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      肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì)、含有其的肥胖基因擴(kuò)增用試劑及其用途的制作方法

      文檔序號(hào):5831895閱讀:243來(lái)源:國(guó)知局

      專利名稱::肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì)、含有其的肥胖基因擴(kuò)增用試劑及其用途的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      :本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增肥胖基因p2AR基因、(33AR基因和UCP1基因的引物對(duì)、含有該引物對(duì)的肥胖基因擴(kuò)增用試劑及其用途。
      背景技術(shù)
      :與肥胖相關(guān)的基因多態(tài)性,已知有編碼(3-2腎上腺素受體((32AR)的基因((32AR基因)、編碼|3-3腎上腺素受體((33AR)的基因((33AR基因)和編碼解偶聯(lián)蛋白(UCP)的基因(UCP1基因)的多態(tài)性。(32AR主要分布在心臟、支氣管平滑肌等中,此外也存在于脂肪組織中,與脂肪分解相關(guān)。編碼J32AR的P2AR基因存在第16位氨基酸精氨酸(Arg)變成甘氨酸(Gly)的多態(tài)性(Argl6Gly)。據(jù)報(bào)道具有該多態(tài)性的受試者(日本人中16%存在該多態(tài)性)與沒有上述多態(tài)性的受試者相比,其安靜時(shí)的代謝量是亢進(jìn)的。此外,P3AR存在于棕色脂肪細(xì)胞組織和白色脂肪細(xì)胞組織中,通過(guò)結(jié)合去甲腎上腺素,引起棕色脂肪細(xì)胞組織產(chǎn)熱、白色脂肪細(xì)胞組織脂肪分解。編碼它的(33AR基因存在第64位氨基酸色氨酸(Trp)變成精氨酸(Arg)的多態(tài)性(Trp64Arg)。據(jù)報(bào)道具有該多態(tài)性的受試者(日本人中34%存在該多態(tài)性)與沒有上述多態(tài)性的受試者相比,安靜時(shí)的代謝量是減少的。此外,UCP1是一種在交感神經(jīng)處于興奮狀態(tài)時(shí),發(fā)揮棕色脂肪組織中的產(chǎn)熱中心作用的蛋白質(zhì)。另夕卜,編碼它的UCPl基因存在mRNA的-3826位(基因組序列中的UCP1基因的翻譯起始點(diǎn)的上游3826位)的腺嘌呤(A)變成鳥噤呤(G)的多態(tài)性。據(jù)報(bào)道具有該多態(tài)性的受試者(日本肥胖女性中24%存在該多態(tài)性)與沒有上述多態(tài)性的受試者相比,全身的代謝量是減少的。由于如上這種各基因的多態(tài)性和代謝量之間的關(guān)系,實(shí)際上已在進(jìn)行解析這些基因的多態(tài)性,將解析結(jié)果用于受試者的肥胖治療、預(yù)防中。另外,作為在基因水平解析所有疾病的原因、個(gè)體間的疾病易感性(易患疾病)、個(gè)體間的藥效的差異等的方法,廣泛地進(jìn)行點(diǎn)突變、所謂的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測(cè)。點(diǎn)突變的通常才全測(cè)方法可以舉出(1)利用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增試樣的目標(biāo)DNA的相當(dāng)于檢測(cè)對(duì)象序列的區(qū)域,再對(duì)其全基因序列進(jìn)行解析的直接測(cè)序法;(2)利用PCR擴(kuò)增試樣的目標(biāo)DNA的相當(dāng)于4全測(cè)對(duì)象序列的區(qū)域,通過(guò)隨上述一全測(cè)對(duì)象序列有無(wú)目標(biāo)突變而切斷作用不同的限制酶,將該擴(kuò)增產(chǎn)物切斷,進(jìn)行電泳從而進(jìn)行分型的RFLP解析;(3)使用目標(biāo)突變位于3,末端區(qū)域的引物進(jìn)行PCR,通過(guò)有無(wú)擴(kuò)增來(lái)判斷突變的ASP-PCR法等。但是,這些方法例如必須進(jìn)行由試樣提取的DNA的精制、電泳、限制酶處理等,因此需要功夫和成本。另外,進(jìn)行PCR后,有必要暫時(shí)開啟反應(yīng)容器,因此有上述擴(kuò)增產(chǎn)物混入到之后的反應(yīng)體系內(nèi)、解析精度降低的顧慮。而且,由于自動(dòng)化困難,因此無(wú)法解析大量的樣品。另外,上述(3)的ASP-PCR法,還存在特異性低的問(wèn)題。由該問(wèn)題出發(fā),近年來(lái)作為點(diǎn)突變的^r測(cè)方法,正在實(shí)施對(duì)由目標(biāo)核酸和纟罙針形成的雙鏈核酸的融解溫度(Tm)進(jìn)行解析的方法。這種方法由于通過(guò)Tm解析或上述雙鏈的融解曲線的解析來(lái)進(jìn)行,因此稱作融解曲線解析。其為如下的方法。即,首先使用與含有檢測(cè)目標(biāo)點(diǎn)突變的檢測(cè)對(duì)象序列互補(bǔ)的探針,形成檢測(cè)試樣的目標(biāo)單鏈DNA與上述探針的雜交體(雙鏈DNA)。接著,對(duì)該雜交產(chǎn)物實(shí)施加熱處理,通過(guò)吸光度等信號(hào)的變動(dòng)來(lái)檢測(cè)隨著溫度上升的雜交體的解離(融解)。然后,根據(jù)該檢測(cè)結(jié)果確定Tm值,從而判斷有無(wú)點(diǎn)突變。在雜交產(chǎn)物的同源性越高時(shí)Tm值越高、同源性越低時(shí)Tm值越低。因此,對(duì)于含有點(diǎn)突變的檢測(cè)對(duì)象序列和與其互補(bǔ)的探針形成的雜交產(chǎn)物,預(yù)先求得Tm值(評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)值),測(cè)定檢測(cè)試樣的目標(biāo)單鏈DNA和上述探針的Tm值(測(cè)定值)。上述測(cè)定值與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)值相同時(shí),則可以判斷為匹配、即目標(biāo)DNA存在點(diǎn)突變,測(cè)定值低于評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)值時(shí),則可以判斷為錯(cuò)配、即目標(biāo)DNA不存在點(diǎn)突變。而且,通過(guò)該方法還可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。但是,對(duì)于利用此類Tm解析的^r測(cè)方法而言,存在PCR中必須特異且高效地?cái)U(kuò)增含有檢測(cè)目標(biāo)位點(diǎn)的區(qū)域的問(wèn)題。特別是,肥胖基因中很受重視的(32AR基因、133AR基因和UCP1基因分別存在多種同工酶,編碼這些同工酶的序列也非常相似。因此,在PCR中存在除了作為目標(biāo)的這些基因以外,同工酶的編碼基因也被擴(kuò)增的可能性。此外,如上所述地其它同工酶的編碼基因也被擴(kuò)增的情況,也成為例如P2AR基因、P3AR基因和UCP1基因的各多態(tài)性的解析(非專利文獻(xiàn)l~3)中解析結(jié)果可信度降低的原因。因此,由于即使解析l個(gè)樣品也要伴隨極大的勞動(dòng)力,存在在解析大量樣品中不實(shí)用的問(wèn)題。非專利文獻(xiàn)l:PMID:9399966JClinInvest.1997Dec15;100(12):3184-8.非專利文獻(xiàn)2:PMID:9049481Diabetologia.1997Feb;40(2):200-4.
      發(fā)明內(nèi)容因此,本發(fā)明的目的在于提供一種用于通過(guò)基因擴(kuò)增法特異性擴(kuò)增選自由P2AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少一個(gè)肥胖基因的目標(biāo)區(qū)域的引物對(duì)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明的引物對(duì),其特征在于,其為用于通過(guò)基因擴(kuò)增法擴(kuò)增肥胖基因的引物對(duì),上述肥胖基因是選自由P2AR基因、卩3AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少一個(gè)基因,所述引物對(duì)包含選自由下述引物對(duì)(1)~(3)所組成的組中的至少一個(gè)引物對(duì)。引物對(duì)(1):包含含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一個(gè)引物對(duì)(Fl):下列寡核苷酸中的至少一個(gè)與序列號(hào)1的堿基序列中的、以第4248位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1堿基、向著5'方向到第18~25個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少l個(gè)寡核香酸,該寡核苷酸以上述胸腺嘧啶堿基(T)作為3'末端和與序列號(hào)1的堿基序列中的、以第4250位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1位堿基、向著5'方向到第18-26個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以上述胸腺嘧啶堿基(T)作為3'末端(Rl):下列寡核香酸中的至少一個(gè)與序列號(hào)1的堿基序列中的、以第4292位的腺嘌呤堿基(A)作為第1位堿基、向著3'方向到第21~31個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以與上述第4292位的腺。票呤堿基(A)互補(bǔ)的胸腺嘧啶堿基(T)作為3'末端和與序列號(hào)1的堿基序列中的、以第4301位的腺噤呤堿基(A)作為第1位堿基、向著3'方向到第18~27個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少1個(gè)寡核苦酸,該寡核苷酸以與上述第4301位的腺嘌呤堿基(A)互補(bǔ)的胸腺嘧啶堿基(T)作為3'末端引物對(duì)(2):包含含有下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一個(gè)引物對(duì)(F2):與序列號(hào)2的堿基序列中的、以第4110位的胞嘧啶堿基(C)作為第1位堿基、向著5'方向到第16~20個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少l個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(C)作為3'末端(R2):與序列號(hào)2的堿基序列中的、以第4172位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1位堿基、向著3'方向到第15~19個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以與上述第4172位的鳥噪呤堿基(G)互補(bǔ)的胞嘧啶堿基(C)作為3'末端引物對(duì)(3):包含含有下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一個(gè)引物對(duì)(F3):與序列號(hào)3的堿基序列中的、以第280位的胞嘧啶堿基(C)作為第1位堿基、向著5'方向到第25~44個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少l個(gè)寡核香酸,該寡核苦酸以上述胞嘧啶堿基(C)作為3'末端(R3):與序列號(hào)3的堿基序列中的、以第350位的胞嘧啶堿基(C)作為第1位;咸基、向著3'方向到第23~38個(gè)^咸基的區(qū)域互補(bǔ)的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以與上述第350位的胞嘧啶堿基(C)互補(bǔ)的鳥。票呤堿基(G)作為3'末端此外,本發(fā)明的基因擴(kuò)增用試劑,其特征在于,其為用于通過(guò)基因擴(kuò)增法擴(kuò)增肥胖基因的試劑,上述肥胖基因是選自由卩2AR基因、P3AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少一個(gè)基因,所述試劑包含上述本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì)。本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法,其特征在于,其為通過(guò)基因擴(kuò)增法制造肥胖基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的方法,上述肥胖基因是選自由(32AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少一個(gè)基因,所述方法包含下述(I)步驟。(I)以試樣中的核酸作為模板,使用本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì),在反應(yīng)液中擴(kuò)增上述選自由P2AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少一個(gè)基因的步驟本發(fā)明的多態(tài)性解析方法,其特征在于,其為解析肥胖基因中的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的多態(tài)性的方法,上述肥胖基因是選自由f32AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少一個(gè)基因,所述方法包含下述(i)~(iv)步驟。(i)通過(guò)本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法,在反應(yīng)液中擴(kuò)增上述選自由卩2AR基因、P3AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因中含有檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的區(qū)域的步驟(ii)準(zhǔn)備反應(yīng)液的步驟,所述反應(yīng)液含有上述(i)步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物和能夠與上述選自由p2AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)雜交的探針(iii)改變上述反應(yīng)液的溫度,測(cè)定上述擴(kuò)增產(chǎn)物和上述探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號(hào)值的步驟(iv)根據(jù)伴隨溫度變化的上述信號(hào)值的變動(dòng),確定上述選自由132AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因中的^r測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的多態(tài)性的步驟根據(jù)本發(fā)明的引物,可以在反應(yīng)液中特異且高效地?cái)U(kuò)增選自由卩2AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少一個(gè)肥胖基因中的、含有發(fā)生檢測(cè)目標(biāo)多態(tài)性的位點(diǎn)的目標(biāo)區(qū)域。因此,與上述的現(xiàn)有方法不同,可以減少功夫和成本。另外,由于如此特異地?cái)U(kuò)增上述肥胖基因中含有發(fā)生特定多態(tài)性的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的區(qū)域,再通過(guò)使用例如與含有檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的檢測(cè)對(duì)象序列互補(bǔ)的探針,可以使用上述反應(yīng)液直接進(jìn)行Tm解析、并進(jìn)行所述多態(tài)性的分型。另外,由于可以在一個(gè)反應(yīng)液中進(jìn)行擴(kuò)增、多態(tài)性的分型,因此還能夠?qū)崿F(xiàn)操作的自動(dòng)化。而且,當(dāng)使用本發(fā)明的引物對(duì)時(shí),例如即便是含有雜質(zhì)的試樣(例如全血或口腔粘膜等),也可以省略預(yù)處理、因此,能夠更為迅速且簡(jiǎn)單地進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。另外,當(dāng)使用本發(fā)明的引物對(duì)時(shí),可以以優(yōu)于以往的擴(kuò)增效率進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),因此還能夠縮短擴(kuò)增反應(yīng)。因此,通過(guò)本發(fā)明的引物對(duì)、含有其的試劑以及使用它們的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法和多態(tài)性解析方法,可以迅速且簡(jiǎn)單的解析選自由(32AR基因、P3AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少一個(gè)肥胖基因的多態(tài)性,在醫(yī)療領(lǐng)域是非常有效的。圖l是表示本發(fā)明的實(shí)施例1中的Tm解析結(jié)果的圖。圖2是表示本發(fā)明的上述實(shí)施例l中的Tm解析結(jié)果的圖。圖3是表示本發(fā)明的上述實(shí)施例l中的Tm解析結(jié)果的圖。圖4是表示本發(fā)明的實(shí)施例2中的Tm解析結(jié)果的圖。圖5是表示本發(fā)明的實(shí)施例3中的Tm解析結(jié)果的圖。圖6是表示比較例中的Tm解析結(jié)果的圖。圖7是表示本發(fā)明的實(shí)施例4中的Tm解析結(jié)果的圖。具體實(shí)施方式<肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì)>本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì),如上所述,其特征在于,含有選自由上述引物對(duì)(1)~(3)所組成的組中的至少1個(gè)引物對(duì)。由于含有至少任一個(gè)引物對(duì),因此,能夠特異性擴(kuò)增例如選自由(32AR基因、f33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少一個(gè)肥胖基因中的特定的目標(biāo)區(qū)域。本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì),例如可以僅含有上述引物對(duì)(1)~(3)中的任意一種,也可以含有任意兩種或者引物對(duì)(1)~(3)的全部。