專利名稱：分析物檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測樣品中分析物的方法和可用于進行此方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
當結(jié)合于特異結(jié)合位點的分析物(如抗原或芽孢)以非常低的水平
存在時，能夠?qū)⑵錂z測出來通常是很重要的。特別是醫(yī)療、診斷、產(chǎn)品安 全和保障等領(lǐng)域。因此,擴增由所述分析物的結(jié)合引起的信號是很有利的。
在WO2005/024386和WO2006/031248中已經(jīng)提出了檢測和擴增方 法，其包括使分子識別活動發(fā)生從而形成一個復合體，將光引發(fā)劑標記連 接到所述復合體上，使所述光？ I發(fā)劑標記的復合體與聚合物前體連接并且 照射所述復合體和聚合物前體，從而形成一個可檢測的聚合物。在這些方 法中，優(yōu)選的是，所述形成的聚合物自身是可因熒光、磁性、放射性或電 傳導性而被檢測的，或是大量形成從而可被肉目艮檢測到的?；蛘?，所述聚 合物也可用附加步驟檢測，其中所述聚合物溶脹于具有熒光、磁性、放射 性或電傳導性的溶液中。WO2005/024386和WO2006/031248以引用的方 式納入本文中。
這些系統(tǒng)工作良好，但需要進一步提高增幅，以及提供可更靈活地 使用所述可以使用的聚合物前體或根本不需要聚合物前體的方法。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面， 一種檢測樣品中分析物的方法，包括下述 步驟
a) 將所述樣品與可與所述分析物特異結(jié)合并且被固定于傳感器上或 傳感器附近的第一配體接觸；
b) 在步驟(a)之前將所述樣品，或在步驟(a)之后將固定化的分析物， 與包括可與所述分析物特異結(jié)合的第二配體的材料接觸，所述材料可被活化以形成聚合引發(fā)劑；和 (c)活化所述材料；
其中所述聚合引發(fā)劑與所述傳感器相互作用而改變了它的物理性 質(zhì)，這引起了所述傳感器的光或聲學特性的變化。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面， 一種本發(fā)明第 一方面的分析物檢測方法所 用的試劑盒，包含
能夠與所述分析物特異結(jié)合的第 一配體和傳感器，其中所述第 一配 體或者固定于所述傳感器上，或者固定于在使用時位于所述傳感器附近的 基底上；以及
包括能夠與所述分析物特異結(jié)合的第二配體的材料，所述材料可被 活化以形成聚合引發(fā)劑。
本發(fā)明利用傳感器經(jīng)由所述可活化材料的存在來檢測所述分析物的 存在。通過活化所述可活化材料產(chǎn)生的所述聚合引發(fā)劑直接或間接與所述 傳感器相互作用以改變其物理性質(zhì)，例如令其膨脹或收縮。這種相互作用 改變了所述傳感器的光學或聲學特性，然后這種變化#1檢測到。
因為在本發(fā)明中使用傳感器，聚合物自身就不必是可被獨立地檢測到 的。使用傳感器意味著可獲得比直接檢測所產(chǎn)生聚合物的方法更大的擴
9多種不同的傳感器可用于本發(fā)明，適合的主要標準是對所述傳感器的 物理性質(zhì)改變的靈敏度。 一類合適的傳感器是基于衍射作用的傳感器(如 只是具有表面浮突的傳感器)，或者包括全息圖或晶體膠體陣列的傳感器。 或者，也可能使用聲學傳感器，例如基于共振石英晶體的傳感器。
在一個簡單的實施方案中，所述聚合引發(fā)劑一通常是或包括自由基 的——直接與所述傳感器相互作用導致其物理性質(zhì)改變，通常是導致快速 膨脹。該實施方案涉及步驟較少，并且意味著可提供結(jié)構(gòu)非常簡單的傳感 器，不需要聚合物前體。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述聚合引發(fā)劑間接與所述傳感器相互作 用。這在所述聚合引發(fā)劑與傳感器中的聚合物前體相互作用導致聚合作用 時發(fā)生，這對所述傳感器的物理結(jié)構(gòu)有影響。這可通過將聚合物前體與所 述傳感器自身連接，或通過將所述傳感器與含有聚合物前體的溶液接觸來 完成。當在一個單獨的步驟中添加所述聚合物前體時，其通常發(fā)生在步驟
