專利名稱：：改進的免疫測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明通常涉及診斷或預(yù)后測定的領(lǐng)域，并特別涉及用于在包含患者體液的樣品中檢測抗體的測定，其中這些抗體用作疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標志物。
背景技術(shù)：
：許多診斷、預(yù)后和/或監(jiān)測測定依賴于檢測特定疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標志物。此類生物標志物通常是作為特定疾病的特征或與疾病易感性相關(guān)的蛋白質(zhì)或多肽。近年來顯然抗體(尤其是自身抗體)也可用作疾病或疾病易感性的生物標志物。自身抗體是天然產(chǎn)生的抗體，其針對被個體的免疫系統(tǒng)識別為外源(盡管該抗原實際上來源于該個體)的抗原。它們可以作為循環(huán)的游離自身抗體或者以循環(huán)的免疫復(fù)合體的形式存在于循環(huán)中，所述循環(huán)免疫復(fù)合體由與其靶抗原結(jié)合在一起的自身抗體組成。在一些情況下，由"正常"細胞表達的野生型蛋白質(zhì)與疾病細胞產(chǎn)生的或在疾病過程中產(chǎn)生的變異形式蛋白質(zhì)之間的差異導(dǎo)致個體的免疫系統(tǒng)將所述改變蛋白質(zhì)識別為"非自身的"，并因此在該個體中引發(fā)免疫應(yīng)答。這可能是體液(即B細胞介導(dǎo)的)免疫應(yīng)答，導(dǎo)致產(chǎn)生對該變異蛋白質(zhì)具有免疫特異性的自身抗體。WO99/58978描述了用于檢測/診斷癌癥的方法，所述方法基于評估個體對兩種或更多種不同肺瘤標志物的免疫應(yīng)答。這些方法通常涉及以下步驟使從該個體中取得的體液樣品與一組兩種或更多種不同胂瘤標志物抗原接觸，每種肺瘤標志物抗原來自不同的肺瘤標志物蛋白；以及檢測所述腫瘤標志物抗原與對該腫瘤標志物蛋白具有免疫特異性的循環(huán)自身抗體結(jié)合的復(fù)合體的形成。將該循環(huán)自身抗體的存在視為癌癥存在的指示。通過自身抗體產(chǎn)生來測定個體對腫瘤標志物蛋白存在的免疫應(yīng)答的測定為直接測定或檢測體液中的肺瘤標志物蛋白提供了替代方案。這種測定基本上構(gòu)成了對腫瘤標志物蛋白存在的間接檢測。由于免疫應(yīng)答的性質(zhì)，很可能自身抗體可被極少量的循環(huán)腫瘤標志物蛋白誘發(fā)，因而依賴于檢測對肺瘤標志物的免疫應(yīng)答的間接方法將比用于直接測定體液中腫瘤標志物的方法更為靈敏。因此，基于自身抗體檢測的測定方法在疾病早期有特殊價值，并還可能用于篩選無癥狀患者，例如用于在無癥狀個體群中鑒定具有發(fā)生疾病"風險"的個體或者在無癥狀個體群中鑒定已患有疾病的個體的篩選中。此外，基于自身抗體檢測的測定方法可能在疾病早期有特殊價值，并還可用于在無癥狀個體群中鑒定已患疾病的個體。此外，它們可用于復(fù)發(fā)性疾病的早期檢測。所述測定方法還可能在疾病療法的選擇或監(jiān)測中有價值。抗體和自身抗體還可用作其它疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標志物，其中類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、原發(fā)性膽汁性肝硬化(primarybiliarycirrhosis,PBC)、自身免疫性甲狀腺炎(例如橋本甲狀腺炎)、自身免疫性胃炎(例如惡性貧血)、自身免疫性腎上腺炎(例如阿狄森氏病)、自身免疫性曱狀旁腺功能減退癥、自身免疫性糖尿病(例如l型糖尿病)、重癥肌無力僅僅是所述疾病的一些實例。本發(fā)明人認識到，當在診斷或預(yù)后上使用基于抗體檢測的測定來評估群體中個體的疾病狀態(tài)、疾病進程或疾病易感性時，在設(shè)計適用于整個待篩選受試者群體的標準化測定法方面可能遇到困難，因為所存在抗體的絕對量在不同個體之間差異顯著。例如在具有低抗體量的個體中，這可產(chǎn)生高頻率的假陰性結(jié)果。類似地，因為抗體的絕對量在不同個體之間變化意味著難于為陽性測定結(jié)果設(shè)置適合于所篩選群體中所有個體的閾值，所以對真陽性結(jié)果的評分有困難。本發(fā)明人確定，可通過包括抗原滴定步驟而明顯改善測定的表現(xiàn)，更尤其改善其臨床效用及可靠性，所述測定基于檢測作為疾病生物標志物的抗體(尤其是自身抗體)。通過檢測懷疑含有針對一系列不同量抗原的抗體的樣品并構(gòu)建滴定曲線，可以不依賴樣品中存在的抗體絕對量而可靠地鑒定真陽性篩選結(jié)果。這樣的方法與現(xiàn)有技術(shù)的方法相反，現(xiàn)有技術(shù)的方法僅滴定抗原來構(gòu)建標準曲線，以允許鑒定待用于檢測實際患者樣品中抗體的最適當抗原濃度。在這些方法中，僅有單個點測定被提出用于實際診斷。因此，這些方法不考慮待檢抗體的量在不同個體之間的變化，這導(dǎo)致假陽性和假陰性的發(fā)生。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，基于抗原滴定的測定方法比在單個抗原濃度下測定自身抗體反應(yīng)性顯示出更高的特異性和靈敏度。本發(fā)明人還確定，將抗原滴定與同時滴定測試樣品相結(jié)合的測定方法甚至比單獨基于抗原滴定的方法提供更大的優(yōu)勢，特別是在自身抗體檢測的情況下。這些所謂的"交叉滴定"方法構(gòu)成了本發(fā)明的主題。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供在哺乳動物受試者中檢測疾病狀態(tài)或疾病易感性的方法，所述方法包括在測試樣品中檢測抗體，其中所述測試樣品包含來自所述哺乳動物受試者的體液，且其中所述抗體是疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標志物，所述方法包括(a)制備所述測試樣品的兩種或更多種不同稀釋液，并對每個測試樣品稀釋液進行以下步驟(i)和(ii):(i)使所述測試樣品稀釋液接觸多種不同量的對所述抗體具有特異性的抗原，(ii)對步驟(i)中所用的每個抗原量，檢測抗體與抗原之間特異性結(jié)合的量，(b)對步驟(a)中所用的每個測試樣品稀釋液，繪制或計算出特異性結(jié)合量相對于抗原量的各個曲線，和(c)對每個所測試的測試樣品稀釋液和抗原量，基于所述抗體與所述抗原之間特異性結(jié)合的量來確定所述疾病狀態(tài)或疾病易感性的存在與否。根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，提供在包含來自哺乳動物受試者的體液的測試樣品中檢測抗體的方法，其中所述抗體是疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標志物，所述方法包括(a)制備所述測試樣品的兩種或更多種不同稀釋液，并就每個測試樣品稀釋液進行以下步驟(i)和(ii):(i)使所述測試樣品稀釋液接觸多個不同量的對所述抗體具有特異性的抗原，(ii)對步驟(i)中所用的每個抗原量，檢測抗體與抗原之間特異性結(jié)合的量，(b)對步驟(a)中所用的每個測試樣品稀釋度，繪制或計算出特異性結(jié)合量相對于抗原量的各個曲線，其中通過對所述測試樣品的至少兩種不同稀釋度呈現(xiàn)總體為S形的曲線來表明測試樣品中存在與測定中所用抗原具有反應(yīng)性的抗體。根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，提供在包含來自哺乳動物受試者的體液的測試樣品中檢測抗體的方法，其中所述抗體針對引入至所述哺乳動物受試者中的外源物質(zhì)，所述方法包括(所述方法包括(a)制備所述測試樣品的兩種或更多種不同稀釋液，并就每個測試樣品稀釋液進行以下步驟(i)和(ii):(i)使所述測試樣品稀釋液接觸多個不同量的對所述抗體具有特異性的抗原，(ii)對步驟(i)中所用的每個抗原量，檢測抗體與抗原之間特異性結(jié)合的量，(b)對步驟(a)中所用的每個測試樣品稀釋液，繪制或計算出特異性結(jié)合量相對于抗原量的各個曲線，其中通過對所述測試樣品中至少兩個不同稀釋液而現(xiàn)總體為S形的曲線來表明測試樣品中存在與測定中所用抗原具有反應(yīng)性的抗體。在本發(fā)明的所有方面中，所述哺乳動物受試者優(yōu)選為人類。在本發(fā)明的所有方面中，所述抗體可以是自身抗體。在本發(fā)明的所有方面中，所述方法優(yōu)選在體外對測試樣品進行，所述測試樣品包含從所述哺乳動物受試者獲得或制備的體液。在本發(fā)明的所有方面中，測定的步驟(a)將優(yōu)選包括使每一種測試樣品稀釋液都與用于所述測定的每一種抗原量接觸，以使測試樣品稀釋液與抗原量的所有可能組合均被測試。在其所有方面中，本發(fā)明的一個獨特特征在于，對測試樣品中是否存在相關(guān)抗體的判斷是基于在測試樣品稀釋度與所測試抗原濃度的每一種不同組合中觀察到的特異性結(jié)合的量，換言之是集合值，而不是僅在單個抗原濃度下的讀數(shù)或單個測試樣品稀釋度的讀數(shù)。因此，可以直接基于這些集合值來確定疾病狀態(tài)或疾病易感性或患者樣品中針對外源物質(zhì)的抗體的存在與否。在一個實施方案中，該判斷是基于對所述測試樣品的至少兩個不同稀釋度而言，在將抗原量對特異性結(jié)合量進行作圖時，存在總體為S形曲線。從本文實施例中將顯而易見的是，本發(fā)明人觀察到，本發(fā)明的方法比僅基于抗原滴定的診斷或檢測方法具有更高的靈敏度，并與其具有至少同等的特異性，并且降低假陽性和假陰性測定的發(fā)生率?，F(xiàn)在將進一步描述本發(fā)明。在以下段落中，更詳細地定義了本發(fā)明多個方面的不同特征。結(jié)合本發(fā)明的一個方面這樣定義的每個特征可與結(jié)合本發(fā)明任何其它方面進行描述的特征相結(jié)合，除非明確指出不是這樣。特別地，指明為優(yōu)選或有利的任何特征可與指明為優(yōu)選或有利的任何其它特征結(jié)合，除非明確指出不是這樣。圖l顯示用于在得自乳腺癌患者的血清樣品中檢測針對p53(圖la至d)和c-myc(圖le至h)的自身抗體的一系列交叉滴定曲線。在每個實驗中，分別對患者血清的六個不同稀釋度針對重組p53或c-myc的不同抗原量的滴定系列測試特異性結(jié)合(1/10,000的血清稀釋液是有效的"無血清，，對照)。對于每種抗原，為患者血清的每個稀釋度繪制了特異性結(jié)合(表述為在650nm處的吸光度)相對于抗原濃度的各個曲線。圖2圖示了根據(jù)實施例3用于進行最佳血清和抗原濃度(OptimalSerumandAntigenConcentration,OSAAC)測定的滴定板布局的實例。注意-血清及抗原的稀釋度示于各個平板上，而實際上卻是將血清及抗原的稀釋液加入至同一平板的對應(yīng)孔中。圖3至7顯示用于在得自原發(fā)性乳腺癌患者和正常對照受試者的血清樣品中檢測針對p53、ECD6(還稱作HER2的胞外結(jié)構(gòu)域)及ECD6的3，片段的自身抗體的一系列交叉滴定曲線。在每個實驗中，分別對患者血清的六個不同稀釋度針對重組p53、ECD6或ECD63'片段不同抗原量的滴定系列測試特異性結(jié)合。