如后所述,通過(guò)引物對(duì)(1)可特異性擴(kuò)增出的目標(biāo)區(qū)域是P2AR基因中含有發(fā)生特定多態(tài)性的位點(diǎn)(序列號(hào)1中第4265位)的區(qū)域,通過(guò)引物對(duì)(2)可特異性擴(kuò)增出的目標(biāo)區(qū)域是(33AR基因中含有發(fā)生特定多態(tài)性的位點(diǎn)(序列號(hào)2中第4134位)的區(qū)域,通過(guò)引物對(duì)(3)可特異性擴(kuò)增出的目標(biāo)區(qū)域是UCP1基因中含有發(fā)生特定多態(tài)性的位點(diǎn)(序列號(hào)3中第292位)的區(qū)域。如上所述,已知肥胖基因(32AR基因、(33AR基因和UCP1基因的各自的特定的多態(tài)性都是對(duì)代謝有影響的多態(tài)性。因此,不僅要重視研究任意一種基因的多態(tài)性,研究任意2種基因或者所有3種基因的多態(tài)性都應(yīng)予以重視。但是,傳統(tǒng)方法存在無(wú)法在l個(gè)反應(yīng)體系中解析多個(gè)序列的問(wèn)題。如上所述,認(rèn)為這是由于上述各肥胖基因存在多個(gè)同工酶,在PCR中連上述各基因以外的同工酶的編碼基因也被擴(kuò)增。因此,為了研究(32AR基因、卩3AR基因和UCP1基因中2種基因的多態(tài)性或者所有3種基因的多態(tài)性,需要在各個(gè)反應(yīng)體系中分別擴(kuò)增含有各個(gè)多態(tài)性發(fā)生位點(diǎn)的區(qū)域,再各自解析所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。這樣一來(lái),傳統(tǒng)的方法很難做到僅以肥胖基因中的上述特定的基因作為模板、并僅特異性擴(kuò)增各基因中分別含有上述多態(tài)性發(fā)生位點(diǎn)的2種或3種目標(biāo)區(qū)域。因此,如上所述,解析l個(gè)樣品就需要大量的勞動(dòng)力,導(dǎo)致解析大量樣品中不實(shí)用的問(wèn)題。針對(duì)這一點(diǎn),通過(guò)使用本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì),即便在含有上述引物對(duì)(1)~(3)中的任意2種或所有3種的情況下,也可以在同一反應(yīng)液中同時(shí)且特異性擴(kuò)增各個(gè)目標(biāo)區(qū)域。因此,與上述傳統(tǒng)方法不同,能夠降低時(shí)間和成本。此外,如上所述,由于可以在同一反應(yīng)液中特異性擴(kuò)增2個(gè)或者3個(gè)目標(biāo)區(qū)域,再通過(guò)j吏用與各個(gè)目標(biāo)區(qū)域中的檢測(cè)對(duì)象序列互補(bǔ)的探針,則可以使用上述反應(yīng)液直接進(jìn)行Tm解析、對(duì)上述2種或者3種多態(tài)性分別進(jìn)行分型。如上所述,由于可以在同一反應(yīng)液中對(duì)(32AR基因、卩3AR基因和UCP1基因中的2種或3種基因中的特定的多態(tài)性進(jìn)行解析,因此本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì)優(yōu)選例如含有引物對(duì)(1)~(3)中任一種,還優(yōu)選含有任意2種或3種。使用這樣的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì),當(dāng)然可以擴(kuò)增l個(gè)目標(biāo)區(qū)域,若同時(shí)擴(kuò)增2個(gè)或者3個(gè)目標(biāo)區(qū)域,則可以比目前方法更高效地對(duì)上述肥胖基因進(jìn)行多態(tài)性解析。此外,以下有時(shí)將正向引物稱為F引物,將反向引物稱為R引物。首先,對(duì)用于擴(kuò)增P2AR基因的引物對(duì)(1)進(jìn)行說(shuō)明。引物對(duì)(1)如上所述是包含含有下述(Fl)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl)的寡核苷酸的反向引物的一對(duì)引物對(duì)。(Fl):下列寡核苷酸中的至少一個(gè)與序列號(hào)1的堿基序列中的、以第4248位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1堿基、向著5'方向到第18~25個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少l個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以上述胸腺嘧啶堿基(T)作為3'末端和與序列號(hào)1的堿基序列中的、以第4250位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1位堿基、向著5'方向到第18~26個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少l個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以上述胸腺嘧啶堿基(T)作為3'末端(Rl):下列寡核苷酸中的至少一個(gè)與序列號(hào)1的堿基序列中的、以第4292位的腺嘌呤堿基(A)作為第1位堿基、向著3'方向到第21~31個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以與上述第4292位的腺。票呤堿基(A)互補(bǔ)的胸腺嘧啶堿基(T)作為3'末端和與序列號(hào)1的堿基序列中的、以第4301位的腺嘌呤堿基(A)作為第1位堿基、向著3,方向到第18~27個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少1個(gè)寡核香酸,該寡核苷酸以與上述第4301位的腺噤呤堿基(A)互補(bǔ)的胸腺嘧啶堿基(T)作為3'末端序列號(hào)l表示的堿基序列是編碼人(Homosapiens)源的(32腎上腺素受體蛋白(Homosapiensadrenergic,beta-2-,receptor,surface;ADR卩2(|32AR))的ADRp2基因的全長(zhǎng)序列,例如,NCBI登錄號(hào)為No.DQ094845的序列。以下,也將該引物對(duì)(1)稱為"(32AR基因用引物對(duì)"。上述I32AR基因用引物對(duì)是用于擴(kuò)增序列號(hào)l中的、含有第4249~429H立的區(qū)i或、第4249~430(H立的區(qū)i或、第4251~429U立的區(qū)域或者第4251~4300位的區(qū)域的DNA鏈及其互補(bǔ)鏈的引物對(duì)。已知該區(qū)域內(nèi)的第4265位堿基(序列號(hào)l中的第4265位堿基)存在點(diǎn)突變(4265A、4265G)。如果第4265位堿基是A,則(32AR基因被翻譯為蛋白質(zhì)時(shí),氨基酸16位是精氨酸(Arg);第4265位的堿基突變?yōu)镚的情況下,呈現(xiàn)出氨基酸16位為甘氨酸(Gly)的多態(tài)性。進(jìn)而,在純合子的情況下,這些多態(tài)性可以表示為4265A/4265A、4265G/4265G,在雜合子的情況下,這些多態(tài)性可以表示為4265A/4265G。此外,在用氨基酸表示的情況下,4265A/4265A可以表示為Arg-16/Arg-16,4265G/4265G可以表示為Gly-16/Gly-16,4265A/4265G可以表示為Arg-16/Gly-16,這種用氨基酸進(jìn)行的表示是目標(biāo)基因(32AR基因的多態(tài)性的常見表示。進(jìn)而,在僅解析(32AR基因的上述多態(tài)性的情況下,可以僅使用P2AR基因用引物對(duì)。在本發(fā)明中,p2AR基因用引物對(duì)的F1引物和R1引物,只要用于決定DNA聚合酶擴(kuò)增起始點(diǎn)的3,末端的堿基滿足上述條件即可。通過(guò)如上所述固定各引物的3,末端的堿基,可以充分防止p2AR基因用引物對(duì)與例如相似的其它同工酶的基因(例如,(31AR基因等)結(jié)合。如上所述,由于只需要固定F1引物和R1引物的3,末端的堿基,因此對(duì)各引物的長(zhǎng)度本身并沒有特殊的限定,可以適當(dāng)調(diào)整為一般的長(zhǎng)度。作為引物長(zhǎng)度的一個(gè)例子,例如為13~50mer的范圍,優(yōu)選1445mer,更優(yōu)選1540mer。作為具體例子,上述F1引物優(yōu)選如下與序列號(hào)l的堿基序列中的、以第4248位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1堿基、向著5,方向到第1825個(gè)堿基(優(yōu)選第19~24個(gè)堿基,更優(yōu)選第19~23個(gè)堿基)的區(qū)域序列相同的至少l個(gè)寡核苷酸、或者是與序列號(hào)1的堿基序列中的、以第4250位的胸腺嘧啶石威基(T)作為第l位石威基、向著5'方向到第18~26個(gè)堿基(優(yōu)選第19~24個(gè)堿基,更優(yōu)選第19~22個(gè)堿基)的區(qū)域序列相同的至少l個(gè)寡核苷酸。此外,上述Rl引物優(yōu)選如下與序列號(hào)l的堿基序列中的、以第4292位的腺。票呤堿基(A)作為第l位堿基、向著3,方向到第21~31個(gè)堿基(優(yōu)選22~30個(gè)i威基、更優(yōu)選23~28個(gè)石威基)的區(qū)域互補(bǔ)的至少l個(gè)寡核苷酸。進(jìn)而,由于F1引物和R1引物的3,末端被固定,因此從引物延伸出的區(qū)域例如如上所述為序列號(hào)1中的第4249~429"立的區(qū)i或、4249~430(H立的區(qū)i或、4251~429H立的區(qū)域或者第4251位~4300位的區(qū)域,所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的全長(zhǎng)隨使用的引物的長(zhǎng)度而變化。此外,Rl引物可以是與序列號(hào)l表示的堿基序列不完全互互補(bǔ)的寡核苦酸。也就是說(shuō),各引物中除3,末端的堿基以外的部分可以與完全互補(bǔ)的寡核苷酸有l(wèi)個(gè)~5個(gè)石威基不同。構(gòu)成R1引物的寡核苷酸中,與序列號(hào)1的堿基序列中第4298位互補(bǔ)的石威基可以是胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G)中的任意一個(gè)。更優(yōu)選同時(shí)使用與第4298位互補(bǔ)的堿基是胞嘧啶的寡核苷酸以及與第4298位互補(bǔ)的堿基是鳥噤呤的寡核苷酸兩者作為Rl引物。已知序列號(hào)l的堿基序列中第4298位的堿基有多態(tài)性(4298C、4298G),但是本發(fā)明并不以該部分中的多態(tài)性為檢測(cè)目標(biāo)。因此,通過(guò)使用上述兩種寡核苷酸作為R1引物,無(wú)論是4298C和4298G中的哪一種,都可以通過(guò)上述引物進(jìn)行基因擴(kuò)增,可以充分避免檢測(cè)目標(biāo)以外的多態(tài)性對(duì)目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增的影響。與第4298位互補(bǔ)的堿基是胞嘧啶的寡核苷酸和與第4298位互補(bǔ)的堿基是烏噤呤的寡核普酸的比例沒有特別的限定,例如,優(yōu)選摩爾比為l:10~10:1。以下,示意出F1引物和R1引物的具體例子,但是本發(fā)明不限定于此。進(jìn)而,序列號(hào)1222的堿基序列中的"s"表示胞嘧啶(C)或者鳥嘌呤(G),相當(dāng)于與序列號(hào)1第4298位互補(bǔ)的堿基。此外,對(duì)這些F1引物和R1引物的組合也沒有任何限定,其中,特別優(yōu)選包含含有序列號(hào)9或序列號(hào)109的寡核苷酸的F1,引物、物的引物對(duì)(r)。進(jìn)而,含有序列號(hào)i2的寡核苷酸以及含有序列號(hào)18的寡核苷酸的Rl,引物,如上所述優(yōu)選同時(shí)含有"s"是胞嘧啶的寡核苷酸、和"s"是鳥嘌呤的寡核苷酸兩者。下表中的"Tm(°C)"是下表的序列和與其完全互補(bǔ)的序列雜交的情況下的Tm(°C),是通過(guò)MELTCALC4欠4牛(http:〃www.meltcalc.com)將參數(shù)設(shè)為寡核苷酸濃度0.2jiM、鈉當(dāng)量(Naeq.)50mM而計(jì)算出來(lái)的(以下相同)。上述Tm值可以通過(guò)例如目前已知的MELTCALC軟件(http:〃www.meltcalc.com)等算出來(lái),此外,還可以通過(guò)領(lǐng)接法(NearestNeighborMethod)確定(以下相同)。下表中,記載了與序列號(hào)1的第4298位的堿基互補(bǔ)的堿基"s"是鳥噤呤的Rl引物的一個(gè)例子的Tm值。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>然后,對(duì)用于擴(kuò)增P3AR基因的引物對(duì)(2)進(jìn)行說(shuō)明。上述引物對(duì)(2),如上所述,是包含含有下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一對(duì)引物對(duì)。(F2):與序列號(hào)2的堿基序列中的、以第4110位的胞嘧啶堿基(C)作為第1位堿基、向著5'方向到第16~20個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(C)作為3'末端(R2):與序列號(hào)2的堿基序列中的、以第4172位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1位堿基、向著3'方向到第15~19個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以與上述第4172位的鳥嘌呤堿基(G)互補(bǔ)的胞嘧啶堿基(C)作為3'末端序列號(hào)2表示的堿基序列是編碼人源的(33腎上腺素受體蛋白(Homosapiensadrenergic,beta畫3-,receptor;ADR(33((33AR))的ADR(33基因的全長(zhǎng)序列,例如NCBI登錄號(hào)為No.DQ104441的序列。以下,也將該引物對(duì)(2)稱為"p3AR基因用引物對(duì)"。上述I33AR基因用引物對(duì)是用于擴(kuò)增序列號(hào)2中的、含有第4111~4171位的區(qū)域的DNA鏈及其互補(bǔ)《連的引物對(duì)。已知該區(qū)域內(nèi)的第4134位堿基(序列號(hào)2中的第4134位堿基)存在點(diǎn)突變(4134T、4134C)。如果第4134位堿基是T,則卩3AR基因被翻譯為蛋白質(zhì)時(shí),氨基酸64位為色氨酸(Trp),第4134位的堿基突變?yōu)镃的情況下,呈現(xiàn)出氨基酸64位變?yōu)榫彼?Arg)的多態(tài)性。進(jìn)而,在純合子的情況下,這些多態(tài)性可以表示為4134T/4134T或4134C/4134C,在雜合子的情況下,這些多態(tài)性可以表示為4134T/4134C。此外,在用氨基酸表示的情況下,4134T/4134T可以表示為Trp-64/Trp-64,4134C/4134C可以表示為Arg-64/Arg-64,4134T/4134C可以表示為Trp-64/Arg-64,這種用氨基酸進(jìn)行的表示是目標(biāo)基因(33AR基因的多態(tài)性的常見表示。進(jìn)而,在僅解析f33AR基因的多態(tài)性的情況下,可以僅使用(33AR基因用引物對(duì)。!33AR基因用引物對(duì)的F2引物和R2引物,只要用于決定DNA聚合酶擴(kuò)增起始點(diǎn)的3,末端的堿基滿足上述條件即可。通過(guò)如上所述固定各引物的3,末端的堿基,可以充分防止(33AR基因用引物對(duì)與例如相似的其它同工酶基因(例如,(31AR基因等)結(jié)合。出于與上述I32AR基因用引物對(duì)相同的理由,F(xiàn)2引物和R2引物只要用于決定DNA聚合酶擴(kuò)增起始點(diǎn)的3,末端的堿基滿足上述條件即可。因此,F(xiàn)2引物和R2引物的長(zhǎng)度本身并沒有特殊的限定,可以例舉與上述相同的長(zhǎng)度。作為具體例子,上述F2引物優(yōu)選如下與序列號(hào)2的堿基序列中的、以第4110位的胞嘧啶堿基(C)作為第l位堿基、向著5,方向到第16~20個(gè)堿基(優(yōu)選第1720個(gè)石威基,更優(yōu)選第17~19個(gè)石威基)的區(qū)域序列相同的至少l個(gè)寡核苷酸。此外,上述R2引物優(yōu)選如下與序列號(hào)2的堿基序列中的、以第4172位的鳥。票呤堿基(G)作為第l位堿基、向著3,方向到第1519個(gè)堿基(優(yōu)選第16~19個(gè)堿基、更優(yōu)選第1618個(gè)堿基)的區(qū)域互補(bǔ)的至少l個(gè)寡核香酸。進(jìn)而,由于F2引物和R2引物的3,末端被固定,從引物延伸出的區(qū)域例如如上所述為序列號(hào)2中第4111~4171位的區(qū)域,所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的全長(zhǎng)隨使用的引物的長(zhǎng)度而變化。此外,R2引物可以是與序列號(hào)2表示的堿基序列不完全互補(bǔ)的寡核苷酸,F(xiàn)2引物可以是與上述堿基序列的互補(bǔ)鏈不完全互補(bǔ)的寡核香酸。也就是說(shuō),各引物除3,末端的堿基以外的部分中,與完全互補(bǔ)的寡核苷酸可以有l(wèi)個(gè)~5個(gè)堿基不同。以下,示意出F2引物和R2引物的具體例子,但是本發(fā)明不限定于此。此外,對(duì)這些F2引物和R2引物的組合也沒有任何限定,其中,特別優(yōu)選的是包含含有序列號(hào)24或序列號(hào)25的寡核苷酸的F2,引物、以及含有序列號(hào)28或序列號(hào)30的寡核苷酸的R2'引物的引物對(duì)(2')。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>然后,對(duì)用于擴(kuò)增UCP1基因的引物對(duì)(3)進(jìn)行說(shuō)明。上述引物對(duì)(3),如上所述,是包含含有下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一對(duì)引物對(duì)。(F3):與序列號(hào)3的堿基序列中的、以第280位的胞嘧啶堿基(C)作為第1位堿基、向著5'方向到第25~44個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少l個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基(C)作為3'末端(R3):與序列號(hào)3的堿基序列中的、以第350位的胞嘧啶堿基(C)作為第1位堿基、向著3'方向到第23~38個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苦酸以與上述第350位的胞嘧啶堿基(C)互補(bǔ)的鳥。票呤堿基(G)作為3'末端序列號(hào)3表示的堿基序列是編碼人源的解偶聯(lián)蛋白的5,多態(tài)性區(qū)域(Humanpolymorphicregion5'ofuncouplingprotein;UCP)的基因序列,例如,NCBI登錄號(hào)No.U28479所登錄的序列。