6b)和c)之間，即恰在活化之前。
本發(fā)明所述方法是非常敏感的，并可用于檢測低水平的分析物，因為 存在的每種分析物都能導致所述可活化材料的結(jié)合，所述可活化材料在活 化之后在所述傳感器中引起的反應(yīng)比單一結(jié)合事件所導致的反應(yīng)大得多。 所存在的每單位的可活化材料在活化以后都可引起大約106個聚合物前體 的聚合，因此擴增效果顯著。
適用于本發(fā)明的可活化材料的使用是比較經(jīng)濟的，并且甚至當使用聚 合物前體時，這些也不昂貴。與自身昂貴并且需要昂貴底物的標記物如酶 相比尤其如此。而且，可活化標記物的體積(bulky) —般比酶小。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述傳感器是一種全息傳感器。在反應(yīng)起 始之后，使用全息傳感器來檢測可活化材料的存在會產(chǎn)生比現(xiàn)有技術(shù)中的 方法更大的增幅，因為基質(zhì)物理性質(zhì)的微小改變可導致所述傳感器光學性 質(zhì)產(chǎn)生隨后可被檢測的實質(zhì)改變。此方案還提供一種非常簡單的讀出。所 述全息圖可用于不透明樣品，并且就熒光團而言，其讀數(shù)是光穩(wěn)定的。
許多已知的全息傳感器系統(tǒng)的基礎(chǔ)是具有對分析物化學敏感的基質(zhì)， 從而使得分析物的存在直接導致所述傳感器的物理性質(zhì)發(fā)生可檢測的改 變。這種傳感器已經(jīng)非常成功，但是檢測限比較高，這在某些應(yīng)用中是主 要缺陷，并完全妨礙了用于其他應(yīng)用。
本發(fā)明不要求所述基質(zhì)對特定分析物化學敏感，只要求其直接或間接 通過聚合物形成對與聚合引發(fā)劑的相互作用物理敏感。這意味著所述傳感 器的生產(chǎn)更容易和更加具有成本效益。這還意味著本發(fā)明的傳感器的靈敏 度相比現(xiàn)有技術(shù)中的全息傳感器有極大的提高，因為與單一分析物種類連 接的可活化材料的存在可引發(fā)鏈式反應(yīng)，所述鏈式反應(yīng)導致基質(zhì)物理性質(zhì) 發(fā)生重大改變，并導致所述傳感器的光學特性發(fā)生相應(yīng)改變。
具體實施例方式
在一個優(yōu)選的實施方案中，第一配體固定于傳感器本身上(即直接連 接在傳感器的表面上)。然而，也可將所述固定的第一配體置于傳感器附 近單獨的基底如濾膜(membranefilter)上，從而使得在活化后所形成的 聚合引發(fā)劑被沖洗到傳感器上，并且因此與其接觸并相互作用。在這個實施方案中，可以使用任何可供所述配體固定于其上的基底，但是優(yōu)選濾膜， 如由硝酸纖維素制備得到的濾膜。術(shù)語"在…附近"是指所述基底處于與所
述傳感器直接接觸或流體接觸(physical or fluid contact)的位置，從而 使得聚合引發(fā)劑一旦形成，就可與基質(zhì)相互作用。
本發(fā)明利用光學或聲學傳感器。已知的聲學傳感器參見，例如， WO01/02857(其內(nèi)容以引用的方式納入本文中)。它們通常包含在電流作 用下會振蕩的石英晶體。所述晶體的上面具有提供所述電流的電極。振蕩 頻率取決于所施加的電流并可被電流控制。振蕩頻率可被檢測，且可測出 很小的變化。
由于傳感器質(zhì)量的改變，振蕩頻率受表面上分子的結(jié)合的影響。通過 這種方式，這種系統(tǒng)已用于直接檢測分析物。WO02/12873和EP1171769 給出了這種系統(tǒng)的實例，并以引用的方式納入本文中。
在本發(fā)明中，除了提供于石英晶體上或在其附近的第一配體之外，還 將聚合物前體連接到石英晶體表面上。附加的聚合物前體是在活化之前加 入的。因此，在活化時，所述固定化的和附加的聚合物前體在所述晶體表 面聚合形成聚合物，因此，附在晶體表面上的質(zhì)量增加，這改變了振蕩頻 率。這種頻率改變可以被檢測到。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述傳感器是一種光學傳感器。光學傳感 器在本領(lǐng)域中是已知的，并且多種不同的光學傳感器都適用于本發(fā)明。
