專利名稱：抑制mphosph1與prc1之間的結(jié)合的作用劑的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用M期磷蛋白(MPHOSPHl)和細(xì)胞質(zhì)分裂蛋白蛋白調(diào)控 因子1 (PRC1)的結(jié)合為指標(biāo)的篩選方法?？梢愿鶕?jù)本方法進(jìn)行鑒定適用于 癌癥，特別是膀胱癌的治療或預(yù)防的作用劑。
背景技術(shù)：
膀胱癌是人群中第二常見(jiàn)的泌尿生殖器腫瘤，全世界每年約有357,000 例的新發(fā)病例(Parkin DM etal.，CA Cancer J Clin 2005, 55:74-108)。這其中 約有1/3的患者很可能在診斷時(shí)已成為浸潤(rùn)性疾病或轉(zhuǎn)移性疾病(ParkinDM et al., CA Cancer J Clin 2005, 55: 74-108; Sternberg CN, Ann Oncol 1995, 6: 113-26; Ardavanis A et al., Br J Cancer 2005, 92: 645-50)。雖然對(duì)于那些4又發(fā) 生肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌的患者的治療而言根治性膀胱切除術(shù)被視為"黃金標(biāo) 準(zhǔn)"，然而這些患者中約有50%在接受膀胱切除術(shù)后2年出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，并隨后 死于該疾病(SternbergCN， Ann Oncol 1995,6: 113-26)。
近二十年間，CMV (順鉑(dsplatin)、曱氨蝶呤(methotrexate)、長(zhǎng)春堿 (vinblastine)或M-VAC(甲氨蝶呤、長(zhǎng)春堿、多柔比星、順柏)等基于順鉑的 組合化學(xué)療法成為晚期膀胱癌患者的首選(Ardavanis A et al.， Br J Cancer 2005, 92: 645-50; Lehmann J et al., World J Urol 2002， 20: 144-50)。然而，總 體預(yù)后仍然很差。而且，M-VAC化學(xué)療法的副作用極大(Vaughn DJ, Semin Oncol 1999, 26(suppl 2): 117-22)。因此，人們熱切希望開(kāi)發(fā)新的針對(duì)膀胱癌 的分子靶向藥物。
cDNA微陣列已被證明是能夠同時(shí)分析數(shù)千基因的表達(dá)圖式的有效手 段。基于cDNA微陣列的癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的全基因組表達(dá)模式的比較可 提供有用的信息來(lái)幫助發(fā)現(xiàn)用于癌癥診斷和治療開(kāi)發(fā)的候選靶標(biāo)分子(Debouck C et al., Na Genet 1999, 21: 48-50)。最近的藥物開(kāi)發(fā)研究著重以與 癌癥發(fā)生相關(guān)的重要分子為靶標(biāo)，以伊馬替尼(imatinib)、去鐵胺(mesylate) 和曲妥單抗(trastuzumab)為代表。通過(guò)將RNAi與癌表達(dá)模式分析相結(jié)合， 可望鑒定這才羊的治療藥物靶標(biāo)(Clarke PA et al., Eur J Cancer 2004, 40: 2560-91)。
通過(guò)全基因組表達(dá)分析，分離了與肝細(xì)胞癌(Hamamoto R et al., Nat Cell Biol2004, 6: 731-40; YagyuR et al., Int J Oncol2002, 20: 1173-8)、滑膜肉瘤 (Nagayama S et al.， Oncogene 2004， 23: 5551-7; Nagayama S et al.， Oncogene 2005. 24: 6201-12)、腎細(xì)胞癌(Togashi A et al.， Cancer Res 2005, 65: 4817-26) 和乳腺癌(WO 2005/28676)的發(fā)生和/或進(jìn)展相關(guān)的多個(gè)癌基因。這樣的分子 被認(rèn)為是用于開(kāi)發(fā)新治療方法的良好候選分子。
M-VAC等細(xì)胞毒劑屢屢產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此，基于已經(jīng)充分闡 明的機(jī)理來(lái)慎重地選擇新的靶標(biāo)分子，對(duì)于開(kāi)發(fā)將副作用的危險(xiǎn)性控制在 最小限度的有效抗癌劑而言是非常有益的。在此目標(biāo)的基礎(chǔ)上，曾經(jīng)進(jìn)行 了 26例膀胱癌與29例正常人組織的表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)了在膀胱癌中特 異性過(guò)表達(dá)的多個(gè)基因(Takata R et al" Clin Cancer Res April 1, 2005， 11(7): 2625-36; Saito-Hisaminato A et al" DNA Res 2002, 9: 35-45)。 MPHOSPHl(參 照C2093)被鑒定為膀胱癌中過(guò)表達(dá)的基因之一。