以下,也將該引物對(duì)(3)稱為"UCP1基因用引物對(duì)"。上述UCP1基因用引物對(duì)是用于擴(kuò)增序列號(hào)3中的、含有第281~349位區(qū)域的DNA鏈及其互補(bǔ)鏈的引物對(duì)。已知該區(qū)域內(nèi)的第292位堿基(序列號(hào)3中的第292位堿基)存在點(diǎn)突變(292A、292G)。在純合子的情況下,這些多態(tài)性可以表示為292A/292A、292G/292G,在雜合子的情況下,這些多態(tài)性可以表示為292A/292G。進(jìn)而,序列號(hào)3中的第292位的堿基相當(dāng)于UCP1的mRNA中的-3826位(UCP1基因翻譯起始點(diǎn)的上游第-3826位)的堿基,上述多態(tài)性一般已知為-3826A/-3826A、-3826G/-3826G、畫3826A/-3826G。進(jìn)而,在僅解析UCP1基因的上述多態(tài)性的情況下,可以僅使用UCP1基因用引物對(duì)。F3引物和R3引物只要用于決定DNA聚合酶擴(kuò)增起始點(diǎn)的3'末端的堿基滿足上述條件即可。通過(guò)如上所述固定各引物的3'末端的堿基,可以充分防止UCP1基因用引物對(duì)與例如相似的其它同工酶基因(例如,UCP2、UCP3、UCP4基因等)結(jié)合。出于與(32AR基因用引物對(duì)相同的理由,UCP1基因用引物對(duì)的F3引物和R3引物只要用于決定DNA聚合酶擴(kuò)增起始點(diǎn)的3'末端的堿基滿足上述條件即可。因此,F(xiàn)3引物和R3引物的長(zhǎng)度本身并沒有特殊的限定,可以例舉與上述相同的長(zhǎng)度。作為具體例子,上述F3引物優(yōu)選如下與序列號(hào)3的堿基序列中的、以第280位的胞嘧啶堿基(C)作為第l位堿基、向著5,方向到第25~44個(gè)堿基(優(yōu)選第30~40個(gè)堿基,更優(yōu)選第32~37個(gè)堿基)的區(qū)域序列相同的至少l個(gè)寡核苷酸。上述R3引物優(yōu)選如下與序列號(hào)3的堿基序列中的、以第350位的胞嘧啶堿基(C)作為第1位堿基、向著3,方向到第23~38個(gè)堿基(優(yōu)選第25~36個(gè)堿基、更優(yōu)選第26~32個(gè)堿基)的區(qū)域互補(bǔ)的至少l個(gè)寡核苷酸。進(jìn)而,由于F3引物和R3引物的3,末端^皮固定,^Mv引物延伸出的區(qū)域例如如上所述為序列號(hào)3中的第281位~第349位的區(qū)域,所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的全長(zhǎng)隨使用的引物的長(zhǎng)度而變化。此外,R3引物可以是與序列號(hào)3表示的堿基序列不完全互互補(bǔ)的寡核香酸。也就是說(shuō),各引物除3,末端的堿基以外的部分中,與完全互補(bǔ)的寡核苷酸可以有l(wèi)個(gè)~5個(gè)堿基不同。構(gòu)成R3引物的寡核苷酸中,與序列號(hào)3的堿基序列中的第376位互補(bǔ)的石咸基可以是鳥。票呤(G)和胸腺嘧咬(T)中的任一個(gè)。更優(yōu)選同時(shí)使用與第376位互補(bǔ)的堿基是鳥嘌呤的寡核苷酸、及與第376位互補(bǔ)的堿基是胸腺嘧啶的寡核苷酸二者作為R3引物。已知序列號(hào)3的堿基序列中第376位的堿基有多態(tài)性(376C、376A),但是本發(fā)明并不以該部分中的多態(tài)性為檢測(cè)目標(biāo)。因此,通過(guò)使用上述兩種寡核香酸作為R3引物,不論是376C和376A中的哪一種,都可以通過(guò)上述引物進(jìn)行基因擴(kuò)增,可以充分避免檢測(cè)目標(biāo)以外的多態(tài)性對(duì)目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增的影響。與第376位互補(bǔ)的堿基是鳥嘌呤的寡核苷酸和與第376位互補(bǔ)的堿基是胸腺嘧啶的寡核苷酸的比例沒有特別的限定,例如優(yōu)選摩爾比為l:10~10:1。以下,示意出F3引物和R3引物的具體例子,但是本發(fā)明不限定于此。進(jìn)而,序列號(hào)5364的堿基序列中的"k,,表示鳥噤呤(G)或者胸腺嘧啶(T),下表的序列號(hào)53~64中記載了與序列號(hào)3的第376位堿基互補(bǔ)的堿基是鳥噤呤或者胸腺嘧咬的情況下各自的Tm值。對(duì)這些F3引物和R3引物的組合也沒有任何限定,其中,特別優(yōu)選包含含有序列號(hào)43的寡核苷酸的F3,引物、以及含有序列號(hào)63的寡核苷酸的R3,引物的引物對(duì)(3,)。進(jìn)而,含有序列號(hào)63的寡核苷酸的R3,引物,如上所述,優(yōu)選同時(shí)含有"k"是鳥嘌呤的寡核香酸和"k"是胸腺嘧啶的寡核苦酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>此外,例如為了升高擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)溫度,上述引物對(duì)(1)~(3)的各引物還可以在5,末端添加目前已知的任意序列。含有此類引物對(duì)(l)~(3)中的至少一個(gè)的本發(fā)明肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì),優(yōu)選例如在擴(kuò)增全血試樣等生物試樣中的肥胖基因時(shí)使用。特別是,將本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì)與如后所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針同時(shí)使用的時(shí)候,基因擴(kuò)增用反應(yīng)液中全血試樣的添加比例優(yōu)選為0.1~0.5體積%。關(guān)于該點(diǎn),容后再敘。<肥胖基因擴(kuò)增用試劑>如上所述,本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用試劑,其特征在于,其是用于通過(guò)基因擴(kuò)增法擴(kuò)增肥胖基因的試劑,上述肥胖基因是選自由卩2AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因,所述試劑含有本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì)。本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用試劑,以含有本發(fā)明的引物對(duì)為特征,對(duì)于此外的組成等沒有任何限定。為了檢測(cè)使用本發(fā)明引物對(duì)通過(guò)基因擴(kuò)增法獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物,本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用試劑,例如可以進(jìn)一步含有能與上述肥胖基因的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)雜交的,探針。如上所述,利用本發(fā)明的引物對(duì),例如可以根據(jù)其所含的引物對(duì)(1)~(3)的種類,通過(guò)基因擴(kuò)增法,分別特異性擴(kuò)增3種肥胖基因各自的區(qū)域。因此,通過(guò)同時(shí)存在有與上述肥胖基因目標(biāo)區(qū)域中的檢測(cè)對(duì)象序列互補(bǔ)的(能夠雜交的)探針,例如能夠通過(guò)后述的方法檢測(cè)擴(kuò)增的有無(wú)、檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的基因型(多態(tài)性)等。此類探針、其利用方法將在后面的多態(tài)性解析方法中說(shuō)明。此外,本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用試劑,優(yōu)選用在擴(kuò)增全血等生物試樣中的肥胖基因時(shí)。特別是,本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用試劑,在與如上所述的探針一同使用時(shí),優(yōu)選基因擴(kuò)增用反應(yīng)液中全血試樣的添加比例為O.l~0.5體積%。進(jìn)而,在本發(fā)明中,"沖全測(cè)對(duì)象序列"意指含有發(fā)生多態(tài)性的位點(diǎn)(檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn))的序列。本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用試劑的形態(tài)沒有特別的限定,例如,可以是含有本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì)的液體試劑,也可以是在使用前用溶劑懸浮的干燥試劑。此外,對(duì)肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì)的含量也沒有特別的限定。<擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法>本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法,如上所述,其特征在于,200780034278.9說(shuō)明書第22/60頁(yè)其為通過(guò)基因擴(kuò)增法制造肥胖基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的方法,上述肥胖基因?yàn)檫x自由(32AR基因、P3AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因,所述方法含有下述(I)步驟。(I)以試樣中的核酸作為模板,使用本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì),在反應(yīng)液中擴(kuò)增上述選自由(32AR基因、卩3AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因的步驟。如上通過(guò)使用本發(fā)明的引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),如上所述,可以擴(kuò)增肥胖基因的目標(biāo)區(qū)域。此外,在本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì)含有上述引物對(duì)(1)~(3)中任意2種的情況下,可以對(duì)任意2種肥胖基因在同一反應(yīng)液中同時(shí)擴(kuò)增含有各自檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的目標(biāo)區(qū)域。此外,在本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì)含有上述引物對(duì)(l)~(3)的全部的情況下,可以對(duì)上述全部3種肥胖基因在同一反應(yīng)液中同時(shí)擴(kuò)增含有各自檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的目標(biāo)區(qū)域。利用本發(fā)明所擴(kuò)增出的目標(biāo)區(qū)域,如上所述,是各肥胖基因中分別含有發(fā)生各多態(tài)性的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的區(qū)域。進(jìn)而,本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法以使用本發(fā)明的引物對(duì)為特征,對(duì)基因擴(kuò)增法的種類、條件等沒有任何限定。上述基因擴(kuò)增法如上所述并無(wú)特別限定,例如可以舉出PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶鏈反應(yīng))法、NASBA(Nucleicacidsequencebasedamplification,基于才亥酸序歹寸的才廣增)法、TMA(Transcriptionmediatedamplification,轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增)法、SDA(StrandDisplacementAmplification,《連置4灸擴(kuò)增)法等,優(yōu)選PCR法。另外,以下以PCR法為例說(shuō)明本發(fā)明,但并非局限于此。作為適用本發(fā)明的試樣,例如只要含有成為模板的核酸即可,并無(wú)特別限定,例如優(yōu)選應(yīng)用于含有雜質(zhì)的試樣。作為上述含有雜質(zhì)的試樣例如可以舉出全血、口腔內(nèi)細(xì)胞(例如口腔粘膜)、指曱或毛發(fā)等體細(xì)胞、生殖細(xì)胞、吐出的痰液、羊水、石蠟包埋組織、尿、胃液(例如胃洗滌液)等、它們的混懸液是含有各種雜質(zhì)的試樣(特別是全血或口腔細(xì)胞等生物試樣),也不易受雜質(zhì)影響,可以特異地?cái)U(kuò)增3種肥胖基因各自的目標(biāo)區(qū)域。因此,通過(guò)本發(fā)明,即便是通過(guò)以往方法較難測(cè)定的雜質(zhì)多的試樣,也可以不進(jìn)行例如精制等預(yù)處理而直接使用。因此,從試樣的預(yù)處理的觀點(diǎn)出發(fā),可以-說(shuō)可以4交以往方法更為迅速地制造擴(kuò)增產(chǎn)物。上述反應(yīng)液中的試樣添加比例并無(wú)特別限定。作為具體例,當(dāng)上述試樣為生物試樣(例如全血試樣)時(shí),上述反應(yīng)液中的添加比例的下限優(yōu)選為例如0.01體積%以上、更優(yōu)選為0.05體積%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為0.1體積%以上。上述添加比例的上限并無(wú)特別限定,例如優(yōu)選為2體積%以下、更優(yōu)選為1體積%以下、進(jìn)一步優(yōu)選為0.5體積%以下。另外,以如后所述的光學(xué)檢測(cè)為目的時(shí),特別是進(jìn)行使用標(biāo)記纟笨針的光學(xué)#r測(cè)時(shí),全血試樣這類生物試樣的添加比例例如優(yōu)選設(shè)定為O.l~0.5體積%。在PCR反應(yīng)中,通常為了使DNA變性(解離成單鏈DNA)而實(shí)施加熱處理,但由于該加熱處理,試樣所含的糖、蛋白質(zhì)等變性,有產(chǎn)生不溶沉淀物、混濁等的顧慮。因此,在利用光學(xué)方法確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)、檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的基因型(多態(tài)性)時(shí),這種沉淀物、混濁的發(fā)生有可能對(duì)測(cè)定精度造成影響。<旦是,通過(guò)將反應(yīng)液中的全血試樣的添加比例設(shè)定在上述范圍內(nèi),雖然原理不明,^f旦可以充分防止變性所產(chǎn)生的沉淀物等造成的影響,因此可以提高光學(xué)方法的測(cè)定精度。另外,由于還可充分地抑制全血試樣中的雜質(zhì)對(duì)PCR的干擾,因此可以進(jìn)一步提高擴(kuò)增效率。因而,在使用本發(fā)明的引物對(duì)的基礎(chǔ)上,通過(guò)進(jìn)一步將全血試樣等試樣的添加比例設(shè)定在上述范圍內(nèi),可以進(jìn)一步排除試樣預(yù)處理的必要性。另外,上述反應(yīng)液中的全血試樣的比例不僅可以用上述體積比例(例如O.l~0.5體積%),還可以用血紅蛋白(以下稱作"Hb")的重量比例表示。此時(shí),上述反應(yīng)液中的全血試樣的比例換算為Hb例如優(yōu)選為0.565~113g/L的范圍、更優(yōu)選為2.825~56.5g/L的范圍、進(jìn)一步優(yōu)選為5.65~28.25g/L的范圍。另夕卜,上述反應(yīng)液中的全血試樣的添加比例例如可以滿足上述體積比例和Hb重量比例兩者,也可以滿足任一者。作為全血,例如可以是溶血的全血、未溶血的全血、抗凝固全血、含有凝固部分的全血等的任一種。本發(fā)明中,試樣所含的目標(biāo)核酸例如為DNA。上述DNA例如可以是生物試樣等試樣中原本含有的DNA,還可以是通過(guò)基因擴(kuò)增法擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物DNA。為后者時(shí),可以舉出利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(例如RT-PCR,逆轉(zhuǎn)錄PCR)由上述試樣原本含有的RNA(總RNA、mRNA等)產(chǎn)生的cDNA。本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法中,優(yōu)選在基因擴(kuò)增反應(yīng)開始前,向上述反應(yīng)液中添加白蛋白。通過(guò)這種白蛋白的添加,例如可以進(jìn)一步降低上述沉淀物、懸濁的產(chǎn)生所帶來(lái)的影響,且可以進(jìn)一步提高擴(kuò)增效率。具體地說(shuō),優(yōu)選在上述(I)步驟的擴(kuò)增反應(yīng)或解離為單鏈DNA的步驟前添加白蛋白。上述反應(yīng)液中白蛋白的添加比例例如為O.Ol~2重量%的范圍、優(yōu)選為0.1~1重量%、更優(yōu)選為0.2~0.8重量%。上述白蛋白并無(wú)特別限定,例如可以舉出牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、馬血清白蛋白等,這些物質(zhì)可以使用任一種,還可以并用兩種以上。然后,對(duì)于本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法列舉如下的例子進(jìn)行說(shuō)明,所述例子為對(duì)全血試樣,以DNA作為目標(biāo)核酸,使用含有上述引物對(duì)(1)~(3)的本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì),利用PCR在同一反應(yīng)液中同時(shí)制造(32AR基因、卩3AR基因和UCP1基因的各擴(kuò)增產(chǎn)物。進(jìn)而,本發(fā)明是以使用本發(fā)明的引物對(duì)為特征,對(duì)其它的構(gòu)成和條件沒有任何限定。首先,制備PCR反應(yīng)液。本發(fā)明的引物對(duì)的添加比例并無(wú)特別限定,優(yōu)選按照引物對(duì)(l)~(3)的F引物分別達(dá)到O.l~2nmol/L的方式進(jìn)行添加、更優(yōu)選為0.25~1.5^imol/L、特別優(yōu)選為0.5~lnmol/L。另外,優(yōu)選按照引物對(duì)(l)~(3)的R引物分別達(dá)到O.l~2fxmol/L的方式進(jìn)^亍添加、更優(yōu)選為0.25~1.5|imol/L、特別優(yōu)選為0.5~ljimol/L。各引物對(duì)中的F引物和R引物的添加比例(F:R,摩爾比)并無(wú)特別限定,例如優(yōu)選為1:0.25~1:4、更優(yōu)選為l:0.5~1:2。反應(yīng)液中全血試樣的比例并無(wú)特別限定,優(yōu)選上述范圍。