對于每種抗原，為患者血清的每個稀釋度繪制了特異性結(jié)合(表述為在650nm處的吸光度)相對于抗原濃度的各個曲線。圖3顯示用于在來自原發(fā)性乳腺癌患者(圖a)或正常對照受試者(圖b)的血清中檢測抗p53自身抗體的代表性滴定曲線。圖4顯示用于在來自原發(fā)性乳腺癌患者(圖a)或正常對照受試者(圖b)的血清中檢測抗ECD6自身抗體(使用ECD6抗原)的代表性滴定曲線。圖5顯示用于在來自原發(fā)性乳腺癌患者(圖a)或正常對照受試者(圖b)的血清中檢測抗ECD6自身抗體(使用ECD63'抗原)的代表性滴定曲線。圖6顯示使用p53抗原(圖A)、ECD6抗原(圖B)或ECD63，抗原(圖C)在來自同一原發(fā)性乳腺癌患者的血清中檢測抗p53自身抗體或抗ECD自身抗體的代表性滴定曲線。圖7(圖a至d)顯示實施例3中提到的額外的滴定曲線。發(fā)明詳述概括而言，本發(fā)明提供用于檢測作為疾病狀態(tài)或疾病易感性生物標志物的抗體的免疫測定方法，其特征在于對每種待檢測抗體存在情況的樣品(測試樣品)的兩種或更多種不同稀釋液各自針對不同量的對所述抗體具有特異性的抗原來測試特異性結(jié)合，并對測試樣品的每個不同稀釋液制備抗體/抗原結(jié)合量相對于所測試抗原量的各個滴定曲線。筒言之，所述測定基于測試樣品及在該免疫測定中用作試劑的抗原的交叉滴定。免疫測定(例如ELISA、放射性免疫測定等)的一般特征為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參閱Immunoassay,E.Diamandis和T.Christopoulus，AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA,1996)。用于檢測具有特殊免疫特異性的抗體的免疫測定法通常需要使用在測試中顯示與抗體具有特異性免疫反應(yīng)性的試劑(抗原)。根據(jù)測定的方式，可以將該抗原固定在固體支持物上。將待檢測抗體存在情況的樣品與該抗原接觸，如果具有所需免疫特異性的抗體存在于所述樣品中，它們將與抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，以形成隨后可檢測或定量測定的抗體-抗原復(fù)合體。本發(fā)明方法的特征在于將每一待檢測抗體存在情況的樣品的兩種或更多種不同稀釋液各自針對多種不同抗原量(本文中也稱作抗原滴定系列)進行測試。所述測定必須包括測試所述測試樣品的至少兩種不同稀釋液，但還可包括測試所述測試樣品的三種、四種、五種或六至十種或甚至更多種不同稀釋液。針對至少兩種，并優(yōu)選至少三種、四種、五種、六種、七種或更多不同抗原量來檢測所述測試樣品的每種不同稀釋液。典型測定還可包括不含任何抗原的陰性對照和/或陰性測試樣品對照，如所述測試樣品的1/10,000稀釋液。在本文的上下文中，術(shù)語"抗原"指包含至少一個抗原決定簇或表位的物質(zhì)，所述抗原決定簇或表位能夠與期望檢測的靶抗體特異性相互作用，或者指與所述抗體的可變區(qū)或互補性決定區(qū)發(fā)生特異性相互作用的任何捕獲試劑。所述抗原通常是天然或合成的生物大分子，如蛋白質(zhì)或肽，多糖或核酸，并可包括抗體或其片段，如抗獨特型抗體。技術(shù)人員讀者將理解，在本發(fā)明的方法中，可供結(jié)合靶抗體的抗原決定簇或表位的量對于建立滴定系列是很重要的。在許多測試形式中，可供結(jié)合的抗原決定簇或表位的量與所存在的抗原分子量直接相關(guān)。然而，在另一些實施方案中，如某些固相測定系統(tǒng)中，暴露的抗原決定簇或表位的量可能與抗原量不直接相關(guān)聯(lián)，而是可能取決于其它因素，如對所述固相表面的附著。在這些實施方案中，本文中提及滴定系列中的"不同抗原量"時可認為是指不同的抗原決定簇或表位量。針對測試樣品稀釋液與測試抗原(抗原決定簇或表位)量的每種不同組合來測定(存在于所述測試樣品稀釋液中的)抗體與抗原之間的特異性結(jié)合的相對量或絕對量。然后使用所得結(jié)果對每一測試抗原量繪制或計算出(相對或絕對)特異性結(jié)合量相對于抗原量的一系列曲線，對測定中所使用的每種測試樣品稀釋度產(chǎn)生了各自的曲線。附圖中展示了用于檢測許多不同抗體的典型結(jié)果，其僅用于舉例?；趯y定中使用的每種測試樣品稀釋度在每種抗原量下觀察到的特異性結(jié)合量來確定測試樣品中與測定中所用抗原具有反應(yīng)性的抗體的存在情況，這通常由在至少兩個不同測試樣品稀釋度下存在總體為s形的曲線來指示?？贵w與抗原之間特異性結(jié)合的絕對量通常并不是必要的，除非期望產(chǎn)生定量測定。對于抗體存在與否的簡單是/非測定而言，只要對測定中所測試的至少兩種不同測試樣品稀釋度產(chǎn)生正確形狀的曲線就足夠了。如果對所測試的任何測試樣品稀釋度而言，在所測試的不同抗原量中可檢測到的結(jié)合沒有變化的話，那么可將此評價為不存在可檢測量的抗體。在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方案中，所述方法是非定量的。因而可使用不依賴于信號強度的無量綱比例關(guān)系來產(chǎn)生抗體存在與否的是/非測定。如需要，可從較差滴定測定的結(jié)果中產(chǎn)生對存在于特定樣品中的抗體量的測定。在涉及患者群體的臨床測試的非限制性實施方案中，可通過與得自正常受試者的對照組的結(jié)果進行比較來確定在特定患者中評價結(jié)果為陽性結(jié)果的截取值(cut-off),例如正常群體的均值+2倍標準差的截取值?？蓪⑦@樣的患者樣品評價為陽性，其中在至少一種抗原濃值)高于該截取值。在本發(fā)明的另一些非限制性實施方案中，可使用校準系統(tǒng)，以將未知測試樣品評價為陽性或陰性。一種這樣的校準系統(tǒng)可以基于使用已知為陽性和陰性的對照樣品?？墒褂帽景l(fā)明的測定方法將陽性及陰性對照/校準樣品與測試樣品平行進行分析。通過與用作校準樣品的已知陽性及陰性對照樣品進行比較，將未知測試樣品判斷為陽性或陰性。本發(fā)明的方法對于所存在靶抗體的絕對量可在不同患者之間有巨大變化的臨床診斷、預(yù)后、預(yù)測和/或監(jiān)測測定是有利的。本發(fā)明人觀察到，如果這些測定基于使用單一測試抗原量/濃度來檢測抗體結(jié)合，則含有處于群體中(抗體量的)正常生理學(xué)范圍內(nèi)極低或極高端抗體量的患者樣品可能由于所述測定方法的局限性而被遺漏；含有少量抗體的樣品可能被評價為假陰性結(jié)果，而那些含有很高水平抗體的樣品可能超出所選測定方法可準確檢測的范圍之外。在本發(fā)明的所有實施方案中，使用交叉滴定測定方法檢測的抗體可以是自身抗體。本發(fā)明的交叉滴定測定方法特別適合于檢測作為疾病狀態(tài)或易感性的生物標志物的抗體/自身抗體，其中在患者中所存在抗體/自身抗體的絕對量以及抗體/自身抗體的特異性(尤其是抗體/自身抗體對其靶抗原的親和力)方面均都存在患者間的顯著差異。由其特定性質(zhì)引發(fā)的自身抗體應(yīng)答在不同患者之間可能差異顯著，并且所存在自身抗體的絕對量及自身抗體的特異性/親和力方面均存在差異。本發(fā)明的方法可將這種患者間差異考慮在內(nèi)，從而使得能夠產(chǎn)生用于任何給定抗體/自身抗體的(適用于檢測群體中所有個體的)標準測定形式。自身抗體與其靶抗原之間的相互作用通常是低親和力的相互作用，但如上文所述，結(jié)合強度在不同患者之間可能存在差異。本發(fā)明的方法特別適合于檢測低親和力的結(jié)合，因為可以從對測定中所用的每個測試樣品稀釋度所產(chǎn)生的滴定曲線的形狀中推斷陽性結(jié)果。本發(fā)明方法與僅基于抗原滴定的測定方法(即涉及針對抗原滴定系列檢測單個測試樣品的測定)的不同在于，其允許檢測由低豐度和/或低親和力抗體的結(jié)合所產(chǎn)生的信號，所述信號在其他情況下可能會被與測試樣品中非靶成分的(測定中所用抗原的)非特異性結(jié)合所掩蓋。本發(fā)明人觀察到，在靶抗體的最佳檢測所需的最佳測試樣品稀釋度中存在顯著的抗原間及抗原內(nèi)差異。因此，同一患者測試樣品可以具有用于檢測針對第一種抗原的抗體的第一最佳稀釋度，以及用于檢測針對來自不同蛋白質(zhì)的第二種抗原的抗體的不同最佳稀釋度(抗原間差異性)。對來自不同蛋白質(zhì)的兩種抗原來說，最佳測試樣品稀釋度的"差異"可以是幾個數(shù)量級。例如，給定的測試樣品用于檢測針對第一種抗原(A蛋白質(zhì))的抗體的最佳稀釋度可以是1:800，但是同一測試樣品可能需要1:50的最佳稀釋度來檢測針對第二種抗原的抗體(B蛋白質(zhì))。當所用抗原是同一蛋白質(zhì)的不同片段或者是全長蛋白質(zhì)和該蛋白質(zhì)的亞片段時，可觀察到類似的結(jié)果(抗原內(nèi)差異性)。因此，如果將對測試樣品測試對一組不同抗原(其來自不同的蛋白質(zhì)或單個蛋白質(zhì)的片段或其組合)的反應(yīng)性，該組中每種抗原所需的測試樣品最佳稀釋度可能不同。本發(fā)明的方法通過每次在臨床環(huán)境中進行該方法時針對該組中每種抗原的不同稀釋度來測試所述測試樣品的不同稀釋度而避開了該問題。因此，該組中每種抗原將在其"最佳"測試樣品稀釋度下進行自動檢測。本發(fā)明人還觀察到，對于特定抗原，可能存在最佳測試樣品稀釋度的個體間差異。因此，對于任何給定抗原，來自第一個受試者的測試樣品可能在第一種測試樣品稀釋度(例如1:100)下產(chǎn)生最佳結(jié)果，而當使用同一抗原檢測來自第二個受試者的測試樣品時，最佳測試樣品稀釋度(例如1:500)可能是不同的。本發(fā)明的方法能夠?qū)⑦@種患者之間的差異考慮在內(nèi)，因為對于所檢測的每個抗原而言，每次在臨床環(huán)境中進行測定時均針對一系列抗原稀釋度來測試一系列測試樣品稀釋度。因此，本發(fā)明的方法將始終對每種測試抗原而言針對每個測試樣品使用最佳測試樣品稀釋度。本發(fā)明的方法還在進行用于診斷、預(yù)后和/或監(jiān)測(疾病狀態(tài)或治療)目的自身抗體/抗體檢測的免疫測定時提供針對日期差異的保障。經(jīng)常觀察到，當進行用于在包含患者體液的樣品中檢測抗體的免疫測定時，信號強度存在顯著的日期差異。該差異例如可能是由于在測試前獲得及保存樣品的方式不同而產(chǎn)生的。這些因素使得難于確定地評價臨床測定的結(jié)果，例如在抗體/抗原結(jié)合的筒單閾值基礎(chǔ)上進行評價。本發(fā)明使這種日期差異的影響降到最低，因為從滴定曲線的形狀可清楚明顯地得到抗體存在的陽性結(jié)果，所述滴定曲線針對用于測定的每個測試樣品稀釋度產(chǎn)生，不依賴于信號強度。本發(fā)明方法的另一優(yōu)點在于，其允許稀釋患者樣品，而仍然產(chǎn)生一致的結(jié)果，并且其使用來自同一個體的不同來源(例如血液或血清以及腹水或胸腔積液)的體液通常產(chǎn)生相同的定性篩選結(jié)果(陽性/陰性)，即便抗體的絕對濃度在不同流體中可能不同。本發(fā)明方法可以以使懷疑含有抗體的樣品的多種稀釋液接觸多種不同抗原量的任何合適形式來實施。方便地，樣品的不同稀釋液與不同抗原量之間的接觸可在分開但平行的反應(yīng)室(如微量滴定板的孔)中發(fā)生?？赏ㄟ^由抗原貯存液在微量滴定板的孔中制備連續(xù)稀釋液而將不同量的抗原包被到微量滴定板的孔中?？