而且，MPHOSPHl先前被鑒定為在G2/M過(guò)渡期被特異性磷酸化的蛋 白質(zhì)，而且;f皮定性為正末端指向驅(qū)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白(plus-end-directed kinesin related protein)(Abaza A et al.， J Biol Chem 2003, 278: 27844-52)。 M尸7/OS7W7 cDNA編碼1780個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該1780個(gè)氨基酸包括3個(gè)NH2型驅(qū) 動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白的特征結(jié)構(gòu)域即NH2驅(qū)動(dòng)蛋白馬達(dá)域、中央巻曲螺旋-莖柄 域和C-球形尾域。而且，先前已經(jīng)證明MPHOSPHl是在胞質(zhì)分裂中起重要 作用的正末端指向分子馬達(dá)，在HeLa細(xì)胞中MPHOSPHl從后期到末期在 紡錘體的中間區(qū)蓄積(Abaza A et al" J Biol Chem 2003, 278: 27844-52; Kamimoto T et al" J Biol Chem 2001， 276: 37520-8)。
有報(bào)道稱PRC1與數(shù)個(gè)驅(qū)動(dòng)蛋白家族蛋白相互作用(BanRetal.， JBiol Chem 2004, 279: 16394-402; Kurasawa Y et al.， EMBO J 2004, 23: 3237-48; Zhu C & Jiang W， Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102: 343-8; Gruneberg U et al., J Cell Biol 2006， 172: 363-72)。有報(bào)道稱Hela細(xì)胞中抗PRC1抗體對(duì)PRC1的抑制引起雙核細(xì)胞的增加(Mollinari C et al., J Cell Biol 2002， 157: 1175-86)。而且，有報(bào)道稱PRCl可以與數(shù)種與細(xì)胞分裂事件特別是胞質(zhì) 分裂相關(guān)的分子(例如KIF4或KIF14)相互作用(EMBO J 2004, 23: 3237-48; MollinariCetal.,Mol Biol Cell 2005, 16: 1043-55)。而且，PRCl已經(jīng)由本發(fā) 明人等鑒定在乳腺癌中過(guò)表達(dá)(WO 2005/28676)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于，至少部分基于體內(nèi)的MPHOHPH1與PRCl間的相互作用 的發(fā)現(xiàn)。MPHOSPHl和PRCl這兩種蛋白均在膀胱癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，而 MPHOSPHl的表達(dá)僅見(jiàn)于膀胱癌細(xì)胞和正常睪丸組織。如本說(shuō)明書中揭示 的，如果抑制編碼這些蛋白的基因中的一個(gè)，細(xì)胞質(zhì)分裂就會(huì)受到抑制， 誘導(dǎo)多核化，從而最終導(dǎo)致表達(dá)該基因的細(xì)胞的增殖抑制。
因此，本發(fā)明提供一種篩選抑制MPHOSPHl與PRCl的結(jié)合的作用劑 的方法。更具體地，該方法包括下述步驟a)在作用劑存在下使MPHOSPHl 與PRCl接觸、b)檢測(cè)MPHOSPHl與PRCl的結(jié)合水平、c)與不存在作用 劑的條件下檢測(cè)出的MPHOSPHl與PRCl的結(jié)合水平相比較；d)選擇降低 MPHOSPHl與PRCl的結(jié)合水平的作用劑。在本方法的語(yǔ)境中，也可以用 片段來(lái)代替完整MPHOSPHl或完整PRC1使用，只要各片段能夠保持與其 配偶配體的結(jié)合能力。本篩選中特別優(yōu)選使用的MPHOSPHl片段包括這樣 的片段，它們包含SEQIDNO:2的第1188-1718位的氨基酸殘基。
考慮到經(jīng)上述方法鑒定的作用劑很可能抑制表達(dá)所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞的 增殖，這樣鑒定出的作用劑可作為膀胱癌的治療或預(yù)防的候選物質(zhì)。因此， 本發(fā)明還提供鑒定抑制膀胱癌細(xì)胞增殖的作用劑的方法，以及用于膀胱癌 治療或預(yù)防的作用劑。


圖1顯示了膀胱癌與正常組織中的MPHOSPHl的表達(dá)。圖面A顯示了 在來(lái)自10例膀胱癌患者的腫瘤細(xì)胞和人正常組織(顯微切除的正常膀胱移 行細(xì)胞、心臟、肺、肝臟、腎臟)中通過(guò)半定量RT-PCR測(cè)定的MPHOSPHl 的表達(dá)。以GAPDH的表達(dá)作為定量對(duì)照。圖面B顯示了膀胱癌細(xì)胞系 (HT1197、 UMUC3、 J82、 HT1376、 SW780、 RT4)和正常人臟器(心臟、肺、肝臟、腎臟、腦、胰臟、睪丸、膀胱)中的MPHOSPHl轉(zhuǎn)錄物的Northern 印跡分析結(jié)果。圖面C顯示了各種人組織中的MPHOSPHl轉(zhuǎn)錄物的 Northern印跡分析結(jié)果。圖面D顯示了手術(shù)切除的膀胱癌組織(淺表性膀胱 癌2例和浸潤(rùn)性膀胱癌2例)和正常膀胱組織切片中使用親和純化抗 MPHOSPHl多克隆抗體免疫組織化學(xué)染色測(cè)定的MPHOSPHl蛋白質(zhì)表達(dá)。