全血試樣可以直^妻添加在反應(yīng)液中,還可以預(yù)先用水或緩沖液等溶劑稀釋后添加至反應(yīng)液中。預(yù)先稀釋全血試樣時(shí),其稀釋率并無(wú)特別限定,例如稀釋率可以按照反應(yīng)液中最終全血添加比例達(dá)到上述范圍來(lái)進(jìn)行設(shè)定,稀釋率例如設(shè)定為100~2000倍、優(yōu)選為200~IOOO倍。上述反應(yīng)液中的其它組成成分并無(wú)特別限定,可以舉出目前已知的成分,其比例也無(wú)特別限定。上述組成成分例如可以舉出DNA聚合酶、核苷酸(核苷三磷酸(dNTP))和溶劑。另外,如上所述,優(yōu)選上述反應(yīng)液中進(jìn)一步含有白蛋白。另外,上述反應(yīng)液中,各組成成分的添加順序并無(wú)任何限定。上述DNA聚合酶并無(wú)特別限定,例如可以使用目前已知的耐熱性細(xì)菌來(lái)源的聚合酶。具體例子有可以商業(yè)地獲得的來(lái)自棲熱水生菌(77zermwa《wa"cw)的DNA聚合酶(美國(guó)專利第4,889,818號(hào)以及美國(guó)專利第5,079,352號(hào))(商品名Taq聚合酶)、來(lái)自極端嗜熱菌(7T^rwwAwmop/n'/w)的DNA聚合酶(WO91/09950XrTthDNApolymerase)、來(lái)自強(qiáng)烈火球菌(/^/asM)的DNA聚合酶(WO92/9689)(PfuDNApolymerase:Stratagenes公司產(chǎn))、來(lái)自嗜熱球菌(77ze,ococcws/〃or幽)的DNA聚合酶(EP-A455430X商標(biāo)Vent:NewEnglandBiolabs公司產(chǎn))等,其中,優(yōu)選來(lái)自棲熱水生菌(TTzwmw"《wa"cw)的耐熱性DNA聚合酶。上述反應(yīng)液中DNA聚合酶的添加比例并無(wú)特別限定,例如為l100U/mL、優(yōu)選為550U/mL、更優(yōu)選為20~30U/mL。另外,DNA聚合酶的活性單位(U)—般是以活化鮭魚精子DNA為模板引物,在活性測(cè)定用反應(yīng)液中、74。C下、30分鐘內(nèi),將10nmo1的總核苷酸吸收到酸不溶性沉淀物中的活性作為1U。上述活性測(cè)定用反應(yīng)液的組成例如為25mMTAPSbuffer(pH9.3、25°C)、50mMKCl、2mMMgCl2、lmM巰基乙醇、200jJVldATP、200,dGTP、200一dTTP、100^iM"a-32P,,dCTP、0.25mg/mL活化鮭魚精子DNA。上述核苷三磷酸通??梢耘e出dNTP(dATP、dCTP、dTTP)。上述反應(yīng)液中的dNTP的添加比例并無(wú)特別限定,例如為0.01~lmmol/L、優(yōu)選為0.05~0.5mmol/L、更4尤選為0.1~0.3mmol/L。上述溶劑例如可以舉出Tris-HCl、N-三(羥曱基)曱基甘氨酸(Tricine)、MES、MOPS、HEPES、CAPS等緩沖液,可以使用市售的PCR用M_沖液或市售的PCR試劑盒的緩沖液等。另外,上述PCR反應(yīng)液還可以含有肝素、甜菜石威、KC1、MgCl2、MgS04、甘油等,它們的添加比例例如可以i殳定為不干擾PCR反應(yīng)的范圍。反應(yīng)液的總體積并無(wú)特別限定,例如可以根據(jù)所用機(jī)器(熱循環(huán)儀)等適當(dāng)?shù)卦O(shè)定,通常為l500^iL、優(yōu)選為10100nL。接著,進(jìn)行PCR。PCR循環(huán)條件并無(wú)特別限定,例如(1)全血來(lái)源的雙鏈DNA解離成單鏈DNA、(2)引物的退火、(3)引物的延伸(聚合酶反應(yīng))分別如下所述。另外,循環(huán)數(shù)也無(wú)特別限定,以下述(l)~(3)的3步驟為l個(gè)循環(huán),例如優(yōu)選為30個(gè)循環(huán)。上限并無(wú)特別限定,例如共計(jì)100個(gè)循環(huán)以下、優(yōu)選70個(gè)循環(huán)以下、更優(yōu)選50個(gè)循環(huán)以下。各步驟的溫度變化例如可以使用熱循環(huán)儀等自動(dòng)地控制。使用本發(fā)明的引物對(duì)時(shí),如上所述由于擴(kuò)增效率優(yōu)異,因此與利用以往方法時(shí)50個(gè)循環(huán)需要3小時(shí)左右相比,利用本發(fā)明可以在約l小時(shí)左右(優(yōu)選l小時(shí)以內(nèi))完成50個(gè)循環(huán)。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>如上才喿作,可以在同一反應(yīng)液中同時(shí)制造(32AR基因、(33AR基因和UCP1基因的各目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物。進(jìn)而,在制造與3種肥胖基因中任意1種或任意2種肥胖基因的各目標(biāo)區(qū)域互補(bǔ)的擴(kuò)增產(chǎn)物的情況下,可以使用含有引物對(duì)(l)~(3)中與目標(biāo)區(qū)域相應(yīng)的任意1種或任意2種引物對(duì)的本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì)。應(yīng)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。如此,可以^r測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)、或者上述肥胖基因的目標(biāo)區(qū)域的基因型。擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)可以通過(guò)目前已知的方法來(lái)確定。具體來(lái)i兌,可以如下進(jìn)4亍確i^:在上述(I)步驟中,向上述反應(yīng)液中預(yù)先添加能夠與(32AR基因、(33AR基因或UCP1基因的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)雜交的探針(例如焚光標(biāo)記探針),進(jìn)而,通過(guò)(II)步驟、即對(duì)于上述反應(yīng)液測(cè)定上述探針的熒光標(biāo)記的熒光強(qiáng)度來(lái)確認(rèn)。另外,當(dāng)所擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)i或?yàn)?個(gè)或3個(gè)時(shí),例如可以如下進(jìn)4亍確i人在上述(I)步驟中向上述反應(yīng)液中預(yù)先添加兩種或三種能夠與(32AR基因、|33AR基因和UCP1基因中任一個(gè)的各檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)雜交的探針(例如熒光標(biāo)記探針),進(jìn)而,通過(guò)(II)步驟、即對(duì)上述反應(yīng)液測(cè)定各探針的各熒光標(biāo)記的熒光強(qiáng)度來(lái)確認(rèn)。另外,以下將肥胖基因多態(tài)性的檢測(cè)作為本發(fā)明的一方式來(lái)進(jìn)行說(shuō)明。<肥胖基因的多態(tài)性解析方法〉本發(fā)明的多態(tài)性解析方法,其特征在于,其為解析肥胖基因中的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的多態(tài)性的方法,上述肥胖基因是選自由(32AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因,所述方法含有下述(i)~(iv)的步驟。(i)通過(guò)本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法,在反應(yīng)液中擴(kuò)增上述選自由(32AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少l個(gè)基因中的、含有檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的區(qū)域的步驟(ii)準(zhǔn)備反應(yīng)液的步驟,所述反應(yīng)液含有上述(i)步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物、和能夠與上述選自由P2AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)雜交的探針(iii)改變上述反應(yīng)液的溫度,測(cè)定上述擴(kuò)增產(chǎn)物和上述探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號(hào)值的步驟(iv)根據(jù)伴隨溫度變化的上述信號(hào)值的變動(dòng),確定上述選自由(32AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少l個(gè)基因的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的多態(tài)性的步驟如此,通過(guò)使用本發(fā)明的引物對(duì)制造擴(kuò)增產(chǎn)物,如上所述可以擴(kuò)增(32AR基因、P3AR基因和UCP1基因中的至少l個(gè)肥胖基因中的、含有多態(tài)性檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的目標(biāo)區(qū)域,可以解析上述目標(biāo)區(qū)域中的;f全測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的多態(tài)性。上述(ii)步驟中的探針沒有特別的限定,優(yōu)選與I32AR基因的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)雜交的探針(以下,稱為"(32AR基因用探針")、與P3AR基因的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)雜交的探針(以下,稱為,3AR基因用探針")和與UCP1基因的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)雜交的探針(以下,稱為"UCP1基因用探針")。這些探針優(yōu)選為與含有上述檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的檢測(cè)對(duì)象序列互補(bǔ)的探針。這些探針可以是任意一種,也可以是任意2種或者全部3種,例如可以根據(jù)使用本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì)所擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域的種類來(lái)確定。在4吏用2種或3種#:針的情況下,例如可以4吏用同一反應(yīng)液解析任意2個(gè)檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)或者全部的上述3個(gè)檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的多態(tài)性。針對(duì)上述肥胖基因的探針沒有特殊的限定,可以根據(jù)目前已知的方法來(lái)設(shè)定,例如,基于各肥胖基因的正義鏈的序列來(lái)設(shè)計(jì)含有多態(tài)性檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的檢測(cè)對(duì)象序列;也可基于反義鏈的序列來(lái)設(shè)計(jì)含有多態(tài)性檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的檢測(cè)對(duì)象序列。此外,多態(tài)性的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的堿基,可以根據(jù)各多態(tài)性的種類適當(dāng)確定。也就是說(shuō),在p2AR基因的情況下,由于已知序列號(hào)1中第4265位堿基存在"A"和"G"的多態(tài)性,因此例如可以列舉與第4265位是A的檢測(cè)對(duì)象序列和第4265位是G的檢測(cè)對(duì)象序列中的任意一種互補(bǔ)的探針(正義鏈檢測(cè)用探針)、或者與其反義鏈的序列互補(bǔ)的探針(反義鏈檢測(cè)用探針)。此外,在p3AR基因的情況下,由于已知序列號(hào)2中第4134位堿基存在"T"和"C"的多態(tài)性,因此可以列舉與第4134位是T的才全測(cè)對(duì)象序列和第4134位是C的檢測(cè)對(duì)象序列中的任意一種互補(bǔ)的探針(正義測(cè)用探針)。此外,在UCP1基因的情況下,由于已知序列號(hào)3中第292位i咸基存在"A,,和"G"的多態(tài)性,因此例如可以列舉與第292位是A的檢測(cè)對(duì)象序列和第292位是G的檢測(cè)對(duì)象序列中的任意一種互補(bǔ)的探針(正義鏈檢測(cè)用探針)、或者與其反義鏈的序列互補(bǔ)的探針(反義鏈檢測(cè)用探針)。如此,不論將發(fā)生多態(tài)性的檢測(cè)目標(biāo)位點(diǎn)的堿基設(shè)計(jì)成上述的任一種堿基,都可以通過(guò)后述的方法判斷各肥胖基因的檢測(cè)目標(biāo)位點(diǎn)顯示何種多態(tài)性。上述各探針可以在上述(i)步驟后、即對(duì)上述肥胖基因的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)4亍擴(kuò)增反應(yīng)后添加于擴(kuò)增反應(yīng)液中,^旦優(yōu)選在上述(i)步驟的擴(kuò)增反應(yīng)之前預(yù)先添加到反應(yīng)液中,其原因在于這樣能容易且迅速地進(jìn)行解析。上述反應(yīng)液中探針的添加比例并無(wú)特別限定,例如優(yōu)選按照各探針達(dá)到10~400nmo1的范圍的方式進(jìn)行添加,更優(yōu)選為20~200nmol。另夕卜,使用熒光染料作為#笨針的標(biāo)記時(shí),例如為了調(diào)整所檢測(cè)的熒光強(qiáng)度,可以同時(shí)使用與標(biāo)記探針序列相同的未標(biāo)記揮:4十,該未標(biāo)記探針可以在其3,末端添加有磷酸。此時(shí),標(biāo)記揮:針與未標(biāo)記4采針的摩爾比例如優(yōu)選為1:10~10:1。上述探針的長(zhǎng)度并無(wú)特別限定,例如為550mer、優(yōu)選為10~30mer。對(duì)于Tm值進(jìn)4亍說(shuō)明。當(dāng)持續(xù)加熱含有雙《連DNA的溶液時(shí),260nm的吸光度上升。這是由于雙鏈DNA雙《連間的氫4建通過(guò)加熱而打開,解離成單鏈DNA(DNA的融解)。而且,當(dāng)全部雙鏈DNA解離、變?yōu)閱捂淒NA時(shí),其吸光度顯示為加熱開始時(shí)的吸光度(僅雙鏈DNA時(shí)的吸光度)的約1.5倍左右,由此可以判斷融解結(jié)束。4艮據(jù)該現(xiàn)象,融解溫度Tm—4殳定義為吸光度到達(dá)吸光度總上升量的50%時(shí)的溫度。在上述(iii)步驟中,測(cè)定上述擴(kuò)增產(chǎn)物與上述探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號(hào),既可以是上述260nm的吸光度的測(cè)定,還可以是標(biāo)i己物的^言號(hào)的測(cè)定。具體;也i兌,伊C選如下4吏用,皮標(biāo)記物標(biāo)記的標(biāo)記#笨4十作為上述#笨4十,測(cè)定上述標(biāo)記物的信號(hào)。上述標(biāo)記探針例如可以舉出單獨(dú)顯示信號(hào)、由于雜交而不顯示信號(hào)的標(biāo)記探針;或者單獨(dú)不顯示信號(hào)、由于雜交而顯示信號(hào)的標(biāo)記探針。為前者的探針時(shí),在與檢測(cè)對(duì)象序列形成雜交體(雙鏈DNA)時(shí)不顯示信號(hào),通過(guò)加熱探針游離時(shí),則顯示信號(hào)。另外,為后者的探針時(shí),在與檢測(cè)對(duì)象序列形成雜交體(雙鏈DNA)時(shí)顯示信號(hào),通過(guò)加熱探針游離時(shí),則信號(hào)減少(消失)。因此,通過(guò)利用信號(hào)特有的條件(吸收波長(zhǎng)等)才企測(cè)該標(biāo)記所產(chǎn)生的信號(hào),可以與上述260nm的吸光度測(cè)定同樣,在融解進(jìn)行的同時(shí)確定Tm值等。本發(fā)明中,還可以對(duì)于在同一反應(yīng)液中擴(kuò)增出的2種或3種肥胖基因的擴(kuò)增產(chǎn)物確認(rèn)各自的多態(tài)性。因此,使用2種或3種探針時(shí),優(yōu)選用在不同的條件下檢測(cè)的不同標(biāo)記(例如熒光標(biāo)記)進(jìn)行標(biāo)記。如此,通過(guò)使用不同的標(biāo)記,即《更是同一反應(yīng)液,也可以通過(guò)改變檢測(cè)條件來(lái)分別解析各擴(kuò)增產(chǎn)物。上述標(biāo)記探針的標(biāo)記物的具體例子,例如可以舉出熒光染料(熒光團(tuán))。上述標(biāo)記探針的具體例子例如優(yōu)選用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記、單獨(dú)顯示熒光、且由于雜交熒光減少(例如淬滅)的探針。利用這種熒光淬滅現(xiàn)象(Quenchingphenomenon)的探針一般被稱作熒光淬滅探針。其中,上述探針優(yōu)選寡核苷酸的3,末端或5,末端纟皮熒光染沖牛標(biāo)記,一皮標(biāo)記的上述末端的^威基優(yōu)選標(biāo)記探針?biāo)s交的檢測(cè)對(duì)象序列中,與上述標(biāo)記探針的末端堿基C成對(duì)的堿基或者從上述成對(duì)的堿基距離1~3個(gè)堿基的堿基為G。這種探針一般被稱作鳥噪呤淬滅探針,已知有所謂的QProbe(注冊(cè)商標(biāo))。這種鳥噤呤淬滅探針與檢測(cè)對(duì)象序列雜交時(shí),用熒光染料標(biāo)記的末端C接近上述^r測(cè)對(duì)象DNA中的G,因此顯示上述熒光染料的發(fā)光減弱(熒光強(qiáng)度減少)的現(xiàn)象。使用這種探針時(shí),可以利用信號(hào)的變動(dòng)容易地確認(rèn)雜交和解離。上述熒光染料并無(wú)特別限定,例如可以舉出熒光染料、磷光體、羅丹明、聚甲炔染料衍生物等,作為市售的熒光染料例如可以舉出BODIPYFL(商標(biāo)、乇k《工,一'7??谝?"^司制)、FluorePrime(商品名、77、>弋厶77A^、二7公司制)、Fluoredite(商品名、Milipore公司制)、FAM(ABI公司制)、Cy3和Cy5(77,>Y厶77At、>7司制)、TAMRA(乇k^工,一7°口一7'公司制)等。三種探針中使用的熒光染料的組合例如只要能夠在不同條件下檢測(cè)即可,并無(wú)特別限定,例^口可以舉出PacificBlue(才企觀'H皮長(zhǎng)450~480nm)、TAMRA(#r測(cè);皮長(zhǎng)585~700nm)、BODIPYFL(才企測(cè);皮長(zhǎng)515~555nm)的組合等。以下,示意出用于檢測(cè)上述(32AR基因、(33AR基因和UCP1基因的各多態(tài)性的探針序列的具體例子。