乖A存液的濃度可以是已知的或未知的。然后可以向平板的孔中加入所制備測試樣品稀釋液的等分試樣，并使每個孔中測試樣品的體積保持一致。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，加入至微量滴定板的孔中的抗原絕對量可根據(jù)諸如靶抗體的性質(zhì)、測試樣品的性質(zhì)、測試樣品的稀釋度等這些因素而變化?？乖考皽y試樣品的稀釋度通常被選擇成產(chǎn)生一系列信號強度，所述信號強度在選擇用于在所述方法中檢測抗體/抗原結(jié)合的讀出值的可接受檢測范圍內(nèi)。在所附實施例中給出了用于檢測懷疑含有抗腫瘤標志物自身抗體的人類血清樣品的典型量及稀釋度。例如，測試樣品的典型稀釋度可為1/30至1/10,000(或1:50至1:1600)不等?？乖臏y試量通常為0.01pg/ml至10照/ml(或0.16nM至160nM)不等，但這并不旨在限制。如上述，即便j^存液中抗原的絕對濃度未知，以抗原的單個貯存液開始對測試樣品的兩種或更多種稀釋度構(gòu)建滴定曲線也是可能的。假如使用相同的單個貯存溶液并以相同方式進行連續(xù)稀釋，就有可能對在不同起始測試樣品上進行的該抗原的各個滴定測定結(jié)果進行比較。在該測定的另一些實施方案中，不同量的抗原(抗原決定簇或表位)可固定在固體支持物上離散的位置或反應(yīng)位點上。然后使整個支持物或其包含反應(yīng)位點亞部分的離散區(qū)域與測試樣品稀釋液接觸，并在每個離散位置或反應(yīng)位點處分別檢測或測定抗體與抗原的結(jié)合。合適的固體支持物還包括微陣列，例如其中陣列上的離散位點或點包含不同量的抗原的陣列?？赏ㄟ^將不同量的特定抗原固定在陣列上離散的可分辨的反應(yīng)位點上來制備微陣列。在另一些實施方案中，固定抗原分子的實際量可保持基本一致，但陣列上位點或點的大小不同，以改變可供結(jié)合的表位量，提供具有不同量的可用結(jié)合表位的位點或點的滴定系列。在這些實施方案中，在滴定系列的制備中重要的是抗原上結(jié)合表位的二維表面濃度，而不是抗原的絕對量。用于制備和檢測蛋白質(zhì)/肽微陣列的技術(shù)為本領(lǐng)域所公知。從以上討論中將會理解，在本發(fā)明的所有實施方案中，可通過改變檢測測試樣品稀釋液的抗原或表位密度，或通過維持抗原或表位密度但增大固定抗原的表面積，或通過以上兩種方法來實現(xiàn)抗原量的改變。微陣列可用于對不同特異性的抗體平行進行的多重測定。這可使用包含多組不同抗原的陣列來完成，每組包含多個不同量或濃度的特定抗原。術(shù)語"不同抗原"包括來自不同蛋白質(zhì)或多肽的抗原(如來自不同基因所編碼的無關(guān)蛋白質(zhì)的抗原)以及來自一種蛋白質(zhì)或多肽的不同肽表位的抗原。給定的微陣列可僅包括來自不同蛋白質(zhì)或多肽的不同抗原組，或僅包括來自一種蛋白質(zhì)或多肽的不同肽表位的抗原組，或者這二者任何比例的混合物。應(yīng)該指出，在本發(fā)明所有實施方案中，優(yōu)選每一個抗原滴定系列包含不同量或不同濃度的僅一種抗原類型，而不是抗原的混合物。本文所用的術(shù)語"體液"在指代使用本發(fā)明方法檢測抗體存在的材料時，包括血漿、血清、全血、尿、汗、淋巴、糞便、腦脊液、腹水、胸腔積液、精液、唾液、乳頭抽吸物、手術(shù)后血清肺或創(chuàng)傷引流液等。如上述，本發(fā)明方法優(yōu)選在體外對包含從測試受試者中取得的體液的測試樣品稀釋液進行。所用體液的類型可以根據(jù)待測抗體的身份及使用該測定的臨床情況而變化。通常，優(yōu)選對血清或血漿樣品進行測定。測試樣品除體液外還可包含其它成分，例如稀釋劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑等。可使用任何合適稀釋劑制備測試樣品的稀釋液。技術(shù)人員讀者將理解，制備測試樣品稀釋液的原因僅是為了產(chǎn)生測試樣品系列，每一測試樣品含有該免疫測定中不同絕對量的待檢靶抗體。它不旨在排除獲得含有不同量靶抗體的"測試樣品"的其它方法。例如，實際上可使用透析來"濃縮，，而非稀釋從患者中取得的測試樣品，以獲得比天然濃度更高的抗體的測試樣品。在另一些實施方案中，如當從患者中取得的體液就靶抗體而言相對較稀時，首先應(yīng)該濃縮所述體液(例如通過透析或類似技術(shù))，以制備濃縮的貯存液，其隨后用于制備用于本發(fā)明測定的一系列稀釋液。本文中的術(shù)語"抗原"以廣義使用，指顯示與待檢測的靶抗體具有特異性免疫反應(yīng)性的任何物質(zhì)。合適的抗原可包括但不局限于天然存在的蛋白質(zhì)、重組或合成蛋白質(zhì)或多肽、合成肽、肽模擬物等，還包括多糖及核酸。尤其是，此處所用的"抗原"旨在包括能夠與待檢抗體的可變區(qū)或互補性決定區(qū)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的任何捕獲劑，無論是人類來源、哺乳動物來源還是其它來源。例如，抗獨特型抗體可被認為是用于該目的的抗原，其可由噬菌體展示產(chǎn)生。某些抗原可包含或來自從天然來源中分離的蛋白質(zhì)或多肽，包括但不局限于從患者組織或體液中分離的蛋白質(zhì)或多肽。在這種實施方案中，所述抗原可包含基本上該天然存在蛋白質(zhì)的全部，即基本為從天然來源中分離時之形式的蛋白質(zhì)，或者它可包含天然存在蛋白質(zhì)的片段。為了作為本發(fā)明方法中的有效抗原，任何這種"片段"必須保留對測試所用抗體的免疫反應(yīng)性。例如可通過對分離蛋白質(zhì)的化學(xué)或酶促切割來制備合適的片段。根據(jù)待用測定的確切性質(zhì)，抗原可包含與一個或多個其他分子連接的天然存在生物分子(例如，蛋白質(zhì)或其片段)，所述其他分子賦予所述生物分子中非天然存在的一些期望特征。例如，所述生物分子(例如蛋白質(zhì)或多肽片段)可綴合至指示標記，例如熒光標記、有色標記、發(fā)光標記、放射性標記或者重金屬如膠體金。在另一些實施方案中，蛋白質(zhì)或片段可表達為融合蛋白。例如，融合蛋白可包括N端或C端的標簽肽，以協(xié)助重組表達抗原的純化。才艮據(jù)法ffl孤l^始報:i'.始.廟"5T閱^在面汰古娃脈H.桐"4o微吾，;翁定板的孔、微陣列珠或芯片或磁珠?？赏ㄟ^非共價吸附或共價附著來實現(xiàn)固定?？墒褂萌魏魏线m的附著方法，只要其不對抗原與靶抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的能力產(chǎn)生顯著負影響即可。本發(fā)明不局限于固相測定，而是還包括全部或部分在液相中進行的測定，例如溶液相珠測定。在一個實施方案中，可使用能有助于固定的配基(如生物素)標記抗原。然后可將抗原稀釋到合適的滴定范圍，隨后使其與患者樣品中的自身抗體在溶液中進行反應(yīng)。然后可將所得的免疫復(fù)合體通過配基-受體相互作用(例如生物素-鏈霉抗生物素蛋白)固定到固體支持物上，如上所述進行測定的其余部分。為了便于產(chǎn)生用于本發(fā)明測定方法的生物素化多肽抗原，編碼全長多肽抗原、其截短部分或其抗原片段的cDNA可表達為標記有蛋白質(zhì)或多肽標簽的融合蛋白，生物素輔因子可通過酶促反應(yīng)附著到所述蛋白質(zhì)或多肽標簽上。用于產(chǎn)生重組生物素化抗原的載體可購自許多來源。使用以生物素化抗原進行的交叉滴定方法的另一優(yōu)點是，所述測定能夠區(qū)分生物素組分與抗生物素抗體的結(jié)合以及抗原與其相應(yīng)抗體的真正結(jié)合。本發(fā)明人觀察到，大量人群天然產(chǎn)生抗生物素抗體，其在基于使用生物素化抗原的測定中可能導(dǎo)致產(chǎn)生假陽性結(jié)果。如上述，根據(jù)本發(fā)明用于檢測抗體的"免疫測定"可基于本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)，只是使用多種抗原量產(chǎn)生滴定系列，所述滴定系列可與所選測試樣品的多種不同稀釋液反應(yīng)。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，所述免疫測定可以是ELISA。ELISA通常為本領(lǐng)域所熟知。在典型的"間接"ELISA中，將對測試抗體具有特異性的抗原固定在固體表面(例如標準微量滴定測定板的孔，或者微珠或微陣列的表面)上，并使包含待檢測抗體存在情況之體液的樣品與固定化的抗原接觸。樣品中存在的具有期望特異性的任何抗體將結(jié)合到所述固定化的抗原上。然后使用合適的方法檢測結(jié)合的抗體/抗原復(fù)合體。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用特異性識別一類或多類人免疫球蛋白常見表位的經(jīng)標記第二抗人免疫球蛋白抗體來檢測所述抗體/抗原復(fù)合體。通常，所述第二抗體將是抗IgG或抗IgM。第二抗體通常^f吏用可檢測的標記物來標記，通常是酶標記(例如過氧化物酶或堿性磷酸酶)，以允許通過添加該酶的底物(其產(chǎn)生可檢測到的產(chǎn)物，例如有色的、化學(xué)發(fā)光的或熒光產(chǎn)物)進行定量檢測?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的其它類型的可檢測標記。本發(fā)明涉及檢測抗體的方法，所述抗體是疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標志物。本發(fā)明的這一特定方面優(yōu)選排除設(shè)計用于檢測因癌癥標志物以外的疫苗攻擊或免疫方法產(chǎn)生的抗體的測定。因此，本發(fā)明這一方面的測定優(yōu)選不包括^:計用于在疫苗接種/免疫后檢測抗病毒或抗細菌抗體存在的測定。在本發(fā)明某些實施方案中，抗體可以是自身抗體。如上所述，術(shù)語"自身抗體"指天然存在的抗體，該抗體針對被個體的免疫系統(tǒng)識別為外源的抗原(盡管該抗原實際上來自于所述個體)。自身抗體包括針對疾病細胞所產(chǎn)生或在疾病過程中產(chǎn)生的天然存在蛋白質(zhì)的變異形式。所述蛋白質(zhì)的變異形式來源于該個體，但可能被所述個體的免疫系統(tǒng)認為是"非自身的"，因而在該個體中引發(fā)免疫應(yīng)答，其形式為對所述改變蛋白質(zhì)具有免疫特異性的自身抗體。這種變異形式的蛋白質(zhì)可包括，例如具有改變的氨基酸序列并任選地伴隨二級、三級或四級結(jié)構(gòu)改變的突變體、截短形式、剪切變體、改變的糖形(glycoform)等。在另一些實施方案中，自身抗體可針對在疾病狀態(tài)中例如由于基因擴增或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)異常而過表達的蛋白質(zhì)。免疫系統(tǒng)的細胞通常不會遇到的蛋白質(zhì)的大量過表達可觸發(fā)免疫應(yīng)答，導(dǎo)致自身抗體產(chǎn)生。在另一些實施方案中，自身抗體可針對在疾病狀態(tài)中開始表達的胚胎形式蛋白質(zhì)。