤抗 體為與食蟹猴IgG特異性結(jié)合、不與人IgG結(jié)合的抗食蟹猴IgG抗體。在 免疫測定ADA的其它優(yōu)選實施方案中，捕獲抗體為與食蟹猴IgG特異性 結(jié)合、不與人IgG結(jié)合的抗食蟹猴IgG抗體，示蹤抗體為藥物抗體。在所 述測定過程中，在藥物抗體、ADA和抗食蟹猴IgG抗體之間形成復(fù)合物， 形成的所述復(fù)合物的量與ADA的濃度相關(guān)聯(lián)。在免疫測定ADA的優(yōu)選實 施方案中，所述抗食蟹猴IgG抗體為單克隆抗體(抗食蟹猴mAb)。
本發(fā)明的另一實施方案為雜交瘤細(xì)胞系3.25.12 (DSM ACC2799)、 3.29.15 (DSM ACC2800 ) 、 4.38.30 (DSM ACC2801 ) 、 7.57.41 (DSM ACC2802) 、 7.72.32 (DSM ACC2803 )。
本發(fā)明的另一方面是用于根據(jù)本發(fā)明的方法的抗體組合物，包含由細(xì) 胞系DSM ACC2799、細(xì)胞系DSM ACC2800、細(xì)胞系DSM ACC2801、 細(xì)胞系DSM ACC 2802和/或細(xì)胞系DSM ACC2803生產(chǎn)的抗體的混合物。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了與食蟹猴IgG特異性結(jié)合、不與人IgG結(jié)合的抗體。 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"藥物抗體，，表示能夠?qū)€體施用以治療疾病的抗 體。在根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的一種測定法中，藥物抗體和捕獲抗體，或藥物抗 體和示蹤抗體，分別包含"相同的"抗體分子，例如用相同的表達(dá)載體重 組生產(chǎn)，并包含相同的M酸序列。藥物抗體(治療性單克隆抗體)廣泛 應(yīng)用于治療多種疾病如腫瘤疾病(例如血液和實體惡性肺瘤，包括非霍奇 金淋巴瘤、乳腺癌和結(jié)直腸癌)、免疫性疾病、中樞神經(jīng)疾病、血管疾病
7或傳染病。例如在Levene, A.P.等人，Journal of the Royal Society of Medicine 98 (2005) 145-152對這樣的抗體有所描述。這樣的抗體為例如針 對CD20、 CD22、 HLA-DR、 CD33、 CD52、 EGFR、 G250、 GD3、 HER2、 PSMA、 CD56、 VEGF、 VEGF2、 CEA、 Levis Y抗原、IL-6受體或IGF-1 受體的抗體。治療性抗體在Groner, B.等人，Curr. Mol. Meth. 4 (2004) 539-547; Harris, M.， Lancet Oncol. (2004) 292-302中也有所描述。
治療性/藥物抗體的實例(優(yōu)選單克隆抗體)為針對IL-6受體的抗體 (mAb IL畫6R)。這樣的抗體在例如Mihara， M.等人，Clin. Immunol. 98 (2001)319-326; Nishimoto， N.等人，Blood 106 (2005) 2627-2632;臨床實 驗NCT00046774; WO 2004/096274中有所描述。
治療性/藥物抗體的實例(優(yōu)選單克隆)為針對IGF-1受體的抗體(mAb IGF-1R)。這樣的抗體在例如WO 2004/087756， WO 2005/005635中有所 描述。
"抗藥物抗體，，為抗體，其可以針對藥物抗體的任何區(qū)域，例如藥物 抗體的可變結(jié)構(gòu)域、恒定結(jié)構(gòu)域或糖結(jié)構(gòu)。這樣的抗藥物抗體可能在抗體 治療過程中作為患者的免疫原性反應(yīng)出現(xiàn)(見Pan， Y.等人，F(xiàn)ASEB丄9 (1995)43-49)。多數(shù)"抗藥物抗體"與藥物抗體的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū) 結(jié)合?？顾幬锟贵w與其藥物抗體的抗原之間的親和力通常低于藥物抗體與 其靶抗原的親和力。
"抗食蟹猴IgG抗體"為與食蟹猴IgG (食蟹猴免疫球蛋白G)特異 性結(jié)合的抗體，優(yōu)選為單克隆抗體(即單克隆抗食蟹猴抗體，mAb<Cyno IgG>)。這樣的抗體與食蟹猴IgG結(jié)合的解離常數(shù)(-KDiss.)為至少l(T9 moI/L，更優(yōu)選KDiss.為少l(r1G mol/L。同時，通過l(T8 mol/L或更差的 KDiss.例如l(T5 mol/L確保其不與人IgG結(jié)合的性質(zhì)。同樣優(yōu)選地，與食 蟹猴IgG結(jié)合、不與人IgG結(jié)合的抗體，分別對食蟹猴IgG和人IgG的 反應(yīng)性之間KDiss.的差異為至少100倍。
優(yōu)選抗食蟹猴IgG抗體還與絨猴IgG、恒河猴IgG和狒狒IgG結(jié)合， 解離常數(shù)(=KDiss.)為至少l(r8mol/l,優(yōu)選為l(T9 mol/L,更優(yōu)選KDiss.