所述光學傳感器一般包括基質(zhì)和位于其中或其上的敏感元件。所述基 質(zhì)通常是可由天然或合成的親水單體聚合而形成的水凝膠。例如， WO03/087899、 WO99/63408和W095/26449中/>開了用作基質(zhì)(也稱為 支持介質(zhì))的合適材料和形成它們的方法。例如，所述基質(zhì)可由丙烯酰胺 (異丁烯酰胺)和/或丙烯酸酯(異丁烯酸酯)來源的共聚單體的共聚形 成。具體地，單體HEMA (羥乙基異丁烯酸酯)容易聚合和交聯(lián)。因為 具有膨潤性、親水性和廣泛的生物相容性，多聚HEMA是一種通用的支 持材料。全息支持介質(zhì)的其他實例是明膠、K-鹿角菜膠、瓊脂、瓊脂糖、 聚乙烯醇(PVA)、溶膠-凝膠(如廣義分類的)、水凝膠(如廣義分類的) 和丙烯酸酯。其他材料為多糖、蛋白和蛋白樣材料、寡核苷酸、RNA、 DNA、纖維素、乙酸纖維素、硅氧烷、聚酰亞胺和聚丙烯酰胺。
水凝膠可被改造為對自由基特別敏感以用于本發(fā)明。例如，如果所
8述聚合物主鏈有不飽和側(cè)鏈，就可增加靈敏度。這可以使用如3-異丙烯 基-a，a-二甲基卞基異氰酸酯(m-TMI)的單體實現(xiàn)，它是一種在一端含有異 氰酸酯基團，在另一端含有乙烯基基團的化合物的一個實例。HEMA水 凝膠的后衍生化作用包括羥基與m-TMI的異氰酸酯反應(yīng)，以提供側(cè)鏈乙 烯基基團，其在存在自由基的情況下交聯(lián)。通過這種方式，聚合物前體可 連接在經(jīng)歷交聯(lián)的水凝g質(zhì)上從而形成聚合物。
在水凝膠中使用低水平交聯(lián)也是有優(yōu)勢的，這產(chǎn)生了 一種更加高度膨 脹的水凝膠，所述水凝膠由于更容易收縮而對聚合更敏感。還可以使用接 近其旋節(jié)點(相之間的穩(wěn)定性)的水凝膠以增加靈敏度。
在一個實施方案中，所述光學傳感器基于固定在基質(zhì)上的粘度敏感的 熒光探針。這種探針在本領(lǐng)域中是已知的，如在例如M.A.Haidekker等 人的說》wg做/c 0^附/W/j 33 (2005) 415 — 425和A. Petric等人的 fi/oo/^"w/c AfW/dmi/ O^aw/s^j Z^/^rs 8 (1998) 1455-1460的文章中所述 那樣，其內(nèi)容以引用的方式納入本文中。
如其名稱所表示的，由于環(huán)境的粘度，粘度敏感的熒光探針改變它們 的光學性質(zhì)。當聚合引發(fā)劑直接或間接與基質(zhì)相互作用時，它引發(fā)所述基 質(zhì)的膨脹或收縮。因此，所連接的焚光團的光學性質(zhì)以一種可檢測的方式
被影響。
合適的粘度敏感的熒光探針包括2-(l，l-二氰基丙烯基)-2,6-二甲基氨 基萘(DDNP)、 4，4誦二曱基氨基千腈(DMABN)、 (7-氨基-4-曱基香豆素-3-乙酰氨基)己酸(AMCA)和9-(二氰基乙烯基)-julidine-三乙烯乙二醇酯 (CCVJ-TEG)。
可以使用的另一種傳感器是一種包含如下結(jié)構(gòu)的傳感器由具有高屈 光指數(shù)的材料制成的光柵或表面浮突、支持所述光柵的基底層和一種或多 種固定在所述基底層對側(cè)的所述光柵表面上的特異性結(jié)合物質(zhì)。當使用寬
語帶光波長照射所述生物傳感器時，窄譜帶光波長可從所述生物傳感器或 光學設(shè)備反射回來。分析物的結(jié)合可根據(jù)反射光的波長移動檢測出來。這 種傳感器在本領(lǐng)域中是已知的，例如，如B. Cunningham等人在5^"wrs "w/iM""fl/ora 5， 2002, 81 ， p. 316-328中所述。
或者，所述傳感器可包含一種其中具有晶體膠質(zhì)陣列(CCA)的基質(zhì)。 這種傳感器在本領(lǐng)域中是已知的，例如，如S. A. Asher等人在77^ /仰r聽/
9幼d膨nc做C7^附/cfl/S鎖'豐2003,125,3322-3329或V. L. Alexeev等 人在a^附/W/j Vol 75， No 10， May 15 2003中所述。合適的基質(zhì) 如上面的文獻所述，具體實例在以引用的方式納入本文的參考文章中列 出。在這個實施方案中聚丙烯酰胺是特別適用的基質(zhì)。所述CCA可用任 何膠粒制備，以這種方式使得其在水凝膠中穩(wěn)定。在過去，高電荷的單分 散性聚苯乙烯已經(jīng)被用于此目的。
