專利名稱：用于測量分析物濃度的測定的穩(wěn)定劑和捕獲配體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的并且有用的用于測量液體中游離的或未結(jié)合的分析物的濃度的組 合物。本發(fā)明包括捕獲配體和穩(wěn)定劑的應(yīng)用，以提高分析物濃度測定法的準確度。本發(fā)明 還公開了應(yīng)用本發(fā)明的方法和工具。
背景技術(shù)：
人們已經(jīng)開發(fā)出多種測定法來測量溶液中分析物的濃度。例如，測定包括將含
有分析物的溶液與捕獲配體混合，洗去任何雜質(zhì)，然后測量與捕獲配體相聯(lián)接的分析物。 這些檢測方法存在數(shù)個技術(shù)難點。在一些情況中，發(fā)生不希望有的雜質(zhì)與捕獲配體的結(jié)合。 另外，在有些情況下，分析物與捕獲配體的結(jié)合是不穩(wěn)定的，并且分析物可以從配體上分 離。在一些情況下，溶液中的分析物可以以被結(jié)合的形式(例如，結(jié)合于蛋白質(zhì)上)和未 結(jié)合的形式存在，并且僅測量未結(jié)合的形式的濃度或許是所期望的。因此，在有些情況下， 必須穩(wěn)定化在結(jié)合形式和未結(jié)合形式之間的平衡，以便得到精確的和可再現(xiàn)的分析物濃度 測量。
為闡明這些該問題，貝克曼考爾特公司(Beckman Coulter, Incorporated) (BCI，
富勒敦市，加利福尼亞州)在BCI的多種分析物濃度測定法中通常使用垸基胺含氟表面活 性劑(FC100， 3M公司制造，圣保羅市，明尼蘇達州)。FC100是一種胺類含氟表面活性 劑的復(fù)合混合物，其顯示出在其精確的化學成分上基本的批次間的變化性。根據(jù)3M公司 的材料安全數(shù)據(jù)表(MSDS， 2000年2月8日公開，文件編號10-3799-3) ， FC100含有水、 二甘醇丁基醚、氟烷基磺酸酯鈉鹽、以及作為商業(yè)秘密的殘留有機含氟化合物的混合物。 不受理論限制，本發(fā)明人相信，通過穩(wěn)定化平衡，烷基胺含氟表面活性劑可以促進游離的 未結(jié)合的分析物含量對比存在于樣品溶液中被結(jié)合的分析物的精確測定，并且因此允許用 于分析物濃度的精確測量。
數(shù)年前，美國環(huán)境保護局表示出對某些碳氟化合物比如碳氟辛酸及其衍生物作為
潛在有害化合物的關(guān)注。因此，需要一種替換物，用于代替具有不同的可以在確定分析物 濃度中起作用的測定成分的烷基胺含氟表面活性劑。本發(fā)明提供了新穎的組合物以及用于在測定中使用那些組合物的方法和試劑盒， 從而精確地測量來自個體的樣品中游離的未結(jié)合的分析物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明闡明了如上所述需要和現(xiàn)用技術(shù)遭遇的問題。本發(fā)明的目的在于提供測定游離分析物濃度的方法，該方法包括
(a) 將捕獲配體加入容器；
(b) 將穩(wěn)定劑加入容器；
(C)將包含游離分析物的樣品加入容器；
(d) 將檢測體系加入容器；以及
(e) 通過使用檢測體系，測量樣品中游離分析物的濃度。本發(fā)明的目的還在于提供用于測量游離分析物濃度的測定的組合物，該組合物包 含用于游離分析物的捕獲配體以及穩(wěn)定劑，其附帶條件是穩(wěn)定劑不包含垸基胺含氟表面活 性劑。本發(fā)明的目的還在于提供用于估計游離分析物濃度的試劑盒，該試劑盒包含
(a) 用于分析物的捕獲配體；
(b) 穩(wěn)定劑；以及
(c) 檢測體系。在一些實施方式中，試劑盒可以進一步包含(d)參考標準。
本發(fā)明的目的還在于提供穩(wěn)定劑，該穩(wěn)定劑包含通式RX。其中，R和X是共價結(jié) 合，并且其中R是飽和或不飽和烴基、烷氧基、烷氧基烷基、垸氧基烷氧基烷基、垸基氨 基垸基、垸基氨基氧基垸基、垸氧基氨基烷基、膦酰基烷基、羧基烷基、羧基垸氧基垸基、 羧基烷基氨基垸基、羧基烷基酰氨基烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基垸基、雜環(huán)基、 芳基、芳基烷基、雜芳基、雜芳基烷基、硅氧烷、或碳硅垸(carbosilane)。其中任何一 種可以任選地用一個以上氧、氮、磷、或硅原子間斷，并且其中R取代物中的任何一種可 以用一個以上羥基、羰基、鹵素、磷酸酯、乙?；?、銨、或其組合選擇性地取代。并且其 中，X是硫酸酯、磺酸、磺酸酯、亞硫酸酯、?；撬猁}、磺基丁二酸酯、磺化甜菜堿、氨
7磺酰(sulfonamide)、甲氧基甲酰胺(methoxymethanilamide)、氨磺酰、次磺酰(sulfeno)、 亞氯酸鹽、氯化物、碘化物、碘酸鹽、溴化物、溴酸鹽、氟化物、氟酸鹽、硝酸酯、亞硝 酸酯、硝胺、氨基、亞氨基、異氰酸基(isocyanoto)、異硫氰基、乙酰胺基、乙酰亞胺基、 疊氮基、重氮基、氰基、氰酰基、磷酸酯、磷酸基、膦?；?、磷?；?、膦基、羧酸酯、丙 烯酸酯、癸二酸酯、鄰苯二甲酸酯、醋酸酯、氧化物、硼酸鹽、過氧化硼酸鹽、四硼酸鹽、 硼垸酸酯(boranate)、硅烷、正硅酸酯(orthosilcate)、硅酸鹽、或硅酸金屬鹽，附帶條 件是RX不能為垸基胺含氟表面活性劑。圖1和圖2描述了包含通式RX的穩(wěn)定劑。
在一些實施方式中，R可以是烷基、亞烷基、炔、烷氧基烷基、烷氧基垸氧基垸 基、烷基氨基烷基、垸基氨基氧基烷基、垸氧基氨基烷基、膦?；榛?、羧基烷基、羧基 烷氧基烷基，其中的任何一種用一個以上羥基、羰基、鹵素、磷酸酯、乙酰基、銨、或其 組合選擇性地取代。在一些實施方式中，R可以是丙基、異丙基、丁基、異丁基、戊基、己基、庚基、 辛基、2-甲基丁基、2-乙基丁基、2-丙基丁基、3-甲基丁基、3-乙基丁基、3-丙基戊基、2-甲基戊基、2-乙基戊基、2-丙基戊基、3-甲基戊基、3-乙基戊基、3-丙基戊基、4-甲基戊基、 4-乙基戊基、4-丙基戊基、2-甲基己基、2-乙基己基、2-丙基己基、3-甲基己基、3-乙基己 基、3-丙基己基、4-甲基己基、4-乙基己基、4-丙基己基、5-甲基己基、5-乙基己基、5-丙 基己基、2-甲基庚基、2-乙基庚基、2-丙基庚基、3-甲基庚基、3-乙基庚基、3-丙基庚基、
4- 甲基庚基、4-乙基庚基、4-丙基庚基、5-甲基庚基、5-乙基庚基、5-丙基庚基、6-甲基庚 基、6-乙基庚基、6-丙基庚基、2-甲基辛基、2-乙基辛基、2-丙基辛基、3-甲基辛基、3-乙 基辛基、3-丙基辛基、4-甲基辛基、4-乙基辛基、4-丙基辛基、5-甲基辛基、5-乙基辛基、
5- 丙基辛基、6-甲基辛基、6-乙基辛基、6-丙基辛基，其中任何一種可以用一個以上羥基、 羰基、鹵素、磷酸酯、乙?；?、銨、或其組合選擇性地取代。在一些實施方式中，X可以是硫酸酯、磺酸、磺酸酯、亞硫酸酯、?；撬猁}、磺 基丁二酸酯、磺化甜菜堿、氨磺酰、甲氧基甲酰胺、氨磺酰、或次磺酰，優(yōu)選是硫酸酯、 磺酸、磺基丁二酸酯、或牛磺酸鹽。在一些實施方式中，R是Cw8垸基并且X是硫酸酯、磺酸酯或者磺酸。在一些實
施方式中，穩(wěn)定劑選自下組2-乙基-己基硫酸酯；l-己烷磺酸或其鹽；l-庚烷磺酸或其鹽; l-辛烷磺酸或其鹽；l-癸烷磺酸或其鹽Q4.,6烯烴磺酸鈉；十二烷基硫酸鈉；二辛磺基琥 珀酸鈉；N-油基-N-甲基?；撬徕c；聚氧化乙烯月桂垸硫酸鈉；胺的垸基苯甲基磺酸酯；乙基-己基硫酸鈉；以及其組合。在一些實施方式中，穩(wěn)定劑是2-乙基-己基硫酸酯。在一 些實施方式中，組合物包含穩(wěn)定劑的鹽。在一些實施方式中，分析物是激素、藥物、或維生素。在一些實施方式中，分析 物包含分析物的單一對映體或去碘化的形式。在一些實施方式中，捕獲配體和穩(wěn)定劑以保持在待分析樣品中游離的分析物和被
結(jié)合的分析物之間平衡的方式而被組合。在一些實施方式中，穩(wěn)定劑的體積分數(shù)是約0.0001至約0.1體積百分數(shù)。
在一些實施方式中，穩(wěn)定劑的濃度是約5至約750微摩爾。在一些實施方式中，2-乙基-己基硫酸酯的體積分數(shù)是約0.004至約0.015體積百分 數(shù)。在一些實施方式中，2-乙基-己基硫酸酯的濃度是約75至約650微摩爾。
在一些實施方式中，捕獲配體選自下組抗體，抗體片段，抗體仿制品，或分析 物特異性結(jié)合蛋白質(zhì)比如內(nèi)因子或者葉酸酯結(jié)合蛋白。在一些實施方式中，捕獲配體被固 定在固相上。在一些實施方式中，捕獲配體是分析物特異性結(jié)合蛋白質(zhì)。在一些實施方式 中，捕獲配體是抗體。在一些實施方式中，分析物是甲狀腺激素。在一些實施方式中，本發(fā)明還包括免疫測定體系。在一些實施方式中，免疫測定 體系包含涂敷有特異性結(jié)合生物素的分子、生物素化的分析物特異性捕獲蛋白質(zhì)、或其組 合的順磁性顆粒。在一些實施方式中，免疫測定體系包含可檢測的標簽。


圖1是顯示多種用于形成本發(fā)明中公開的穩(wěn)定劑的R基團(I至VIII)的圖表。
圖2是顯示多種用于形成本發(fā)明中公開的穩(wěn)定劑的X基團(I至VIII)的圖表。
圖3是顯示多種作為本發(fā)明中公開的穩(wěn)定劑而被評價的RX化合物的圖表。"工 作濃度V/V%"指的是可溶解的受測穩(wěn)定劑的濃度。圖4是顯示多種作為本發(fā)明中公開的穩(wěn)定劑而被評價的EHS同系物的圖表。"工 作濃度V/V%"指的是可溶解的受測穩(wěn)定劑的濃度。