8為至少10"Q mol/L。
在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體為單克隆抗體。在本申請中使 用的術(shù)語"單克隆"表示由單種細(xì)胞或其子代生產(chǎn)的抗體群，并且與其乾
抗原的單個抗原決定簇結(jié)合。在本申請中使用的術(shù)語"不與人IgG結(jié)合，， 或其等同語法用語表示不與人IgG特異性結(jié)合的抗體，即其KDiss.為10-7 mol/L或更差，例如10-5mol/L。這不包括食蟹猴這樣的多克隆抗體群，其 已與人免疫球蛋白交叉吸附以除去與人IgG結(jié)合的食蟹猴IgG。由于此過 程中形成的結(jié)合平衡，交叉吸附不提供不與人IgG結(jié)合的多克隆抗體群， 更不必說單克隆抗體。因為此平衡下許多與人IgG結(jié)合的抗體不交叉吸附， 而留在溶液中，于是留在得到的抗體制品中。因此，免疫球蛋白一旦與人 IgG交叉吸附，不會完全排除任何抗人IgG的結(jié)合，而仍然顯示人IgG結(jié) 合。
本發(fā)明的其它方面為細(xì)胞系DSMACC2799、細(xì)胞系DSMACC2800、 細(xì)胞系DSMACC2801、細(xì)胞系DSMACC2802、細(xì)胞系DSMACC2803， 以及由細(xì)胞系DSMACC2799、或細(xì)胞系DSM ACC2800、或細(xì)胞系DSM ACC2801、或細(xì)胞系DSMACC2802、或細(xì)胞系DSM ACC2803生產(chǎn)的單 克隆抗體。本發(fā)明的另一方面為抗體組合物，包含由細(xì)胞系DSM ACC2799、細(xì)胞系DSM ACC2800、細(xì)胞系DSM ACC2801、細(xì)胞系DSM ACC 2802和/或細(xì)胞系DSM ACC2803生產(chǎn)的抗體的混合物。本發(fā)明還包 含組合物，其包含由細(xì)胞系DSM ACC2799、或細(xì)胞系DSM ACC2800、 或細(xì)胞系DSM ACC2801、或細(xì)胞系DSM ACC 2802、或細(xì)胞系DSM ACC2803生產(chǎn)的抗體。
使用根據(jù)本發(fā)明的抗體，能夠最小化或甚至排除個體人血清的背景變化。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"猴"指食蟹猴、絨猴、恒河猴和狒狒。"猴"優(yōu) 選表示食蟹猴、恒河猴和狒狒。
優(yōu)選抗人Ig抗體(Ig表示免疫球蛋白)為這樣的抗體，其與不存在 于食蟹猴免疫球蛋白上的表位特異性結(jié)合，在WO 2006/066912中對此有
9所描述。此表位的特征在于其與MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9,也稱 MAB<h-Fcgamma>M-R10Z8E9,或簡稱MAB M-R10Z8E9結(jié)合。在根據(jù) 本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，抗人Ig抗體進(jìn)一步的特征在于，其結(jié)合的表位 與MAB M-R10Z8E9相同。MAB M-R10Z8E9由這樣的細(xì)胞系生產(chǎn)，該 細(xì)胞系于2004年12月22日保藏于德國微生物保藏中心(DSMZ),保藏 號為DSM ACC2708。優(yōu)選抗人Ig抗體包含MAB M-R10Z8E9的可變重 鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域。更優(yōu)選抗人Ig抗體包含MAB M-R10Z8E9可變重鏈和 輕鏈結(jié)構(gòu)域的CDR區(qū)和非人框架。優(yōu)選抗人Ig抗體為單克隆抗體(抗人 Ig mAb )。
優(yōu)選用BIAcore 儀器評估抗體的結(jié)合性質(zhì)，特別是KDiss.。在此方 法中，通過表面等離子體共振(SPR)的變化評價結(jié)合性質(zhì)?？煞奖愕貙?所研究的抗體結(jié)合到固相(稱為芯片)上，并評估單克隆抗體、多克隆抗 體、或甚至包含IgG的血清與此包被的芯片的結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明，用于免疫測定法的固相支持物在本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中有廣 泛描述(見例如Butler， J.E., Methods 22 (2000) 4-23 )。
例如Hage， D.S.,于Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R中描述了不同 免疫測定法的原理。Lu， B.等人，于Analyst. 121 (1996) 29R-32R中報道 了抗體的定向固定，以用于免疫測定法。例如Wilchek， M.和Bayer， E.A., Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469報道了抗生物素蛋白-生物素介導(dǎo)的 免疫測定法。
本發(fā)明中使用的術(shù)語"雙抗原橋聯(lián)免疫測定法"表示夾心型免疫測定 法，其中抗原與兩種不同抗體結(jié)合，其各自與抗原中不相重疊或干擾的不 同表位結(jié)合。在此測定法中，形成包含捕獲抗體、抗原和示蹤抗體的夾心 體，抗原由此將與之結(jié)合的兩種抗體橋聯(lián)起來。
作為蛋白質(zhì)，單克隆抗體和其恒定結(jié)構(gòu)域包含許多反應(yīng)性側(cè)鏈與結(jié)合 配偶體偶聯(lián)，結(jié)合配偶體如表面、蛋白質(zhì)、聚合物(例如PEG)、纖維素、 或聚苯乙烯、酶、或結(jié)合對的成員?？贵w的化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)為例如，氨基(賴 氨酸的s-氨基、a-氨基)、硫醇基(胱氨酸、半胱氨酸、曱硫氨酸)、羧
10酸基(天冬氨酸、谷氨酸)和糖醇基。例如Aslam， M.和Dent， A，， Bioconjuation，麥考林出版公司(MacMillan Ref. Ltd.) (1999) ， 50-100 頁，對這樣的方法有所描述。
術(shù)語"樣品"包括來自猴的任意量的物質(zhì)。這樣的物質(zhì)包括但不限于來 自這樣的個體的全血、血清或血漿，這些是在臨床前例程中最廣泛使用的 樣品來源。