在一種與全息傳感器相似的方法中(在下面討論)，包埋的CCA衍 射可見光，其衍射波長取決于所述水凝膠的體積。因此，導致收縮或膨脹 的自由基與水凝膠的相互作用會使所述傳感器的光學性質(zhì)發(fā)生可檢測的 改變。水凝膠內(nèi)的聚合作用對水凝膠的體積有迅速且明顯的作用，這通過 所述傳感器光學性質(zhì)的可檢測的改變獲知。
另一種可用的光學傳感器基于表面等離子共振，籍此目標分析物通 過介電常數(shù)的改變來檢測。這種傳感器在本領(lǐng)域中是已知的，例如，如 I. D. Parsons等人在Nucleic Acids Res. 1995， 23， 211-216和Anal. Biochem. 1997， 254(1)， 82-87中所述。
在優(yōu)選的實施方案中，所述傳感器是包含一種其中或其上具有全息 圖的基質(zhì)的全息傳感器。例如，WO03/087899 、 WO99/63408和 W095/26449公開了適用于本申請的全息傳感器，它們都以引用的方式納 入本文中。
所述基質(zhì)通常是上文所列出的水凝膠?；蛘?，明膠是一種用于支持 光敏物質(zhì)(如囟化銀顆粒)的標準基質(zhì)材料。還可以利用鉻III離子對明 膠進行光交聯(lián)，交聯(lián)位置為膠鏈上的羧基基團之間。
以任何常規(guī)方法將全息圖記錄在基質(zhì)上。例如，如WO99/63408所 述，可將可溶性鹽(如卣化銀)灌注在膠體中，然后使其發(fā)生反應(yīng)形成其 中形成了圖像的不可溶感光沉淀?；蛘撸鏦O04/081676所述，可構(gòu)建"無 銀系統(tǒng)"。
本發(fā)明傳感器中的全息圖可通過光衍射產(chǎn)生。所述全息圖可能僅在 放大時可見，或可能在白光、UV線或紅外線下可見，或在特定的溫度、 磁力或壓力條件下可見。所述全息圖優(yōu)選為一個物體，或具有2維或3 維效果。
所述傳感器還包含用于在用激光照射時產(chǎn)生干涉效應(yīng)的工具，所述工具優(yōu)選地含有消偏層。
由所述聚合引發(fā)劑與所述傳感器的相互作用引起的光學性質(zhì)的變化 可通過肉眼或使用設(shè)備檢測。所述設(shè)備優(yōu)選地選自光學閱讀器、移動電話、 計算機和數(shù)碼相機。應(yīng)當預想到，可使用任何形式的計算機，如筆記本、
臺式機或掌上設(shè)備如個人數(shù)字助理(PDA)，所述個人數(shù)字助理為一種個人 電腦記事本設(shè)備。
光學性質(zhì)的改變應(yīng)該是全息圖的顏色或圖像的明顯和明確的改變， 優(yōu)選在電磁波鐠的可見范圍內(nèi)。這提供了可通過肉眼觀察的精確和可靠的 讀數(shù)。為了確保達成這一目的，所述傳感器的上面優(yōu)選地含有濾光器。所 述濾光器應(yīng)該覆蓋所述傳感器的部分或全部表面，觀察所述表面以監(jiān)測分 析物相互作用。
所述濾光器可以是低通濾光器(允許低于某一波長的光照通過)、高 通濾光器(允許高于某一波長的光照通過)或帶通濾光器(允許具有某一 譜帶內(nèi)或者在多帶通濾光器的情況下某些譜帶內(nèi)的波長的光照通過)。因 此，這些濾光器的使用控制了到達所述傳感器的光線的頻率。全息傳感器 中的全息圖起到了帶通反射器的作用，從而所述全息圖的反射波長肯定在
選擇i光器以;高波長或低i長或二者的i:線提;一個截斷點，從而 能夠保證任何反應(yīng)都在特定范圍內(nèi)，例如，在可見范圍內(nèi)。它們可用于識
反應(yīng))。假如所述傳感器用于非最佳光線條件下，則它們也可用于防止不 明確的反應(yīng)。濾光器可被特異性改造以優(yōu)化所觀察到的對特定分析物的反 應(yīng)。
透明基底通常與濾光器聯(lián)合使用并被置于所述傳感器和所述濾光器 之間。濾光器和透明基底所產(chǎn)生的鏡面反射觀察不到。
本發(fā)明的試劑盒適用于農(nóng)業(yè)研究、環(huán)境研究、人類或獸醫(yī)預后、治 療診斷學、診斷學、治療。適當時，所述全息傳感器位于試紙條、芯片、
藥筒、藥簽(swab)、試管、移液管或者流體取樣或分析設(shè)備。