具體實施例方式本發(fā)明的目的在于提供一種用于測量游離分析物濃度的測定的組合物，該組合物包含用于游離分析物的捕獲配體以及穩(wěn)定劑，其附帶條件是穩(wěn)定劑不包含烷基胺含氟表面 活性劑。應(yīng)理解，當在本說明書和附后的權(quán)利要求書中使用時，單數(shù)形式的"一"、"一 種(個)"和"該"包括單個和多個參照，除非上下文清楚地指出。因此，例如"穩(wěn)定劑" 包括單個穩(wěn)定劑以及兩個以上不同穩(wěn)定劑的組合。術(shù)語"選擇性衍生的"指的是主體分子或者分子部分被選擇性地取代、選擇性地 間斷、或兩者皆有。術(shù)語"選擇性地取代"指的是用原子或者原子團置換在主體分子或者 分子部分上的氫或碳原子。在此描述的術(shù)語"選擇性地間斷"指的是碳鏈或硅氧垸鏈骨架 中插入Si、 O、 N、 S、或P。在一些實施方式中，術(shù)語"選擇性地衍生"指的是用一個以 上氧、氮、鹵素、或含有氧、氮、或鹵素的部分置換或間斷。本發(fā)明的組合物可以在測量游離分析物濃度的測定中使用。該組合物可以包含 (i)用于游離分析物的捕獲配體；以及(ii)穩(wěn)定劑，其中，穩(wěn)定劑包含通式RX或其鹽， 其中R是飽和或者不飽和烴基、芳基、或硅基聚合物，其中任何一種用一個以上含有氧、 氮、鹵素、或其組合的部分選擇性地衍生。并且其中，X是硫或磷的氧代陰離子或氧化物、
氮的氧代陰離子或羰基衍生物、羧酸酯、硼酸鹽、硅酸酯、或鹵素，附帶條件是穩(wěn)定劑不 包含烷基胺含氟表面活性劑。在一些實施方式中，穩(wěn)定劑包含通式RX或其鹽，其中，R是飽和或不飽和烴基、 垸氧基、烷氧基垸基、烷氧基垸氧基垸基、垸基氨基烷基、烷基氨基氧基烷基、烷氧基氨 基垸基、膦酰基烷基、羧基烷基、羧基垸氧基烷基、羧基烷基氨基垸基、羧基烷基酰氨基 烷基、環(huán)垸基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)垸基垸基、雜環(huán)基、芳基、芳基烷基、雜芳基、雜芳基 垸基、硅氧烷、硅酮、或碳硅垸，其中任何一種可以被一個以上氧、氮、磷、或硅原子選 擇性地間斷，并且其中R取代物中的任何一種可以用一個以上羥基、羰基、鹵素、磷酸酯、 乙?；?、銨、或其組合選擇性地取代；并且其中，X是硫酸酯、磺酸、磺酸酯、亞硫酸酯、 牛磺酸鹽、磺基丁二酸酯、磺化甜菜堿、氨磺酰、甲氧基甲酰胺、氨磺酰、次磺酰、亞氯 酸鹽、氯化物、碘化物、碘酸鹽、溴化物、溴酸鹽、氟化物、氟酸鹽、硝酸酯、亞硝酸酯、 硝胺、氨基、亞氨基、異氰酸基、異硫氰基、乙酰胺基、乙酰亞胺基、疊氮基、重氮基、 氰基、氰?；?、磷酸酯、磷酸基、膦?；⒘柞；?、膦基、羧酸酯、丙烯酸酯、癸二酸酯、 鄰苯二甲酸酯、醋酸酯、氧化物、硼酸鹽、過氧化硼酸鹽、四硼酸鹽、硼垸酸酯、硅烷、 正硅酸酯、硅酸鹽、或硅酸金屬鹽，附帶條件是RX不是烷基胺含氟表面活性劑，即，R 不是氟代垸基胺。
圖1和圖2概述了本發(fā)明的穩(wěn)定劑中的多種R和X基團。在一些實施方式中，穩(wěn) 定劑可以由分子式RX表示。在其他實施方式中，穩(wěn)定劑可以由分子式比如RXR'、 XRX' 和RXR'X表示。本發(fā)明中，當穩(wěn)定劑由分子式RXR'、 XRX鄰RXR'X表示時，R和R'、 或X和X'可以是相同的主體分子或分子部分，或者任選地，它們可以是不同的主體分子或 分子部分。在一些實施方式中，R選自下組直鏈或支鏈硅氧垸、直鏈或支鏈碳硅烷、直鏈 或支鏈垸基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基烷基、雜芳基、及其組合。在一些實施方式中，R是 用一個以上羥基、酮基、羰基、羧基、或其組合選擇性地取代的烷基、芳基、或硅基聚合 物。在一些實施方式中，R是醚、酯、或其組合。在一些實施方式中，R包含聚氧化丙烯 或聚氧化乙烯。在一些實施方式中，R是用一個以上包含胺、氨基、亞胺、亞氨基、酰胺、銨、 或其組合的含氮部分選擇性地取代的烷基、芳基、或硅基聚合物。在一些實施方式中，R可以是烷基、亞垸基、炔、垸氧基烷基、垸氧基烷氧基烷 基、烷基氨基烷基、烷基氨基氧基垸基、烷氧基氨基烷基、膦?；榛?、羧基烷基、羧基 烷氧基烷基，其中的任何一種用一個以上羥基、羰基、鹵素、磷酸酯、乙酰基、銨、或其 組合選擇性地取代。在一些實施方式中，在此限定的R可以用羥基、羧基、胺、氧化胺、磷酸酯、醋 酸酯、羧酸酯、烷基或芳基的鉸衍生物、或其組合選擇性地取代。在一些實施方式中，R 用一個以上羥基、氧、醋酸酯、銨、羧基、氨基、或氧化胺選擇性地取代。
在一些實施方式中，R是烷基或芳基，其中的任何一種用一個以上羥基、羰基、 鹵素、磷酸酯、乙?；@、或其組合選擇性地取代。本發(fā)明的實施方式包括其中R是
烷基，并且烷基是Ci—30烷基、Ci-22烷基、Ci — i6烷基、Ci — i2烷基、Ci-io烷基、或Ci-8烷基。 在一些實施方式中，烷基部分是<:4.3()烷基、C4-22烷基、Cm8院基、(34.16烷基、cm4烷基、
或<:4.12烷基。在一些實施方式中，烷基部分是<:6.3()烷基、<:6.22烷基、<:6-18垸基、<:6.16烷
基、C6—14烷基、或Cw2垸基。在一些實施方式中，烷基是用一個以上羥基、羰基、鹵素、 磷酸酯、乙酰基、銨、或其組合選擇性地取代的Cwo烷基、C7—22垸基、Cw8垸基、c7.14
烷基、G7-i2烷基、或C7-9烷基。烷基取代基可以包括乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、戊基、己基、庚基、 辛基、2-甲基丁基、2-乙基丁基、2-丙基丁基、3-甲基丁基、3-乙基丁基、3-丙基戊基、2-甲基戊基、2-乙基戊基、2-丙基戊基、3-甲基戊基、3-乙基戊基、3-丙基戊基、4-甲基戊基、4-乙基戊基、4-丙基戊基、2-甲基己基、2-乙基己基、2-丙基己基、3-甲基己基、3-乙基己 基、3-丙基己基、4-甲基己基、4-乙基己基、4-丙基己基、5-甲基己基、5-乙基己基、5-丙 基己基、2-甲基庚基、2-乙基庚基、2-丙基庚基、3-甲基庚基、3-乙基庚基、3-丙基庚基、
4- 甲基庚基、4-乙基庚基、4-丙基庚基、5-甲基庚基、5-乙基庚基、5-丙基庚基、6-甲基庚 基、6-乙基庚基、6-丙基庚基、2-甲基辛基、2-乙基辛基、2-丙基辛基、3-甲基辛基、3-乙 基辛基、3-丙基辛基、4-甲基辛基、4-乙基辛基、4-丙基辛基、5-甲基辛基、5-乙基辛基、
5- 丙基辛基、6-甲基辛基、6-乙基辛基、以及6-丙基辛基，其中任何一種可以用一個以上 羥基、羰基、鹵素、磷酸酯、乙?；@、或其組合選擇性地取代。在一些實施方式中，R可以是垸基的烯烴同系物，具有一個以上不飽和的碳-碳鍵。 即，在一些實施方式中，在此描述的R的取代物中任何一個可以是不飽和的。R的不飽和 取代物的例子包括但不限于烯基、鏈烯氧基、鏈烯氧基垸基、鏈烯氧基烷氧基烷基、烯 基氨基烷基、烯基氨基氧基烷基、烯基氧基氨基垸基、膦?；┗?、羧基烯基、羧基烯基
氧基烷基、羧基烯基氨基烷基、羧基烯基酰氨基垸基。該術(shù)語"烯基"指的是C2-22烯基基 團，優(yōu)選<:4.18烯基，更優(yōu)選C6-,8烯基或者Cw4烯基。術(shù)語烯基包括所有的立體異構(gòu)體，
即，順反異構(gòu)體以及E-型和Z-型異構(gòu)體。在一些實施方式中，不飽和的烴基可以包含炔。
該術(shù)語"炔"指的是C2—22炔基團，優(yōu)選(:4_18炔，更優(yōu)選<:6.18炔或者(:7-14炔，其中烴基鏈 中可以存在一個以上三鍵。在一些實施方式中，在此限定的R的取代物中任何一個可以是飽和的。在一些實施方式中，R可以是烷基或芳基的環(huán)狀、多環(huán)、或雜環(huán)衍生物，即，R
是環(huán)垸基、雜環(huán)基、芳基、或雜芳基。在一些實施方式中，環(huán)垸基、雜環(huán)基、芳基或雜芳
基可以用一個以上羥基、羰基、鹵素、磷酸酯、乙?；?、銨、或其組合選擇性地取代。在
一些實施方式中，術(shù)語環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基可以是指雙環(huán)、或三環(huán)。術(shù)語"環(huán)烷基"指的是飽和的或者部分不飽和的環(huán)化烴基。環(huán)垸基基團可以包括
C3—8環(huán)垸基。典型的環(huán)烷基包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基。術(shù)語"雜環(huán)基"或"雜環(huán)"指的是被Si、 O、 N、 P、或其組合所間斷的環(huán)烷基衍
生物。更具體地講，在此使用的術(shù)語"雜環(huán)基"或者"雜環(huán)"指的是飽和的或部分不飽和
的3-7元單環(huán)的、或3-14元雙環(huán)的環(huán)系，該環(huán)系由碳原子和一個到四個獨立地選自由Si、
O、 N、 P或其組合所構(gòu)成的組的雜原子組成。其例子包括但不限于四氫呋喃基、四氫吡
喃基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡唑烷基、二氫呋喃基、嗎啉基、二氫咪唑基、二氫