術(shù)語"固相"指非流體物質(zhì)，包括顆粒(包括微粒和珠子)，其由如 諸如聚合物、金屬(順磁、鐵磁性顆粒)、玻璃和陶瓷等材料制成；凝膠 物質(zhì)如硅膠、氧化鋁和聚合物凝膠；毛細(xì)管，其可以由聚合物、金屬、玻 璃和/或陶瓷制成；沸石和其它多孔物質(zhì)；電極；微孔板；固體檢測條(strip); 比色亞、管或其它分光計樣品容器。測定法中的固相元件與測定法中可能 接觸到的惰性固體表面的不同之處在于，"固相"元件表面包含至少一個預(yù) 期與捕獲抗體相互作用的部分。固相可以是固定元件，如管、條、比色皿 或微孔板，或可以是不固定的元件，如珠子和孩M立。孩m還可以作為固相 用于勻相測定法形式。可以使用允許蛋白質(zhì)和其它物質(zhì)非共價或共價附著 的多種微粒。這樣的顆粒包括聚合物顆粒如聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲 酯；金顆粒如金納米顆粒和金溶膠；和陶瓷顆粒如硅膠、玻璃和金屬氧化 物顆粒。見伊J:ft口 Martin, C.R.等人，Analytical Chemistry-News & Features 70 (1998) 322A-327A,其通過引用并入本文。
可檢測的標(biāo)記的實例為色原(熒光或發(fā)光基團(tuán)和染料)、酶、NMR-活性基團(tuán)或金屬顆粒、半抗原，例如洋地黃毒苷?？蓹z測的標(biāo)記還可以是 光活化交聯(lián)基團(tuán)，例如疊氮基或吖丙啶基(azirine)?？梢杂秒娀瘜W(xué)發(fā)光檢 測的金屬螯合物也是優(yōu)選的信號發(fā)射基團(tuán)，特別優(yōu)選釕螯合物，例如釕(聯(lián) 吡p定):;2+螯合物。例如EP 0 580 979、 WO 90/05301、 WO 90/11511和WO 92/14138中描述了適合的釕標(biāo)記基團(tuán)。
免疫測定法為技術(shù)人員所熟知。相關(guān)的教科書中總結(jié)了實施這樣的測 定法的方法，以及實際用途和操作。相關(guān)教科書的實例有Tijssen， P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule
iiconjugates, 于Practice and theory of enzyme immunoassay, Burdon, R，H.和v. Knippenberg， P，H.(編)，愛思唯爾公司(Elsevier)，阿姆斯 特丹(19卯)221-278頁；Colowick， S.P.和Caplan, N.O.(編)，"Methods inEnzymology",學(xué)術(shù)出版社，中涉及免疫檢測方法的多巻，特別是巻70、 73、 74、 84、 92和121。
根據(jù)本發(fā)明的抗體可以由雜交瘤細(xì)胞系3.25.12 (DSM ACC2799)、 3.29.15 (DSM ACC2800 ) 、 4.38.30 (DSM ACC2801 ) 、 7.57.41 (DSM ACC2802) 、 7.72.32 (DSM ACC2803 )生產(chǎn)，這些雜交瘤細(xì)胞系本身也是 本發(fā)明的一方面。根據(jù)本發(fā)明的其它抗體，即與食蟹猴IgG特異性結(jié)合、 不與人IgG結(jié)合的抗體，可以用例如實施例3中概述的方法得到。
可選地，例如可以使用這樣的方法，其中第一步先用竟?fàn)幵囼炏到y(tǒng)測 定與同一耙抗原結(jié)合的兩種抗體的表位重疊。為此目的，例如借助酶免疫
測定法，測試所研究的抗體與已知抗體竟?fàn)幗Y(jié)合固定化靶抗原的程度，例 如根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系生產(chǎn)的抗體的竟?fàn)幗Y(jié)合程度。為此目的，將適當(dāng)?shù)?固定化的靶抗原與標(biāo)記形.式的已知抗體和過量所研究的抗體進(jìn)行孵育。通 過測定在所研究的抗體存在和不存在的情況下，標(biāo)記形式的抗體結(jié)合的量， 能夠評估所研究的抗體能夠置換已知抗體的結(jié)合的程度。如果在同樣的濃 度置換多于20%，優(yōu)選多于30%;或者所研究的抗體在更高的濃度，優(yōu)選 103-105倍過量于已知抗體時，如果置換多于70%，優(yōu)選多于80%，則為 發(fā)生表位重疊，兩種抗體均與同一表位的相同或重疊部分結(jié)合。在所述方 法的第二步中使用這樣鑒定的抗體。此時測定第一步中鑒定的抗體與人 IgG的結(jié)合。可以用例如ELISA、免疫測定法或用表面等離子體共振進(jìn)行 這樣的測定。如果測定其不與人IgG結(jié)合，則定義這樣的抗體為與食蟹猴 IgG特異性結(jié)合、不與人IgG結(jié)合的抗體?？蛇x地，才艮據(jù)本發(fā)明的抗體可 以通過分別測定其對于食蟹猴IgG和人IgG的KDiss.并對比這些數(shù)值而得 到鑒定。
本發(fā)明報道了測定藥物抗體和抗藥物抗體的復(fù)合物的免疫測定方法， 所述復(fù)合物在下文中表示為DA/ADA復(fù)合物。更詳細(xì)地，本發(fā)明包含用夾
12心型免疫測定法對猴種樣品中藥物抗體(DA )和針對所述藥物抗體的抗體 (抗藥物抗體，ADA)的免疫復(fù)合物(DA/ADA復(fù)合物)進(jìn)行免疫測定的 方法，該方法包含捕獲抗體和示蹤抗體，其中所述抗體之一為與食蟹猴IgG 特異性結(jié)合、優(yōu)選不與人IgG結(jié)合的抗體，另一所述抗體為與人IgG特異 性結(jié)合、優(yōu)選不與食蟹猴IgG結(jié)合的抗體。在一個實施方案中，捕獲抗體 為與人IgG特異性結(jié)合、不與食蟹猴IgG結(jié)合的抗體，示蹤抗體為與食蟹 猴IgG特異性結(jié)合、不與人IgG結(jié)合的抗體。在不同的實施方案中，捕獲 抗體為與食蟹猴IgG特異性結(jié)合、不與人IgG結(jié)合的抗體，示蹤抗體為與 人IgG特異性結(jié)合、不與食蟹猴IgG結(jié)合的抗體。本發(fā)明的另一實施方案 中，與食蟹猴IgG特異性結(jié)合的抗體和/或與人IgG特異性結(jié)合的抗體為 單克隆抗體。
在本方法的優(yōu)選實施方案中，樣品與預(yù)定量的藥物抗體預(yù)孵育。這4吏 得無論樣品中是否存在藥物抗體，均可檢測抗藥物抗體，因為本方法檢測 的是DA/ADA復(fù)合物(見例如圖5和6 )。
根據(jù)人或人源化藥物抗體和食蟹猴IgG之間的高度同一性，藥物抗體 的主要抗原決定簇為其互補(bǔ)決定區(qū)?？顾幬锟贵w優(yōu)選識別這些抗原決定簇。 于是，多數(shù)抗藥物抗體識別相應(yīng)藥物抗體的互補(bǔ)決定區(qū)、并從而與之結(jié)合。 抗藥物抗體-藥物抗體復(fù)合物的形成屏蔽抗原表位，從而對抗夾心測定法中 對所述復(fù)合物的測定。
例如如在WO 2006/066912中所描述的那樣，抗人IgG抗體是與這樣 的表位特異性結(jié)合的抗體，所述表位不存在于從食蟹猴中得到的免疫球蛋 白上。在優(yōu)選實施方案中，抗人IgG抗體的進(jìn)一步特征在于，其與由細(xì)胞 系DSM ACC 2708生產(chǎn)的抗體結(jié)合的表位相同，也就是與這樣的表位結(jié) 合，所a位存在于G類人免疫球蛋白的所有亞類中，而除了存在于黑猩 猩的IgG上，在多數(shù)實驗動物的免疫球蛋白上都不存在。在其它優(yōu)選實施 方案中，抗人IgG抗體是由細(xì)胞系DSMACC2708生產(chǎn)的抗體。