如果通常僅在發(fā)育早期階段在免疫系統(tǒng)有功能之前表達的胚胎蛋白質(zhì)在疾病狀態(tài)中開始表達，那么所述免疫系統(tǒng)可將所述胚胎形式識別為"外源的"，從而觸發(fā)免疫應(yīng)答，導(dǎo)致自身抗體產(chǎn)生。在一個實施方案中，抗體可以是對腫瘤標志物蛋白具有特異性的自身抗體，更具體地是"癌癥相關(guān)性的"抗肺瘤自身抗體。術(shù)語"癌癥相關(guān)性的"抗肺瘤自身抗體指針對在癌癥疾病狀態(tài)中優(yōu)先表達的腫瘤標志物蛋白質(zhì)形式上所存在表位的自身抗體。這種自身抗體的存在是癌癥疾病狀態(tài)或無癥狀患者中癌癥誘因的特征。在一些優(yōu)選應(yīng)用中，本發(fā)明方法將用于在來自人類受試者或患者的測試樣品中檢測癌癥相關(guān)性抗腫瘤自身抗體的存在(但本方法也可用于來自其它非人類哺乳動物的測試樣品)，并將最優(yōu)選釆取體外免疫測定的形式，在包含從該受試者/患者中取得的體液樣品的兩種或更多種測試樣品稀釋液上進行?？稍谌魏魏线m的緩沖液中稀釋體液樣品，并可對其進行處理以用于長期貯藏，或在測試前進行其他處理。體外免疫測定是非侵入性的，并且可以認為必要的頻繁程度重復(fù)進行，以產(chǎn)生自身抗體產(chǎn)生特征鐠，這可以是在疾病發(fā)病之前，例如在"風險"個體的篩選中；或者在疾病的整個病程中(在下文中就本方法的優(yōu)選應(yīng)用進一步進行討論)。特別但非限制性的是，本發(fā)明方法的實施方案可包含免疫測定，以(同時)檢測兩種或更多種類型的自身抗體，每種自身抗體對相同或相關(guān)肺瘤標志物蛋白(例如由單個基因編碼的不同同工型或變體)上的不同表位或者對不同腫瘤標志物蛋白(指由不同基因編碼的蛋白質(zhì))上的表位具有特異性。這些方法將通常包括使用兩組或更多組抗原的組合，每組抗原通常來自不同的腫瘤標志物蛋白("不同，，在該上下文中指作為不同基因之產(chǎn)物的蛋白質(zhì))，但如上文指出，一組抗原也可包括同一腫瘤標志物蛋白上的不同表位。"一組"抗原指有待于在本發(fā)明方法中以不同量/濃度檢測的單個抗原。在下文中稱作"組合測定"的這些方法利用兩組或更多組抗原的組合來監(jiān)測個體對胂瘤或其它致癌/贅生性改變的總體免疫應(yīng)答。這樣，這些方法檢測給定個體中的免疫應(yīng)答"鐠"，指出哪一肺瘤標志物引發(fā)了導(dǎo)致自身抗體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。使用兩種或更多種抗原的組合來監(jiān)測針對兩種或更多種不同肺瘤標志物的自身抗體的產(chǎn)生通常比檢測單個標志物的自身抗體更為靈敏，并且給出頻率低得多的假陰性結(jié)果(參閱WO99/58978和WO2004/0445卯，所述內(nèi)容以引用方式整體并入本文)。因而，在本發(fā)明的非限制性實施方案中提供了在包含來自哺乳動物受試者之體液的測試樣品中檢測兩種或更多種抗體的方法，其中至少一種所述抗體是疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標志物，該方法包括(a)制備所述測試樣品的兩種或更多種不同稀釋液，并就每個測試樣品稀釋液進行以下步驟(0和(ii):(i)使所述測試樣品稀釋液與對兩組或更多組抗原接觸，其中所述組中的每一種抗原對測試樣品中待檢測抗體之一具有特異性，并且其中每一組抗原包含多個不同量的相同抗原，(ii)對步驟(i)中所用的每一組抗原中每種抗原量，檢測抗體與抗原之間特異性結(jié)合的量，(b)對步驟(a)中所用的每一樣品組中的每種測試樣品稀釋度，繪制或計算出特異性結(jié)合量相對于抗原量的各個曲線，其中測試樣品中與至少一組抗原具有反應(yīng)性之抗體的存在是通過對所述測試樣品的至少兩種不同稀釋度和該組而言呈現(xiàn)總體為S形的曲線來表明。在該方法的一個實施方案中，所述兩種或更多種抗體中的每一種都將是疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標志物，但將用于疾病標志物抗原的交叉滴定測定與用于同一測試樣品中任何其它類型抗體(可能是或不是疾病標志物)的交叉滴定測定相結(jié)合，這也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。無論如何，對于測試樣品中是否存在相關(guān)抗體的判斷都是基于就測試中每種不同抗原而言在每個不同抗原濃度下觀察到的特異性結(jié)合量，換言之，是每種抗原的集合值，而不是每種抗原在單個濃度下的讀數(shù)。因此，可以在每種抗原的這些集合值的基礎(chǔ)上，基于患者樣品中兩種或更多種抗體類型的存在情況來確定疾病狀態(tài)或疾病易感性是否存在。優(yōu)選地，基于對測試中存在的任何或全部抗原而言在至少兩個不同測試樣品稀釋度下顯示總體為s形的曲線來做出判斷。為了避免混淆，基于使用單個類型抗原來檢測抗體的測定在本文中可稱作"單標志物測定"，而基于使用兩種或更多種抗體之組合的測定稱作"組合測定"。在組合測定法的一個優(yōu)選實施方案中，在測定中檢測的至少一個(優(yōu)選所有)抗體是與肺瘤標志物蛋白反應(yīng)的自身抗體。本發(fā)明的交叉滴定測定可適用于檢測針對基本上任何可制備合適抗原的腫瘤標志物蛋白的自身抗體，作為單標志物測定或組合測定之成分的合適抗原。具體地，通過使用相應(yīng)的抗原，所述方法可適用于檢測/測定對兩種或更多種以下肺瘤標志物蛋白中的任何一種或任何組合具有免疫特異性的自身抗體表皮生長因子受體蛋白EGFR(Downward等(1984)Nature.307:521-527;Robertson等(2001)ArchivesofPathologyandLaboratoryMedicine126;177-81);MUC1(Batra，S.K.等(1992)Int.J.Pancreatology.12:271-283);Myc(c畫myc)(Blackwood,E.M.等(1994)MolecularBiologyoftheCell5:597-609);p53(Matlashewski,G.等(1984)EMBOJ.3:3257-3262;Wolf,D.等(1985)Mol.Cell.Biol.5:1887-1893);ras(或Ras)(Capella，G.等(1991)EnvironHealthPerspectives.93:125-131);BRCA1(Scully,R.等(1997)PNAS94:5605-10);BRCA2(Sharan，S.K.等(1997)Nature.386:804-810);APC(Su，L.K.等(1993)CancerRes.53:2728-2731;M廳mitsu，S.等(1995)PNAS92:3046-50);CA125(Nouwen,E.J.等(19卯)Differentiation.45:192-8;NorumLF,等，TumourBiol.2001Jul-Aug;22(4):223國8;PereyL,等，BrJCancer.1990Oct;62(4):668畫70;DevinePL,等，AnticancerRes.1992May畫Jun;12(3):709畫17);PSA(Rosenberg,R.S.等(1998)BiochemBiophysResCommun.248:935-939);癌胚抗原CEA(Duffy，M丄(2001)ClinChem，Apr47(4):624國30);CA19.9(Haga,Y.等(1989)ClinBiochem(1989)Oct22(5):363-8);NY-ESO國l(癌/睪丸抗原；Chen,Y.-T.等，Proc.Nat.Acad.Sci.94:1914-1918,1997);PSMA(前列腺特異性膜抗原；Israeli,R.S.等，CancerRes.53:227-230，1993);PSCA(前列腺干細胞抗原;Reiter，R.E.等,Proc.Nat.Acad.Sci.95:1735-1740，1998);EpCam(上皮細胞粘附分子；Szala，S.等,Proc.Nat.Acad.Sci.87:3542-3546，1990);HER2-neu(也稱為c國erbB2)(Coussens,L.等，Science230:1132-1139,1985);EDC6,其為HER2胞外結(jié)構(gòu)域的另一名稱。CAGE(JagerD，等，CancerRes.1999Dec15;59(24):6197畫204;MashinoK,等，BrJCancer.2001Sep1;85(5):713國20);細胞角蛋白(MollR，等，Cell.1982Nov;31(l):ll-24;BraunS，等，NEnglJMed.2000;342:525-533)。術(shù)語"細胞角蛋白"寬泛地用于指其相應(yīng)自身抗體發(fā)揮腫瘤標志物功能的任何細胞角蛋白家族成員。優(yōu)選實例是細胞角蛋白5/14、8/18(KimMJ,RoJY，AhnSH,KimHH,KimSB,GongGHumPathol.2006Sep;37(9):1217-26.Epub2006Jul18);細胞角蛋白7、20(VangR，GownAM,BarryTS，WheelerDT，YemelyanovaA，SeidmanJD，RonnettBM.AmJSurgPathol.2006Sep;30(9):1130國1139);和細胞角蛋白8/18/19(BarakV，GoikeH，PanaretakisKW，EinarssonR.ClinBiochem.2004Jul;37(7):529-40)?；謴?fù)蛋白(recoverin)(MaedaA，等,CancerRes.2000Apr1;60(7):1914畫20);激肽釋放酶(KimH,等，BrJCancer2001;84:643-650;YousefGM，等，TumorBiol2002;23:185-192)。術(shù)語"激肽釋放酶"寬泛地用于指其相應(yīng)自身抗體發(fā)揮腫瘤標志物功能的任何激肽釋放酶家族成員。優(yōu)選實例是激肽釋放酶1至15(KLKl-15/Hkl國Hkl5)(ObiezuCV，DiamandisEP.CancerLett.2005Jun16;224(1):1國22;DiamandisEP，YousefGM.ClinChem.2002Aug;48(8):1198-205)，特別是KLK4-7(PrezasP，ArltMJ，ViktorovP,SoosaipillaiA,HolzscheiterL,SchmittM,TalieriM,DiamandisEP，KrugerA,MagdolenV.BiolChem.2006Jun;387(6):807國ll;DiamandisEP，YousefGM，LuoLY，MagklaraA,ObiezuCV.Thenewhumankallikreingenefamily:implicationsincarcinogenesis.TrendsEndocrinolMetab.2000Mar;ll(2):54誦60.綜述)；膜聯(lián)蛋白(HudelistG，等,BreastCancerResTreat.2004Aug;86(3):281國91;Gerke，V.&Moss,S.E.PhysiologicalReviews200282:331-371)。術(shù)語"膜聯(lián)蛋白，，寬泛地用于指其相應(yīng)自身抗體發(fā)揮腫瘤標志物功能的任何膜聯(lián)蛋白家族成員。