但是本發(fā)明不限定于此。下述探針(Pl)是(32AR基因用探針的一個(gè)例子,(1-1)是用于檢測(cè)正義鏈的探針,(1-2)是用于檢測(cè)反義鏈的探針。下述探針(2)是(33AR基因用探針的一個(gè)例子,(2-1)是用于檢測(cè)反義鏈的探針,(2-2)是用于檢測(cè)正義鏈的探針。下述探針(3)是UCP1基因用探針的一個(gè)例子,是用于檢測(cè)反義鏈的探針。進(jìn)而,各探針(PI)~(P3)可以分別使用l種,也可以如后述,同時(shí)4吏用2種以上。探針(Pl)(1-1):與序列號(hào)l中的、以第4254位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1位堿基、向著3'方向到第21~26個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以與上述胸腺嘧咬堿基互補(bǔ)的腺噤呤堿基(A)作為3'末端(1-2):與序列號(hào)l中的、以第4259位的胞嘧啶堿基(C)作為第1位堿基、向著3'方向到第15~19個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少l個(gè)寡核苷酸,該寡核香酸以上述胞嘧啶堿基作為5'末端探針(P2)(2-1):與序列號(hào)2中的、以第4140位的胞嘧啶堿基(C)作為第1位堿基、向著5,方向到第17-28個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基作為3'末端(2-2):與序列號(hào)2中的、以第4144位的鳥噤呤堿基(G)作為第1位堿基、向著5'方向到第12~17個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少1個(gè)寡核香酸,該寡核香酸以與上述鳥噤呤堿基互補(bǔ)的胞嘧啶堿基(C)作為5'末端探針(P3)與序列號(hào)3中的、以第280位的胞嘧啶堿基(C)作為第1位堿基、向著3'方向到第17~31個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核香酸以上述胞嘧啶堿基作為5,末端在上述探針(1-1)中,用y表示與序列號(hào)l第4265位互補(bǔ)的堿基,上述y是T或者C。在上述探針(l-2)中,用r表示位于序列號(hào)1第4265位的堿基,上述r是A或者G。在上述探針(2-l)中,用y表示位于序列號(hào)2第4134位的堿基,上述y是T或者C,在上述探針(2-2)中,用r表示與序列號(hào)2第4134位互補(bǔ)的堿基,上述r是A或者G。在上述探針(3)中,用r表示位于序列號(hào)3第292位的石威基,上述r是A或者G。進(jìn)一步,下表示意出上述探針(1)、探針(2)和探針(3)的具體例子。而且,下表中的"Tm(。C)"是下表的序列和與其完全互補(bǔ)的序列雜交的情況下的Tm(。C),是利用MELTCALC軟件(http:〃www.meltcalc.com/)將參數(shù)設(shè)為寡核苷酸濃度0.2(iM、鈉當(dāng)量(Na叫.)50mM而計(jì)算出的值。<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>在上表中,序列號(hào)69~74的寡核苷酸是探針(1-1)的具體例子,各石咸基序列中的"y",如下所述,可以是T和C中的任一個(gè)。在上表中,"y"是C的序列號(hào)69~序列號(hào)74所表示的探針(1-1)是與序列號(hào)1的第4265位堿基是G的(32AR基因(正義鏈)互補(bǔ)(完全匹配)的探針,大寫的堿基C表示與序列號(hào)1第4265位的堿基G互補(bǔ)的堿基。在上表中,示意出"y"是"C"的探針序列、以及上述探針和與其完全互補(bǔ)的序列雜交時(shí)的Tm值(°C)作為具體例子。5,—cgcatggcttcyattgggtgcca—3,(序歹'J號(hào)72:y)5,一cgcatggcttccattgggtgcca—3,(序列號(hào)72、101:y是C)5,一cgcatggcttctattgggtgcca—3,(序歹寸號(hào)72、101.y是t)在上表中,序列號(hào)112~116的寡核苷酸是上述探針(1-2)的具體例子,各堿基序列中的"r"如上所述可以是A和G中的任一個(gè)。此外,在上表中,"r"是G的序列號(hào)112序列號(hào)116所表示的探針(1-2)是與序列號(hào)1第4265位堿基是G的P2AR基因的互補(bǔ)鏈(反義鏈)互補(bǔ)(完全匹配)的探針,大寫的堿基表示序列號(hào)1第4265位的堿基。在上表中,示意出"r"是"G"的探針序列、以及上述探針和與其完全互補(bǔ)的序列雜交時(shí)的Tm值(°C)作為具體例子。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>在上表中,序列號(hào)75~86所示的探針(2-1)包含與序列號(hào)2第4134位是C的區(qū)域相同的序列,大寫的堿基表示序列號(hào)2中第4134位的堿基。進(jìn)而,在上述探針(2-l)中,上述大寫的堿基可以置換為y,上述y可以是C和T中的任一個(gè)。在上表中,序列號(hào)117~128所示的探針(2-2)包含與序列號(hào)2中第4134位堿基是C的區(qū)域互補(bǔ)的序列,大寫的堿基表示與序列號(hào)2中第4134位的堿基互補(bǔ)的石成基。進(jìn)而,在上述探針(2-2)中,上述大寫的堿基可以置換為r,上述r可以是G和A中的任一個(gè)。在上表中,序列號(hào)87~100和139所表示的探針(3)包含與序列號(hào)3中第292位堿基是G的區(qū)域相同的序列,大寫的堿基表示序列號(hào)3中的第292位的堿基。進(jìn)而,在上述探針(3)中,大寫的堿基可以置換為r,上述r可以是G和A中的任一個(gè)。進(jìn)而,本發(fā)明中的探針的具體例子,如上所述例如也可以是上表中所示的寡核苷酸的互補(bǔ)鏈。上述探針是一個(gè)例子,本發(fā)明并不限定于此。(32AR基因用探針優(yōu)選探針(1-1)之中含有序列號(hào)72的堿基序列的寡核苷酸,"y,,如上所述可以是T和C的任一個(gè)。此外,在探針(l-2)之中,優(yōu)選含有序列號(hào)114的堿基序列的寡核苷酸,"r"可以是A和G的任一個(gè)。此外,優(yōu)選同時(shí)使用所謂的野生型檢測(cè)用探針和突變型檢測(cè)用探針作為(32AR基因用探針。在此,野生型檢測(cè)用探針是指例如用于檢測(cè)序列號(hào)1第4265位堿基是A(或者G)的檢測(cè)對(duì)象序列(正義鏈)或其互補(bǔ)鏈(反義鏈)的探針,突變型檢測(cè)用探針是指用于檢測(cè)序列號(hào)1第4265位堿基是G(或者A)的檢測(cè)對(duì)象序列(正義鏈)或其互補(bǔ)鏈(反義鏈)的探針。在本發(fā)明中,探針(1-1)之中優(yōu)選例如同時(shí)使用含有"y"是"C"的序列號(hào)69~74的堿基序列的至少l個(gè)寡核苷酸(突變型檢測(cè)用探針)、和含有"y"是"T"的序列號(hào)6974的堿基序列的至少l個(gè)寡核苷酸(野生型檢測(cè)用探針),更優(yōu)選同時(shí)使用含有"y"是"C"的序列號(hào)72的堿基序列的寡核苷酸(突變型檢測(cè)用探針)、和含有"y"是"T"的序列號(hào)72的堿基序列的寡核苷酸(野生型檢測(cè)用探針)。本發(fā)明人根據(jù)其它方法對(duì)多態(tài)性解析進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在解析(32AR基因多態(tài)性(編碼(32AR第16位氨基酸的位點(diǎn)的多態(tài)性序列號(hào)1第4265位堿基的多態(tài)性)的情況下,通過(guò)使用探針進(jìn)行Tm解析時(shí),信號(hào)檢測(cè)很困難。因此,本發(fā)明人進(jìn)行進(jìn)一步深入研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)若上述探針(1)是含有序列號(hào)72的堿基序列的寡核苷酸(也就是序列號(hào)101的寡核苷酸和序列號(hào)102的寡核苷酸),則如后述那樣能夠充分區(qū)分并檢測(cè)與(32AR基因的擴(kuò)增產(chǎn)物匹配情況下的信號(hào)和錯(cuò)配情況下的信號(hào)。序列號(hào)101表示的探針是與序列號(hào)1第4265位堿基是G的(32AR基因(正義鏈)的檢測(cè)對(duì)象序列完全匹配的探針,序列號(hào)102表示的探針是與序列號(hào)1的第4265位堿基是A的(32AR基因(正義鏈)的檢測(cè)對(duì)象序列完全匹配的探針。進(jìn)而,如上所述,本發(fā)明的特征是通過(guò)使用肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì),在同一反應(yīng)液中同時(shí)且特異性擴(kuò)增3種基因各自的目標(biāo)區(qū)域,因此,對(duì)所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的解析中所使用的探針序列沒有特殊的限定。(33AR基因用探針優(yōu)選探針(2-1)之中含有序列號(hào)83的堿基序列的寡核苷酸。此外,優(yōu)選同時(shí)使用所謂的野生型檢測(cè)用探針和突變型檢測(cè)用探針作為探針(2-2)。在此,野生型檢測(cè)用探針例如是指用于檢測(cè)序列號(hào)2第4134位堿基是T的檢測(cè)對(duì)象序列(正義鏈)或其互補(bǔ)鏈(反義鏈)的探針,突變型檢測(cè)用探針是指用于檢測(cè)序列號(hào)2第4134位堿基是C的檢測(cè)對(duì)象序列(正義鏈)或其互補(bǔ)鏈(反義鏈)的探針。在本發(fā)明中,例如優(yōu)選同時(shí)使用含有序列號(hào)117~122的堿基序列的至少l個(gè)寡核苷酸(突變型檢測(cè)用探針)、和含有序列號(hào)123128的堿基序列的至少l個(gè)寡核苷酸(野生型檢測(cè)用探針),更優(yōu)選同時(shí)使用含有序列號(hào)120的堿基序列的寡核苷酸(突變型檢測(cè)用探針)、和含有序列號(hào)127的堿基序列的寡核苷酸(野生型檢測(cè)用探針)。在這樣同時(shí)使用野生型檢測(cè)用探針和突變型檢測(cè)用探針的情況下,優(yōu)選例如設(shè)定為使各探針的完全匹配的Tm值錯(cuò)開。UCP1基因用探針優(yōu)選探針(3)之中含有序列號(hào)95或序列號(hào)139的堿基序列的寡核苷酸。并且,使用2種以上這些探針時(shí),如前所述優(yōu)選分別用不同的熒光染料(用不同的波長(zhǎng)檢測(cè)的熒光染料)進(jìn)行標(biāo)記。例如,將上表中所示的探針作成淬滅探針的情況下,優(yōu)選探針(1-1)和探針(2-1)的3,末端用上述那樣的熒光染料(例如,PacificBlue、BODIPYFL等)進(jìn)行標(biāo)記,優(yōu)選探針(1-2)、探針(2-2)和探針(3)的5,末端的胞嘧啶用上述那樣的熒光染料(例如TAMRA等)進(jìn)行標(biāo)記。進(jìn)而,上表中表示的4笨針(1-1)的3,末端是腺。票呤(A),但由于可以通過(guò)相鄰的胞嘧啶(C)與鳥噤呤(G)雜交來(lái)確定淬滅,因此也可以作為鳥噤呤淬滅探針來(lái)使用。另外,在5,末端標(biāo)記有熒光染料的探針,為了預(yù)防探針本身延伸,還可以在其3,末端進(jìn)一步添加磷酸基。此外,如上所述地使用野生型檢測(cè)用探針和突變型檢測(cè)用探針的情況下,各自的熒光染料可以相同也可以不同。接下來(lái),舉一個(gè)例子對(duì)本發(fā)明的#企測(cè)方法進(jìn)行說(shuō)明,所述例子為使用下述探針檢測(cè)P2AR基因的多態(tài)性(序列號(hào)1中第4265位堿基的多態(tài)性)、(33AR基因的多態(tài)性(序列號(hào)2中第4134位堿基的多態(tài)性)和UCP1基因的多態(tài)性(序列號(hào)3中第292位堿基的多態(tài)性)。另外,本發(fā)明并不限定于此。(探針)(32AR基因用探針5,—cgcatggcttcCattgggtgcca-(PacificBlue)—3,(序歹ij號(hào)72)或5'—(PacificBlue)—cccaatGgaagccatgc—P—3,(序歹'J號(hào)114)p3AR基因用探針5,—cgtggccatcgccCggactc-(BODIPYFL)—3,(序列號(hào)83)或5,一(BODIPYFL)-ctcggagtccGggc-P—3,(序歹ij號(hào)120)和5,—(BODIPYFL)-ctcggagtccAggc-P—3,(序列號(hào)127)UCP1基因用探針5,一(TAMRA)—cacagtttgatcGagtgcatttg—3,(序歹ij號(hào)95)或5,—(TAMRA)-cacagtttgatcGagtg—3,(序歹ij號(hào)139)首先,使用添加了上述3種標(biāo)記探針的反應(yīng)液,如上所述地進(jìn)行PCR,在同一反應(yīng)液中同時(shí)擴(kuò)增(32AR基因、(33AR基因和UCP1基因的各目標(biāo)區(qū)域。接著,進(jìn)行所得的擴(kuò)增產(chǎn)物的解離以及通過(guò)解離獲得的單鏈DNA與上述標(biāo)記^:針的雜交。這可以通過(guò)例如改變上述反應(yīng)液的溫度來(lái)進(jìn)4亍。上述解離步驟的加熱溫度只要是上述擴(kuò)增產(chǎn)物能夠解離的溫度則無(wú)特別限定,例如為8595。C。加熱時(shí)間也無(wú)特別限定,通常為1秒10分鐘、優(yōu)選1秒5分鐘。解離的單鏈DNA和上述標(biāo)記揮:針的雜交例如可以在上述解離步驟后,通過(guò)降低上述解離步驟的加熱溫度來(lái)進(jìn)行。溫度條件例如為40~50°C。然后,改變上述反應(yīng)液的溫度,測(cè)定上述擴(kuò)增產(chǎn)物與上述標(biāo)記探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號(hào)值。具體地說(shuō),例如加熱上述反應(yīng)液(上述單鏈DNA與上述標(biāo)記纟果針的雜交產(chǎn)物),測(cè)定隨溫度上升的信號(hào)值的變動(dòng)。如上所述,例如當(dāng)使用鳥噤呤淬滅探針時(shí),在與單鏈DNA雜交的狀態(tài)下,熒光減少(或者淬滅),在解離的狀態(tài)下發(fā)出熒光。因此,例如可以慢慢加熱熒光減少(或者淬滅)了的雜交產(chǎn)物,測(cè)定隨溫度上升的焚光強(qiáng)度的增加。測(cè)定熒光強(qiáng)度變動(dòng)時(shí)的溫度范圍并無(wú)特別限定,例如起始溫度為室溫85。C、優(yōu)選為2570。C,終止溫度例如為40105°C。另夕卜,溫度的上升速度并無(wú)特別限定,例如為O.l~20°C/秒、優(yōu)選為0.3~5。C/秒。接著,解析上述信號(hào)的變動(dòng)來(lái)確定Tm值。具體地說(shuō),可以從所得熒光強(qiáng)度求得各溫度下每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化量(-d熒光強(qiáng)度增加量Zdt),將顯示最低值的溫度作為Tm值。另外,可以將每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度增加量(d熒光強(qiáng)度增加量/dt)最高的點(diǎn)作為Tm值。另外,不使用淬滅探針,而是使用單獨(dú)不顯示信號(hào)、由于雜交而顯示信號(hào)的探針作為標(biāo)記探針時(shí),相反地可以測(cè)定熒光強(qiáng)度的減少量。在本發(fā)明中,為了檢測(cè)3個(gè)基因的多態(tài)性,在與3種探針的各標(biāo)記相應(yīng)的條件下,確定各自的Tm值。(32AR基因用探針的PacificBlue例如可在波長(zhǎng)450480nm下檢測(cè);卩3AR基因用探針的BODIPYFL例如可在波長(zhǎng)515~555nm下4企測(cè);UCP1基因用探針的TAMRA例如可以在波長(zhǎng)585~700nm下檢測(cè)。然后,由這些Tm值確定各基因的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的基因型。Tm解析中,可以獲得如下的結(jié)果與有一個(gè)堿基不同的雜交體(錯(cuò)配)相比,完全互補(bǔ)的雜交體(匹配)其顯示解離的Tm值增高。因此,通過(guò)對(duì)上述探針預(yù)先確定完全互補(bǔ)的雜交體的Tm值和有一個(gè)堿基不同的雜交體的Tm值,可以確定擴(kuò)增產(chǎn)物與探針是匹配還是錯(cuò)配。例如,在將檢測(cè)對(duì)象序列中的目標(biāo)位點(diǎn)的堿基假設(shè)為突變型(例如假定序列號(hào)1的第4265位堿基為G)、使用與含有其的檢測(cè)對(duì)象序列互補(bǔ)的探針時(shí),所形成的雜交體的Tm值若與完全互補(bǔ)的雜交體的Tm值相同,則可判定上述擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性為突變型。另外,所形成的雜交體的Tm值若與有一個(gè)堿基不同的雜交體的Tm值相同(低于完全互補(bǔ)的雜交體的Tm值),則可判定上述擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性為野生型(例如序列號(hào)1的第4265位的堿基為A)。而且,當(dāng)檢測(cè)到兩種Tm值時(shí),可以判斷為雜合子。如此,由與各標(biāo)記探針相應(yīng)的Tm值,可以判斷(32AR基因、(33AR基因和UCP1基因的各多態(tài)性。進(jìn)而,通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度來(lái)確定Tm值時(shí),為了充分區(qū)分匹配的信號(hào)和錯(cuò)配的信號(hào),優(yōu)選如上所述那樣組合使用相同寡核苷酸序列的非標(biāo)記探針作為探針。在(32AR基因用探針、P3AR基因用探針和UCP1基因用探針中,對(duì)何者組合添加非標(biāo)記探針沒有特別的限定,優(yōu)選例如對(duì)(33AR基因用探針添加標(biāo)記探針和非標(biāo)記探針。另外,本發(fā)明中,還可以測(cè)定雜交體形成時(shí)的信號(hào)變動(dòng)來(lái)代替如上所述的升高含有上述探針的反應(yīng)液的溫度(加熱雜交產(chǎn)物)、測(cè)定伴隨溫度上升的信號(hào)變動(dòng)的方法。即,也可以在降低含有上述探針的反應(yīng)液的溫度以形成雜交產(chǎn)物時(shí),測(cè)定伴隨上述溫度降低的信號(hào)變動(dòng)。作為具體例,當(dāng)使用單獨(dú)顯示信號(hào)、且由于雜交而不顯示信號(hào)的標(biāo)記探針(例如鳥嘌呤淬滅探針)時(shí),在單鏈DNA和探針解離的狀態(tài)下發(fā)出熒光,當(dāng)溫度降低而形成雜交體時(shí),上述熒光減少(或者淬滅)。因此,例如可以慢慢降低上述反應(yīng)液的溫度,測(cè)定伴隨溫度降低的熒光強(qiáng)度的減少。另外,使用單獨(dú)不顯示信號(hào)、且由于雜交而顯示信號(hào)的標(biāo)記探針時(shí),在單鏈DNA和探針解離的狀態(tài)下不發(fā)出熒光,當(dāng)溫度降低而形成雜交體時(shí),則發(fā)出熒光。