本發(fā)明第一配體與待檢測的分析物結(jié)合，并且可以是適用于此目的 的任何基團，例如當分析物是抗原時，所述第一配體可以為抗體。所述配 體也可是核酸探針如用于與核酸分析物結(jié)合的DNA。 cDNA——在實驗室中從mRNA模板合成的復制DNA——適用于本發(fā)明。類似地，第二配體 可以是與所述分析物特異性結(jié)合的任何材料。第二配體自身可以是可活化 材料或可與可活化材料直接或間接地相連。
通常第二配體在結(jié)合于所述分析物之前與所述可活化材料相連，但
是所述可活化材料也可后來再與所述第二配體相連，例如可在最后一步引 入所述可活化材料，使得它取代與第二配體連接的物體或連接于其上。這 在所述可活化材料特別靈敏并需要作為最后一個組分加入以使不需要和 過早活化減到最少時特別有用。一個實例是當所述第二配體是最初與生物 素(水溶性B復合物，也稱為維生素H或B7，分子式為C1()H16N203S) 相連的核苷酸時。一旦其與所述分析物相連且形成含有第一配體的多層結(jié) 構(gòu)，則抗生物素蛋白——一種可被光活化的材料——就被引入，所述抗生 物素蛋白是一種與生物素緊密結(jié)合的蛋白(在蛋清中發(fā)現(xiàn)的)。
因為所述結(jié)合是在結(jié)合位點和特定分析物之間特異的，因此通過檢 測其對位于不同傳感器上或位于同一傳感器的不同區(qū)域的不同配體的抗 性，不僅可以檢測，也可以識別樣品中存在的分析物。
任何分析物都可被檢測到，但是本發(fā)明優(yōu)選地用于檢測發(fā)生分子識 別事件的分析物，如帶有抗原的物體(如病毒或細胞)、芽孢、核酸(包 括RNA或DNA)、酶、肽、蛋白或藥物。
所述可活化材料可以是在活化時產(chǎn)生聚合引發(fā)劑(如自由基)的任 何材料，所述聚合引發(fā)劑可直接或通過聚合作用改變所述傳感器的物理性 質(zhì)。例如，本發(fā)明可使用經(jīng)歷不同類型活化的可活化材料，例如化學活 化，如使用TEMED催化劑和過硫酸銨/鉀；還原氧化活化系統(tǒng)，如使用 過苯曱酸叔丁酯、硫酸鐵、鹽酸或維生素C鈉；熱活化，如使用V50; 或光活化，如使用2，2-雙曱氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)、 (4-苯曱?？ɑ? 三曱基氯化銨(Quantacure BTC)、核黃素或2-蒽醌磺酸鈉(AQS)。
如果使用可光活化的材料，則可通過使用更亮的光源使反應(yīng)時間和靈 敏度增加，所述光源的波長范圍匹配所述光敏引發(fā)劑的吸收最大值。加熱 可加速聚合反應(yīng)，導致靈敏度的增加。
可活化材料單獨或當與第二配體連接時，應(yīng)該是可溶于水或普通有機 溶劑的，并籍由此將其《1入該系統(tǒng)中。這種溶劑的實例是水、乙醇、DMSO 或DMF或者它們的混合物。
12通常通過洗滌將未結(jié)合的可活化材料從所述系統(tǒng)中除去以保證獲得 的任何信號純粹是由于存在分析物。洗滌步驟也可發(fā)生在將樣品添加到傳 感器中之后，以洗去未反應(yīng)的分析物。
根據(jù)所用的材料，通過多種方式進行活化，例如通過照射或加熱。 當本發(fā)明涉及形成聚合物時，聚合物前體可與傳感器偶聯(lián)或在一個如 上面詳述的額外步驟中被加入。所述聚合物前體可以是與所述聚合引發(fā)劑 相容并且以所需要的的方式在所述傳感器中反應(yīng)形成聚合物的任何單體，
例如，丙烯酰胺或m-TMI。某些單體可被氧氣抑制，某些單體需要氧氣 才能起作用(如核黃素)?？蓪λ鰡误w和聚合引發(fā)劑加以選擇以對聚合 反應(yīng)和貯存條件有更好的控制。
根據(jù)所用的聚合引發(fā)劑系統(tǒng)，所述多聚反應(yīng)可通過自由基聚合或 "活"聚合反應(yīng)(如原子轉(zhuǎn)移聚合(ATP))進行。可使用鏈轉(zhuǎn)移試劑來控制 分子量和聚合速率。
由于分析物結(jié)合事件，本發(fā)明會導致反應(yīng)的大量擴增，但在某些情況 下，尤其是當所述分析物是核酸時，需要更進一步地增加反應(yīng)以獲得最大 的敏感度。
在這種情況下，可能使用已知方法復制所述分析物，這又會使得更 多的第二配體結(jié)合，并因此存在更多的可活化材料。在這個實施方案中， 進行了兩重擴增，首先是分析物量的擴增，導致更多的可活化材料相結(jié)合； 其次是通過使用可活化材料擴增每個結(jié)合事件。