優(yōu)選實例是膜聯(lián)蛋白1和2(Pedrero,J.M.G"Fernandez,M.P"Morgan,O.,Zapatero,A.H"Gonzalez,M.V"Nieto,C.S.&Rodrigo,J.P.AmericanJournalofPathology2004164(1):73-79;Brichory,F.M.,Misek,D.E.，Yim,A.,Krause,M.C.，Giordano,T.J.,Beer,D.G"Ha腦h,S.M.2001MedicalSciences98(17):9824國9829)和膜聯(lián)蛋白XI-A(Fern在ndez-Madrid，F(xiàn)"Tang，N.,Alansari,H.,Granda,J丄.,Tait,L.，Amirikia，K.C.，Moroianu，M.，Wang，X.&Karvonen,R.L.CancerResearch200464:5089-5096);甲胎蛋白(AFP)(StillerD，等，ActaHistochemSuppl.1986;33:225-31);GRP78(BlockTM，等，ProcNatlAcadSciUSA.2005Jan18;102(3):779-84;HsuWM,等,IntJCancer.2005Marl;113(6):920-7);乳腺珠蛋白(Mammaglobin)(ZehentnerBK，等，ClinChem.2004Nov;50(ll):2069-76;ZehentnerBK,CarterD.ClinBiochem.2004Apr;37(4):249-57);raf(CallansLS.等，AnnSurgOncol.1995Jan;2(l):38-42;PrattMA,等，MolCellBiochem.1998Dec;189(l國2):119-25);P-人絨毛膜促性腺激素b-HCG(AyalaAR,等，AmJReprodImmunol.1983Apr-May;3(3):149-51;GregoryJJJr，等，Drugs.1999Apr;57(4):463-7);4國5抗原(KrauseP,等，JImmunolMethods.2003Dec;283(l國2):261誦7);NY畫BR畫l(JageD,StockertE,GureAO,ScenlanMJ,KarbachJ，JageE，KnuthA,OldLJ,ChenYT.(2001)Identificationofatissue-specificputativetranscriptionfactorinbreasttissuebyserologicalscreeningofabreastca&cerlibrary.CancerRes61(5):2055-61);Livin(KasofGM,GomesBC(2001)Livin，anovelinhibitorofapoptosisproteinfamily.JBiolChem,276(5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性反應(yīng)的"改變，，方向(即提高或降低)將取決于治療的確切性質(zhì)。對于任何給定的治療而言，例如可通過監(jiān)測自身抗體水平，與治療反應(yīng)的其它臨床或生物化學(xué)指標進行比較而容易地確定指示陽性結(jié)果的自身抗體水平"改變"方向。當所述免疫測定用于篩選無癥狀人類受試者群體時，它可用于被鑒定為發(fā)生癌癥的風險升高的受試者，可將與"正常"對照個體相比自身抗體水平升高的個體鑒定為具有發(fā)生癌癥的"風險"。"正常"對照個體將優(yōu)選為未鑒定出具有發(fā)生癌癥的任何誘因或任何顯著升高的癌癥發(fā)生風險的年齡匹配對照。其例外可能是年齡本身是主要風險因素的情況。當所述免疫測定用于篩選無癥狀人類受試者群體時，它可用于在已發(fā)生癌癥的受試者中診斷癌癥，將與"正常，，對照個體相比具有升高的自身抗體水平的個體評價為患有癌癥或某些形式的贅生性變化。所述"正常"對照個體將優(yōu)選為未鑒定出具有發(fā)生癌癥的任何誘因或任何顯著升高的癌癥發(fā)生風險的年齡匹配對照。其例外可能是年齡本身是主要風險因素的情況?；蛘?，所述"正常對照，，可以是為所測試的特定患者確定的"基線"水平。所述"基線，，水平可以是例如患者被首次測試并發(fā)現(xiàn)具有不高于"正常對照"群體的水平時所存在的自身抗體水平?？蓪⑵浜筢槍υ摶€測定的任何升高視為該個體中存在癌癥的指示。因此，所述個體可通過該基線測試而成為其自身的對照，用于進一步的自身抗體測定。當所述免疫測定用于監(jiān)測癌癥患者對抗癌治療(例如疫苗接種、抗生長因子或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)治療、放射治療、內(nèi)分泌治療、人抗體治療、化學(xué)療法)的反應(yīng)時，將治療后存在改變的自身抗體水平視為所述患者已經(jīng)對該治療做出陽性反應(yīng)的指示?？蓪⒅委熼_始前所取的自身抗體基線水平用于比較目的，以確定治療是否導(dǎo)致自身抗體水平的升高或降低?？蓪⒆陨砜贵w水平的改變視為治療效果的指示。指示對治療的陽性反應(yīng)的"改變"方向(即提高或降低)將取決于治療的確切性質(zhì)。對于任何給定的治療而言，可通過例如監(jiān)測自身抗體水平，與治療反應(yīng)的其它臨床或生物化學(xué)指示進行比較而容易地確定指示陽性結(jié)果的自身抗體水平"改變"方向。本發(fā)明方法可用于預(yù)測和/或監(jiān)測個體對基本上任何已知抗癌治療的反應(yīng)。例如，這包括人抗體治療，其中將單克隆或多克隆抗體輸注到患者中，一個非限制性的具體實例是利用抗生長因子抗體HerceptinTM(Baselga,J.,D.Tripathy等，JClinOncol"14(3),737-744,1996)進行治療。天然自身抗體應(yīng)答的存在可增強或抑制人工注入治療性抗體的有效性。使用本發(fā)明方法，有可能在任何患者或患者群中將對任何抗癌治療(包括抗體治療)的應(yīng)答與治療前或治療過程中自身抗體的天然水平相關(guān)聯(lián)。然后可將這一了解反過來用于預(yù)測其它患者(或在重復(fù)治療情況下的同一患者)將怎樣響應(yīng)于相同的治療。當所述免疫測定用于檢測復(fù)發(fā)性疾病時，可將與"正常對照"相比患者中存在升高的自身抗體水平視為疾病已經(jīng)復(fù)發(fā)的指示。所述"正常對照"可以是對照個體(優(yōu)選基于臨床、成像和/或生物化學(xué)標準未診斷出任何癌癥的年齡匹配的對照個體)中存在的自身抗體水平?；蛘撸?正常對照"可以是對測試中的特定患者確定的"基線"水平。例如，所述"基線，，水平可以是基于臨床、成像和/或生物化學(xué)標準在疾病緩和期間存在的自身抗體水平。本發(fā)明方法可應(yīng)用于檢測許多不同類型的癌癥，其實例為乳腺、膀胱、結(jié)腸、前列腺、肺、胰和卵巢的癌癥。所述測定可補充現(xiàn)有的篩選31和監(jiān)控方法。例如，對于原發(fā)性乳腺癌的情況，對自身抗體的免疫測定可用于提醒臨床醫(yī)師對乳房X線照片上在X線攝影中不顯得可疑的小損傷進行活檢，或者比計劃更早地來進行胸部成像或重復(fù)成像。在臨床上，預(yù)計本發(fā)明的測定方法比目前成功依賴于操作者的顯像技術(shù)(即乳房造影法和超聲)更具目的性并更具再現(xiàn)性?？筛鶕?jù)具體的臨床應(yīng)用來修改"組合測定"。用于檢測至少p53和HER2-neu(c-erbB2)的自身抗體的抗原組合對許多癌癥類型都十分有用，并可任選地補充以用已知與待檢測的特定癌癥或特定癌癥階段有關(guān)聯(lián)的其它標志物。例如對于乳腺癌，該組合可額外地包括MUCl和/或c-myc和/或BRCA1和/或BRCA2和/或PSA和/或乳腺珠蛋白和/或EpCam和/或EGFR和/或細胞角蛋白和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或膜聯(lián)蛋白11A和/或存活素；而對于膀胱癌，該組可任選地包括MUC1和/或c-mycj對于直腸癌可包括ras和/或APC和/或MUC2;對于前列腺癌可包括PSA和/或BRCA1和/或BRCA2和/或p62;對于卵巢癌可包括BRCA1和/或BRCA2和/或CA125和/或p-HCG和/或激肽釋放酶和/或APC;對于肺癌可包括livin和/或存活素和/或EpCam和/或恢復(fù)蛋白和/或細胞角蛋白和/或l-myc和/或CEA和/或MUC1和/或恢復(fù)蛋白；對于肝癌可包括AFP和/或p-HCG和/或gp78和/或p62和/或存活素。也存在其中p53或HER2-neii不一定必需的其他實施方案。在乳腺癌的情況下，合適的組合可選自以下p53和MUCl，以及任選的HER2-neu和/或c-myc，和/或BRCA1和/或BRCA2和/或PSA和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或EpCam和/或乳腺珠蛋白和/或存活素和/或膜聯(lián)蛋白11A和/或細胞角蛋白和/或EpCam;p53和c-myc，以及任選的HER2-neu和/或MUC1和/或BRCA1和/或BRCA2和/或PSA和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或EpCam和/或乳腺珠蛋白和/或存活素和/或膜聯(lián)蛋白11A和/或細胞角蛋白和/或EpCam;p53和BRCA1，以及4壬選的c-erB2和/或MUC1和/或c-myc和/或BRCA2和/或PSA和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或EpCam和/或32乳腺珠蛋白和/或存活素和/或膜聯(lián)蛋白11A和/或細胞角蛋白和/或EpCam;p53和BRCA2,以及4壬選的HER2-neu和/或MUC1和/或c-myc和/或BRCA1和/或PSA和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或EpCam和/或乳腺珠蛋白和/或存活素和/或膜聯(lián)蛋白11A和/或細胞角蛋白和/或EpCam;HER2-neu和MUC1，以及4壬選的p53和/或c-myc,和/或BRCA1和/或BRCA2和/或PSA和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或EpCam和/或乳腺珠蛋白和/或存活素和/或膜聯(lián)蛋白11A和/或細胞角蛋白和/或EpCam;HER2-neu和c-myc，以及任選的p53和/或MUC1和/或BRCA1和/或BRCA2和/或PSA和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或EpCam和/或乳腺珠蛋白和/或存活素和/或膜聯(lián)蛋白11A和/或細胞角蛋白和/或EpCam;HER2-neu和BRCA1，以及4壬選的p53和/或MUC1和/或c-myc和/或BRCA2和/或PSA和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或EpCam和/或乳腺珠蛋白和/或存活素和/或膜聯(lián)蛋白11A和/或細胞角蛋白和/或EpCam;HER2-neu和BRCA2,以及4壬選的p53和/或MUC1和/或c-myc和/或BRCA1和/或PSA和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或EpCam和/或乳腺珠蛋白和/或存活素和/或膜聯(lián)蛋白11A和/或細胞角蛋白和/或EpCam。