因此,例如可以慢慢降低上述反應(yīng)液的溫度,測(cè)定伴隨溫度降低的熒光強(qiáng)度的增加。進(jìn)而,在解析3種肥胖基因(p2AR基因、卩3AR基因和UCP1基因)中任意l種基因的多態(tài)性或者任意2種基因的多態(tài)性的情況下,例如使用含有引物對(duì)(l)~(3)中與目標(biāo)區(qū)域相應(yīng)的任意1種或者任意2種引物對(duì)的本發(fā)明的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì),進(jìn)一步還可使用與目標(biāo)檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)雜交的任意l種探針或者任意2種探針?!?32AR基因解析用探針>本發(fā)明的肥胖基因解析用探針,其特征在于,其是用于肥胖基因的多態(tài)性解析中的探針,上述肥胖基因是(32AR基因,含有下述(Pl)所示的寡核苷酸。(Pl):下述(1-1)和下述(1-2)中的至少一種寡核苷酸(l-l):與序列號(hào)1中的、以第4254位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1位堿基、向著3'方向到第21~26個(gè)^威基的區(qū)域互補(bǔ)的至少1個(gè)寡核香酸,該寡核苷酸以與上述胸腺嘧啶堿基互補(bǔ)的腺噤呤堿基(A)作為3'末端(1-2):與序列號(hào)1中的、以第4259位的胞嘧啶堿基(C)作為第1位堿基、向著3'方向到第15~19個(gè);威基的區(qū)域序列相同的至少l個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以上述胞嘧啶堿基作為5'末端包含上述(Pl)所示的寡核苷酸的探針,其為上述(32AR基因用探針,其如上所述。使用本發(fā)明的P2AR基因用探針,可以檢測(cè)(32AR基因中的包含編碼(32AR16位氨基酸的位點(diǎn)的4全測(cè)對(duì)象序列。具體的,通過(guò)使用本發(fā)明的探針,例如能夠以優(yōu)異的可靠性對(duì)本發(fā)明的探針和上述檢測(cè)對(duì)象序列的雜交產(chǎn)物的融解溫度進(jìn)行解析,進(jìn)而,通過(guò)上述融解溫度解析,可以以優(yōu)異的可靠性進(jìn)行試樣中的上述檢測(cè)對(duì)象序列的有無(wú)和量的解析、確定上述^r測(cè)對(duì)象序列中上述檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的多態(tài)性(序列號(hào)1中第4265位堿基的多態(tài)性)。因此,如后所述,本發(fā)明的P2AR基因解析用探針可以用于(32AR基因的解析、具體來(lái)說(shuō)例如融解溫度的解析、通過(guò)融解溫度解析而進(jìn)行的I32AR基因的多態(tài)性解析中。此外,也可以在上述3種肥胖基因的多態(tài)性解析方法中使用。因此,可以說(shuō)本發(fā)明的(32AR基因解析用探針、解析方法,尤其在肥胖的治療和預(yù)防的醫(yī)療領(lǐng)域中是非常有用的工具、解析方法。上述(32AR基因用探針,例如可以是不帶標(biāo)記物的未標(biāo)記探針,-f旦優(yōu)選的是帶有標(biāo)記物的標(biāo)記4果針。標(biāo)記位點(diǎn)和標(biāo)記物,均如上所述。<(32AR基因解析用試劑〉本發(fā)明的肥胖基因解析用試劑,其特征在于,其為用于(32AR基因解析的試劑,所述試劑含有本發(fā)明的(32AR基因解析用探針(以下,也稱為,2AR基因解析用試劑")。如后所述,本發(fā)明的解析用試劑,可以用于卩2AR基因的解析、具體而言例如融解溫度的解析、通過(guò)融解溫度解析來(lái)進(jìn)行的卩2AR基因的多態(tài)性解析中。此外,也可以在含有卩2AR基因的上述2種或3種肥胖基因的多態(tài)性解析方法中使用。進(jìn)而,本發(fā)明的!32AR基因解析用試劑特征在于含有本發(fā)明的(32AR基因解析用探針,對(duì)于此外的組成等沒有任何限定。本發(fā)明的(32AR基因解析用試劑還優(yōu)選含有用于擴(kuò)增(32AR基因中含有上述檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的檢測(cè)對(duì)象序列的引物。上述引物例如可以例舉上述(32AR基因用引物對(duì)。這樣,使用含有j32AR基因用引物對(duì)的本發(fā)明的解析用試劑,可以進(jìn)行例如P2AR基因的擴(kuò)增反應(yīng)、使用通過(guò)上述反應(yīng)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行卩2AR基因的解析。通過(guò)上述(32AR基因用引物擴(kuò)增出的區(qū)域只要是(32AR基因中含有上述檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的區(qū)域即可。作為具體例子,例如可以是(32AR基因中、具有上述4全測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的檢測(cè)對(duì)象序列、即與本發(fā)明的探針雜交的序列,也可以是含有上述檢測(cè)對(duì)象序列的區(qū)域。以下,將擴(kuò)增反應(yīng)所擴(kuò)增出的區(qū)域稱為"目標(biāo)區(qū)i或"。此外,本發(fā)明的P2AR基因解析用試劑優(yōu)選用于例如解析全血等生物試樣中的(32AR基因。特別是,本發(fā)明的P2AR基因解析用試劑,在本發(fā)明的P2AR基因解析用探針之外還含有上述(32AR基因用引物對(duì)并用于擴(kuò)增檢測(cè)對(duì)象序列時(shí),優(yōu)選擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)液中全血試樣的添加比例為O.l~0.5體積%。關(guān)于該點(diǎn),如上所述。本發(fā)明的(32AR基因解析用試劑的形態(tài)沒有特別的限定,例如,可以是含有本發(fā)明的(32AR基因解析用探針的液體試劑,也可以是在使用前用溶劑懸浮的干燥試劑。此外,對(duì)(32AR基因解析用探針的含量也沒有特別的限定。此外,本發(fā)明的(32AR基因解析用試劑例如還可以在同一反應(yīng)液中進(jìn)一步含有用于檢測(cè)其它基因、其它多態(tài)性的探針、引物。如上所述,已知(33AR基因和UCP1基因的多態(tài)性與(32AR基因同樣,也是肥胖治療和預(yù)防的指標(biāo),因此例如還可以含有用于檢測(cè)任意一者或者兩者的探針、引物對(duì)。如此,在擴(kuò)增多個(gè)基因的目標(biāo)區(qū)域、用探針進(jìn)行檢測(cè)的情況下,為了能夠特異性擴(kuò)增(32AR基因的目標(biāo)區(qū)域,優(yōu)選含有如上所述的P2AR基因用的引物對(duì)?!?32AR基因解析方法〉本發(fā)明的肥胖基因解析方法,其特征在于,其為解析(32AR基因的解析方法,含有下述(a)~(c)步驟。(a)準(zhǔn)備反應(yīng)液的步驟,所述反應(yīng)液含有(32AR基因中的、含有多態(tài)性檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的檢測(cè)對(duì)象序列、以及本發(fā)明的(32AR基因解析用探針(b)改變上述反應(yīng)液的溫度,測(cè)定上述4全測(cè)對(duì)象序列和上述P2AR基因解析用探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號(hào)值的步驟(c)由伴隨溫度變化的上述信號(hào)值的變動(dòng),確定上述雜交產(chǎn)物的融解溫度的步驟如此,通過(guò)使用本發(fā)明的(32AR基因解析用探針,例如可以充分地檢測(cè)上述檢測(cè)對(duì)象序列和上述p2AR基因解析用探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號(hào)值的變動(dòng)。因此,根據(jù)本發(fā)明的(32AR基因解析方法,能夠以高可靠性進(jìn)行與(32AR基因的檢測(cè)對(duì)象序列有關(guān)的融解溫度的確定。由此,例如對(duì)含有(32AR基因的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的區(qū)域進(jìn)行核酸擴(kuò)增的時(shí)候,能夠通過(guò)融解溫度(Tm)的解析,高可靠性地判斷上述目標(biāo)區(qū)域有無(wú)擴(kuò)增。進(jìn)而,因?yàn)楸景l(fā)明的探針和上述檢測(cè)對(duì)象序列完全匹配的情況下的Tm值、和錯(cuò)配情況下的Tm值間顯示出能夠充分進(jìn)行判斷的差異,所以能夠充分地區(qū)分受試對(duì)象的(32AR基因與本發(fā)明的探針是完全匹配和4晉配中的哪一種。如此地可以充分區(qū)分完全匹配和錯(cuò)配,就可以以更優(yōu)異的可靠性判斷受試對(duì)象的p2AR基因的多態(tài)性。進(jìn)而,本發(fā)明的P2AR基因解析方法特征在于使用本發(fā)明的P2AR基因解析用探針,對(duì)例如測(cè)定的信號(hào)的種類、測(cè)定方法、測(cè)定條件等沒有任何限定。本發(fā)明的卩2AR基因解析方法,如上所述能夠確定Tm值,還可以含有下述(d)步驟。(d)根據(jù)所確定的融解溫度來(lái)確定(32AR基因的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的多態(tài)性的步驟本發(fā)明的(32AR基因解析方法,可以進(jìn)一步含有下述(x)步驟。根據(jù)此類方法,例如能夠使用同一反應(yīng)液連續(xù)地進(jìn)行(32AR基因的擴(kuò)增、Tm值的確定還有多態(tài)性的解析。另外,下述引物可以使用上述的P2AR基因用引物。(x)以試樣中的核酸作為模板,使用用于擴(kuò)增(32AR基因中的上述檢測(cè)對(duì)象序列的引物,在反應(yīng)液中擴(kuò)增上述檢測(cè)對(duì)象序列的步驟上述(x)步驟中的基因擴(kuò)增方法沒有特殊的限定,例如,可以采用如上所述的方法,優(yōu)選PCR法??梢栽谏鲜?x)步驟之后、也就是在進(jìn)行P2AR基因的擴(kuò)增反應(yīng)之后,向擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)液中添加上述(32AR基因解析用探針,但為了能夠容易且迅速地進(jìn)行解析,優(yōu)選在上述(x)步驟的擴(kuò)增反應(yīng)之前,預(yù)先向反應(yīng)液中添加上述P2AR基因解析用探針。在此情況下,可以將上述(x)步驟的擴(kuò)增反應(yīng)后的上述反應(yīng)液作為上述(a)步驟中的反應(yīng)液使用。才艮據(jù)此類方法,可以直接使用進(jìn)行了擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)液來(lái)進(jìn)行融解溫度解析。上述反應(yīng)液中^:針的添加比例并無(wú)特別限定,例如優(yōu)選4姿照各探針達(dá)到10~400nmol/L的范圍的方式進(jìn)行添加,更優(yōu)選為20~200nmol/L。另外,使用熒光染料作為揮:針的標(biāo)記時(shí),例如為了調(diào)整檢測(cè)的熒光強(qiáng)度,可以同時(shí)使用與標(biāo)記探針序列相同的未標(biāo)記纟果針,該未標(biāo)記纟罙針可以在其3,末端添加有石粦酸。此時(shí),標(biāo)記探針與未標(biāo)記纟果針的摩爾比例如優(yōu)選為1:10~10:1。上述探針的長(zhǎng)度并無(wú)特別限定,例如為550mer、優(yōu)選為10~30mer。在上述(b)步驟中,上述檢測(cè)對(duì)象序列和上述P2AR基因解析用探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號(hào)值的測(cè)定,例如可以使用非標(biāo)記的纟笨針進(jìn)行上述260nm的吸光度測(cè)定,^f旦優(yōu)選^f吏用標(biāo)記探針進(jìn)行標(biāo)記物的信號(hào)測(cè)定。具體而言,優(yōu)選使用用標(biāo)記物標(biāo)記的標(biāo)記探針作為上述P2AR基因解析用探針,進(jìn)行上述標(biāo)記物的信號(hào)測(cè)定。上述標(biāo)記揮:針可以列舉如上所述的#果針,并與上述同樣地測(cè)定。對(duì)于應(yīng)用本發(fā)明的試樣,例如,只要含有作為模板的核酸就沒有特別的限定,可以列舉如上所述的試樣。此外,上述反應(yīng)液中的試樣的添力p比例例如也如上所述。然后,列舉一個(gè)例子對(duì)本發(fā)明的P2AR基因解析方法進(jìn)行說(shuō)明,所述例子為通過(guò)PCR從全血試樣中擴(kuò)增(32AR基因,使用本發(fā)明的(32AR基因解析用探針來(lái)確定(32AR基因的多態(tài)性(序列號(hào)1中第4265位堿基的多態(tài)性)。此外,只要沒有特別聲明,則與上述本發(fā)明的肥胖基因的多態(tài)性解析方法同樣進(jìn)行,并且不限定于此。首先,制備PCR反應(yīng)液進(jìn)行PCR,進(jìn)行所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的解離、以及將通過(guò)解離獲得的單鏈DNA和上述P2AR基因解析用探針進(jìn)行雜交。然后,加熱上述反應(yīng)液(加熱上述單鏈DNA和上述(32AR基因解析用探針的雜交產(chǎn)物),測(cè)定上述反應(yīng)液的信號(hào)值。信號(hào)值的測(cè)定與上述同樣地可以根據(jù)所使用的(32AR基因解析用探針的標(biāo)記的有無(wú)、以及標(biāo)記物的種類等適當(dāng)確定。接著,解析測(cè)得的上述信號(hào)的變動(dòng)來(lái)確定Tm值。當(dāng)P2AR基因解析用探針為熒光標(biāo)記探針時(shí),可以從所得焚光強(qiáng)度求得各溫度下每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化量(^熒光強(qiáng)度變化量/&或d熒光強(qiáng)度變化量/dt),將顯示最大絕對(duì)值的溫度作為Tm值。例如,使用鳥嘌呤淬滅探針時(shí),將-d熒光強(qiáng)度變化量/dt顯示最低值的溫度作為Tm或?qū)熒光強(qiáng)度變化量/dt最高的點(diǎn)作為Tm值。另外,不使用淬滅探針,而是使用單獨(dú)不顯示信號(hào)且由于雜交顯示信號(hào)的探針作為標(biāo)記探針時(shí),相反地可以測(cè)定熒光強(qiáng)度的減少量。然后,由Tm值確定P2AR基因的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的基因型。Tm解析中,可以獲得如下的結(jié)果與有一個(gè)堿基不同的雜交體(錯(cuò)配)相比,完全互補(bǔ)的雜交體(完全匹配)其顯示解離的Tm值增高。因此,通過(guò)對(duì)上述探針預(yù)先確定完全互補(bǔ)的雜交體的Tm值和有一個(gè)堿基不同的雜交體的Tm值,可以確定擴(kuò)增產(chǎn)物與探針是匹配還是錯(cuò)配。例如,在將檢測(cè)對(duì)象序列中的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的堿基假設(shè)為突變型(例如假定序列號(hào)1的第4265位堿基為鳥。票呤)、使用與含有其的檢測(cè)對(duì)象序列互補(bǔ)的探針時(shí)(序列號(hào)2中的y為胞嘧啶),所形成的雜交體的Tm值若與完全互補(bǔ)的雜交體的Tm值相同,則可判定上述擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性為突變型。另外,所形成的雜交體的Tm值若與有一個(gè)堿基不同的雜交體的Tm值相同(低于完全互補(bǔ)的雜交體的Tm值),則可判定上述擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性為野生型(例如序列號(hào)1的第4265位的堿基為腺膘呤)。而且,當(dāng)僅檢測(cè)到一個(gè)Tm值時(shí),可以判斷為純合子;當(dāng)檢測(cè)到兩種Tm值時(shí),可以判斷為雜合子。如此,由卩2AR基因解析用探針的Tm值,可以判斷(32AR基因的多態(tài)性。根據(jù)本發(fā)明的(32AR基因解析方法,通過(guò)使用本發(fā)明的探針,如上所述,上述探針和檢測(cè)對(duì)象序列完全匹配的情況下的Tm值和錯(cuò)配情況下的Tm值顯示出能夠充分區(qū)別的差異。該差值例如是4。C以上,優(yōu)選6。C以上。此外,在本發(fā)明中,可以進(jìn)行例如雜交形成時(shí)信號(hào)變動(dòng)的測(cè)定來(lái)代替如上所述的升高含有上述探針的反應(yīng)液的溫度(加熱雜交產(chǎn)物)并測(cè)定伴隨溫度上升的信號(hào)變動(dòng)的方法。<多態(tài)性解析方法〉本發(fā)明的多態(tài)性解析方法,其特征在于,其是通過(guò)解析融解溫度來(lái)解析(32AR基因中的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的多態(tài)性的多態(tài)性解析方法,所述方法含有本發(fā)明的卩2AR基因解析方法。本發(fā)明的多態(tài)性解析方法,可以與上述本發(fā)明的卩2AR基因解析方法同樣來(lái)進(jìn)行。接下來(lái),根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。但是,本發(fā)明不限定于下述實(shí)施例。實(shí)施例1對(duì)受試者8人使用肝素鋰采血管進(jìn)行采血(樣品1~8)。將獲得的血液10(iL與蒸餾水90jiL混合,再將該混合液10(iL與蒸餾水90pL混合。將該混合液10pL添加到40jiL下述組成的PCR反應(yīng)液中,使用熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR。PCR條件是95。C處理60秒之后,以95。C1秒和56。CIO秒作為I個(gè)循環(huán),重復(fù)進(jìn)行50個(gè)循環(huán),再在95。C下處理l秒,在40。C下處理60秒。然后,將溫度的上升速度設(shè)為rC/3秒,將上述PCR反應(yīng)液從40。C加熱到95。C,測(cè)定熒光強(qiáng)度的經(jīng)時(shí)變化。測(cè)定波長(zhǎng)是450~480nm(熒光染料PacificBlue的才全觀'J),515~555nm(焚光染沖牛BODIPYFL的才企觀寸)禾口585~700nm(焚光染泮牛TAMRA的才企測(cè))。進(jìn)而,50個(gè)循玉不的PCR需要的時(shí)間是約l小時(shí)。