合適的復制方法包括聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或反轉(zhuǎn)錄酶PCR、連接 酶鏈式反應(yīng)、鏈置換擴增技術(shù)、基于DNA分割的信號擴增或滾環(huán)擴增。 這些方法涉及能夠結(jié)合核苷酸的經(jīng)修飾的聚合酶，所述核苷酸被可活化材 料或用于在擴增后結(jié)合可活化材料的分子團(如生物素)所標記。這些方 法在本領(lǐng)域中是已知的。
滾環(huán)擴增在本發(fā)明中特別有用，因為它是最特異和通用的擴增方法。 此方法也包括增加特異性的連接反應(yīng)，因為連接酶對3，錯配比聚合酶更 嚴格。
本發(fā)明中使用滾環(huán)復制的實例如下諸如cDNA或表達序列標記 (EST)的第一配體被固定在傳感器上；引入分析物，如得自流感病毒的 mRNA遺傳物質(zhì)；引入復制配#-互補單鏈DNA;連接第一配體和復
13制配體；引入環(huán)狀(滾環(huán))DNA;在環(huán)狀DNA存在的條件下延伸所述復制 配體；除去所述滾環(huán)；引入連接于可光活化材料上的第二配體，如單鏈 DNA;引入聚合物前體，并照射該系統(tǒng)，這導致在所述基質(zhì)中形成聚合 物，導致所述基質(zhì)的收縮，及因此產(chǎn)生可檢測的光學性質(zhì)變化。
實施例
已經(jīng)用全息傳感器進行的原理論證實驗表明聚合作用導致可檢測反 應(yīng)。實施例使用常規(guī)的葡萄糖敏感的全息傳感器來說明本發(fā)明是如何工作 的。在實施例中，在引入聚合物前體之后再引入活化的可活化材料。實施 例1-3使用化學活化，實施例4使用光活化。
實施例1
將0.265克丙烯酰胺和0.0179克的N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)劑溶 解在652 filMQ-水中。添加4.6 pl的TEMED催化劑(所述TEMED可
用化學方法連接在所述第二抗體上)。將所迷溶液混勻，然后添加到含有 葡萄糖敏感全息圖(5摩爾％的雙丙烯酰胺交聯(lián)劑，8摩爾％的3-丙烯酰 胺基苯硼酸)的比色杯中。反應(yīng)平衡后，將40 fil的0.05g/mL的過硫酸 鉀溶液添加到所述比色杯的內(nèi)容物中(不攪拌)，并監(jiān)控所述全息圖的反 應(yīng)。聚合伴隨著所述全息圖快速且突然的收縮，可見到衍射峰值波長下降。 在聚合反應(yīng)結(jié)束時在所述比色杯內(nèi)可觀察到固體凝膠。
實施例2 (對照)
將4.6 plTEMED催化劑(所述TEMED可用化學方法連接到所述第 二抗體上)添加到652jilMQ-水中。將溶液混勻然后添加到含有葡萄糖敏 感全息圖(5摩爾％的雙丙烯酰胺交聯(lián)劑，8摩爾％的3-丙烯酰胺基苯硼 酸)的比色杯中。反應(yīng)平衡后，將40 pl 0.05g/mL的過硫酸鉀溶液添加到 所述比色杯的內(nèi)容物中(不攪拌)，并監(jiān)控所述全息圖的反應(yīng)?？捎^察到 所述全息圖稍微膨脹，可見到衍射峰值波長少量升高。沒有觀察到該比色 杯內(nèi)有凝膠形成。
14實施例3 (對照的重復)
將0.265克的丙烯酰胺和0.0179克的N，N'-亞曱基雙丙烯酰胺交聯(lián)劑 溶解在652 jd MQ-水中。添加4.6 jd的TEMED催化劑(所述TEMED 可用化學方法連接在所述第二抗體上)。將溶液混勻然后添加到含有葡萄 糖敏感全息圖(5摩爾％的雙丙烯酰胺交聯(lián)劑，8摩爾％的3-丙烯酰胺基 苯硼酸)的比色杯中。反應(yīng)平衡后，將40jilMQ-水添加到所述比色杯的 內(nèi)容物中(不攪拌)。在進一步平衡后，將40jil0.05g/mL的過硫酸鉀溶 液到所述比色杯的內(nèi)容物中(不攪拌)，并監(jiān)控所述全息圖的反應(yīng)。聚合 伴隨著所述全息圖快速且突然的收縮，可見到衍射峰值波長下降。在聚合 反應(yīng)結(jié)束時在所述比色杯內(nèi)可觀察到固體凝膠。
實施例4