吡喃基、二氫噁唑基、四氫噁唑基、2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚基、2,5-二氮雙環(huán)[2.2.1]庚基、噁嗪基、異噁嗪基、氧硫雜嗪基(oxathiazinyl)等。雜環(huán)基可以用一個以上甲基、乙基、氧、 鹵代基、羥基、氨基、烷氨基、羥甲基、羥乙基、羥丙基、甲氧甲基、羧基、或其組合選 擇性地取代。在一些實施方式中，術(shù)語"雜環(huán)基"指的是在環(huán)中含有氧的環(huán)垸基，即，環(huán) 醚比如四氫呋喃或四氫吡喃。在一些實施方式中，術(shù)語"雜環(huán)基"指的是在環(huán)中含有氮和 氧的環(huán)烷基。術(shù)語"芳基"指的是任何芳香碳環(huán)結(jié)構(gòu)、或任何具有芳香性的碳環(huán)結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的 芳基包括Cw4芳基，尤其優(yōu)選Qh()芳基，例如苯基或萘基，并且最優(yōu)選六碳芳基。芳基 基團用一個以上甲基、乙基、羥基、烷氧基、氨基、烷氨基、鹵代基、羥甲基、羥乙基、 羥丙基、甲氧甲基、或羧基選擇性地取代。優(yōu)選芳基用一個以上甲基、乙基、鹵代基、羥 甲基、羥乙基、或羧基選擇性地取代。術(shù)語"雜芳基"指的是芳基衍生物，其中芳環(huán)被一個以上Si、 O、 N、 P、或其組 合所間斷。更具體地講，術(shù)語"雜芳基"指的是5-14元雜芳環(huán)系，并且最優(yōu)選五或六元雜 芳環(huán)系，其中在環(huán)狀結(jié)構(gòu)中有一個到四個原子是獨立地選自于由Si、 O、 N、 P或其組合所 構(gòu)成的組的雜原子。其例子包括但不限于四唑基，吡啶基，咪唑基，異惡唑基，呋喃基， 惡唑基，噻唑基，吡咯基，噻吩基，吡唑基，三唑基例如1,2,3-三唑基和1,2,4-三唑基，異 噻唑基，噁二唑基例如1,2，3-噁二唑基、1，2，4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基和1,3,4-噁二唑基， 噁三唑基，噠嗪基，嘧啶基，吡嗪基，三嗪基例如1,2,3-三嗪基和1,2,4-三唑基，喹啉基， 異喹啉基，吲哚基，苯并呋喃基，苯并噻吩基，苯并咪唑基，以及吲唑基。在一些實施方 式中，術(shù)語"雜芳基"指的是在環(huán)中含有氧、氮或兩者的芳基。在一些實施方式中，R是脂肪酸、或脂肪酸的同系物。術(shù)語"脂肪酸"指的是用 羥基、CM烷基、卣代基、或烷氧基選擇性地取代的飽和或不飽和的羧基垸基、羧基烷氧 基烷基、羧基垸基氨基烷基、羧基烷基酰氨基烷基、或其鹽或者酯。在一些實施方式中，
羧基烷基是用一個以上Si、 O、 N、 P、或其組合選擇性地間斷的飽和或不飽和的C2-30的羧
基烷基、C2.2Q的羧基烷基、C2-l8的羧基烷基、C2.l6的羧基烷基、C2.14的羧基垸基、C2-10 的羧基烷基、或C2-8的羧基烷基。在一些實施方式中，羧基烷基是用一個以上Si、 0、 N、 P、或其組合選擇性地取代的C6—3o的羧基烷基、<:6.2()的羧基烷基、Cw8的羧基垸基、C6-16
的羧基烷基、<:6.14的羧基烷基、<:6.1()的羧基烷基、或C6—8的羧基烷基。在一些實施方式中， 羧基垸基是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、十二垸酸、十四酸、十六酸、硬脂酸、二十烷酸、 或二十二烷酸。在一些實施方式中，R是脂肪酸酯，即，R是用酯選擇性地間斷的羧基垸基。用
13酯間斷的羧基烷基的例子包括，但不限于，羧基烷氧基烷基或羧基烷氧基烷氧基烷基。在 一些實施方式中，R是脂肪酸的鏈烷酰胺衍生物，即，R是用酰胺基間斷的羧基垸基。例 如，在一些實施方式中，R是羧基烷基酰氨基或羧基烷基酰氨基垸基。在一些實施方式中，
R是乙氧基化的脂肪酸。在本發(fā)明中，R可以是用Si、 O、 N、 P、或其組合選擇性地間斷的脂肪酸衍生物， 即，在一些實施方式中，R是用Si、 O、 N、 P、或其組合選擇性地間斷的羧基烷基。在一 些實施方式中，R是用鹵素選擇性地取代的羧基垸基。在一些實施方式中，R是荷電的羧 基垸基，S卩，R是脂肪酸的陰離子或陽離子衍生物。在一些實施方式中，R是醇類或醇類衍生物。例如，R可以是烷基酚、或醇類的 酯。在一些實施方式中，R是用Si、 O、 N、 P、或其組合選擇性地間斷、用鹵素選擇性地 取代、或兩者的醇類或酚類。在一些實施方式中，R是烷基的酯或聚酯衍生物。例如，在一些實施方式中，R 是飽和或不飽和的烷氧基烷基、烷氧基烷氧基烷基、或垸氧基垸氧基烷氧基烷基，優(yōu)選C2.20
的烷氧基烷基、C2.20的烷氧基垸氧基院基、或C2.20的烷氧基垸氧基烷氧基垸基；Cw6的烷 基、C^6的烷氧基烷基、C5-,6的烷氧基垸氧基烷基、C5—,6的烷氧基烷氧基烷氧基垸基；或 Cw4的烷氧基垸基、C7.,4的垸氧基垸氧基烷基、或Cw4的烷氧基烷氧基烷氧基垸基；其中 的任何一種可以用一個以上羥基選擇性取代。在一些實施方式中，術(shù)語"聚酯"是一種具 有通式[(CHq) nC02Xp]m的化合物，其中，X是Cmo院基、Q-k)烯基、或d-h)烷氧基烷
基；p是0或l; q是l或2; n是1-10;而m是1-100，優(yōu)選1-20或1-10。在一些實施方 式中，烷基的酯或聚酯衍生物用一個以上羥基選擇性地取代。在一些實施方式中，R是聚氧化烯。術(shù)語"聚氧化烯"指的是被兩個以上氧原子 間斷的亞烷基主體分子或分子部分。在一些實施方式中，術(shù)語"聚氧化烯"指的是Q.2！、 Ow4的聚氧化烯或者d.M、 Ow的聚氧化烯。適合本發(fā)明的聚氧化烯的例子包括，但不限 于聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、聚氧化丁烯、聚氧化戊烯、聚氧化己烯、聚氧化庚烯、或 聚氧化辛烯。在一些實施方式中，R是兩種以上下述基團的共聚物聚氧化乙烯、聚氧化
丙烯、聚氧化丁烯、聚氧化戊烯、聚氧化己烯、聚氧化庚烯、或聚氧化辛烯基團。在一些
實施方式中，R是具有其他有機或無機部分的乙氧基化的共聚物。在一些實施方式中，R可以是烷基的聚胺、氧化胺、胺類乙氧基化物及其他胺的 衍生物。術(shù)語"聚胺衍生物"指的是其中烷基鏈上兩個以上碳原子用氮替換的烷基鏈。該 術(shù)語還包括單烷基胺和二烷基胺。術(shù)語"氧化胺衍生物"指的是其中烷基鏈上兩個以上碳原子用氮和氧(即，-N-O-)替換的烷基鏈。例如，R可以是垸基氨基氧基烷基、羧基烷基 氨基氧基烷基、烷基氨基氧基烷基、或烷氧基氨基烷基。在一些實施方式中，聚胺衍生物 或者氧化胺衍生物用乙氧基化物選擇性地取代。在一些實施方式中，R是硅基聚合物。術(shù)語"硅基聚合物"指的是被連接的單體，
各個單體含有至少一個硅原子。例如，術(shù)語"硅基聚合物"可以包括，但不限于硅氧垸、
硅酮、或碳硅烷。在一些實施方式中，硅基聚合物可以是用不含硅的末端基團進行末端封 閉的聚合物。在一些實施方式中，R是直鏈、支鏈、或環(huán)狀硅氧烷。在一些實施方式中，R是 用一個以上羥基、羰基、垸基、鹵素、鹵代垸基、羥基烷基、磷酸酯、乙?；@、或其 組合選擇性地取代的硅氧烷。在一些實施方式中，R是Siw卜Ow!的硅氧烷、Si3.14、 03.|4 的硅氧烷、或Siwo、 05-|()的硅氧垸。在其他實施方式中，R是碳硅垸。術(shù)語"碳硅烷"指 的是一種在其骨架上具有碳和硅的聚合物。在一些實施方式中，R是用一個以上羥基、羰 基、烷基、鹵素、鹵代烷基、羥垸基、磷酸酯、乙酰基、銨、或其組合選擇性取代的碳硅 烷。在一些實施方式中、R是Si"2,、 C^的碳硅烷；Si3-14、 Cw4的碳硅垸；或Siwo、 C5.10 的碳硅烷。在一些實施方式中，硅氧垸或碳硅烷是末端封閉的，例如，用乙烯基或硅垸酮 末端封閉。在一些實施方式中，R是用一個以上烷基、鹵素、鹵代垸基、羥基烷基、或其 組合選擇性取代的硅氧烷或碳硅烷。例如，在一些實施方式中，硅氧烷或者碳硅烷可以是 甲基、乙基、丙基、丁基、或戊基取代物，或者是它們的組合物。在一些實施方式中，R包含具有聚醚、聚酯、多元醇、聚胺、聚氨酯、聚氧化乙 烯、聚氧化丙烯、以及其他聚合部分的硅酮共聚物。例如，在一些實施方式中，R是用一 個以上聚酯、多元醇、聚胺、聚氨酯、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、或其組合選擇性取代的 硅氧垸或者碳硅烷。本發(fā)明的硅氧烷或碳硅垸可以包括它們的鹽、醚、以及酯。在一些實 施方式中，R是荷電的硅氧垸或碳硅垸，例如，硅氧烷的陽離子衍生物或陰離子衍生物。 在一些實施方式中，R是硅氧垸或碳硅烷的鹽，例如，銨鹽。在一些實施方式中，R包含 用長鏈酯、長鏈醇、長鏈胺、或其組合衍生的硅酮。通過本發(fā)明可以提供多種X官能團。在一些實施方式中，X是硫或磷的氧代陰離 子或氧化物、氮的氧代陰離子或羰基衍生物、羧酸酯、硼酸鹽、或硅酸酯。在一些實施方 式中，X是硫酸酯、磺酸、磺酸酯、亞硫酸酯、亞砜、?；撬猁}、磺基丁二酸酯、磺化甜 菜堿、硫酸甜菜堿、氨磺酰、磷酸酯、磷酸基、膦?；?、磷酰基、硝酸酯、亞硝酸酯、氨 基、亞氨基、異氰基、異硫氰基、乙酰胺基、乙酰亞胺基、疊氮基、重氮基、氰基、氰酰
15基、烷基羧酸酯、丙烯酸酯、癸二酸酯、鄰苯二甲酸酯、硼酸鹽、四硼酸鹽、正硅酸酯、 硅酸鹽、硅酸金屬鹽、亞氯酸鹽、氯化物、碘化物、碘酸鹽、溴化物、溴酸鹽、氟化物、 或氟酸鹽。在一些實施方式中，X是硫酸酯、磺酸、磺酸酯、磺基丁二酸酯、或?；撬猁}。
在一些實施方式中，X是含有硫原子的官能團。其例子包括，但不限于，任何含 有硫酸酯、磺酸酯或磺酸的官能團。術(shù)語"硫的氧代陰離子或氧化物"指的是硫酸酯、磺 酸、磺酸酯、亞硫酸酯、牛磺酸鹽、磺基丁二酸酯、磺化甜菜堿、氨磺酰、甲氧基甲酰胺、 氨磺酰、或次磺酰。在本發(fā)明的一些實施方式中，X可以是任何含有鹵素的官能團。其例子包括，但 不限于，任何含有氯、氟、溴、碘基團、或其組合的官能團。在一些實施方式中，X可以 是亞氯酸鹽、氯化物、碘化物、碘酸鹽、溴化物、溴酸鹽、氟化物或氟酸鹽。