這樣的組合還可包括p53和/或c-myc和/或NY-ESO-l和/或BRCA2。在直腸癌的情況下，合適的組合例如可選自以下p53和ras，以及4壬選的HER2-neu和/或APC和/或MUC2;p53和APC，以及4壬選的HER2-neu和/或Ras和/或MUC2;Ras和APC,以及4壬選的p53和/或HER2-neu和/或MUC2這樣的組合還可包括CEA和/或CA19誦9。在前列腺癌的情況下，合適的組合例如可選自以下p53和PSA，以及4壬選的BRCA1和/或BRCA2和/或HER2-neu和/或p62;HER2-neu和PSA，以及^f壬選的p53和/或BRCA1和/或BRCA2和/或p62。這樣的組合還可包括PSMA和/或PSCA和/或激肽釋放酶。在卵巢癌的情況下，合適的組合例如可選自以下p53和CA125，以及4壬選的HER2-neu和/或BRCA1和/或BRCA2和/或APC;HER2-neu和CA125，以及任選的p53和/或BRCA1和/或BRCA2和/或APC。這樣的組合還可包括膜聯(lián)蛋白和/或CAGE和/或4-5。在肺癌的情況下，合適的組合例如可選自以下p53和NY-ESO-l，以及任選的其它標志物；HER2、膜聯(lián)蛋白、livin、存活素、恢復(fù)蛋白、MUC1、c畫myc、l畫myc、CEA、陽CG、CAGE和4-5。當本發(fā)明方法用于基于來自不同蛋白質(zhì)的兩種或更多種腫瘤標志物抗原進行"組合測定"時，則該組合中的至少一種抗原必須在本發(fā)明的交叉滴定中進行測試，所述測試基于將測試樣品的兩種或更多種稀釋度針對多種不同抗原量進行檢測，以形成一系列滴定曲線，其中每種所用測試樣品稀釋度各一條曲線。優(yōu)選地，構(gòu)成該組合中的每種抗原均根據(jù)本發(fā)明的交叉滴定測定進行測試，并對該組中的每一單個抗原繪制/計算出一系列滴定曲線。本發(fā)明還考慮到，用于檢測至少一種抗腫瘤標志物抗體的交叉滴定測定可與設(shè)計用于檢測同一患者樣品中至少一種腫瘤標志物蛋白(其與交叉滴定測定中所用的抗原相關(guān)或不相關(guān))的測定結(jié)合使用。這樣，可對單個患者樣品平行進行用于抗腫瘤標志物自身抗體的測定及用于腫瘤標志物蛋白的測定。在另一實施方案中，本發(fā)明測定方法可用于選擇在特定患者中使用的抗癌疫苗。在該實施方案中，使用兩種或更多種抗原的組合來檢測從患者中取得的體液樣品(每種抗原對應(yīng)于不同的腫瘤標志物蛋白)，以確定患者對每一不同腫瘤標志物蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。對給定腫瘤標志物蛋白的"免疫應(yīng)答強度"由對使用免疫測定檢測的肺瘤標志物蛋白質(zhì)特異性的癌癥相關(guān)性自身抗體的存在和/或量來表示；對自身抗體進行定量時，癌癥相關(guān)性自身抗體的水平越高，免疫應(yīng)答越強。然后選擇鑒定為誘發(fā)患者中最強免疫應(yīng)答或強應(yīng)答的腫瘤標志物蛋白(即自身抗體水平最高)，以形成用于所述患者的抗癌疫苗的基礎(chǔ)。本發(fā)明方法的用途不限于檢測抗腫瘤自身抗體，雖然所述測定對該目的特別有用。癌癥僅是其中自身抗體的檢測可用作疾病狀態(tài)/疾病易感性的生物標志物的一個疾病實例。本發(fā)明人已顯示，通過使用交叉滴定方法來檢測患者樣品中的自身抗體可獲得顯著的優(yōu)勢。因此可以合理地推斷，通過使用交叉滴定方法檢測作為除癌癥以外疾病的生物標志物的自身抗體將會獲得類似的優(yōu)勢。因此，所述方法適用于在任何已經(jīng)顯示(或可顯示)與自身抗體產(chǎn)生相關(guān)的疾病中檢測疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標志物。本發(fā)明方法的其它應(yīng)用包括但不局限于檢測作為自身免疫病之生物標志物的自身抗體，所述自身免疫性疾病如類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、自身免疫性曱狀腺炎(例如橋本甲狀腺炎)、自身免疫性胃炎(例如惡性貧血)、自身免疫性腎上腺炎(例如阿狄森氏病)、自身免疫性甲狀旁腺功能減退癥、自身免疫性糖尿病(例如1型糖尿病)或重癥肌無力；在患者樣品中篩選導(dǎo)致任何器官機能不全或衰竭的腎病或肝??；以及用于篩選移植后患者樣品，以檢測是否存在針對疾病組織(其在移植后保留在原位)或針對移植組織的抗體。在本發(fā)明的另一方面中提供了在測試樣品中檢測抗體的方法，所述測試樣品包含來自哺乳動物受試者的體液，其中所述抗體針對引入所述哺乳動物受試者中的外源物質(zhì)，所述方法包括(a)分別使所述測試樣品的兩種或更多種不同稀釋液與對所述抗體具有特異性的多種不同抗原量接觸，(b)對于步驟(a)中所使用的測試樣品與抗原的每種組合，檢測所述抗體與所述抗原之間特異性結(jié)合的量，(c)對步驟(a)中所用的每個測試樣品稀釋度，繪制或計算出特異性結(jié)合量相對于抗原量的各個曲線，其中通過對所述測試樣品的至少兩種不同稀釋度呈現(xiàn)總體為S形的曲線來指示測試樣品中存在與測定中所用抗原具有反應(yīng)性的抗體。在本發(fā)明的這一方面，所述交叉滴定方法可用于評估哺乳動物受試者(優(yōu)選人類受試者)對引入該受試者中的任何外源物質(zhì)的免疫應(yīng)答。在一個實施方案中，所述外源物質(zhì)可以是治療劑，例如藥物或前藥，人抗體治療劑或疫苗。本發(fā)明方法可用于評估對患者施用治療劑是否觸發(fā)了免疫應(yīng)答，導(dǎo)致產(chǎn)生對該治療劑或與該治療劑一起施用的遞送媒介物、賦形劑、載體等成分上的表位具有特異性的抗體。用于本發(fā)明該實施方案的抗原可以是合成的或天然存在的。治療劑的確切性質(zhì)在本發(fā)明中沒有限制。在非限制性實施方案中，本發(fā)明的方法可用于評估針對合成小分子、天然存在的物質(zhì)、天然存在或合成產(chǎn)生的生物制劑、或兩種或更多種上述物質(zhì)的任何組合(任選地與賦形劑、載體或送遞媒介物組合)的免疫應(yīng)答。在一個有用的實施方案中，本發(fā)明的方法可用于評估對治療劑或疫苗中非靶部分的免疫應(yīng)答。"非靶"部分指所施用的治療劑或疫苗的組成部分，其在治療劑的情況下不直接形成治療活性，或在疫苗的情況下不旨在誘發(fā)宿主中產(chǎn)生抗體。可存在所述非靶部分，從而例如有利于治療劑或疫苗的純化，或可設(shè)計用于幫助治療劑或疫苗的遞送、攝取或靶向。這種"非耙"部分的實例包括但不局限于通常附著到重組表達的多肽上的接頭或標志物，如生物素標簽、組氨酸標簽等。36在本發(fā)明該方面的另一個實施方案中，所述外源物質(zhì)可以是感染因子，如真菌、細菌、病毒或寄生蟲。將參考以下非限制性試驗性實施例進一步理解本發(fā)明實施例1-用于在自身抗體測定中產(chǎn)生抗原滴定的最佳血清和抗原濃度(OptimalSerumandAntigenConcentration,OSAAC)的一般性方案可按照與WO99/58978中描述的類似方法，通過重組表達來制備肺瘤標志物抗原的樣品。簡言之，將編碼目標標志物抗原的cDNA克隆進pET21載體(Invitrogen)中，所述載體經(jīng)過修飾以編碼生物素標簽和6x組氨酸標簽，從而輔助所表達蛋白質(zhì)的純化。使所得克隆在合適的細菌宿主細胞(在包含體中)中生長，裂解細菌并變性，并通過鎳螯合物親和柱(Hi-trap，從Amersham購得，按照制造商的方案)回收所表達的抗原。通過在適當緩沖液中透析來將所表達的抗原復(fù)性，通過SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡和ELISA來評估所表達蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，并在保存前進行定量。除非另有說明，否則用于以下實施例的所有抗原均通過從經(jīng)修飾的pET21載體中重組表達來制備，因而表達為包含N端生物素化標簽(來自pET21)和C端His標簽的融合蛋白。許多標志物cDNA(或所編碼的蛋白質(zhì))的GenBank登錄號如下p53:B003596c國myc:V00568HER2(erbB-2)同工型a:NP—0044391.在0.1M碳酸鹽緩沖液中將抗原稀釋至適當濃度，然后連續(xù)稀釋以形成半對數(shù)滴定范圍(見表l)。使用TecanEvolyzer機械手移液操作臺將抗原稀釋液根據(jù)平板布局以50jtl/孔分配在Falcon微量滴定板的行中。蓋上平板并在4。C保存48小時。2.使用自動平板洗滌機在PBS+0.1%tween20中洗滌平板一次，然后在面巾紙上輕扣干燥。3.用高鹽孵育緩沖液(HSB，PBS+0.5MNaCl+0.1%酪蛋白)以200^1/孔封閉平板卯分鐘(于4°C下加蓋保存)。4.在封閉孵育過程中，將血清樣品解凍、渦旋，并在室溫下以HSB中從1/30至1/10,000的半對數(shù)系列將其連續(xù)稀釋在管中。5.在吸水紙上將平板倒空并輕叩干燥。使用電子多通道移液器將稀釋的血清樣品以50jil/孔分配到微量滴定板的所有孔中，以形成半對數(shù)滴定范圍(參閱表l)。蓋上平板并在室溫下?lián)u動孵育90分鐘。6.洗滌步驟使用自動平板洗滌機在PBS+0.1%tween20中將平板洗滌3次，然后在吸水紙上輕叩干燥。7.將綴合辣才艮過氧化物酶的兔抗人Ig(Jackson,在HSB中為1/10,000)以50pl/孔分配到微量滴定板的所有孔中。將綴合HRP的兔抗鼠Ig(在HSB+為1/1000)分配到含有抗抗原之抗體的對照孔中。然后將平板在室溫搖動孵育1小時。8.如步驟6洗滌平板。9.以50pl/孔加入預(yù)先制備的TMB底物，并在桌面上孵育10分鐘。輕輕叩擊平板以混勻。10.使用標準的平板讀數(shù)方案在650nm處確定孔的吸光度。表l:標準的平板布局123456789101112A抗原10嗎/ml抗原10嗎/ml抗原10將/ml抗原10照/ml抗原10fig/ml抗原10|ug/ml血清1/30血清1/100血清1/300血清1/1000血清1/3000血清1/10000B抗原3嗎/ml抗原3jig/ml3將/ml抗原3嗎/ml抗原3ng/ml抗原3照/ml血清1/30血清1/100血清1/300血清1/1000血清1/3000血清1/10000C抗原1fig/ml抗原lpg/ml抗原1fig/ml抗原1照/ml抗原1ng/ml抗原1fig/ml血清1/30血清1/100血清1/300血清1/1000血清1/3000血清1/10000D抗原0.3ftg/ml抗原0.3照/ml抗原0.03ng/ml抗原0.03抗原0.03抗原0.03血清1/30血清1/100血清1/300jig/mlfig/mlHg/ml血清1/1000血清1/3000血清1/10000E抗原0.1^g/ml抗原0.1照/ml抗原0.1fig/ml抗原0.1fig/ml抗原0.1fig/ml抗原0.1fig/ml血清1/30血清1/100血清l膽血清1/1000血清1/3000血清1/10000F抗原0.03抗原0.03抗原0.03嗎/ml抗原0.03抗原0.03抗原0,03fig/ml38<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>使用重復(fù)實驗的平均值對整個血清稀釋度范圍內(nèi)的每個樣品構(gòu)建抗原滴定曲線。