將0.265克丙烯酰胺和0.0179克的N，N'-亞曱基雙丙烯酰胺交聯(lián)劑溶 解在652 ^ilMQ-水中。將溶液混勻然后添加到含有葡萄糖敏感全息圖(5 摩爾％的雙丙烯酰胺交聯(lián)劑，8摩爾％的3-丙烯酰胺基苯硼酸)的比色杯 中。反應(yīng)平衡后，將20 nl 2%的DMPA的DMSO溶液(所述DMPA可 用化學方法連接到所述第二抗體上)到比色杯中，無需攪拌。在卣素光源 下進一步平衡后，將所述比色杯在紫外燈(在350nm處)下照射。紫外 燈光照產(chǎn)生快速聚合反應(yīng)，伴隨著所述全息圖快速且突然的收縮，可見到 衍射峰值波長下降。在聚合反應(yīng)結(jié)束時在所述比色杯內(nèi)可觀察到固體凝 膠。
權(quán)利要求
1. 一種檢測樣品中分析物的方法，所述方法的步驟包括a)將所述樣品與可與所述分析物特異結(jié)合并且被固定于傳感器上或傳感器附近的第一配體接觸；b)在步驟(a)之前將所述樣品，或在步驟(a)之后將所述固定化的分析物，與包括可與所述分析物特異結(jié)合的第二配體的材料接觸，所述材料可被活化以形成聚合引發(fā)劑；和(c)活化所述材料；其中所述聚合引發(fā)劑與傳感器相互作用而改變了它的物理性質(zhì)，這引起了所述傳感器的光學或聲學特性的變化。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述聚合引發(fā)劑是直接與所述傳感器相 互作用以改變其物理性質(zhì)的自由基引發(fā)劑。
3. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述傳感器包括聚合物前體， 并且所述聚合引發(fā)劑與所述聚合物前體相互作用以在所述傳感器中形 成聚合物。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，另外包括將所述傳感器與聚合物前 體接觸的步驟，從而使得所述聚合引發(fā)劑與所述聚合物前體相互作用以 在所述傳感器中形成聚合物。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述第一配體是抗體或核酸， 優(yōu)選cDNA。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述分析物是抗原、芽孢或核 酸。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述第二配體是與可活化材料 相連的抗體。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述材料可通過化學反應(yīng)、氧 化還原反應(yīng)、加熱或照射來活化。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法.，其中所述分析物是核酸，且所述方 法在步驟a)和b)之間另外包括復制所述分析物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述復制包括聚合酶鏈式反應(yīng)、反轉(zhuǎn)錄 酶聚合酶鏈式反應(yīng)、連接酶鏈式反應(yīng)、鏈置換擴增、基于DNA分割的 信號擴增或滾環(huán)擴增。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10的方法，其中使用被可活化材料標記的核苷酸和經(jīng)修飾的聚合酶。
12. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述傳感器還包含用于在用激 光照射時產(chǎn)生干涉效應(yīng)的工具。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述工具包含消偏層。
14. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述傳感器上有濾光器。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述濾光器為通帶濾光器。
16. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其中使用選自光學閱讀器、移動電 話、計算機和數(shù)碼相機的設(shè)備來檢測光學或聲學性質(zhì)的改變。
17. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述傳感器是包含其中或其上 具有全息圖的基質(zhì)的全息傳感器。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項的方法，其中所述傳感器包含其中含有晶 體膠體陣列的基質(zhì)。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項的方法，其中所述傳感器包含其上固定有 粘度敏感的熒光探針的基質(zhì)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項的方法，其中所述傳感器包含具有表面浮 突的基質(zhì)。
21. 根據(jù)權(quán)利要求17-20任一項的方法，其中所述基質(zhì)是水凝膠。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項的方法，其中所述傳感器包含石英晶體共 振器，所述石英晶體共振器連有電極并且上面固定了聚合物前體，所述 方法還包括將所述傳感器與附加的聚合物前體接觸的步驟，從而使得所 述聚合引發(fā)劑與固定化的和附加的聚合物前體相互作用以形成固定于 所述共振器上的聚合物。
23. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述全息圖僅在放大的情況下才可見。
24. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述全息像是一個物體，或具有2 維或3維效果。
25. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述全息圖在白光、紫外線或紅外線 照射下可見。
26. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述全息圖在特定的溫度、磁力或壓 力條件下可見。
27. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述全息圖是通過光的衍射產(chǎn)生的。
28. —種用于根據(jù)前述權(quán)利要求任一項檢測分析物的方法中的試劑盒，包括能夠與所述分析物特異結(jié)合的第 一配體和傳感器，其中所述第 一配體 或者固定于所述傳感器上，或者固定于在使用時位于所述傳感器附 近的基底上；以及包括能夠與所述分析物特異結(jié)合的第二配體的材料，所述材料可被活 化以形成聚合引發(fā)劑。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28的試劑盒，其中所述傳感器上連有聚合物前體。
30. 根據(jù)權(quán)利要求28的試劑盒，另外含有一種聚合物前體。
31. 根據(jù)權(quán)利要求28-30任一項的試劑盒，用于農(nóng)業(yè)研究、環(huán)境研究、人 類或獸醫(yī)預后、治療診斷學、診斷學或治療。
32. 根據(jù)權(quán)利要求28-31任一項的試劑盒，其中所述傳感器位于試紙條、 芯片、藥筒、藥簽、試管、移液管或者流體取樣或分析設(shè)備。
33. 根據(jù)權(quán)利要求28-32任一項的試劑盒，其中所述傳感器是含有其中或 其上具有全息圖的基質(zhì)的全息傳感器。
全文摘要
一種檢測樣品中分析物的方法，所述方法的步驟包括a)將樣品與可與所述分析物特異結(jié)合并且被固定于傳感器上或傳感器附近的第一配體接觸；b)在步驟(a)之前將所述樣品，或在步驟(a)之后將固定化的分析物，與包括可與所述分析物特異結(jié)合的第二配體的材料接觸，所述材料可被活化以形成聚合引發(fā)劑；和(c)活化所述材料；其中所述聚合引發(fā)劑與傳感器相互作用而改變了它的物理性質(zhì)，這引起了所述傳感器的光或聲學特性的變化。
文檔編號G01N33/58GK101512344SQ200780033464
公開日2009年8月19日 申請日期2007年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月8日
發(fā)明者A·M·霍根, G·J·沃斯利 申請人:精確全息圖有限公司