在本發(fā)明的一些實施方式中，X可以是任何含有氮的官能團。其例子包括，但不 限于，任何含有硝酸酯、亞硝酸酯、硝胺、氨基、亞氨基、異氰酸基、異硫氰基、乙酰胺 基、乙酰亞胺基、疊氮基、重氮基、氰基、氰?；?、亞硝基、亞硝基亞氨基、硝氨基、硝 基、或其組合的官能團。在一些實施方式中，X可以是任何含有磷的官能團。術(shù)語"磷的氧代陰離子或氧 化物"指的是磷酸酯、磷酸基、膦酰基、磷酰基、或膦基。在一些實施方式中、X是羧酸酯、丙烯酸酯、癸二酸酯、鄰苯二甲酸酯、醋酸酯、 或氧化物。在一些實施方式中，X可以是任何含有硼的官能團。其例子包括，但不限于， 硼酸鹽、過氧化硼酸鹽、四硼酸鹽、或硼垸酸酯。在本發(fā)明中，X可以是任何含有硅原子的官能團。其例子包括，但不限于，硅烷、 正硅酸酯、硅酸鹽、或硅酸金屬鹽。篩選出許多穩(wěn)定劑以確定其(視需要)可以代替垸基胺含氟表面活性劑，并且對 測定準確度也沒有負面影響。不受理論限制，我們假定穩(wěn)定劑可以保持樣品中游離的分析 物和被結(jié)合的分析物之間的比率，從而抑制在主體的生物流體中或體外體系中發(fā)現(xiàn)的游離 的未結(jié)合的分析物相對被結(jié)合的分析物平衡的失調(diào)。在一種實施方式中，穩(wěn)定劑包含通式RX，其中，R包括含有烷基、芳基、脂肪酸、 醇類、酯、醚、氧基烷基化物、或硅氧烷的化學基團，而X包括含有硫的化學基團。當 RX包含鹵素時，鹵素部分可以是任何鹵素，例如，F(xiàn)、 Cl、 Br、或I，附帶條件是本發(fā)明 不包含烷基胺含氟表面活性劑比如FC100。在一種實施方式中，本發(fā)明將穩(wěn)定劑識別為烷基醇類衍生物化合物，例如2-乙基-己基硫酸酯(EHS)。這樣的烷基醇類衍生物化合物的一般化學結(jié)構(gòu)是C。H2n+,X，其中，n 為約6至約18;而X是硫酸酯衍生物，例如，對于2-乙基-己基硫酸鈉鹽的S04-Na+，其 具有化學結(jié)構(gòu)CH3(CH2)3CH(C2H5)CH2OS03"Na+。 X也可以是任何圖2中基團X欄公開 的含硫基團。適用于本發(fā)明的其他穩(wěn)定劑包括1-己烷磺酸或其鹽(例如，Na+鹽)；1-庚垸磺 酸或其鹽(例如，Na+鹽)；1-辛烷磺酸或其鹽(例如，Na+鹽)；1-癸烷磺酸或其鹽(例 如，Na+鹽)；<:14-16烯烴磺酸鈉(CAS# 68439-57-6);十二烷基硫酸鈉；二辛磺基琥珀酸
鈉；N-油基-N-甲基?；撬徕c；聚氧化乙烯月桂垸硫酸鈉(分子量346);烷基苯甲基磺
酸胺鹽(分子量385);以及乙基-己基硫酸鈉。本發(fā)明提供了新的并且有用的組合物，用于液體中游離的或未結(jié)合的分析物的濃 度的診斷測量。在一些實施方式中，分析物存在于生物流體中。生物流體可以是血漿或者 血清。其也可以由精液、唾液、尿液、糞便液、腦脊髓液、或胃液組成。然而， 一般來講， 生物流體是血漿或血清。本發(fā)明的組合物也可以在包括細胞培養(yǎng)上清液或濾液的體外體系 中使用。術(shù)語"生物流體"包括來自生物學有機體的液體，以及衍生于生物學有機體的液 體，例如，已經(jīng)被分級、稀釋、化學方法改變、或其組合的液體。分析物可以是任何小分子，例如，但不限于，激素、藥物、或維生素。在一些實 施方式中，分析物以在游離的未結(jié)合狀況與結(jié)合狀況(例如被蛋白質(zhì)結(jié)合)之間的平衡狀 態(tài)存在。例如，分析物可以是甲狀腺激素或維生素B12。適用于本發(fā)明的其他分析物包括 下述種類的脊椎動物激素
胺類激素
a. 酪氨酸衍生物(簡單的芳香環(huán))
-兒茶酚胺(例如腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺)。
-甲狀腺激素(例如，T4，或者T3、 T2、以及T1的異構(gòu)體)。
b. 色氨酸衍生物(多環(huán)和雜環(huán)的芳香化合物) -褪黑素、5-羥色胺。
肽類激素
a.小肽，例如
-具有6個氨基酸殘基的血管緊張素IV、分別具有7個和8個氨基酸的血管緊張素 III和血管緊張素II。由于小分子的大小，這些肽可能會與血漿載體分子比如蛋白質(zhì)結(jié)合起 來。-大腦利鈉劑的肽(BNP)，有32個氨基酸。其他利鈉劑的肽類激素包括心房的利 鈉劑的肽(ANP)和C型利鈉劑的肽(CNP)。
-降血鈣素，是32個氨基酸的肽，來源于前體--前降血f丐素(procalcitonin)。 -促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)，具有39個氨基酸。 -胰島素，是51個氨基酸的肽。
-甲狀旁腺激素(PTH)，有84個氨基酸。PTH還可以以具有不同臨床應(yīng)用的數(shù)種 不同的片段出現(xiàn)完整的PTH; N-末端PTH;中等分子PTH、以及C-末端PTH。
b.大肽(大肽在蛋白質(zhì)多聚體分解后或者分裂以后可以產(chǎn)生較小蛋白質(zhì)分子。這些
較小分子可以在與載體分子的平衡中循環(huán))，例如
-促卵泡激素(FSH)。
-促黃體生成激素(LH)。-促甲狀腺激素(TSH)。
-絨毛膜促性腺激素(例如hCG)。
-促甲狀腺激素釋放激素(TRH)。-催乳激素(PRL)。
-促紅細胞生成素(EPO)。
甾族化合物或固醇類激素本發(fā)明可用于具有與結(jié)合于血漿轉(zhuǎn)運分子比如蛋白質(zhì)的 形式相平衡的游離形式的那些甾族化合物或固醇類激素。游離形式是生物學活性的并且具 有臨床應(yīng)用性。
a.甾體激素，例如
-皮質(zhì)醇約4%的循環(huán)性皮質(zhì)醇是游離的，因此對受體有用。剩余的皮質(zhì)醇結(jié)合于
包括皮質(zhì)類固醇結(jié)合球蛋白(CBG)和白蛋白在內(nèi)的蛋白質(zhì)上。
-睪丸激素約2-3%的循環(huán)性睪丸激素是游離的；其余的睪丸激素結(jié)合于包括性激
素結(jié)合蛋白(SHBG，約44%)和皮質(zhì)醇結(jié)合球蛋白(CBG，約3.5%)在內(nèi)的睪丸酮結(jié)合 蛋白上，以及結(jié)合于白蛋白(約50%)上。
-脫氫表雄甾酮(DHEA)。較小百分比的DHEA以游離形式存在，雖然大多數(shù)DHEA 被較強地結(jié)合于性類固醇結(jié)合球蛋白上并且被較弱地結(jié)合于皮質(zhì)類固醇結(jié)合球蛋白和白 蛋白上。
-黃體酮較小百分比的黃體酮以游離形式存在，雖然大多數(shù)黃體酮被結(jié)合于皮質(zhì) 醇結(jié)合球蛋白和白蛋白上。
-雌三醇雌三醇以游離形式或者與性激素結(jié)合蛋白結(jié)合的形式存在。-雌二醇約1-3%的循環(huán)性雌二醇是游離的，而其余的雌二醇較強地結(jié)合于雌激素 結(jié)合球蛋白上。
b.固醇類激素
-維生素D衍生物。
-鈣三醇。術(shù)語"甲狀腺激素"指的是甲狀腺素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3) 、 二碘甲狀 腺原氨酸(T2)、 一碘甲腺原氨酸(Tl)、及其組合物。應(yīng)理解，甲狀腺激素可以由它們 的鹽、它們的L-型或D-型對映體、或它們的去碘化形式和同分異構(gòu)形式組成。
為本發(fā)明的目的，應(yīng)理解，術(shù)語"分析物"包含特定分析物的所有對映體和異構(gòu) 體，其或在混合物中、或在均一的環(huán)境中。對于生物流體中的分析物，分析物可以外源地 或內(nèi)源地產(chǎn)生。在一些實施方式中，分析物可以是在生物流體中，該生物流體來自靈長類 動物比如猿、猴子、猩猩、狒狒、長臂猿、以及黑猩猩；犬科動物比如狗和狼；貓科動物 比如貓、獅子、以及老虎；馬科動物比如馬、驢、以及斑馬；食用動物比如牛、豬、以及 綿羊；以及兔子、小鼠、大鼠、豚鼠、以及白鼬。分析物還可以是在液體中，該液體來自 模型動物，例如，疾病模型動物比如小鼠、大鼠、或其他的實驗動物；有經(jīng)濟價值的動物， 例如，經(jīng)濟性重要的種畜、競賽動物、展示動物、古老性動物、稀有動物或者瀕于滅絕的 動物、或伴生動物。特別地，分析物存在于來自人類的生物流體。在此使用的術(shù)語"主體" 指的是包括人類和非人類在內(nèi)的任何哺乳動物，例如，但不限于，馴養(yǎng)的動物和家畜、動 物園動物、體育動物、以及寵物。穩(wěn)定劑可以被并入試劑緩沖液、或洗滌緩沖液、或兩者中。還可以將其與捕獲配 體混合。在其他的實施方式中，其可以是單獨的溶液。在一種實施方式中，本發(fā)明的目的在于提供一種用于測量分析物濃度的測定的組
合物。在一些游離分析物的實施方式中，組合物包括捕獲配體和穩(wěn)定劑。捕獲配體是對分析物特異的，并且可以包含任何能夠選擇性地結(jié)合所研究的游離
分析物的物質(zhì)。捕獲配體的例子包括，但不限于抗體，抗體片段，抗體仿制品，或分析
物特異性結(jié)合蛋白質(zhì)比如內(nèi)因子或葉酸(folate)結(jié)合蛋白、及其組合物。在此使用的術(shù)語"抗體"應(yīng)包括所有的形式，例如，但不限于多克隆、單克隆、
純化的IgG、純化的IgM、純化的IgA、或其組合物；單鏈抗體(美國專利No. 4,946,778)、
嵌合或人源化抗體(Morrison et al.， 1984, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851; Neuberger et al.,
1984, Nature 81:6851)和互補確定的區(qū)域(CDR;參見Verhoeyen和Windust，分子免疫學(第二版)，B. D. Hames和D. M. Glover, IRL出版社，奧克斯福德大學出版社，1996， 第283-325頁)。術(shù)語"抗體片段"包括，但不限于片段比如Fv、單鏈Fv (scFv) 、 F(ab')2， 以及Fab片段(Harlow和Leon, 1988，抗體，冷泉港(Cold Spring Harbor))。本發(fā)明