令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，使用根據(jù)本發(fā)明的方法防止了對于抗藥物抗體的不 完全檢測。例如，如果捕獲分子和抗藥物抗體結(jié)合相同的抗原決定簇，即
13藥物抗體的CDR，則藥物抗體與捕獲分子的結(jié)合會封閉這些表位，即將它 們相對于抗藥物抗體屏^來，從而阻止了抗藥物抗體的結(jié)合和被檢測到。 這導(dǎo)致對樣品中的抗藥物抗體的不完全檢測?？顾幬锟贵w通常對于藥物抗 體具有低結(jié)合親和力，因此結(jié)合藥物抗體需要抗藥物抗體的兩個抗原結(jié)合 區(qū)的合作。于是，不能與捕獲分子結(jié)合也可能導(dǎo)致對抗藥物抗體的低檢測。 因此，通過抗藥物抗體的CDR進(jìn)行捕獲不適合用于測定。
因此，本發(fā)明的一方面是用包含捕獲抗體和示蹤抗體的夾心免疫測定 法對猴種樣品中藥物抗體(DA)和針對所述藥物抗體的抗體(抗藥物抗體， ADA)的免疫復(fù)合物(DA/ADA復(fù)合物)進(jìn)行免疫測定的方法，其中所述 抗體之一為與食蟹猴IgG特異性結(jié)合、不與人IgG結(jié)合的抗體，另一抗體 為與人IgG特異性結(jié)合、不與食蟹猴IgG結(jié)合的抗體。在此方面的一個實 施方案中，與食蟹猴IgG特異性結(jié)合、不與人IgG結(jié)合的抗體由細(xì)胞系
DSMACC2803生產(chǎn)。在此方面的另 一實施方案中，與人IgG特異性結(jié)合、 不與食蟹猴IgG結(jié)合的抗體由細(xì)胞系DSMACC2708生產(chǎn)。
在本方法的一個實施方案中，形成的復(fù)合物的量與DA/ADA復(fù)合物、 DA和/或ADA的濃度相關(guān)聯(lián)。
在另一實施方案中，捕獲抗體與抗藥物抗體或DA/ADA復(fù)合物結(jié)合， 不與抗藥物抗體的CDR、或在序列上或幾何結(jié)構(gòu)上與CDR緊鄰的框架區(qū) 結(jié)合。
本發(fā)明的另一方面是用包含捕獲抗體和示蹤抗體的夾心免疫測定法對 猴種樣品中針對藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)進(jìn)行免疫測定的方 法，其中捕獲抗體為與食蟹猴IgG特異性結(jié)合、不與人IgG結(jié)合的抗體， 示蹤抗體為藥物抗體。還有一方面是用包含捕獲抗體和示蹤抗體的夾心免 疫測定法對猴種樣品中針對藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)進(jìn)行免 疫測定的方法，其中示蹤抗體為與食蟹猴IgG特異性結(jié)合、不與人IgG結(jié) 合的抗體，捕獲抗體為藥物抗體。
才艮據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選雜交瘤細(xì)胞系3.25.12、 3.29.15、 4.38.30、 7.57.41、
14和7.72.32依據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約保藏于 德國微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ):
克隆保藏號保藏日
3.25.12DSM ACC27992006.08.24
3.29.15DSM ACC28002006.08.24
4.38.30DSM ACC28012006.08.24
7.57.41DSM ACC28022006.08.24
7.72.32DSM ACC28032006.08.24
MAB M-R10Z8E9DSM ACC270822.12.2004
由所述細(xì)胞系可得的抗體是本發(fā)明的實施方案。
提供下文的實施例和附圖以幫助對本發(fā)明的理解，本發(fā)明的真正范圍 由隨附的權(quán)利要求書闡明。應(yīng)理解在不偏離本發(fā)明精神的情況下可以對列 出的方法l故出i奮改。


圖1:檢測DA/ADA復(fù)合物的測定法——不加入DA。 將生物素化的抗人Ig抗體固定到抗生蛋白鏈菌素包被的微孔板 (SA-MTP)上。藥物抗體/抗藥物抗體(DA/ADA)復(fù)合物被固定化抗人 Ig抗體(Bi;生物素化的)所捕獲。用洋地黃毒苷標(biāo)記的(Dig;洋地黃 毒苷化的)抗食蟹猴IgG抗體和抗洋地黃毒苷抗體辣根過氧化物酶(POD ) 綴合物(多克隆抗DIG抗體與POD綴合，pAb<Dig>POD)檢測結(jié)合的 DA/ADA復(fù)合物。用與食蟹猴IgG化學(xué)綴合的人IgG作為標(biāo)準(zhǔn)。 圖2:檢測DA/ADA復(fù)合物的測定法——加入DA。 在樣品分析之前，用基于PBS的緩沖液稀釋猴血清樣品，摻加藥物抗 體。15分鐘預(yù)孵育之后，用上述ELISA分析樣品(見圖l的說明)。
15圖3:用抗食蟹猴抗體檢測ADA的測定法。
將生物素化的藥物抗體與抗生蛋白鏈菌素包被的微孔板(SA-MTP) 結(jié)合(Bi;生物素化的)?？顾幬锟贵w(ADA)與固定化藥物抗體結(jié)合。 用洋地黃毒苷標(biāo)記的(Dig;洋地黃毒苷化的)抗食蟹猴IgG抗體和抗洋 地黃毒苷抗體辣根過氧化物酶綴合物(pAb<Dig>POD )檢測結(jié)合的ADA。 用與食蟹猴IgG化學(xué)綴合的抗人IgG抗體作為標(biāo)準(zhǔn)。
圖4: DA/ADA復(fù)合物測定法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
用含有1% (v-/v)食蟹猴血清的基于PBS的緩沖液稀釋與食蟹猴IgG化 學(xué)綴合的人IgG，圖中給出了其在多個濃度下的光密度(OD)。
圖5:在食蟹猴中進(jìn)行HuMalXlGF-lR〉單劑量藥物動力學(xué)研究(3 mg/kg;靜脈注射)，檢測該研究樣品中的DA/ADA復(fù)合物。
在給藥后0 h和1176 h之間的8個時間點，收集血清樣品，用ELISA 分析(如圖1所示)，不加入藥物抗體。將DA/ADA復(fù)合物的量(405 nm 的OD信號)相對于給藥后的時間作圖。
圖6:在食蟹猴中進(jìn)行HuMab〈IGF-lR〉單劑量藥物動力學(xué)研究(3 mg/kg;靜脈注射)，檢測該研究樣品中的DA/ADA復(fù)合物。
在給藥后0 h和1176 h之間的8個時間點，收集血清樣品，用ELISA 分析(如圖2所示)，加入藥物抗體。將DA/ADA復(fù)合物的量(405 nm 的OD信號)相對于給藥后的時間作圖。
圖7:單克隆抗食蟹猴IgG和多克隆食蟹猴IgG對于食蟹猴IgG檢測 的對比。