(PCR反應(yīng)液?jiǎn)挝籶L)蒸餾水115%NaN30.420%BSA140%甘油12.510xGeneTaq緩沖液承52.5mMdNTPs4100mMMgCl20.55pM(32AR基因用探針15pM(33AR基因用探針10.55jiM(33AR基因用^笨針20.85pMUCP1基因用探針0.8100i!Mp2AR基因Fl引物0.5100fxM(32AR基因Rl引物混合物0.25100pM(33AR基因F2引物0.25100^MP3AR基因R2引物0.5IOOiiMUCPI基因F3引物0.25100pMUCPl基因R3引物混合物0.55U/pLGeneTaqFP*0.25共計(jì)40|iL61*商品名GeneTaqFP:-;K75、一》7>司產(chǎn)(探針)(32AR基因用探針5,一cgcatggcttcCattgggtgcca—P3AR基因用探針15,一cgtggccatcgccCggactc—(PacificBlue)—3'(序歹廿號(hào)72)—(BODIPYFL)—3,(序列號(hào)83)P3AR基因用探針25,—cgtggccatcgccCggactc—P—3,(序歹,j號(hào)83)UCP1基因用探針5,一(TAMRA)—cacagtttgatcGagtgcatttg—3,(序歹'J號(hào)95)(引物對(duì))J32AR基因Fl引物5,一cccgggaacggcagcgcctt—3,(序歹,j號(hào)9)p2AR基因Rl引物混合物5,—cccacacctcgtccctttSctgcgt—3,(序歹ij號(hào)ig)S是c或者g,將兩種引物按l:1(摩爾比)混合P3AR基因F2引物5,一ccaccgtgggaggcaacc—3,(序歹,j號(hào)26)(33AR基因R2引物5,一ctgcggccagcgaagtc—3,(序歹寸號(hào)31)UCP1基因F3引物5,一ggaagacattttgtgcagcgatttctgattgacc—3,(序歹寸號(hào)44)UCP1基因R3引物混合物5,一cKtagcaaaggagtggcagcaagttctg—3,(序列號(hào)63)K是g或t,將兩種引物以l:1(摩爾比)混合與(32AR基因用探針匹配的雜交體的Tm值是70.0。C,錯(cuò)配的雜交體的Tm值是62.0。C,與p3AR基因用探針匹配的雜交體的Tm值是73.(TC,錯(cuò)配的雜交體的Tm值是66.0。C,與UCP1基因用探針匹配的雜交體的Tm值是65.0。C,錯(cuò)配的雜交體的Tm值是60.0°C。在圖1~3中分別示出樣品1~8的結(jié)果。這些圖是表示伴隨溫度上升的熒光強(qiáng)度的變化的Tm解析的圖,縱軸的微分值表示"-d熒光強(qiáng)度增加量/dt",橫軸表示溫度(以下,相同)。如該圖所示,根據(jù)信號(hào)的峰值來(lái)確定各樣品中(32AR基因、(33AR基因和UCP1基因的各多態(tài)性。為了支持這些實(shí)施例的結(jié)果,通過(guò)RFLP法確定8位受試者的(32AR基因、(33AR基因和UCP1基因的各多態(tài)性,獲得了與實(shí)施例相同的結(jié)果。如此,通過(guò)使用本發(fā)明的引物對(duì),使用未實(shí)施預(yù)處理的全血試樣,可以在同一反應(yīng)液中同時(shí)擴(kuò)增(32AR基因、(33AR基因和UCP1基因,并且,可以使用上述同一反應(yīng)液解析上述基因的各多態(tài)性。實(shí)施例2對(duì)受試者3人使用EDTA采血管進(jìn)行采血(樣品1~3)。將獲得的血液10pL與下述稀釋液A70jiL混合,再將該混合液10pL與下述稀釋液B70[iL混合。將所得的混合液10pL在95。C加熱處理5分鐘之后,添加到46pL下述組成的PCR反應(yīng)液中,使用熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR。PCR條件是95。C處理60秒之后,以95。Cl秒和64°C15秒作為l個(gè)循環(huán),重復(fù)進(jìn)行50個(gè)循環(huán),再在95。C下處理1秒,在4o。c處理6o秒。然后將溫度的上升速度設(shè)為rc/3秒,將上述PCR反應(yīng)液從40°C加熱到75°C,測(cè)定熒光強(qiáng)度的經(jīng)時(shí)變化。測(cè)定;皮長(zhǎng)是450~480nm(熒光染一+PacificBlue的才企測(cè)),515~555nm(熒光染料BODIPYFL的檢測(cè))和585~700nm(熒光染料TAMRA的檢測(cè))。(稀釋液A)10mMTris—HCl(pH8)、0.lmMEDTA、0.05%關(guān)、0.3%SDS3(稀釋液B)10mMTris—HCl(pH8)、0.lmMEDTA、0.05%NaN(表8)(PCR反應(yīng)液?jiǎn)挝籲L)蒸餾水12.255%NaN30.520%BSA0.540%甘油1510xGeneTaq緩沖液承2.5mMdNTPs4100mMMgCl20.255pM(32AR基因用探針25fiM卩3AR基因用4果針115jiM(33AR基因用探針215pMUCP1基因用探針2100^MP2AR基因Fl引物0.25100pMp2AR基因Rl引物0.5100pM(33AR基因F2引物0.5100(iM(33AR基因R2引物0.25100jxMUCPl基因F3引物0.25100pMUCPl基因R3引物混合物0.55U/fiLGeneTaqFP*0.25共計(jì)46nL*商品名GeneTaqFP:-7水°:x-—》公司產(chǎn)(探針)(32AR基因用探針5,—(PacificBlue)—cccaatGgaagccatgc—P—3,(序歹ij號(hào)114)J33AR基因用探針15,一(BODIPYFL)—ctcggagtccGggc—P—3,(序歹ij號(hào)120)(33AR基因用探針25,—(BODIPYFL)—ctcggagtccAgg—P—3,(序列號(hào)120)UCP1基因用探針5,一(TAMRA)—cacagtttgatcGagtg—P—3,(序歹ij號(hào)139)(引物對(duì))(32AR基因Fl引物5,—cgggaacggcagcgccttct—3,(序歹,j號(hào)109)卩2AR基因Rl引物5,一ccaccacccacacctcgtccct—3,(序歹'J號(hào)134)卩3AR基因F2引物5,—gccaccgtgggaggcaacc—3,(序歹'J號(hào)24)(33AR基因R2引物5,—ggctgcggccagcgaagtc—3,(序歹"號(hào)28)UCP1基因F3引物5,一ggaagacattttgtgcagcgatttctgattgacc—3,(序歹,J號(hào)43)UCP1基因R3引物混合物5,一cKtagcaaaggagtggcagcaagttctg—3,(序歹,j號(hào)63)K是g或者t,將兩種引物按l:1(摩爾比)混合與J32AR基因用探針匹配的雜交體的Tm值是58。C,錯(cuò)配的雜交體的Tm值是51°C,與P3AR基因用探針匹配的雜交體的Tm值是58'C,錯(cuò)配的雜交體的Tm值是5rC,與UCP1基因用探針匹配的雜交體的Tm值是56。C,錯(cuò)配的雜交體的Tm值是49。C。在圖4中示意出樣品1~3的結(jié)果。該圖是顯示伴隨溫度上升的熒光強(qiáng)度的變化的Tm解析的圖,縱軸的微分值表示"-d熒光強(qiáng)度增加量/dt",橫軸表示溫度。如該圖所示,根據(jù)信號(hào)的峰值來(lái)確定各樣品中(32AR基因、P3AR基因和UCP1基因的各多態(tài)性。為了支持這些實(shí)施例的結(jié)果,通過(guò)RFLP法確定3位受試者的(32AR基因、(33AR基因和UCP1基因的各多態(tài)性,獲得了與實(shí)施例相同的結(jié)果。如此,通過(guò)使用本發(fā)明的引物對(duì),使用未實(shí)施預(yù)處理的全血試樣,可以在同一反應(yīng)液中同時(shí)擴(kuò)增(32AR基因、P3AR基因和UCP1基因,并且,可以使用上述同一反應(yīng)液解析上述基因的各多態(tài)性。實(shí)施例3制造(32AR基因的各種探針,進(jìn)行Tm解析。首先,合成下述表9中所示的探針、和與前述各探針互補(bǔ)的下述表10中所示的寡核苷酸(互補(bǔ)鏈DNA)。在下述表9的探針序列中,大寫的堿基是與序列號(hào)1中第4265位相應(yīng)的堿基,這些探針是作為用于檢測(cè)正義鏈中第4265位(G、A)或者與其互補(bǔ)的反義鏈中的堿基(C、T)的探針而設(shè)計(jì)的。下述表10中所示的寡核苷酸是(32AR基因的正義鏈或反義鏈的部分序列,是含有序列號(hào)1的第4265位石威基或與其互補(bǔ)的石咸基的序列。然后,使用這些探針和互補(bǔ)鏈DNA,制備反應(yīng)液,4吏其為下述表ll的組成。在#笨針的4企測(cè)對(duì)象鏈?zhǔn)钦x鏈的情況下,互補(bǔ)鏈DNA使用1A(4265A)和1B(4265G),制備分別添加它們的反應(yīng)液。此外,在探針的檢測(cè)對(duì)象鏈?zhǔn)欠戳x鏈的情況下,互補(bǔ)鏈DNA^f吏用2A(4265A)和2B(4265G),制備分別添加它們的反應(yīng)液。將這些反應(yīng)液供給熱循環(huán)儀(商品名SmartCycler,Cepheid公司制),將溫度的上升速度設(shè)為rC/3秒,將上述反應(yīng)液從45。C加熱到95。C,測(cè)定熒光<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>說(shuō)明書第57/60頁(yè)*商品名GeneTaqFP:-7;K:v^—>司產(chǎn)在圖5中示意出使用實(shí)施例3-l的探針的結(jié)果,圖6中分別示意出使用比較例3-9和比較例3-11的探針的結(jié)果。這些圖是表示伴隨溫度上升的熒光強(qiáng)度變化的Tm解析的圖(融解曲線),縱軸的微分值表示"-d熒光強(qiáng)度增加量/dt",橫軸表示溫度(以下,相同)。圖5中綜合示意出在反應(yīng)液中添加了上述互補(bǔ)鏈DNA(1A)的體系的融解曲線(細(xì)線)和添加了上述互補(bǔ)鏈DNA(1B)的體系的融解曲線(粗線),圖6綜合示意出在反應(yīng)液中添加了上述互補(bǔ)《連DNA(2A)的體系的融解曲線(細(xì)線)和添加了上述互補(bǔ)鏈DNA(2B)的體系的融解曲線(粗線)。根據(jù)圖6所示,在使用比較例3-9的探針的情況下,檢測(cè)不到4265G的信號(hào)。此外,在使用比較例3-ll的探針的情況下,表示上述探針和互補(bǔ)鏈DNA(2B)完全匹配的峰的Tm值(68°C)和表示上述探針和互補(bǔ)鏈DNA(2A)錯(cuò)配的峰的Tm值(65°C)的差值小(3°C)。因此,根據(jù)使用這些比較例的探針的融解曲線無(wú)法以優(yōu)異的可靠性來(lái)判斷完全匹配或錯(cuò)配為哪一個(gè)。進(jìn)而,其它的比較例也表現(xiàn)出與圖6中的比較例3-9或者比較例3-11相同的融解曲線。與其相反,使用實(shí)施例3-l的探針的情況下,如圖5所示,可以充分地確認(rèn)表示上述探針和互補(bǔ)鏈DNA(1B)完全匹配的信號(hào)和表示上述探針和互補(bǔ)鏈DNA(1A)錯(cuò)配的信號(hào)。進(jìn)而,表示上述完全匹配的峰的Tm值(75°C)和表示上述錯(cuò)配的峰的Tm值(68°C)之間的差值約為7。C。是能夠充分判斷兩者的差值。因此,根據(jù)實(shí)施例的探針,能夠充分地判斷所顯示的是完全匹配還是錯(cuò)配。實(shí)施例4制備序列號(hào)1中第4265位表現(xiàn)為4265A/4265A的純合子的純化的人基因組、以及第4265位表現(xiàn)為4265G/4265G的純合子將這些純化的基因組1|iL,分別加入到24^L下述組成的PCR反應(yīng)液中,供給熱循環(huán)儀(商品名SmartCycler,Cepheid公司制)進(jìn)行PCR。PCR的條件是95。C處理60秒后,以95。C1秒和62。C30秒作為l個(gè)循環(huán),重復(fù)進(jìn)行50個(gè)循環(huán)。然后將溫度的上升速度設(shè)為rC/3秒,將上述反應(yīng)液從45。C加熱到95°C,測(cè)定熒光強(qiáng)度的經(jīng)時(shí)變化。測(cè)定波長(zhǎng)是505~537nm(熒光染沖牛FAM的4企測(cè),lch)。(表12)(PCR反應(yīng)液?jiǎn)挝籶L)蒸餾水6.62540%甘油12.510xGeneTaq緩沖液氺2.510mMdNTPs0.5100mMMgCl20.3755pM(32AR基因用探針1IOOjiM卩2AR基因用正向引物0.25100nM(32AR基因用反向引物0.1255U/^iLGeneTaqFP*_0.125總計(jì)24pL*商品名GeneTaqFP:-7;K>、-—7/>司產(chǎn)(探針)卩2AR基因解析用探針5,一cgcatggcttcCattgggtgcca—(BODIPYFL)—3,(序列號(hào)72)(引物對(duì))(32AR基因用正向引物—3,(序歹寸號(hào)165)(32AR基因用反向引物5,一tggtgaccgtctgcagacgctcgaac—3,(序歹'J號(hào)166)使用上述引物對(duì)通碌PCR擴(kuò)增出的區(qū)域是序列號(hào)1中含有第4265位的200個(gè)堿基左右的DNA鏈。從顯示為4265G/4265G的基因組擴(kuò)增出第4265位是G(反義鏈?zhǔn)荂)的DNA鏈,從顯示為4265A/4265A的基因組擴(kuò)增出第4265位是A(反義鏈?zhǔn)荰)的DNA。與上述序列號(hào)72所示的(32AR基因解析用探針匹配的雜交體的Tm值是69。C,錯(cuò)配的雜交體的Tm值是62。C。圖7中示意出這些結(jié)果。圖7顯示了伴隨溫度上升的焚光強(qiáng)度變化的Tm解析的圖(融解曲線),縱軸的微分值表示"-d熒光強(qiáng)度增加量/dt",橫軸表示溫度(以下相同)。圖7中綜合示意出添加了表示4265A/4265A純合子的純化的人基因組的體系的融解曲線(細(xì)線)、以及添加了表示4265G/4265G純合子的純化的人基因組的體系的融解曲線(粗線)。根據(jù)該圖所示,在實(shí)施例4的探針共存下,擴(kuò)增人純化基因組的p2AR基因中的DNA、進(jìn)行Tm解析的結(jié)果,能夠與4265位的堿基相區(qū)別而檢測(cè)。具體的,表示上述探針和4265G/4265G純合子來(lái)源的擴(kuò)增產(chǎn)物完全匹配的峰的Tm值(69°C)與表示上述探針和4265A/4265A純合子來(lái)源的擴(kuò)增產(chǎn)物錯(cuò)配的峰的Tm值(62°C)之間的差值約為7。C,是足以充分區(qū)別兩者的差值。因此,根據(jù)實(shí)施例的探針,能夠充分地解析(32AR基因中第4265位的多態(tài)性。產(chǎn)業(yè)上的實(shí)用性如上,根據(jù)本發(fā)明的引物,可以特異且高效地?cái)U(kuò)增肥胖基因((32AR基因、(33AR基因和UCP1基因)中含有發(fā)生特定多態(tài)性的位點(diǎn)的區(qū)域。因此,如上所述,與傳統(tǒng)方法相比,能夠降低時(shí)間和成本。此外,由于可以特異性擴(kuò)增含有多態(tài)性的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的區(qū)域,再通過(guò)使用例如與含有上述檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的檢測(cè)對(duì)象序列互補(bǔ)的探針,可以使用上述反應(yīng)液直接進(jìn)行Tm解析、將上述多態(tài)性進(jìn)行分型。另外,由于可以在一個(gè)反應(yīng)液中進(jìn)行擴(kuò)增、分型,因此還能夠?qū)崿F(xiàn)操作的自動(dòng)化。而且,當(dāng)使用本發(fā)明的引物對(duì)時(shí),例如即便是含有雜質(zhì)的試樣(例如全血或口腔粘膜等),也可以省略預(yù)處理、因此,能夠更為迅速且簡(jiǎn)單地進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。另外,當(dāng)使用本發(fā)明的引物對(duì)時(shí),可以以優(yōu)于以往的擴(kuò)增效率進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),因此還能夠縮短擴(kuò)增反應(yīng)。因此,通過(guò)本發(fā)明的引物對(duì)、含有其的試劑以及使用它們的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法,可以迅速且簡(jiǎn)單地解析選自由(32AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少一個(gè)肥胖基因的多態(tài)性,在醫(yī)療領(lǐng)域是非常有效的。權(quán)利要求1.一種肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì),其特征在于,其為用于通過(guò)基因擴(kuò)增法擴(kuò)增肥胖基因的引物對(duì),所述肥胖基因是選自由β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因,所述引物對(duì)含有選自下述引物對(duì)(1)~(3)所組成的組中的至少1個(gè)引物對(duì)。引物對(duì)(1)包含含有下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一個(gè)引物對(duì)(F1)下列寡核苷酸中的至少一個(gè)與序列號(hào)1的堿基序列中的、以第4248位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1位堿基、向著5’方向到第18~25個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以所述胸腺嘧啶堿基(T)作為3’末端和與序列號(hào)1的堿基序列中的、以第4250位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1位堿基、向著5’方向到第18~26個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以所述胸腺嘧啶堿基(T)作為3’末端(R1)下列寡核苷酸中的至少一個(gè)與序列號(hào)1的堿基序列中的、以第4292位的腺嘌呤堿基(A)作為第1位堿基、向著3’方向到第21~31個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以與所述第4292位的腺嘌呤堿基(A)互補(bǔ)的胸腺嘧啶堿基(T)作為3’末端和與序列號(hào)1的堿基序列中的、以第4301位的腺嘌呤堿基(A)作為第1位堿基、向著3’方向到第18~27個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以與所述第4301位的腺嘌呤堿基(A)互補(bǔ)的胸腺嘧啶堿基(T)作為3’末端引物對(duì)(2)包含含有下述(F2)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2)的寡核苷酸的反向引物的一個(gè)引物對(duì)(F2)與序列號(hào)2的堿基序列中的、以第4110位的胞嘧啶堿基(C)作為第1位堿基、向著5’方向到第16~20個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以所述胞嘧啶堿基(C)作為3’末端(R2)與序列號(hào)2的堿基序列中的、以第4172位的鳥嘌呤堿基(G)作為第1位堿基、向著3’方向到第15~19個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以與所述第4172位的鳥嘌呤堿基(G)互補(bǔ)的胞嘧啶堿基(C)作為3’末端引物對(duì)(3)包含含有下述(F3)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R3)的寡核苷酸的反向引物的一個(gè)引物對(duì)(F3)與序列號(hào)3的堿基序列中的、以第280位的胞嘧啶堿基(C)作為第1位堿基、向著5’方向到第25~44個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以所述胞嘧啶堿基(C)作為3’末端(R3)與序列號(hào)3的堿基序列中的、以第350位的胞嘧啶堿基(C)作為第1位堿基、向著3’方向到第23~38個(gè)堿基的區(qū)域互補(bǔ)的至少1個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以與所述第350位的胞嘧啶堿基(C)互補(bǔ)的鳥嘌呤堿基(G)作為3’末端2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì),所述(1)~(3)的引物對(duì)分別是下述(1,)~(3,)的引物對(duì)。