通過用每個血清稀釋度下無抗原結(jié)合時所獲得的值減去背景水平(1/10，000的血清并且沒有抗原)來計算對應(yīng)于每個血清稀釋度下非特異性結(jié)合水平的值。然后將其用于在每組重復(fù)實驗中校正非特異性結(jié)合。實施例2-在原發(fā)性乳腺癌中檢測自身抗體從初步研究中獲得以下數(shù)據(jù)，以評估一個交叉滴定自身抗體測定組合(OSAAC)在原發(fā)性乳腺癌(PBC)中的靈敏度及再現(xiàn)性。研究包括來自無癌癥跡象的14名婦女的血清及來自患有原發(fā)性乳腺癌的14名婦女的手術(shù)前血清樣品。正常樣品與癌樣品是年齡匹配的。使用抗原p53和c-myc，根據(jù)實施例1中給出的方案進行測定。兩個正常樣品(一個用于p53)必須從研究中去除，因為它們在一系列血清和抗原濃度內(nèi)顯示出持久且極高水平的自身抗體結(jié)合。圖l給出了當交叉滴定測定用于測定血清中p53及c-myc自身抗體時獲得的曲線實例。可以看出，對于一些樣品(例如樣品17179和18781)，獲得了與預(yù)計一致的最濃血清給出最強信號的一系列滴定。然而在其它樣品(例如樣品19150和18057)中，曲線基本上是平的，但隨血清濃度升高，信號也增強。這被認為是由于血清免疫球蛋白的非特異性結(jié)合，并由上文描述的非特異性結(jié)合校正來補償。將自身抗體水平表述為由結(jié)合測試抗原所致的光密度(650nm)減去由非特異性結(jié)合所致的光密度(650nm)。正常的截取值計算為正常組的95%(均值+2倍標準差)。如果樣品在1/30至1/1000之間的至少2個血清稀釋度和10ng/ml至1jig/ml之間的2個抗原濃度下顯示高于判斷值的水平，則認為它們是陽性的。在表2中指出了陽性樣品。抗原陽性血清樣口口口正常PBCp53J001總計1/14(7%)171791878118237195021892719622p53陽性庫7/14(50%)c-mycJ0011717918781J0411823718964p53陽'性庫總計2/14(14%)5/14(36%)表2:正常及乳腺癌血清中自身抗體測定的陽性率。如果非特異性結(jié)合校正值高于在至少兩種抗原濃度和兩個血清稀釋液下檢測的正常樣品的均值+2倍SD，則將樣品判定為陽性的。實施例3-與僅抗原滴定相比分析交叉滴定測定的靈敏度和特異性使用交叉滴定測定(OSAAC)和僅抗原滴定方法(其中僅在1/100的血清稀釋液下進行自身抗體測定)對患有原發(fā)性乳腺癌(PBC)的14名婦女進行自身抗體(AAb)測定。如果樣品在抗原滴定曲線上10和3網(wǎng)/ml處都高于截取值水平，則認為它們是陽性的。下面表2顯示了兩種方法的直接比較抗原抗原滴定方法OSAAC測定p53靈敏度5/14(36%)7/14(50%)特異性13/14(93%)13/14(93%)c-myc靈敏度3/14(21%)5/14(36%)特異性12/14(86%)12/14(86%)表3:僅在一個血清稀釋度下計算AAb靈敏度的抗原滴定方法與OSAAC測定的比較。40可以看出，通過使用一系列抗原滴定曲線(其中抗原濃度和血清濃度都是變化的)，與其中僅抗原濃度是變化的滴定曲線相比，可獲得更高的靈敏度和至少同樣好的特異性。用于自身抗體測定的交叉滴定測定(OSAAC)已經(jīng)顯示在檢測原發(fā)性乳腺癌的靈敏度方面優(yōu)于基于針對單個血清稀釋度滴定抗原的測定。p53和c-myc自身抗體都是這種情況，并且沒有理由推測這將不適用于一系列的抗原。不希望受理論的限制，本申請人認為，在基于抗原與測試樣品交叉滴定的測定中觀察到的更高靈敏度有許多原因。(i)該測定形式具有寬得多的動態(tài)范圍。這提供了可以同時在高抗原濃度下檢測低親和力抗體以及在高抗原濃度下檢測在其他情況下將失真(hook)的高豐度抗體的范圍。(ii)可在低血清濃度下檢測可能被高水平非特異性結(jié)合掩蓋的低豐度抗體。(iii)此處應(yīng)用的用于定義樣品為陽性的嚴格標準(對于至少2個抗原濃度和2個血清稀釋度，高于正常群體的均值+2倍SD)意味著技術(shù)人員對陽性測定是真陽性可以肯定得多。實施例4-通過抗原交叉滴定檢測原發(fā)性乳腺癌血清本研究中使用來自患有原發(fā)性乳腺癌(PBC，n=8(6個PBC血清在所有抗原之間均相同，2個PBC血清對p53或ECD6蛋白具有特異性))婦女及沒有惡性疾病跡象婦女的血清(n=10)。使用實施例1中所述一般性方案的修改形式一式兩份地進行測定。簡言之，用抗原蛋白包被一組微量滴定板重組p53、ECD6(也已知為HER2胞外結(jié)構(gòu)域)，或ECD63，片段。所述ECD6抗原包含登錄號NM—004439所示全長HER2(erbB-2)氨基酸序列的1到647位氨基酸，其;N端生物素化序列和C端His標簽融合。所述ECD63'片段抗原包含登錄號NMJJ04439所示全長HER2(erbB-2)氨基酸序列的361到647位氨基酸，其與N端生物素化序列和C端His標簽融合。以160nM、50nM、16nM、5nM、1.6nM、0.5nM、0.16nM的濃度將抗原連續(xù)滴定(由上至下)到每一平板上。在每一平板的最下一行中包括僅為緩沖液的"無抗原"對照。使所述抗原吸附48小時，之后洗滌平板并用含酪蛋白(0.1%w/v)和NaCl(0.5M)的PBS封閉90分鐘。在封閉孵育過程中，在試管中以1:1600、1:800、1:400、1:200、1:100和1:50的稀釋度制備一組連續(xù)血清滴定。去除封閉緩沖液后，將這些稀釋液加入到抗原包被的平板中(從平板由左到右加入稀釋度1:1600、1:800、1:400、1:200、1:100和1:50)并孵育卯分鐘。如實施例1中描述進行測定的其余部分。(平板布局概述于圖2)使用重復(fù)實驗的平均值對血清稀釋度范圍內(nèi)的每一樣品構(gòu)建抗原滴定曲線。通過減去非特異性背景(針對0.16nM抗原的血清反應(yīng))來獲得對應(yīng)于自身抗體應(yīng)答水平的值。結(jié)果代表性的滴定曲線示于圖3至圖7中。可以看出，對于一些樣品(例如用于ECD6的樣品20642和20620)，獲得了與預(yù)計一致的最濃血清給出最強信號的一系列滴定。然而在其它樣品(例如用于ECD63'片段的樣品MVV272和EA0220)中，曲線基本上是平的，但隨血清濃度升高信號也增強。認為這是由于血清免疫球蛋白的非特異性結(jié)合。將陽性截取值計算為正常群體的均值+2倍SD。如果樣品在兩次運行中及在160nM或50nM抗原濃度下都顯示高于截取值的水平，則認為樣品是陽性的。表4證明，目前用于自身抗體檢測的1:100的血清稀釋度不總是最佳的。此外，該表顯示，最佳血清稀釋度在抗原之間是變化的。當1:50稀釋血清時，對ECD6靈敏度的最高水平是75。/。。這與對ECD63，片段相反，后者在1:50下具有0%的靈敏度。其部分原因是由于所分析的正常樣品(例如樣品MMV272和EAO220)中針對ECD63，片段的信號增強。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表4:對每個抗原針對8個所分析PBC樣品的自身抗體測定靈敏度。如果非特異性結(jié)合校正值高于在兩個抗原濃度中任一濃度下檢測的正常樣品的均值+2倍SD，則判斷樣品為陽性的。表5概述了其中將血清稀釋到不同濃度的測定的特異性。使用該測定中所分析的樣品沒有觀察到測定特異性的差異。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表5:具有IO個PBC樣品的自身抗體測定的特異性。如果非特異性結(jié)合校正值高于在兩個抗原濃度任一濃度下檢測的正常樣品的均值+2倍SD，則判斷樣品為陽性的。在表6中，比較針對所有抗原分析的6個PBC血清的最佳血清稀釋度。所述最佳血清稀釋度是其中可檢測到自身抗體應(yīng)答的最高稀釋度。例如，可將血清20628稀釋到1:800,并可檢測到針對p53的應(yīng)答(即自身抗體)，但是同一血清需要稀釋到1:50以用于檢測ECD6的自身抗體。因此，該抗原的最佳稀釋度應(yīng)該是1:50，使得可鑒定所有陽性的自身抗體應(yīng)答。每個抗原的最佳稀釋度血清P53ECD6ECD63'最佳稀釋度20593----20641-1:50-1:5020620-1:16001:16001:160020639--—一206281:8001:50-1:50206421:4001:400_1:400表6:針對所有抗原所分析的6個PBC血清樣品的最佳個體間稀釋度。其中顯示了檢測針對P53、ECD6或ECD63，片段的自身抗體應(yīng)答所需的最低稀釋度。表7概括了當使用交叉滴定方法檢測針對每一測試抗原的自身抗體時，用于檢測原發(fā)性乳腺癌的整體測定靈敏度升高。_交叉滴定1:100的血清靈^L66.7%33.3%特異性100%100%表7:使用ECD6和ECD63，片段的整體測定靈敏度和特異性，如果使用交叉滴定測定，來代替針對所有抗原用于6個所分析PBC血清樣品的1:100稀釋的血清。結(jié)論用于自身抗體測定的OSAAC測定已經(jīng)顯示在檢測原發(fā)性乳腺癌的靈敏度方面優(yōu)于僅滴定抗原。p53、ECD6和ECD63'自身抗體是這樣的情況，并且沒有理由推測這會不適用于所有的腫瘤標志物自身抗體?？雌饋磉@是由于該測定形式具有寬得多的動態(tài)范圍這一事實。這提供了同時以高抗原濃度檢測低親和力自身抗體以及以高抗原濃度檢測在其他情況下將失真的高豐度抗體的范圍。此外，可在低血清濃度下檢測可能被高水平非特異性結(jié)合掩蓋的低豐度自身抗體看起來也是可能的。本文引用的所有專利、專利申請書;5Ul表的參考文獻均通過參考整體并入本文。盡管已經(jīng)參考優(yōu)選實施方案顯示并描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，在不背離權(quán)利要求包括的本發(fā)明范圍的情況下可對形式和細節(jié)進行多種改變。權(quán)利要求1.在哺乳動物受試者中檢測疾病狀態(tài)或疾病易感性的方法，所述方法包括檢測測試樣品中的抗體，其中所述測試樣品包含來自所述哺乳動物受試者的體液，并且其中所述抗體是疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標志物，所述方法包括(a)制備所述測試樣品的兩種或更多種不同稀釋液，并對每個測試樣品稀釋液進行以下步驟(i)和(ii)(i)使所述測試樣品稀釋液接觸多種不同量的對所述抗體具有特異性的抗原，(ii)對步驟(i)中所用的每個抗原量，檢測抗體與抗原之間特異性結(jié)合的量，(b)對步驟(a)中所用的每個測試樣品稀釋液，繪制或計算出特異性結(jié)合量相對于抗原量的各個曲線，和(c)對所測試的每個測試樣品稀釋液和抗原量，基于所述抗體與所述抗原之間特異性結(jié)合的量來確定所述疾病狀態(tài)或疾病易感性的存在與否。