用含有1% (v/v)食蟹猴血清的基于PBS的緩沖液稀釋與食蟹猴IgG化 學(xué)綴合的人IgG，圖中給出了其在多個濃度下的光密度(信號(中位值))。
實施例 實施例1
制*蟹猴IgG和食蟹猴Fc片斷 a)制^蟹猴IgG
16食蟹猴血清經(jīng)Aerosil 380脫脂，用硫酸銨(ad 2.0 M )沉淀。將沉淀 在磷酸鹽緩沖液均質(zhì)化，以磷酸鹽緩沖液，pH7.0透析。用DEAE離子交 換色譜在pH 7.0分離混合物，通過凝膠過濾濃縮純化流出液中的IgG。
b)制備食蟹猴Fc
在15 mM半胱氨酸存在下，在37°C ， pH 7.0用木瓜蛋白酶(4 mU木 瓜蛋白* mg IgG )將a)中純化的IgG片斷化。80分鐘后，將混合物與 碘乙酰胺(ad 30 mM)在25。C酵育，隨后以含30 mM NaCi， pH 7.5的 10 mM HEPES緩沖液透析。用Q-瓊脂糖離子交換色i普分離混合物。Fab 級分在流出液中，用濃度達(dá)l M氯化鈉的鹽梯度洗脫Fc級分。最后，將 Fc級分以磷酸鹽緩沖液透析，通過凝膠過濾純化。
實施例2
產(chǎn)生單克隆抗食蟹猴IgG抗體
a) 免疫小鼠
用100照食蟹猴IgG (食蟹猴免疫球蛋白G)或與CFA (弗氏完全 佐劑)混合的食蟹猴Fc，對8-12周齡的雌性Balb/c或NMRI小鼠分別進(jìn) 行^M內(nèi)初次免疫。在4、 7和10周后，每只小鼠用100ng與IFA(弗氏 不完全佐劑)混合的食蟹猴IgG再進(jìn)行三次腹膜內(nèi)免疫步驟。然后在融合 前三天，各用100網(wǎng)處于PBS(磷酸緩沖鹽溶液；加入抗組胺和腎上腺素) 中的食蟹猴IgG進(jìn)行靜脈內(nèi)加強(qiáng)免疫。
b) 融合和克隆
才艮據(jù)Galfr" G.和Milstein， C.， Methods Enzymol. 73 (1981) 3-46將 按照a)免疫的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。將約lxl()8脾細(xì)胞與約 2xl()7骨髓瘤細(xì)胞(P3x63-Ag8.653， ATCC CRL1580 )混合，離心(10分 鐘，300xg， 4'C)。之后用無FCS (胎牛血清)的RPMI 1640培養(yǎng)基洗 涂細(xì)胞一次，在50 mL尖底管中以400xg再次離心。此后，加入1 mL PEG
17(聚乙二醇，分子量4,000 g/mol)，通過吸液進(jìn)行混合。在37C水浴1分 鐘后，逐滴加入5 mL無FCS的RPMI 1640,混合懸液，用含10% (v/v) FCS 的RPMI 1640加滿至50 mL，然后離心。沉淀的細(xì)胞用含10%FCS的RPMI 1640重懸，在含生長因子白介素6 (IL-6， 100U/mL)的次黃噤呤-重氮絲 氨酸選擇培養(yǎng)基(100 mmol/L次黃嘌呤，1 jig/mL重氮絲氨酸，處于含 10%FCS的RPMI 1640中)中鋪板。約10天之后，測定原代培養(yǎng)物的特 定抗體合成(參見實施例3)。將顯示與食蟹猴IgG結(jié)合、且不與人正常 IgG交叉反應(yīng)的原代培養(yǎng)物用流式細(xì)胞儀(FACSAria, BD生物科學(xué)公司
(BD Biosciences ))通過單細(xì)胞沉積至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)而進(jìn)行個體化， 培養(yǎng)基中含生長因子白介素6 (100U/mL)。依照此實驗方案產(chǎn)生保藏的 克隆(表l)。用于本發(fā)明的細(xì)胞系保藏在德國微生物保藏中心(DSMZ)
(表l)。
表l:
抗食蟹猴mAb克隆
克隆IgG類和亞類免疫原保藏號保藏日
3.25.12IgGl, kIgGDSM ACC27992006.08.24
3.29.15IgGl， kIgGDSM ACC28002006.08.24
4.38.30IgGl, kIgGDSM ACC28012006.08.24
7.57.41IgG2a, kFcDSM ACC28022006.08.24
7.72.32IgGl， kFcDSM ACC28032006.08.24
c)由細(xì)胞培養(yǎng)物上清生產(chǎn)免疫球蛋白
產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞系以1.0xl()s到2.2xl()s個細(xì)胞每mL (取決于個體 細(xì)胞系)的初始細(xì)胞密度(活細(xì)胞)在補(bǔ)加10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng) 基中接種，用攪拌技術(shù)擴(kuò)增9到16天(取決于個體細(xì)胞系)的時間。在收 獲的培養(yǎng)物上清中，單克隆抗體濃度達(dá)到每mL36到61 ng。培養(yǎng)物上清 得到的抗體的純化根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)化學(xué)方法例如根據(jù)Bruck, C.等人，
18Methods Enzymol. 121 (1986) 587- 596進(jìn)行。
實施例3
檢測抗食蟹猴IgG抗體的篩選法
a) 初步篩選與食蟹猴IgG優(yōu)先結(jié)合的抗體
為測定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清中抗體的特異性，將重組抗生蛋白鏈菌 素(MicroCoat, Bernried公司，批次MC 1098 )預(yù)包被的MTP (微孑L板) 分別用處于補(bǔ)加1.0% (w/v) BSA II的PBS中的生物素化的食蟹猴IgG， 250 ng/mL或生物素化的人IgG， 250 ng/mL進(jìn)行包被(100 每孔，室 溫孵育60分鐘，伴隨振蕩)，之后用0.9% (w/v) NaCl/0.05%Tween 20 洗滌三次。下一步，每孔加入100nL待測的抗體溶液(培養(yǎng)物上清)，室 溫賻育60分鐘，伴隨振蕩。經(jīng)過用0.9% (w/v) NaCl/0.05%Tween 20洗 滌三次的步驟之后，每孔加入100 辣根過氧化物酶標(biāo)記的多克隆綿羊抗 小鼠Fcy抗體的F(ab，)2片斷，以檢測結(jié)合的樣品抗體，室溫孵育60分鐘， 伴隨振蕩。隨后，按上文進(jìn)行洗滌。最后，每孔加入100 ABTS (德國 羅氏診斷產(chǎn)品有限公司(Roche Diagnostics GmbH ),目錄號1684302 )。 室溫孵育30分鐘后，在商用微孔板ELISA讀板器中測量405和492 nm [405/492]處的消光(OD )。此篩選選出與食蟹猴IgG很好結(jié)合且對人IgG 顯示無/低交叉反應(yīng)性的抗體。選出的抗體繼續(xù)進(jìn)行步驟b)的測定。