引物對(duì)(l'):包含含有下述(Fl,)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(Rl,)的寡核苷酸的反向引物的一個(gè)引物對(duì)(Fl,)含有序列號(hào)9的堿基序列的寡核苷酸和含有序列號(hào)109的堿基序列的寡核苷酸中的至少1種寡核苷酸(Rl,)選自由含有序列號(hào)12的i成基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)18的堿基序列的寡核苷酸以及含有序列號(hào)134的堿基序列的寡核苷酸所組成的組中的至少l種寡核香酸引物對(duì)(2'):包含含有下述(F2,)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R2')的寡核苷酸的反向引物的一個(gè)引物對(duì)(F2,)含有序列號(hào)24的堿基序列的寡核苷酸和含有序列號(hào)25的堿基序列的寡核苷酸中的至少1種寡核苷酸(R2,)含有序列號(hào)28的堿基序列的寡核苷酸、和含有序列號(hào)30的堿基序列的寡核苷酸中的至少1種寡核苷酸引物對(duì)(3'):包含含有下述(F3,)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R3')的寡核苷酸的反向引物的一個(gè)引物對(duì)(F3,)含有序列號(hào)43的堿基序列的寡核苷酸(R3,)含有序列號(hào)63的堿基序列的寡核苷酸3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì),所述肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì)是用于擴(kuò)增生物試樣中的肥胖基因的引物對(duì)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì),所述生物試樣是全血。5.—種肥胖基因擴(kuò)增用試劑,其特征在于,其為用于通過(guò)基因擴(kuò)增法擴(kuò)增肥胖基因的試劑,所述肥胖基因是選自由P2AR基因、P3AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因,所述試劑含有權(quán)利要求1所述的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì)。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的肥胖基因擴(kuò)增用試劑,還含有能夠與所述選自由卩2AR基因、p3AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因中的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)雜交的探針。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的肥胖基因擴(kuò)增用試劑,所述探針是選自由下述(P1,)~(P3,)所示的寡核苷酸所組成的組中的至少一種探針。(Pl,)含有序列號(hào)72的堿基序列的寡核苷酸和含有序列號(hào)114的堿基序列的寡核苷酸中的至少一種寡核香酸(P2,)選自由含有序列號(hào)83的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)120的堿基序列的寡核苷酸、和含有序列號(hào)127的堿基序列的寡核苷酸所組成的組中的至少一種寡核苷酸(P3,)含有序列號(hào)95的堿基序列的寡核苷酸和含有序列號(hào)139的堿基序列的寡核苷酸中的至少一種寡核香酸8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的肥胖基因擴(kuò)增用試劑,所述探針是熒光標(biāo)記探針。9.一種擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法,其特征在于,其為通過(guò)基因擴(kuò)增法制造肥胖基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的方法,所述肥胖基因是選自由卩2AR基因、卩3AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因,所述方法含有下述(I)步驟。(I)以試樣中的核酸為模板,使用權(quán)利要求1所述的肥胖基因擴(kuò)增用引物對(duì),在反應(yīng)液中擴(kuò)增所述選自由P2AR基因、P3AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因的步驟10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法,在所述(I)步驟中,向所述反應(yīng)液中,進(jìn)一步添加能夠與所述選自由卩2AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因中的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)雜交的探針。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法,所述探針是選自由下述(P1,)~(P3,)所示的寡核苷酸所組成的組中的至少一種探針。(Pl,)含有序列號(hào)72的堿基序列的寡核苷酸和含有序列號(hào)114的堿基序列的寡核苷酸中的至少一種寡核苷酸(P2,)選自由含有序列號(hào)83的堿基序列的寡核苷酸、含有序列號(hào)120的堿基序列的寡核苷酸、和含有序列號(hào)127的堿基序列的寡核苷酸所組成的組中的至少一種寡核苷酸(P3,)含有序列號(hào)95的堿基序列的寡核苷酸和含有序列號(hào)139的堿基序列的寡核苷酸中的至少一種寡核苷酸12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法,所述探針是熒光標(biāo)記探針。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法,還含有下述(II)步驟。(II)對(duì)于所述反應(yīng)液,測(cè)定所述熒光標(biāo)記探針中的熒光標(biāo)記的焚光強(qiáng)度的步驟14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法,所述試樣是生物試樣。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法,所述生物試樣是全血。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法,所述反應(yīng)液中全血試樣的添加比例是0.1~0.5體積%。17.—種多態(tài)性解析方法,其特征在于,其為解析肥胖基因中的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的多態(tài)性的方法,所述肥胖基因是選自由所述(32AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因,所述方法含有下述(i)~(iv)步驟。(i)通過(guò)權(quán)利要求9所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的制造方法,在反應(yīng)液中擴(kuò)增所述選自由P2AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因中的含有檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的區(qū)域的步驟(ii)準(zhǔn)備反應(yīng)液的步驟,所述反應(yīng)液含有所述(i)步驟中的擴(kuò)增產(chǎn)物、和能夠與所述選自由P2AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)雜交的探針(iii)改變所述反應(yīng)液的溫度,測(cè)定所述擴(kuò)增產(chǎn)物和所述探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號(hào)值的步驟(iv)根據(jù)伴隨溫度變化的所述信號(hào)值的變動(dòng),確定所述選自由(32AR基因、(33AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因中的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的多態(tài)性的步驟18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的多態(tài)性解析方法,在所述(i)步驟中,在擴(kuò)增反應(yīng)前向所述反應(yīng)液中添加能夠與所述選自由P2AR基因、p3AR基因和UCP1基因所組成的組中的至少1個(gè)基因的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)雜交的探針。19.一種肥胖基因解析用探針,其特征在于,其為用于肥胖基因的多態(tài)性解析中的探針,所述肥胖基因是(32AR基因,所述探針含有下述(Pl)所示的寡核苷酸。(Pl):下述(1-1)和下述(1-2)中的至少一種寡核香酸(1-1):與序列號(hào)1中的、以第4254位的胸腺嘧啶堿基(T)作為第1位石威基、向著3'方向到第21~26個(gè)石咸基的區(qū)域互補(bǔ)的至少l個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以與所述胸腺嘧啶堿基互補(bǔ)的腺噤呤堿基(A)作為3'末端(1-2):與序列號(hào)1中的、以第4259位的胞嘧啶堿基(C)作為第1位堿基、向著3'方向到第15~19個(gè)堿基的區(qū)域序列相同的至少l個(gè)寡核苷酸,該寡核苷酸以所述胞嘧啶堿基作為5,末端20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的肥胖基因解析用探針,所述探針是用于通過(guò)融解溫度的解析來(lái)進(jìn)行的(32AR基因的多態(tài)性解析中的探針。21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的肥胖基因解析用探針,所述探針是用于權(quán)利要求17所述的多態(tài)性解析方法中的探針。22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的肥胖基因解析用探針,所述探針是含有下述(Pl,)所示的寡核苷酸的探針。(Pl,)含有序列號(hào)72的堿基序列的寡核苷酸和含有序列號(hào)114的堿基序列的寡核苷酸中的至少一種寡核苷酸23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的肥胖基因解析用探針,所述探針是帶有標(biāo)記物的標(biāo)記探針。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的肥胖基因解析用探針,所述標(biāo)記物是熒光物質(zhì)。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的肥胖基因解析用探針,所述標(biāo)記探針是單獨(dú)顯示熒光、且由于雜交而熒光消失的探針。26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的肥胖基因解析用探針,所述探針是所述(1-1)的寡核苷酸的3,末端帶有所述標(biāo)記物的標(biāo)記探針。27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的肥胖基因解析用探針,所述探針是所述(1-2)的寡核苷酸的5,末端帶有所述標(biāo)記物的標(biāo)記探針。28.—種肥胖基因解析用試劑,其特征在于,其為用于肥胖基因的解析的試劑,所述肥胖基因是(32AR基因,所述試劑含有權(quán)利要求19所述的肥胖基因解析用探針。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的肥胖基因解析用試劑,所述試劑是用于通過(guò)融解溫度的解析來(lái)進(jìn)行的肥胖基因的多態(tài)性解析中的試劑。30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的肥胖基因解析用試劑,所述試劑是用于權(quán)利要求17所述的多態(tài)性解析方法中的試劑。31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的肥胖基因解析用試劑,其還含有用于擴(kuò)增(32AR基因中的、含有多態(tài)性檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的檢測(cè)對(duì)泉序列的引物。32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的肥胖基因解析用試劑,所述肥胖基因解析用試劑是用于解析生物試樣中的P2AR基因中的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的多態(tài)性的試劑。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的肥胖基因解析用試劑,所述生物試樣是全血。34.—種肥胖基因解析方法,其特征在于,其為解析肥胖基因的肥胖基因解析方法,所述肥胖基因是P2AR基因,所述方法包含下述(a)~(c)步驟。(a)準(zhǔn)備反應(yīng)液的步驟,所述反應(yīng)液含有(32AR基因中的、含有多態(tài)性檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的檢測(cè)對(duì)象序列、以及權(quán)利要求19所述的肥胖基因解析用探針(b)改變所述反應(yīng)液的溫度,測(cè)定所述^r測(cè)對(duì)象序列和所述肥胖基因解析用探針的雜交產(chǎn)物顯示融解狀態(tài)的信號(hào)值的步驟(c)由伴隨溫度變化的所述信號(hào)值的變動(dòng),確定所述雜交產(chǎn)物的融解溫度的步驟35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的肥胖基因解析方法,還包含下述(d)步驟。(d)根據(jù)所確定的融解溫度,判斷(32AR基因的所述檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的多態(tài)性的步驟36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的肥胖基因解析方法,所述肥胖基因解析用探針是帶有熒光物質(zhì)的標(biāo)記探針,在所述(b)步驟中,測(cè)定所述熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度作為所述信號(hào)值。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的肥胖基因解析方法,所述標(biāo)記探針是單獨(dú)顯示熒光、且由于雜交而熒光消失的探針,在所述(b)步驟中,升高所述反應(yīng)液的溫度,測(cè)定伴隨溫度上升的熒光強(qiáng)度的減少。38.根據(jù)權(quán)利要求34所述的肥胖基因解析方法,還含有下述(x)步驟。(x)以試樣中的核酸作為模板,使用用于擴(kuò)增(32AR基因中的所述檢測(cè)對(duì)象序列的引物,在反應(yīng)液中擴(kuò)增所述檢測(cè)對(duì)象序列的步驟39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的肥胖基因解析方法,在所述(x)步驟中,在擴(kuò)增反應(yīng)前,向所述反應(yīng)液中添加所述肥胖基因解析用探針,將所述(x)步驟中的擴(kuò)增反應(yīng)后的所述反應(yīng)液作為所述(a)步驟中的反應(yīng)液使用。40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的肥胖基因解析方法,所述試樣是生物試樣。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的肥胖基因解析方法,所述生物試樣是全血。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的肥胖基因解析方法,所述反應(yīng)液中全血的添力p比例是0.1~0.5體積%。43.—種多態(tài)性解析方法,其特征在于,其為通過(guò)融解溫度的解析來(lái)解析肥胖基因中的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的多態(tài)性的多態(tài)性解析方法,所述肥胖基因是(32AR基因,所述方法包括權(quán)利要求34所述的肥胖基因解析方法。全文摘要本發(fā)明提供引物對(duì),其為用于通過(guò)基因擴(kuò)增法擴(kuò)增肥胖基因(β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因)中包含檢測(cè)目標(biāo)位點(diǎn)的目標(biāo)區(qū)域的引物對(duì),其可以特異性擴(kuò)增上述區(qū)域。使用3對(duì)引物對(duì),其分別包含含有序列號(hào)9或序列號(hào)109、序列號(hào)25和序列號(hào)43的堿基序列的正向引物,和包含序列號(hào)18、序列號(hào)30和序列號(hào)63的堿基序列的反向引物。通過(guò)使用該引物對(duì),可以在同一反應(yīng)液中同時(shí)特異性擴(kuò)增β2AR基因、β3AR基因和UCP1基因中包含發(fā)生檢測(cè)目標(biāo)多態(tài)性的位點(diǎn)的目標(biāo)區(qū)域。文檔編號(hào)G01N21/78GK101517080SQ200780034278公開日2009年8月26日申請(qǐng)日期2007年11月30日優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日發(fā)明者平井光春,間島智史申請(qǐng)人:愛科來(lái)株式會(huì)社
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