的抗體和抗體片段可以通過任何慣常的方法得到，例如，但不限于，《抗體》實驗手冊
(E. Harlow, D, Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的方法。將其全部 內(nèi)容引入本發(fā)明作為參考。術(shù)語"抗體仿制品"指的是模仿抗體功能的化合物?？贵w仿制品通常尺寸較小， 使其避免引起免疫原性響應(yīng)。有數(shù)種方法可獲得這些抗體仿制品的如下結(jié)構(gòu)和制品，比如 可選的蛋白質(zhì)骨架；包括RNA的結(jié)構(gòu)；非天然的低聚體比如苯二氮、e-轉(zhuǎn)角仿制品、蛋 白酶抑制劑和嘌呤衍生物；非天然的生物高聚物比如寡聚氨基甲酸鹽、寡聚尿和低聚砜； 以及如Hsieh-Wilson等((1996) Ace. Chem Res. 29:164-170)和美國專利No. 5,770,380所 述的多種取代物與架構(gòu)比如氧雜蒽和立方烷的連接體術(shù)語"內(nèi)因子"指的是為吸收維生素B,2所必需的糖蛋白。在一些實施方式中，術(shù) 語"內(nèi)因子"指的是人類內(nèi)因子。術(shù)語"分析物特異性結(jié)合蛋白質(zhì)"可以包括任何特異性地結(jié)合分析物的非抗體的 蛋白質(zhì)。分析物與它們的分析物特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的例子包括，但不限于甲狀腺素/甲狀 腺素結(jié)合球蛋白；酶抑制劑、輔酶或輔助因子/酶；皮質(zhì)醇/皮質(zhì)醇結(jié)合蛋白；維生素B12/ 內(nèi)因子；以及葉酸/葉酸鹽結(jié)合蛋白。在一些實施方式中，分析物特異性結(jié)合蛋白質(zhì)是捕獲 配體。在一些實施方式中，分析物特異性結(jié)合蛋白質(zhì)是葉酸鹽結(jié)合蛋白或內(nèi)因子。
在一種實施方式中，本發(fā)明的組合物可以包含捕獲配體、穩(wěn)定劑，并且可以進一 步包含鹽比如銨鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋅鹽、氯化物鹽、羧酸鹽、磷酸鹽、無機 的硫酸鹽、或其組合物。在一種實施方式中，本發(fā)明的目的在于提供一種用于測量分析物濃度的測定的組 合物。在一些實施方式中，分析物作為游離的分析物和被結(jié)合的分析物存在，并且本發(fā)明 的目的在于提供一種測量游離分析物濃度的測定方法。術(shù)語"游離分析物"指的是未被或 者特異性地或者非特異性地結(jié)合于除捕獲配體之外的其它分子種類比如蛋白質(zhì)上的分析 物。因此，在液體中游離的分析物未與其它分子種類相連接。術(shù)語"被結(jié)合的分析物"指 的是或者特異性地或者非特異性地與除捕獲配體之外的其它分子種類比如蛋白質(zhì)相聯(lián)接 的分析物。在一些實施方式中，為穩(wěn)定游離分析物與被結(jié)合的分析物的比率，本發(fā)明使用 一種以上包含通式RX的穩(wěn)定劑。
穩(wěn)定劑可以以各種濃度存在。在此當描述穩(wěn)定劑的濃度時，術(shù)語"體積百分數(shù)" 指的是每單位體積最終組合物中穩(wěn)定劑的體積。術(shù)語"最終組合物"指的是包含捕獲配體 和穩(wěn)定劑的組合物。因此，例如，如果將l mL的穩(wěn)定劑加入49mL的洗滌緩沖液中，并 且將穩(wěn)定劑/洗滌緩沖液置于50 mL含有分析物和捕獲配體的溶液中，那么體積百分數(shù)將為 1%的穩(wěn)定劑(即，在100 mL最終組合物中有1 mL穩(wěn)定劑)。在最終組合物中穩(wěn)定劑的 合適的體積百分數(shù)包括，但不限于，約0.00001至約0.5體積百分數(shù)、約0.00005至約0.4 體積百分數(shù)、約0.00009至約0.3體積百分數(shù)、約0.0001至約0.1體積百分數(shù)、約0.0002 至約0.2體積百分數(shù)、或約0.00015至約0.15體積百分數(shù)，其中，上述體積百分數(shù)是以最 終組合物的總體積為基礎(chǔ)的。因為分析物對于其分析物特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合親合力確 定了在游離分析物和被結(jié)合的分析物形式之間的平衡，故本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以以逐次情 形為基礎(chǔ)優(yōu)化用于特定分析物的穩(wěn)定劑的百分比。還可以以每升最終組合物中穩(wěn)定劑摩爾的形式測量穩(wěn)定劑的濃度。在最終組合物 中穩(wěn)定劑的濃度通常可以是約1至約900微摩爾、約5至約850微摩爾、約25至約800 微摩爾、約40至約800微摩爾、約5至約750微摩爾、約30至約700微摩爾、或約25 至約600微摩爾。在穩(wěn)定劑是EHS的實施方式中，在最終組合物中EHS的體積分數(shù)通常是約0.0001 至約0.05體積百分數(shù)、約0.0005至約0.04、約0.0009至約0.03、約0.001至約0.02、約 0.002至約0.019、約0.004至約0.015、或約0.005至約0.01體積百分數(shù)，其中，上述體積 百分數(shù)是以最終組合物的總體積為基礎(chǔ)的。在穩(wěn)定劑是EHS的實施方式中，在最終組合物中EHS的濃度通?？梢允羌s50至 約800微摩爾、約100至約750微摩爾、約150至約700微摩爾、約150至約650微摩爾、 約200至約600微摩爾、約250至約550微摩爾、或約300至約500微摩爾。
就本發(fā)明的方法而言，應(yīng)理解，穩(wěn)定劑可以或者當樣品剛一與對分析物特異的捕 獲配體混合時就存在、或者此后立即存在。例如，可以將穩(wěn)定劑依序加入下述樣品與對分 析物特異的捕獲配體的組合物，該捕獲配體作為試劑緩沖液、洗滌緩沖液、或兩者的成分。
在某些實施方式中，本發(fā)明的目的還在于提供一種測定游離分析物濃度的方法， 該方法包含
(a) 將用于游離分析物的捕獲配體加入容器；
(b) 將穩(wěn)定劑加入容器；
(c) 將包含游離分析物的樣品加入容器；(d) 將檢測體系加入容器；以及
(e) 通過使用檢測體系，測量樣品中游離分析物的濃度。應(yīng)當承認，用于測量游離分析物濃度的方法的步驟可以以各種依序的順序進行，附帶條件是步驟(e)必須是最后的步驟。因此，例如，步驟(b)可以先于步驟(a)、步驟(c)可以先于歩驟(b)、或兩者皆有。在一些實施方式中，容器可以包括小瓶、試管、反應(yīng)混合容器、微孔板孔、橫向流動體系薄膜、或其他的液體流動系統(tǒng)中的穩(wěn)定環(huán)節(jié)。在此使用的術(shù)語"檢測體系"指的是一種以上已知的直接或間接地檢測分析物的體系中的成分。在一些實施方式中，檢測體系包含放射免疫測定、酶聯(lián)免疫吸附測定、酶免疫測定、化學發(fā)光免疫測定法、生物發(fā)光免疫測定法、或熒光免疫測定法中的成分。這樣的檢測體系在文獻中眾所周知。在一些實施方式中，檢測體系包含涂敷有捕獲配體特異性結(jié)合分子、可檢測的標簽、或其組合的順磁性顆粒。在一些實施方式中，捕獲配體特異性結(jié)合分子具有半抗原特異性，并且捕獲配體是半抗原化物。例如，在一些實施方式中，半抗原是生物素。在一些實施方式中，捕獲配體特異性結(jié)合分子選自下組鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、生物素特異性抗體、生物素特異性抗體片段、以及生物素特異性抗體仿制口n o在一些實施方式中，檢測體系包含可檢測的標簽。這里使用的術(shù)語"可檢測的標簽"具有本技術(shù)領(lǐng)域普通的意思，并且指的是原子(例如，放射性核)、分子(例如，熒光素)、或復(fù)合物，該復(fù)合物或者可以被用于檢測(例如，基于物理或化學性質(zhì))或者可以被用于指示分子的存在、或者被用于顯示另一個分子對其的結(jié)合，所述結(jié)合是共價結(jié)合或其他方式的聯(lián)接。術(shù)語"標簽"還指被共價結(jié)合或以其他方式聯(lián)接的作用于底物上以產(chǎn)生可檢測的原子、分子或者復(fù)合物的分子(例如，生物分子比如酶)。適用于本發(fā)明的可檢測的標簽包括任何可通過光譜的、光化學的、放射性的、生物化學的、免疫化學的、電的、光學的或者化學的方法檢測的組合物。在本發(fā)明中有用的標簽包括熒光染料(例如，熒光素、德克薩斯紅、若丹明、綠色熒光蛋白、增強綠色熒光蛋白、麗絲胺、藻紅蛋白、Cy2、 Cy3、 Cy3.5、 Cy5、 Cy5.5、Cy7、氟X、 SyBR綠I和II[分子探針]等)、放射性同位素示蹤(例如，3H、 125I、 35S、 14C、或34)、酶(例如，水解酶，特別是磷酸酯酶比如堿性磷酸酶；酯酶和糖苷酶；或氧化還原酶，特別是過氧化物酶例如辣根過氧化酶；以及其它在ELISA中常用的酶)、底物、輔助因子、抑制劑、化學發(fā)光基團、顯色劑、以及比色標簽例如膠態(tài)金或者有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠。用于檢測這些標簽的技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的。