b) 篩選對人IgG沒有可檢測的交叉反應(yīng)性的抗體
為了從初步篩選a)中選出的抗體中鑒定出對人IgG顯示沒有可檢測的 交叉反應(yīng)性的抗體，進(jìn)行下文描述的測定法。將重組抗生蛋白鏈菌素 (MicroCoat, Bernried 7>司，批次MC 1098 )預(yù)包^皮的MTP用處于含 1.0% BSA II的PBS (磷酸緩沖鹽溶液)中的生物素化的食蟹猴IgG, 250 ng/mL進(jìn)行包被(100 jiL每孔，室溫孵育60分鐘，伴隨振蕩)，隨后用 0.9% (w/v) NaCl/0.05%Tween 20洗滌三次。下一步，分別加入每孔100 fiL 待測的抗體溶液(培養(yǎng)物上清)，和50 nL PBS (參照信號)，或50 jiL
19人IgG溶液(80 mg/mL;測定法中的終濃度27 mg/mL;測定信號)， 室溫孵育60分鐘，伴隨振蕩。經(jīng)過用0.9% (w/v) NaCl/0.05°/。Tween 20 洗滌三次的步驟之后，每孔加入100 fiL辣根過氧化物酶標(biāo)記的多克隆綿羊 抗小鼠Fc7抗體的F(ab，)2片斷，以檢測結(jié)合的樣品抗體，室溫孵育60分 鐘，伴隨振蕩。隨后，按上文進(jìn)行洗滌。最后，每孔加入100nLABTS⑧(德 國羅氏診斷產(chǎn)品有限公司，目錄號1684302 )。室溫孵育30分鐘后，在商 用微孔板ELISA讀板器中測量[405/492] nm處的消光。選擇測定信號顯示 與相關(guān)的參照信號沒有顯著差異的抗體作進(jìn)一步用途。以量化角度而言， 這等于與人IgG的交叉反應(yīng)性估計為<0.001 %。
("沒有顯著差異"的定義測定信號=參照信號的卯-110%。)
實施例4
制務(wù)資蟹猴IgG (Cyno-IgG)和人IgG ( H-IgG )的綴合物
a) 制備Cyno畫IgG-SATP
從食蟹猴血清中通過離子交換色譜法和凝膠過濾純化的食蟹猴IgG以 30 mM磷酸鉀緩沖液，pH 7.1透析，調(diào)整得到的蛋白質(zhì)溶液至蛋白質(zhì)濃 度為約10 mg/ml。將N-琥珀酰亞胺-3-乙酰硫代丙酸酯(SATP )溶于 DMSO，以1:5 (IgG:SATP)的摩爾比加入抗體溶液中?；旌衔镌?5。C， pH 7.1孵育60分鐘。通過加入L-賴氨酸至終濃度為10 mM停止反應(yīng)，將 pH調(diào)整為pH6.1，以含200mMNaCl和1 mMEDTA， pH 6.1的10 mM 磷酸鉀緩沖液進(jìn)行透析，除去過量的SATP。
b) 制備H-IgG-MH
從人血清中通過離子交換色i普法純化的人IgG以30 mM礴酸鉀緩沖 液，pH7.1透析，調(diào)整得到的蛋白質(zhì)溶液至蛋白質(zhì)濃度為約20mg/ml。將 馬來酰亞胺己酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Maleimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimideester，MHS)溶于DMSO，以1:6 (IgG:MHS )的摩 爾比加入抗體溶液中?；旌衔镌?5。C， pH7.1孵育60分鐘。通過加入L-
20賴氨酸至終濃度為10 mM停止反應(yīng)，將pH調(diào)整為pH 6.1 ，以含200 mM NaCl和1 mM EDTA, pH 6.1的10 mM鱗酸鉀緩沖液進(jìn)行透析，除去過 量的MHS。
c)綴合Cyno-IgG畫SATP和H畫IgG畫MH
加入2.5% (v/v) 1 M羥胺溶液，pH 7.5,在25。C孵育60分鐘，將 Cyno-IgG-SATP去乙酰化為Cyno-IgG-SH。去乙?；目贵w與H-IgG-MH 混合(Cyno-IgG-SH:H-IgG-MH的摩爾比=1:1)至總IgG的終濃度為約7 mg/ml。將pH調(diào)整為7.1，在25'C孵育混合物。用分析性凝膠過濾柱(例 如TSK3000)分析綴合過程。 一般而言，在40分鐘后通過加入半胱氨酸 至終濃度為2 mM停止綴合過程。孵育30分鐘后，加入N-甲基馬來酰亞 胺(NMM)至終濃度為5 mM，將pH調(diào)整為7.5。在25。C賻育60分鐘后， 用丙烯葡聚糖凝膠S-300通過凝膠過濾色鐠法分離綴合物，除去未綴合的 抗體。
實施例5
制備洋地黃毒苷化的單克隆抗食蟹猴Fc抗體
a) 制備單克隆抗食蟹猴Fc抗體
將單克隆抗食蟹猴Fc抗體的發(fā)酵上清濃縮約10倍，移至含20 mM TRIS， 1M硫酸銨，pH9.0的緩沖液，上樣至蛋白A-瓊脂糖柱。將用0.2 M檸檬酸鈉，pH3.0洗脫的洗脫液以磷酸鹽緩沖液，pH7.5進(jìn)行透析。通 過用針對牛IgG的固定化抗體進(jìn)行免疫吸附分離牛IgG污染物(來自發(fā)酵 液中的FCS)。
b) 單克隆抗食蟹猴Fc抗體的洋地黃毒苷化
將處于磷酸鹽緩沖液中的單克隆抗食蟹猴Fc抗體溶液調(diào)整為pH 8.1 ， 濃度為約2 mg/ml。將洋地黃毒苷-3-0-曱基羰基-s-氨基己酸-N-羥基琥珀酰 亞胺酯溶于DMSO，以1:5的摩爾比加入抗體溶液中。60分鐘后通iti口入
21L-賴氨酸停止反應(yīng)，以含150mMNaCl， pH 7.5的50 mM磷酸鉀緩沖液 透析除去過量的標(biāo)記試劑。
實施例6
通過BIAcore⑧系統(tǒng)評估抗體的結(jié)合/特異性
所有的測量均用使用CM5芯片的81入。^@2000儀器進(jìn)行。通過標(biāo)準(zhǔn) 胺偶聯(lián)實現(xiàn)抗體對芯片的包被。除非另有說明，所有的孵育步驟均于25。C 在HBS緩沖液(HEPES， NaCl， pH 7.4)中進(jìn)行。將飽和量的不同單克 隆抗食蟹猴IgG抗體、MAB M-R10Z8E9和多克隆抗人Fcy抗體(Dianova 7〉司，德國)，通過胺偶聯(lián)分別固定在同一CM5芯片的不同槽(channel) 上。所有的動物血清均在含1 mg/ml羧曱基葡聚糖的HBS緩沖液中稀釋至 終濃度為1 %。通過注入1比100稀釋的血清并孵育60秒分析結(jié)合。通過 用HBS緩沖液洗滌芯片表面180秒測量解離。用BIAcore 的 BIAevaluation軟件，以1:1蘭米爾擬合才莫型(Langmuir fitting model)計 算解離常數(shù)值(=KDiss.)。對于所有動物血清，此計算都基于IgG水平 為15 mg/ml的假設(shè)。選擇開始注入測試抗體80秒后的信號值用于對比結(jié) 合的IgG的量(表2中的RU )。
表2:
動物血清與單克隆抗食蟹猴IgG抗體 和多克隆抗人Fcy抗血清的結(jié)合信號[RU
樣品(血清)抗食蟹猴mAb (克隆3.25.12)PAb<H-Fcy>
結(jié)合的RUKDiss. (mol/L)結(jié)合的RUKDiss. —1/L)
絨猴-31.4無結(jié)合5321.41xl008