2.權(quán)利要求l的方法，其中針對所有的測試樣品稀釋度及所測試抗原量基于特異性結(jié)合量的集合值來確定所述疾病狀態(tài)或疾病易感性的存在與否。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中通過評估在步驟(c)中獲得的曲線中一條或更多條總體為S形的曲線的存在來確定所述疾病狀態(tài)或疾病易感性的存在與否。4.權(quán)利要求3的方法，其中通過在所述測試樣品的至少兩個不同稀釋度下存在總體為S形的曲線來指示所述測試樣品中存在所述抗體。5.檢測測試樣品中抗體的方法，所述測試樣品包含來自哺乳動物受試者的體液，其中所述抗體是疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標志物，所述方法包括(a)制備所述測試樣品的兩種或更多種不同稀釋液，并就每個測試樣品稀釋液進行以下步驟(i)和(ii):(i)使所述測試樣品稀釋液接觸多個不同量的對所述抗體具有特異性的抗原，(ii)對步驟(i)中所用的每個抗原量，檢測抗體與抗原之間特異性結(jié)合的量，(b)對步驟(a)中所用的每個測試樣品稀釋度，繪制或計算出特異性結(jié)合量相對于抗原量的各個曲線，其中通過對所述測試樣品的至少兩種不同稀釋度呈現(xiàn)總體為S形的曲線來指示測試樣品中存在與測定中所用抗原具有反應(yīng)性的抗體。6.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述抗體是自身抗體。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述自身抗體對腫瘤標志物蛋白是特異性的。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述抗原包括腫瘤標志物蛋白或者其抗原性片段或表位。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述腫瘤標志物蛋白選自MUC1、MUC16、c-myc、EGFR、p53、ras、BRCA1、BRCA2、APC、HER2-neu、PSA、CEA、CA19.9、NY國ESO國l、4-5、CAGE、PSMA、PSCA、EpCam、細胞角蛋白、恢復(fù)蛋白、激肽釋放酶、膜聯(lián)蛋白、AFP、b-HCG、GRP78、CA125、乳腺珠蛋白、raf、NY-BR-1、livin、存活素、MUC2、內(nèi)皮抑制素、Bcl-2、BIRC7、HSP70、No55、uPA、四連蛋白、催乳素、骨橋蛋白、HE4、TATI、抑制素、波形蛋白、cox-l和cox-2。10.權(quán)利要求7至9任何一項的方法在癌癥診斷、預(yù)后或監(jiān)測中的用途。11.權(quán)利要求7至9任何一項的方法在篩選無癥狀人類受試者群體以鑒定發(fā)生癌癥風險提高之受試者中的用途，其中待使用所述方法檢測的所述樣品是從所述受試者中取得的體液樣品，并且其中將與正常對照個體相比具有升高的自身抗體水平的受試者鑒定為具有發(fā)生癌癥的風險。12.權(quán)利要求7至9任何一項的方法在檢測無癥狀人類受試者中早期贅生性變化或早期致癌變化中的用途，其中待使用所述方法檢測的所述樣品是從所述受試者中取得的體液樣品，并且其中將與正常對照個體相比存在升高的自身抗體水平作為所述受試者中早期贅生性變化或早期致癌變化的指示。13.權(quán)利要求7至9任何一項的方法在篩選無癥狀人類受試者群體以鑒定已發(fā)生癌癥之受試者中的用途，其中待使用所述方法檢測的所述樣品是從所述受試者中取得的體液樣品，并且其中與正常對照個體相比具有升高的自身抗體水平的受試者被診斷為患有癌癥。14.權(quán)利要求7至9任何一項的方法在測試有癥狀人類受試者群體以鑒定已經(jīng)發(fā)生癌癥之受試者中的用途，其中待使用所述方法檢測的所述樣品是從所述受試者中取得的體液樣品，并且其中與正常對照個體相比具有升高的自身抗體水平的受試者被診斷為患有癌癥。15.權(quán)利要求7至9任何一項的方法在監(jiān)測患者中癌癥或其它贅生性疾病的進程中的用途，其中待使用所述方法檢測的所述樣品是從人類患者中取得的體液樣品，并且其中將與正常對照相比存在升高的自身抗體水平作為所述患者中癌癥存在的指示。16.權(quán)利要求7至9任何一項的方法在檢測先前診斷為患有癌癥的人類患者中復(fù)發(fā)性疾病中的用途，所述患者已進行過抗癌治療以減少所存在的癌量，其中待使用所述方法檢測的所述樣品是從所述患者中取得的體液樣品，并且其中將與正常對照相比該患者中存在自身抗體水平升高作為所述疾病已經(jīng)復(fù)發(fā)的指示。17.權(quán)利要求7至9任何一項的方法在評估癌癥預(yù)后中的用途，其中待使用所述方法檢測的所述樣品是從人類患者中取得的體液樣品，并且其中將與正常對照相比存在升高的自身抗體水平作為該患者具有癌癥預(yù)后的指示。18.權(quán)利要求7至9任何一項的方法在預(yù)測對抗癌治療的應(yīng)答中的用途，其中待使用所述方法檢測的所述樣品是從人類患者中取得的體液樣品，并且其中將所述患者中的自身抗體水平與先前已經(jīng)確定的自身抗體水平與治療的可能結(jié)果之間的關(guān)系進行比較，用于提供所述患者是否將對該抗癌治療產(chǎn)生應(yīng)答的指示。19.權(quán)利要求18的用途，其中所述抗癌治療是疫苗接種、抗生長因子或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)治療、放射治療、內(nèi)分泌治療、人抗體治療或化學(xué)療法。20.權(quán)利要求7至9任何一項的方法在監(jiān)測人類癌癥患者對抗癌治療的應(yīng)答中的用途，其中待使用所述方法檢測的所述樣品是從所述患者中取得的體液樣品，并且其中將治療后自身抗體水平的變化作為所述患者是否已經(jīng)應(yīng)答于所述治療的指示。21.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中所述治療是疫苗接種、抗生長因子或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)治療、放射治療、內(nèi)分泌治療、人抗體治療或化學(xué)療法，并且將治療后自身抗體水平的變化作為所述患者已經(jīng)對所述治療作出積極應(yīng)答的指示。22.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述抗體是作為自身免疫病之特征或者與自身免疫病相關(guān)的自身抗體。23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述自身免疫病是類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、自身免疫性甲狀腺炎、橋本甲狀腺炎、自身免疫性胃炎、惡性貧血、自身免疫性腎上腺炎、阿狄森氏病、自身免疫性甲狀旁腺功能減退癥、自身免疫性糖尿病或重癥肌無力。24.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述抗體是作為導(dǎo)致器官機能不全或衰竭之腎病或肝病的特征性的或者與其相關(guān)的自身抗體。25.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述抗體針對移植到所述哺乳動物受試者中的組織上所存在的表位。26.在包含來自哺乳動物受試者的體液的測試樣品中檢測抗體的方法，其中所述抗體針對引入到所述哺乳動物受試者中的外源物質(zhì)，所述方法包括(a)制備所述測試樣品的兩種或更多種不同稀釋液，并就每個測試樣品稀釋液進行以下步驟(i)和(ii):(i)使所述測試樣品稀釋液接觸多個不同量的對所述抗體具有特異性的抗原，(ii)對步驟(i)中所用的每個抗原量，檢測抗體與抗原之間特異性結(jié)合的量，(b)對步驟(a)中所用的每個測試樣品稀釋液，繪制或計算出特異性結(jié)合量相對于抗原量的各個曲線，其中通過對所述測試樣品的至少兩個不同稀釋液呈現(xiàn)總體為s形的曲線來指示測試樣品中存在與測定中所用抗原具有反應(yīng)性的抗體。27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述哺乳動物受試者是人類。28.根據(jù)權(quán)利要求26或權(quán)利要求27的方法，其中所述外源物質(zhì)是治療劑。29.根據(jù)權(quán)利28的方法，其中所述治療劑是藥物、前藥或抗體治療劑。30.根據(jù)權(quán)利要求26或權(quán)利要求27的方法，其中所述外源物質(zhì)是疫苗。31.根據(jù)權(quán)利要求28或權(quán)利要求29的方法，其中所述外源物質(zhì)是治療劑或疫苗的非靶部分。32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述非靶部分是生物素。33.根據(jù)權(quán)利要求26或權(quán)利要求27的方法，其中所述外源物質(zhì)是感染因子，如真菌、細菌、病毒或寄生蟲。34.在包含來自哺乳動物受試者的體液的測試樣品中檢測兩種或更多種抗體的方法，其中至少一種所述抗體是疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標志物，所述方法包括(a)制備所述測試樣品的兩種或更多種不同稀釋液，并就每個測試樣品稀釋液進行以下步驟(i)和(ii):(i)使所述測試樣品稀釋液與兩組或更多組抗原接觸，其中所述抗原組中的每一種對測試樣品中待檢測抗體之一具有特異性，并且其中每一抗原組包含同一抗原的多種不同量，(ii)對步驟(i)中所用每一抗原組中的每種抗原量，檢測抗體與抗原之間特異性結(jié)合的量，(b)對步驟(a)中所用的每一抗原組和每種測試樣品稀釋度，繪制或計算出特異性結(jié)合量相對于抗原量的各個曲線，其中測試樣品中與任何一組抗原具有反應(yīng)性之抗體的存在是通過對與該抗原組一起的所述測試樣品的至少兩種不同稀釋度呈現(xiàn)總體為S形的曲線來指示。35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述兩種或更多種抗體中的至少一種是自身抗體。36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述兩種或更多種抗體中的至少一種是對腫瘤標志物蛋白具有特異性的自身抗體。全文摘要本發(fā)明一般地涉及診斷或預(yù)后測定的領(lǐng)域，并特別涉及用于在包含患者體液的樣品中檢測抗體的測定，其中該抗體用作疾病狀態(tài)或疾病易感性的生物標志物。所述測定基于待檢測抗體的患者體液以及通過特異性結(jié)合用于檢測所述抗體的抗原之間的交叉滴定。文檔編號G01N33/557GK101632020SQ200780039186公開日2010年1月20日申請日期2007年9月12日優(yōu)先權(quán)日2006年9月13日發(fā)明者卡羅琳·查普曼,安德烈亞·默里,托尼·巴爾內(nèi)斯,約翰·福賽思·魯塞爾·羅伯特森申請人:昂西免疫有限公司