因此，例如，通過使用閃爍計數(shù)器可以檢測出放射性同位素示蹤；通過使用光檢測器來檢測發(fā)射光可以檢測出化學發(fā)光標簽和熒光標記(例如，在熒光激活細胞分類術(shù)中使用)。典型地，通過向酶提供底物并且檢測通過酶作用于底物而產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物，可檢測酶催化標簽。并且通過簡單地顯像有色標簽可檢測比色標簽。因此，標簽可以是任何可通過光譜的、光化學的、放射性的、生物化學的、免疫化學的、電的、光學的或者化學的方法檢測的組合物。該標簽可以被直接或間接地偶聯(lián)于根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的方法的測定中的期望成分。非放射性標簽經(jīng)常是通過間接手段而被附接。在一些實施方式中，可檢測的標簽或者是原有地可檢測，或者共價結(jié)合于信號產(chǎn)生體系比如可檢測的酶、熒光化合物、或化學發(fā)光化合物(例如，用于游離T4的競爭性免疫測定中的T4-ALP或T3-ALP)，該標簽與分析物(例如，液體樣品中的游離T4)相競爭，用于結(jié)合捕獲配體(例如，T4-特異性的單克隆抗體)。在一些實施方式中，捕獲配體可以被直接地固定在固相上。在一些實施方式中，捕獲配體可以被生物素化，其用于通過與捕獲配體特異性結(jié)合分子比如鏈霉抗生物素蛋白或生物素特異性的單克隆抗體相結(jié)合而間接地固定在固相上。如果分析物具有天然的分析物特異性結(jié)合分子，那么在檢測體系中，這樣的分析物可以通過使用分析物或分析物類似物的被標記的形式、或者分析物特異性結(jié)合分子的形式而被檢測或者被測量。在一些實施方式中，捕獲配體(例如，內(nèi)因子(IF)特異性的單克隆抗體)與分析物(例如，維生素B12)相競爭，用于結(jié)合天然的、對分析物特異的可檢測的標簽(例如，用于維生素B12的競爭性免疫測定中的IF-ALP)。在一些實施方式中，捕獲配體可以被直接地固定在固相上。在一些實施方式中，捕獲配體可以被生物素化，其用于通過與捕獲配體特異性結(jié)合分子比如鏈霉抗生物素蛋白或生物素特異性的單克隆抗體相結(jié)合而間接地固定在固相上。該可檢測的標簽或者是原有地可檢測，或者共價結(jié)合于信號產(chǎn)生體系比如可檢測的酶、熒光性化合物、或化學發(fā)光化合物上。這樣的可檢測的標簽可以被直接地接合于信號產(chǎn)生化合物上，例如，與酶或熒光團相接合。用于檢測標簽的技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的，并且包括，但不限于化學發(fā)光試劑、比色試劑、能量轉(zhuǎn)移劑、酶、酶反應(yīng)底物、熒光劑或放射性同位素的使用。酶可以選自含有下述酶的組堿性
磷酸酶、淀粉酶、熒光素酶、過氧化氫酶、e-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6 -脫氫酶、己糖激酶、辣根過氧化物酶、內(nèi)酰胺酶、尿素酶和蘋果酸脫氫酶。底物包含在先標簽已知對其會起作用的那些分子基團。在本發(fā)明的一些實施方式中，捕獲配體被固定在固相上。固相可以由蛋白質(zhì)偶聯(lián)表面組成，包括例如，微孔板、膠態(tài)金屬顆粒、氧化鐵顆粒、聚合物小球、納米顆粒或微粒。另外，固相可以由在分離系統(tǒng)(例如分餾、沉淀、或離心)中起固相作用的化合物或分子聚集物組成。在某些實施方式中，本發(fā)明的目的還在于提供一種用于估計游離分析物濃度的試劑盒，該試劑盒包含
(a) 用于游離分析物的捕獲配體；
(b) 穩(wěn)定劑；以及(C)檢測體系。在一些實施方式中，試劑盒還包含(d)參考標準。取決于所研究的分析物，可
以使用各種參考標準。 一般來講，參考標準包含具有已知濃度并且被用于估計特定待測分析物濃度的分析物或其類似物。該參考標準可以包含純化的分析物、重組體、天然的或合成的分析物、藥物、激素或維生素。參考標準基質(zhì)的基質(zhì)部分包含可以近似于待測樣品中分析物的環(huán)境的生物流體或合成液體。在一個特定的實施方式中，通過使用2-乙基-己基硫酸酯(EHS)和/或相關(guān)化合物作為穩(wěn)定劑，本發(fā)明提高了測量游離的非蛋白質(zhì)結(jié)合的甲狀腺激素濃度的測定精度。本發(fā)明進一步提高了測量存在于主體體液的甲狀腺激素中有生物利用價值的部分或游離部分的診斷精度。通過穩(wěn)定化體液比如血清或血漿中固有的游離的非蛋白質(zhì)結(jié)合的激素與蛋白質(zhì)結(jié)合的激素的平衡性，帶來濃度精度測量的提高。在本實施方式中，本發(fā)明使用磺化或硫酸酯化小分子作為穩(wěn)定劑的陰離子鹽成分。通常，硫酸酯或者磺酸酯比如8-苯胺基萘-l -磺酸酯(ANS)被用于替換被蛋白質(zhì)結(jié)合的分析物，以便測量全部(結(jié)合的+游離的)激素。因此，可預(yù)料到具有磺酸酯或硫酸酯基團的分子作為穩(wěn)定劑而包含入組合物會導(dǎo)致在游離激素組分或者過量樣品診斷誤差方面的人為的增加。因此，本發(fā)明是料想不到的。在本實施方式中，通過作為穩(wěn)定劑而被加入至測定反應(yīng)，具有磺酸酯或硫酸酯基團的表面活性劑或者非表面活性劑提高了免疫測定的一致性。不受理論限制，假定用于能夠使游離的甲狀腺激素濃度測量精確化的機制是通過在反應(yīng)早期添加EHS、或其他小鏈(6至18個碳)陰離子硫酸酯或者磺酸酯，穩(wěn)定了游離激素與被結(jié)合激素間的平衡性。在各種硫酸酯化或者磺化化合物中，具有空間利用性的硫酸酯或磺酸酯的那些化合物作為合適的穩(wěn)定劑而起作用。在一些實施方式中，其他對于合適的穩(wěn)定劑重要的因素通過通式RX進行描述，其中，R包含短鏈碳氫化合物(使分子一端具有疏水性)；并且其中X包含較小的親水基，例如，含有一個以上氧原子的較小的化學基團。并非限制性的圓1和圖2顯示了一些可以被組合從而形成本發(fā)明穩(wěn)定劑的不同的R基團和X基團。
在本發(fā)明的一種實施方式中，分析物是甲狀腺激素。下面是關(guān)于甲狀腺激素應(yīng)注意的興趣點。
1. 甲狀腺素(T4)是由甲狀腺產(chǎn)生的必需激素。在甲狀腺中三碘甲腺原氨酸(T3)可以直接地從甲狀腺球蛋白中釋放，但是大多數(shù)T3是在身體其他部分中通過甲狀腺素脫碘而制造出來的。
2. 經(jīng)過與酶-甲狀腺過氧化酶(thyr叩eroxidase)反應(yīng)，碘被共價結(jié)合于甲狀腺球蛋白分子中的酪氨酸殘基，形成一碘酪氨酸(MIT)和二碘酪氨酸(DIT)。通過連接DIT的兩個部分，甲狀腺素被制造出來。--分子MIT和一分子DIT的組合產(chǎn)生了三碘甲腺原氨酸。在甲狀腺球蛋白上MIT和DIT被原位形成，作為T4和T3激素的無活性的前體。在溶酶體消化液中蛋白酶碘化了甲狀腺球蛋白，釋放T3和T4。 MIT和DIT還是蛋白水解作用的產(chǎn)物，但是它們被碘化酪氨酸脫鹵素酶原位降解。
3. 除T4和T3之外的甲狀腺的其他組成包括二碘甲腺原氨酸(T2)和一碘甲腺原氨酸(Tl)。
4. 甲碘安(Thyronamine)是甲狀腺激素-甲狀腺素(T4)和3,5，3'-三碘甲腺原氨酸(T3)
的脫去羧基和去碘酸化的代謝產(chǎn)物。
5. 在甲狀腺中的濾泡細胞合成含有碘的甲狀腺激素、T4和T3;甲狀腺中的甲狀濾泡旁細胞產(chǎn)生降鈣素，其為由較大的多肽前降血鈣素裂解來的32個氨基酸的肽類激素。
血液中的甲狀腺素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3) 、 二碘甲腺原氨酸(T2)、以及一碘甲腺原氨酸(ti)可以被結(jié)合于血清蛋白，因此僅一小部分可以以游離的無蛋白質(zhì)結(jié)合的形式、或者稱為有生物利用價值的部分而被分配。該游離物的含量在主體甲狀腺疾病狀態(tài)下或增或減。例如，在甲狀腺機能減退癥中，血液中游離的無蛋白質(zhì)結(jié)合的小部分被減?。环粗?，在甲亢中，無蛋白質(zhì)結(jié)合的小部分被提高。游離甲狀腺素(FT4)測試被用作甲狀腺功能的直接測量法，并且通常被內(nèi)科醫(yī)師要求作為繼續(xù)的、或與促甲狀腺激素(TSH)測試同時使用，以便確定主體的甲狀腺狀態(tài)是否是甲狀腺機能正常(健康的甲狀腺功能)、甲狀腺功能減退或者甲狀腺功能亢進。然而，與誤導(dǎo)性的TSH測量法相比較，其更普遍地會遭遇誤導(dǎo)性的FT4測試。這是因為結(jié)合蛋白固有地依賴于所有游離的無蛋白質(zhì)結(jié)合的甲狀腺激素及其它可以改變游離與被結(jié)合間平衡性的千擾因子。因此，當為適當?shù)募谞钕俟δ軠y試來自個體的樣品時，重要的是要包括穩(wěn)定劑以穩(wěn)定化FT4。在本發(fā)明的一種實施方式中，在加入含有分析物的樣品之前，將穩(wěn)定劑加入測定物中。在其他實施方式中，可以在加入含有分析物的樣品后，將穩(wěn)定劑加入測定物中，例如，作為試劑緩沖液的一部分加入。在一些實施方式中，穩(wěn)定劑是含有捕獲配體(例如，對分析物特異的抗體)的試劑盒的一部分。在一些實施方式中，可以以多種方式將本發(fā)明的穩(wěn)定劑加入到對分析物特異的測定物例如FT4測定物中。例如，可以利用小瓶體系、緩沖系統(tǒng)、或包裝體系將穩(wěn)定劑加入。在小瓶體系中，將穩(wěn)定劑例如一種以上磺化化合物從小瓶加入到反應(yīng)混合物中。在緩沖系統(tǒng)中，穩(wěn)定劑，例如， 一種以上磺化化合物是加入到反應(yīng)混合物中的洗滌緩沖溶液的一部分。