狒狒2038.59.39xl0131404.66.37xlOn
大鼠-20.9無結(jié)合48.2無結(jié)合
黑猩猩-28.2無結(jié)合1918.13.72xl(K13
22食蟹猴2278.72.03xl(T091344.87.17xl012
恒河猴2362.85.09xl01Q1172.19.08xl011
NMRI小鼠-15.7無結(jié)合-23.8無結(jié)合
人-25.5無結(jié)合1571.64.56xl012
狗-35.9無結(jié)合564.31.15xl008
CD1小鼠-40.4無結(jié)合-30.7無結(jié)合
表2顯示單克隆抗食蟹猴IgG抗體不與人血清交叉反應(yīng)。只檢測到了 其與食蟹猴、恒河猴和狒狒血清包含的IgG的結(jié)合。與單克隆抗食蟹猴IgG 抗體不同，多克隆抗人Fc抗體顯示與人、狗和所有測試猴種的血清的高 反應(yīng)性。
實施例7
測定DA/ADA復(fù)合物——不加入DA
在第一步中，生物素化的MAB M-R10Z8E9結(jié)合至抗生蛋白鏈菌素包 被的微孔板(SA-MTP)的孔中。通過洗滌除去過量的未結(jié)合抗體。之后， 在孔中孵育猴血清樣品和參照標(biāo)準(zhǔn)(人IgG與摻加在1。/。食蟹猴血清中的 食蟹猴IgG化學(xué)綴合)。洗去未結(jié)合的物質(zhì)之后，結(jié)合的DA/ADA復(fù)合 物用洋地黃毒苦化的抗食蟹猴抗體檢測，而后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗 洋地黃毒苷抗體進(jìn)行孵育。抗體一酶綴合物催化ABTS⑧底物的顯色反應(yīng)。 用ELISA讀板器在波長405nm處(參照波長490 nm ([405/490] nm )) 測量信號。以一式兩份測定各血清樣品的吸光值。圖l顯示例示此測試系 統(tǒng)的方案。
實施例8
測定DA/ADA復(fù)合物——加入DA
樣品分析之前，將猴血清樣品在基于PBS的緩沖液中稀釋，摻加藥物 抗體。15分鐘預(yù)孵育之后，通過上述ELISA分析樣品。圖2顯示例示此
23測試系統(tǒng)的方案。
實施例9
檢測食蟹猴藥物動力學(xué)研究樣品中的DA/ADA復(fù)合物
用針對IGF-1R (WO 2005/005635; 3 mg/kg; iv)的人抗體進(jìn)行食蟹 猴血清樣品單劑量藥物動力學(xué)研究(PK=藥物動力學(xué))，用上述ELISA 進(jìn)行分析i)檢測DA/ADA復(fù)合物，不加入藥物抗體(圖5 )，和ii)檢 測DA/ADA復(fù)合物，加入藥物抗體(圖6 )。在給藥后0 h和1176 h之間 的8個時間點，收集血清樣品并分析。將DA/ADA復(fù)合物的量(405 nm 處的OD信號)相對于給藥后的時間作圖。如圖5所示，如果體內(nèi)形成 AD/ADA復(fù)合物，而未經(jīng)體外加入藥物抗體，則血清樣品中僅在336 h和 672 h之間(峰形)檢測到陽性信號。不存在抗藥物抗體的情況下，沒有 免疫復(fù)合物形成，檢測不到陽性信號(336h之前的時間點)。給藥后672 h或之后，由于樣品中不存在藥物，不能檢測到復(fù)合物。當(dāng)在血清樣品中 加入藥物抗體作為預(yù)孵育步驟時，均能檢測到/可檢測到體內(nèi)形成和體外形 成的DA/ADA復(fù)合物。如圖6所示，陽性信號僅依賴于ADA的產(chǎn)生。兩 幅圖(圖5和6)均與藥物一時間曲線4艮好地相關(guān)。
實施例10
用抗食蟹猴抗體進(jìn)行ADA檢測的測定法
在第一步中，將生物素化的藥物抗體(針對IGF-1R的人抗體)結(jié)合 到抗生蛋白鏈菌素包被的微孔板(SA-MTP)的孔中。洗滌除去過量未結(jié) 合的抗體。之后，孵育猴血清樣品(在基于PBS的緩沖液中稀釋20倍) 和參照標(biāo)準(zhǔn)。洗去未結(jié)合的物質(zhì)之后，用洋地黃毒苷化的抗食蟹猴抗體檢 測結(jié)合的抗藥物抗體(ADA)，而后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗洋地黃毒 苷抗體孵育?？贵w一酶綴合物催化入818@底物的顯色反應(yīng)。用ELISA讀 板器測量波長405 nm處的信號(參照波長4卯nm )。以一式三份測定 各血清樣品的吸光值。圖3顯示例示此測試系統(tǒng)的方案。
24實施例11制備針對食蟹猴IgG的多克隆抗體a) 從兔血清中純化多克隆抗體根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，已經(jīng)用食蟹猴Fc對兔進(jìn)行免疫。對于來自五只用食 蟹猴Fc免疫的兔的原始血清，用Aerosil (1.5% (w/v))脫脂除去其中的脂成 分，用硫酸銨(1.7M)沉淀免疫球蛋白。經(jīng)酸處理(30min.， pH 5.5 )并 以補(bǔ)加50 mM NaCl， pH 7.0的15 mM磷酸鉀緩沖液透析之后，用DEAE 離子交換色譜法于pH 7.0分離混合物，將流出液中的IgG級分(=兔多 克隆抗食蟹猴IgG抗體)濃縮至約25mg/ml。b) 制備親和純化的多克隆兔抗食蟹猴IgG抗體(pAb<Cyno-IgG>)，其 對人IgG沒有交叉反應(yīng)性將步驟a)的濃縮IgG級分移至補(bǔ)加150 mM NaCl， pH 7.5的50 mM 磷酸鉀緩沖液系統(tǒng)(PBS)。用現(xiàn)有技術(shù)將食蟹猴IgG與NHS瓊脂糖綴 合，制備得到具有固定化食蟹猴IgG的免疫吸附劑，填充到柱中，用補(bǔ)加 150 mM NaCl pH 7.5的50 mM礴酸鉀緩沖液平衡。將10 mg IgG/ml免疫吸附劑上樣至用PBS平衡的柱中。依次用PBS、 補(bǔ)加0.05% (w/v) Tween 20的0.5 M NaCl和30 mM NaCl洗柱。用3 mM HC1和1 M丙酸洗脫與親和基質(zhì)特異性結(jié)合的IgG,以PBS透析。為除去對人IgG具有交叉反應(yīng)性的抗體，將親和純化的抗體上祥至具 有固定化人IgG的親和柱中，該親和柱為用現(xiàn)有技術(shù)將非特異性人IgG與 NHS瓊脂糖綴合制備而得。用PBS平衡柱。將約6 mg IgG/ml免疫吸附劑 上樣至柱中。特異性多克隆IgG級分在流出液中。用補(bǔ)加0.05% (w/v) Tween 20的0.5 M NaCl、 30 mM NaCl、 1 M丙酸和PBS令柱再生后， 重復(fù)進(jìn)行兩次對于非特異性結(jié)合的IgG的免疫吸附，以完全除去對人IgG 具有交叉反應(yīng)性的抗體。將得到的對人IgG不具有交叉反應(yīng)性的純化多克隆抗食蟹猴IgG抗體25濃縮至約4mg/ml，儲存于-80'C。 實施例12用BIAcore⑧系統(tǒng)評估多克隆兔抗食蟹猴Fc抗體(pAb<Cyno-Fc> )的抗體 結(jié)合/特異性全部的測量均用使用CM5芯片的BIAcore 2000儀器進(jìn)行。