在包裝體系中，將穩(wěn)定劑例如一種以上磺化化合物從含有對分析物特異的抗體的試劑包裝的孔中取出，并且加入到含有反應(yīng)混合物的容器中。 BCI公司的Access FT4測定系統(tǒng)(BCI，富勒敦市，加利福尼亞州)被用于測量主體血清或血漿中的游離的無蛋白質(zhì)結(jié)合的甲狀腺素濃度。通過在洗液中使用烷基胺含氟表面活性劑，該測定法被第一次開發(fā)。該洗液在測定反應(yīng)物釋放后被用作探針清除劑(probepurge)，并且還被用作洗滌溶液。為了用更多對環(huán)境無害的碳氫化合物表面活性劑取代洗液表面活性劑，開發(fā)了本發(fā)明。本發(fā)明的組合物可以含有，但是不局限于蛋白質(zhì)、表面活性劑、緩沖液離子、以及不會顯著地擾亂血清或血漿中甲狀腺素游離的無蛋白質(zhì)結(jié)合的部分與被蛋白質(zhì)結(jié)合的部分之間平衡性的鹽類組合物。甲狀腺素結(jié)合蛋白由白蛋白、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、以及轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin)組成。在本發(fā)明的一種實施方式中，EHS是穩(wěn)定劑并且在優(yōu)化的濃度范圍內(nèi)被滴定，對于FT4而言在最終的反應(yīng)組合物中為約0.002%體積/體積至約0.015%體積/體積，優(yōu)選0.004%體積/體積(或181微摩爾)，以便有助于保持游離與被結(jié)合間的平衡性。
下述實施例闡明了使用本發(fā)明的操作方式，例舉了一種以上實施例，但并非所有的示例性的本發(fā)明實施方式皆可被本發(fā)明人所預(yù)料，因此，無論如何它們都不是對本發(fā)明和權(quán)利要求范圍的限制。
實施例
Access Free T4測定(BCI公司)是兩步酶免疫測定法。將偶聯(lián)于生物素的單克隆抗甲狀腺素(T4)抗體(BCI公司)、含有T4的生物樣品、含有穩(wěn)定劑的蛋白質(zhì)緩沖溶液、以及涂敷鏈霉抗生物素蛋白的固相加入反應(yīng)容器。在該第一次孵育期間，偶聯(lián)于生物素的抗T4抗體結(jié)合于樣品中的固相的游離T4上。在反應(yīng)容器中孵育后，被結(jié)合于固相上的材料被磁場保持，同時未結(jié)合的材料被洗去。接著，將蛋白質(zhì)緩沖液和三碘甲腺原氨酸(T3)-堿性磷酸酶結(jié)合物加入反應(yīng)容器。 T3-堿性磷酸酶結(jié)合物結(jié)合于空的抗T4抗體結(jié)合位點。在反應(yīng)容器中孵育后，被結(jié)合于固相上的材料被磁場保持，同時未結(jié)合的材料被洗去。然后，將化學發(fā)光底物Lumi-Phos 530 (Lumigen公司，薩斯菲爾德市，密歇根州)加入容器，并且用光度計測量反應(yīng)產(chǎn)生的光。產(chǎn)光量與樣品中游離T4的濃度成反比。樣品中的分析物含量通過累積的多點標準曲線確定。血清和血漿(肝素)是推薦的樣品。 BCI公司的Access Free T4 A33070A測定試劑盒包括Access Free T4試劑包產(chǎn)品目錄號No. 33880:每個包包括IOO個測定數(shù)據(jù)、2個包裝、50項測試。該試劑盒提供得即可使用。該試劑包含下述試劑A至E:試劑A:在具有蛋白質(zhì)(家禽)、表面活性劑、0.125% NaN3、以及0.125%ProClin 300 (購自羅門哈斯公司，費城，賓夕法尼亞州)的TRIS緩沖液中的涂敷有鏈霉抗生物素蛋白的Dynabead^順磁性顆粒。試劑B:具有蛋白質(zhì)(家禽的)、表面活性劑、<0.1% NaN3、以及0.1% ProClin300的TRIS緩沖鹽水。試劑C:具有蛋白質(zhì)(家禽的)、表面活性劑、0.125% NaN3、以及0.125% ProClin300的TRIS緩沖鹽水。試劑D:在具有蛋白質(zhì)(牛的)、表面活性劑、<0.1%NaN3、以及0.1%ProClin300的TRIS緩沖鹽水中的三碘甲腺原氨酸-堿性磷酸酶(牛的)結(jié)合物。
試劑E:在具有蛋白質(zhì)(家禽的和鼠科的)、表面活性劑和穩(wěn)定劑、0.125%NaN3、以及0.125% PrOClin 300的TRIS緩沖液中的偶聯(lián)于生物素上的小鼠單克隆抗甲狀腺素(T4)。 —種附加的試劑，其并非試劑包本身的一部分，并且用于方便地篩選許多穩(wěn)定劑，其被稱為小瓶試劑F。小瓶試劑F是含有至少一種穩(wěn)定劑的緩沖液(例如，作為圖3或圖4中參照的磺化表面活性劑)。實施例l
穩(wěn)定劑僅在試劑包的試劑E中第一反應(yīng)包含下述向反應(yīng)容器的依序添加
1) 50pL試齊ijE (含有穩(wěn)定劑，例如，0.016% EHS);
2) 30pL含有分析物的樣品；
3) 30jaL系統(tǒng)洗滌緩沖液(不包含穩(wěn)定劑)；
4) 30pL試劑B (不包含穩(wěn)定劑)；
5) 50pL試齊ijA。
在孵育和洗滌反應(yīng)容器后，第二反應(yīng)包含下述向反應(yīng)容器的依序添加
6) 220 ^試齊化；
7) 50pL試齊UD;
8) 80nL系統(tǒng)洗滌緩沖液(不包含穩(wěn)定劑)。
在孵育和洗滌反應(yīng)容器后，通過使用檢測體系測量樣品中游離分析物的濃度。
實施例2
穩(wěn)定劑僅在試劑包的試劑B中第一反應(yīng)包含下述向反應(yīng)容器的依序添加
1) 5(H丄試劑E (不包含穩(wěn)定劑)；
2) 30laL含有分析物的樣品；
3) 30pL系統(tǒng)洗滌緩沖液(不包含穩(wěn)定劑)；
4) 30pL試齊ijB (含有穩(wěn)定劑，例如，0.016% EHS);
5) 50inL試齊iJ A。
在孵育和洗滌反應(yīng)容器后，第二反應(yīng)包含下述向反應(yīng)容器的依序添加-
6) 220 nL試齊iJC;
7) 50pL試齊UD;
8) 80nL系統(tǒng)洗滌緩沖液(不包含穩(wěn)定劑)。
在孵育和洗滌反應(yīng)容器后，通過使用檢測體系測量樣品中游離分析物的濃度。
實施例3
穩(wěn)定劑僅在小瓶系統(tǒng)的小瓶試劑F中第一反應(yīng)包含下述向反應(yīng)容器的依序添加1 ) 50 試劑E (不包含穩(wěn)定劑)；
2) 30^iL含有分析物的樣品；
3) 30)aL小瓶試劑F (含有具有至少一種在圖3或圖4中作為參照的穩(wěn)定劑的洗滌緩 沖液)；
4) 30pL試劑B (不包含穩(wěn)定劑)；
5) 50laL試齊UA。
在孵育和洗滌反應(yīng)容器后，第二反應(yīng)包含下述向反應(yīng)容器的依序添加-
6) 220 (^L試齊U C;
7) 50pL試齊iJ D;
8) 80pL小瓶試劑F (含有具有至少一種在圖3或圖4中作為參照的穩(wěn)定劑的洗滌緩 沖液)；
在孵育和洗滌反應(yīng)容器后，通過使用檢測體系測量樣品中游離分析物的濃度。
實施例4
穩(wěn)定劑僅在系統(tǒng)洗滌緩沖液中第一反應(yīng)包含下述向反應(yīng)容器的依序添加
1) 50^L試劑E (不包含穩(wěn)定劑)；
2) 30(iL含有分析物的樣品；
3) 30 在鹽基質(zhì)中的系統(tǒng)洗滌緩沖液，所述鹽基質(zhì)比如是20 mM TRIS、0.15 M NaCl、 0.1%Proclin300、 0.1%NaN3、 pH 8.0,該系統(tǒng)洗滌緩沖液含有至少一種穩(wěn)定劑比如在圖3 或圖4中作為參照的EHS或其他磺化表面活性劑；
4) 30nL試劑B (不包含穩(wěn)定劑)；
5) 50pL試齊UA。
在孵育和洗滌反應(yīng)容器后，第二反應(yīng)包含下述向反應(yīng)容器的依序添加-
6) 220 nL試齊U C;
7) 50nL試齊UD;
8) 80 在鹽基質(zhì)中的系統(tǒng)洗滌緩沖液，所述鹽基質(zhì)比如是20 mM TRIS、0.15 MNaCl、 0.1% Proclin300、 0.1%NaN3、 pH 8.0，該系統(tǒng)洗滌緩沖液含有至少一種穩(wěn)定劑比如在圖3 或圖4中作為參照的EHS或其他磺化表面活性劑；
在孵育和洗滌反應(yīng)容器后，通過使用檢測體系測量樣品中游離分析物的濃度。
這些實施例顯示了本發(fā)明實施方式的可行性。同時參考一些實施方式，本發(fā)明已 經(jīng)得到具體體現(xiàn)和描述。應(yīng)當理解，這些實施方式僅用于舉例，而并非用于限制。在不背 離本發(fā)明精神和范圍的情況F，可以對本發(fā)明作出各種形式和細節(jié)上的改變。因此，本發(fā) 明的保護范圍和寬度將不會被任何上述示例性的實施方式所限制，而是僅根據(jù)隨附的權(quán)利 要求書及其等價形式而限定。在此引用的所有文件，包括雜志文章或者摘要、公開的或者相應(yīng)的美國或國外專 利申請、出版物或者國外專利、或者任何其他的文件，其全部內(nèi)容在此都被作為參考文獻， 包括所有的數(shù)據(jù)、表、圖、以及引用文件中的正文。
權(quán)利要求
1. 一種測量游離分析物濃度的方法，該方法包括(a)將用于游離分析物的捕獲配體加入容器；(b)將穩(wěn)定劑或其鹽加入容器，其中，所述穩(wěn)定劑包含通式RX，其中，R是飽和或者不飽和的烴基、芳基、或硅基聚合物，其中任何一種可選地以一個或多個含有氧、氮、鹵素、或其組合的部分衍生；并且其中，X是硫或磷的氧代陰離子或氧化物、氮的氧代陰離子或羰基衍生物、羧酸酯、硼酸鹽、硅酸酯、或鹵素，其附帶條件是所述穩(wěn)定劑不包含烷基胺含氟表面活性劑。(c)將包含分析物的樣品加入容器；(d)將檢測體系加入容器；以及(e)使用檢測體系測量樣品中分析物的濃度。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述穩(wěn)定劑包含通式RX，其中R是Cws 烷基，X是硫酸酯，磺酸、或磺酸酯。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述穩(wěn)定劑是2-乙基-己基硫酸酯、或其
4. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述分析物是甲狀腺激素。
5. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述捕獲配體是對分析物特異的，并且選 自于由抗體、抗體片段、抗體仿制品、分析物特異性結(jié)合蛋白質(zhì)、及其組合物所構(gòu)成的組。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述分析物特異性結(jié)合蛋白質(zhì)是內(nèi)因子或 葉酸結(jié)合蛋白。
7. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述檢測體系包含涂敷有捕獲配體特異性 結(jié)合分子、可檢測的標簽、或其組合物的固相。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述固相是順磁性顆粒。
9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述捕獲配體特異性結(jié)合分子具有半抗原 特異性，其中所述捕獲配體被半抗原化。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述半抗原是生物素。
11. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述捕獲配體特異性結(jié)合分子選自下組 鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、生物素特異性抗體、生物素特異性抗體片段、以及生 物素特異性抗體仿制品。
12. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕獲配體被固定在固相上。
13. —種用于測量游離分析物濃度的測定的組合物，所述組合物包含-(i) 用于游離分析物的捕獲配體；以及(ii) 穩(wěn)定劑，其中所述穩(wěn)定劑包含通式RX或其鹽，其中，R是飽和或者不飽和的烴基、芳基、或硅基聚合物，其中任何一種可選地以一 個或多個含有氧、氮、卣素、或其組合的部分衍生；并且其中，X是硫或磷的氧代陰離子或氧化物、氮的氧代陰離子或羰基衍生物、羧酸酯、硼酸鹽、硅酸酯、或鹵素，其附帶條 件是所述穩(wěn)定劑不包含垸基胺含氟表面活性劑。
14. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，R選自下組直鏈或支鏈硅酮、直鏈 或支鏈硅氧垸、直鏈或支鏈碳硅烷、直鏈或支鏈烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基烷基、雜芳 基、及其組合。
15. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，R是烷基、芳基、或硅基聚合物，并 且可選地被一個或多個羥基、酮基、羰基、羧基、或其組合取代。
16. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，R是醚、酯、或其組合。
17. 如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，R包含聚氧化丙烯或者聚氧化乙烯。
18. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，R是烷基、亞烷基、或炔。
19. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，R是烷基、芳基、或硅基聚合物，并 且可選地被一個或多個包含胺、氨基、亞胺、亞氨基、酰胺、銨、或其組合的含氮部分取 代。
20. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，R選自下組烷氧基烷基、烷氧基垸 氧基烷基、烷基氨基烷基、烷基氨基氧基烷基、垸氧基氨基垸基、膦?；榛?、羧基烷基、 羧基烷氧基烷基、羧基垸基氨基烷基、羧基垸基酰氨基烷基、環(huán)垸基垸基、雜環(huán)烷基烷基、 雜芳基烷基、及其組合。
21. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，R是烷基，并且烷基選自下組乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、戊基、己基、庚基、辛基、2-甲基丁基、2-乙基丁基、2-丙基丁基、3-甲基丁基、3-乙基丁基、3-丙基戊基、2-甲基戊基、2-乙基戊基、2-丙基戊基、3- 甲基戊基、3-乙基戊基、3-丙基戊基、4-甲基戊基、4-乙基戊基、4-丙基戊基、2-甲基己 基、2-乙基己基、2-丙基己基、3-甲基己基、3-乙基己基、3-丙基己基、4-甲基己基、4-乙 基己基、4-丙基己基、5-甲基己基、5-乙基己基、5-丙基己基、2-甲基庚基、2-乙基庚基、 2-丙基庚基、3-甲基庚基、3-乙基庚基、3-丙基庚基、4-甲基庚基、4-乙基庚基、4-丙基庚 基、5-甲基庚基、5-乙基庚基、5-丙基庚基、6-甲基庚基、6-乙基庚基、6-丙基庚基、2-甲 基辛基、2-乙基辛基、2-丙基辛基、3-甲基辛基、3-乙基辛基、3-丙基辛基、4-甲基辛基、4- 乙基辛基、4-丙基辛基、5-甲基辛基、5-乙基辛基、5-丙基辛基、6-甲基辛基、6-乙基辛 基、以及6-丙基辛基，其中任何一種可選被一個或多個羥基、羰基、鹵素、磷酸酯、乙酰 基、銨、及其組合取代。
22. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，X選自下組硫酸酯、磺酸、磺酸酯、 亞硫酸酯、亞砜、?；撬猁}、磺基丁二酸酯、磺化甜菜堿、硫酸甜菜堿、氨磺酰、磷酸酯、 硝酸酯、羧酸酯、硼酸鹽、硅酸酯、溴酸鹽、及其組合物。
23. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，X是硫酸酯、磺酸、磺酸酯、磺基丁 二酸酯、或?；撬猁}。
24. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，包含所述穩(wěn)定劑的鹽。
25. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，R是Cw8垸基，X是硫酸酯、磺酸或 磺酸酯。
26. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述穩(wěn)定劑選自下組2-乙基-己基硫 酸酯；l-己烷磺酸或其鹽；l-庚烷磺酸或其鹽；l-辛烷磺酸或其鹽；l-癸垸磺酸或其鹽； 。14-16烯烴磺酸鈉；十二烷基硫酸鈉；二辛磺基琥珀酸鈉；N-油基-N-甲基牛磺酸鈉；聚氧 化乙烯月桂烷硫酸鈉；胺的烷基苯甲基磺酸鹽；乙基-己基硫酸鈉；以及其組合物。
27. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述穩(wěn)定劑是2-乙基-己基硫酸酯、 或其鹽。
28. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述穩(wěn)定劑的濃度是約5微摩爾至約 750微摩爾。
29. 如權(quán)利要求26所述的組合物，其特征在于，所述2-乙基-己基硫酸酯的濃度是約75 微摩爾至約650微摩爾。
30. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述捕獲配體是分析物特異性結(jié)合蛋 白質(zhì)。
31. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述捕獲配體是抗體、抗體片段、或 抗體仿制品。
32. —種用于估計游離分析物濃度的試劑盒，所述試劑盒包含(a) 用于游離分析物的捕獲配體；(b) 穩(wěn)定劑或其鹽，其中所述穩(wěn)定劑包含通式RX，其中，R是飽和或者不飽和的烴基、芳基、或硅基聚合物，其中任何一種可選地以一 個或多個含有氧、氮、鹵素、或其組合的部分衍生；并且其中，X是硫或磷的氧代陰離子 或氧化物、氮的氧代陰離子或羰基衍生物、羧酸酯、硼酸鹽、硅酸酯、或鹵素，其附帶條 件是穩(wěn)定劑不包含烷基胺含氟表面活性劑。(c) 檢測體系。
全文摘要
本發(fā)明涉及可用于測量液體中游離的或未結(jié)合的分析物濃度的組合物。本發(fā)明包括捕獲配體和穩(wěn)定劑的應(yīng)用，以提高分析物濃度測定法的準確度。本發(fā)明還公開了應(yīng)用本發(fā)明的方法和工具。
文檔編號G01N33/566GK101512342SQ200780032399
公開日2009年8月19日 申請日期2007年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月28日
發(fā)明者凱瑟琳·M·利思, 斯蒂芬·P·陳, 考特尼·E·沃爾頓, 陸文元 申請人:貝克曼考爾特公司