通過標(biāo)準(zhǔn) 胺偶聯(lián)實現(xiàn)抗體對此芯片的包被。除非另有說明，所有的孵育均在HBS 緩沖液(HEPES， NaCl， pH 7.4)中在25。C進(jìn)行。將飽和量的多克隆抗 食蟹猴IgG抗體通過胺偶聯(lián)固定在CM5芯片。所有的動物血清均在含1 mg/ml羧甲基葡聚糖的HBS緩沖液中稀釋至終濃度為1 %。通過注入1 比100稀釋的血清并孵育60秒分析結(jié)合。通過用HBS緩沖液洗滌芯片表 面180秒測量解離。用BIAcore⑧的BIAevaluation軟件，以1:1蘭米爾擬 合模型計算解離常數(shù)值(-KDiss.)。對于所有動物血清，此計算都基于IgG 水平為15 mg/ml的假設(shè)。選擇開始注入測試抗體80秒后的信號值用于對 比結(jié)合的IgG的量(表3中的RU)表3:動物血清與多克隆抗食蟹猴IgG抗體的結(jié)合信號[RU樣品(血清)抗食蟹猴pAb結(jié)合的RUKDiss. (mol/L)絨猴50.81.80xl007狒狒1297.44.11xl010大鼠-12.4無結(jié)合黑猩猩3,8無結(jié)合食蟹猴1357.91.92xl009恒河猴1244.62.16xl009NMRI小鼠42.14.27xl(T0626樣品(血清)抗食蟹猴pAb人-6.7無結(jié)合狗-10無結(jié)合CD1小鼠-15.9無結(jié)合表3顯示多克隆抗食蟹猴IgG抗體不與人血清交叉反應(yīng)。只檢測到了 其與絨猴、食蟹猴、恒河猴和狒狒血清包含的猴IgG的結(jié)合。與單克隆抗 食蟹猴IgG抗體不同，多克隆抗食蟹猴IgG抗體顯示與NMRI小鼠血清 的反應(yīng)性。而且多克隆抗食蟹猴IgG抗體不與人IgG結(jié)合，且與猴IgG和 小鼠IgG之間的反應(yīng)性的差異至少為100倍。
權(quán)利要求
1. 與食蟹猴IgG特異性結(jié)合的抗體，特征在于其不與人IgG結(jié)合，且為單克隆抗體。
2. 單克隆抗體，其由細(xì)胞系DSM ACC2799、或細(xì)胞系DSM ACC2800、或細(xì)胞系DSM ACC2801、或細(xì)胞系DSM ACC2802、或細(xì)胞 系DSM ACC2803生產(chǎn)。
3. 用包含捕獲抗體和示蹤抗體的雙抗原橋聯(lián)免疫測定法對猴種樣品 中藥物抗體(DA)和針對所述藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)的 免疫復(fù)合物(DA/ADA復(fù)合物)進(jìn)行免疫測定的方法，特征在于所述抗體 之一是與食蟹猴IgG特異性結(jié)合、不與人IgG結(jié)合的抗體，另一抗體是與 人免疫球蛋白特異性結(jié)合的抗體。
4. 權(quán)利要求3所述的方法，特征在于捕獲抗體為與人IgG特異性結(jié)合 的抗體，示蹤抗體為與食蟹猴IgG特異性結(jié)合、不與人免疫球蛋白結(jié)合的 抗體。
5. 權(quán)利要求3所述的方法，特征在于捕獲抗體為與食蟹猴IgG特異性 結(jié)合、不與人免疫球蛋白結(jié)合的抗體，示蹤抗體為與人IgG特異性結(jié)合的 抗體。
6. 權(quán)利要求3到5任一項所述的方法，特征在于所述與食蟹猴IgG特 異性結(jié)合的抗體和/或所述與人免疫球蛋白特異性結(jié)合的抗體為單克隆抗 體。
7. 權(quán)利要求3到6任一項所述的方法，特征在于形成的復(fù)合物的量與 DA/ADA復(fù)合物、DA和/或ADA的濃度相關(guān)聯(lián)。
8. 權(quán)利要求3到任一項所述的方法，特征在于樣品與預(yù)定量的所述藥 物抗體預(yù)將育。
9. 用包含捕獲抗體和示蹤抗體的雙抗原橋聯(lián)免疫測定法對猴種樣品 中針對藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)進(jìn)行免疫測定的方法，特征 在于捕獲抗體為與食蟹猴IgG特異性結(jié)合、不與人IgG結(jié)合的抗體，示蹤抗體為藥物抗體。
10. 用包含捕獲抗體和示蹤抗體的雙抗原橋聯(lián)免疫測定法對猴種樣品 中針對藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)進(jìn)行免疫測定的方法，特征在 于示蹤抗體為與食蟹猴IgG特異性結(jié)合、不與人IgG結(jié)合的抗體，捕獲抗 體為藥物抗體。
11. 權(quán)利要求3到IO任一項所述的方法，特征在于捕獲抗體通過特異 性結(jié)合對固定化。
12. 權(quán)利要求ll所述的方法，特征在于捕獲抗體與生物素綴合，通過 固定化抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素進(jìn)行固定。
13. 權(quán)利要求3到12任一項所述的方法，特征在于示蹤抗體通過特異 性結(jié)合對與可檢測的標(biāo)記綴合。
14. ;〖又利要求13所述的方法，特征在于示蹤抗體與洋地黃毒苷綴合， 通過針對洋地黃毒苷的抗體實現(xiàn)與可檢測的標(biāo)記連接。
15. 雜交瘤細(xì)胞系3.25.12 (DSM ACC2799 ) 、 3.29.15 (DSM ACC2800 ) 、 4.38.30 (DSM ACC2801 ) 、 7.57.41 (DSM ACC2802 ) 、 7.72.32 (DSMACC2803)。
16. 用于權(quán)利要求3到14所述的方法的抗體組合物，特征在于其包含 由細(xì)胞系DSM ACC2799、細(xì)胞系DSM ACC2800、細(xì)胞系DSM ACC2801、 細(xì)胞系DSM ACC 2802和/或細(xì)胞系DSM ACC2803生產(chǎn)的抗體的混合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了與食蟹猴IgG特異性結(jié)合的抗體，特征在于其不與人IgG結(jié)合，以及用雙抗原橋聯(lián)免疫測定法對猴種樣品中藥物抗體(DA)和針對所述藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)的免疫復(fù)合物(DA/ADA復(fù)合物)進(jìn)行免疫測定的方法。
文檔編號G01N33/564GK101506659SQ200780030744
公開日2009年8月12日 申請日期2007年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月12日
發(fā)明者K-G·施圖本拉赫, R·福格爾, U·埃西希, U·韋塞爾斯 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司