圖2顯示了細(xì)胞周期進(jìn)行中膀胱癌細(xì)胞內(nèi)源性MPHOSPHl蛋白質(zhì)的亞 細(xì)胞定位。對(duì)于UMUC細(xì)胞，使用親和純化的MPHOSPHl多克隆抗體進(jìn) 行了免疫組織化學(xué)染色(綠)。DAPI顯示了核染色(藍(lán))。
圖3顯示了 MPHOSPHl-siRNA對(duì)膀胱癌細(xì)胞系J82和UMUC3的增殖 抑制效果。圖面A顯示通過(guò)western印跡(上圖面)和半定量RT-PCR(下圖面) 測(cè)定的MPHOSPHl表達(dá)。圖面B顯示了用表達(dá)MPHOSPHl-siRNA、對(duì)照 siRNA (EGFP)或MPHOSPHl錯(cuò)配siRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的J82細(xì)胞和UMUC3 細(xì)胞的集落形成測(cè)定結(jié)果。圖面C顯示，與對(duì)照的導(dǎo)入相比較，J82細(xì)胞和 UMUC3細(xì)胞應(yīng)答于MPHOSPHl-siRNA的通過(guò)MTT測(cè)定的存活力纟是高。
圖4顯示NIH3T3細(xì)胞中外源性MPHOSPHl的生長(zhǎng)促進(jìn)效果。圖面A 顯示用外源性MPHOSPHl高水平表達(dá)細(xì)胞或者模擬載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的 western印跡分析結(jié)果。用抗HA標(biāo)簽單克隆抗體驗(yàn)證了外源性導(dǎo)入的 MPHOSPHl表達(dá)。使用了 (3-肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照。圖面B顯示體外的 NIH3T3-MPHOSPH1細(xì)胞生長(zhǎng)。采用MTT測(cè)定法測(cè)量了用MPHOPH1轉(zhuǎn)染 的NIH3T3細(xì)胞(NIH3T3-MPH0PH1-弁1 、 #2、 #3)和用模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 (NIH3T3-模擬41 、#2、#3)的生長(zhǎng)。在圖面C中，采用阿非迪霉素(aphidicoline) 處理24小時(shí)使NIH3T3-MPH0SPH1 (NIH3T3-MPH0SPH1-弁1)和模擬 (NIH3T3-模擬弁1)同步。停滯解除(release)后，在顯示的時(shí)間點(diǎn)制備了細(xì)胞樣 品。圖面D顯示了對(duì)NIH3T3-MPHOSPHl細(xì)胞實(shí)施的體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)測(cè)定的 結(jié)果。腫瘤的直徑用測(cè)徑器測(cè)定，腫瘤體積通過(guò)下式來(lái)確定0.5x(長(zhǎng)徑(larger diameter))x(短徑(smaller diameter))2。采用非成對(duì)t檢驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)注射后第21 日的NIH3T3-MPHOSPH1與NIH3T3-模擬的差異(pO.001;非成對(duì)t檢驗(yàn))。
圖5顯示MPHOSPHl和PRC1的相互作用。圖面A顯示通過(guò)半定量 RT-PCR測(cè)定的膀胱癌病例的MPHOSPHl和PRC1的表達(dá)。使用GAPDH 表達(dá)作為定量對(duì)照。圖面B顯示了 MPHOSPHl和PRCl的共免疫沉淀。對(duì) 于用HA標(biāo)簽MPHOSPHl和myc標(biāo)簽PRCl蛋白轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞的細(xì)胞裂解物，使用抗HA或抗myc進(jìn)行了免疫沉淀。對(duì)于免疫沉淀物，使用單 克隆抗HA抗體或抗myc抗體進(jìn)行了免疫印跡。圖面C顯示了 UMUC3細(xì) 胞中內(nèi)源性MPH0SPH1和外源性PRC1的亞細(xì)胞定位。內(nèi)源性MPH0SPH1 蛋白(綠)與外源性PRC1蛋白(紅)共定位。
圖6顯示MPH0SPH1中被確定與PRC1相互作用的區(qū)域。圖面A為免 疫沉淀實(shí)驗(yàn)中使用的MPHOSPHl的片段和全長(zhǎng)的模式圖。圖面B顯示一系 列MPHOSPH1片段和PRC1的共免疫沉淀。對(duì)于用HA標(biāo)簽MPHOSPH1 和myc標(biāo)簽PRC1蛋白轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞的細(xì)胞裂解物，使用抗HA或抗 myc進(jìn)行了免疫沉淀。對(duì)于免疫沉淀物，如圖5的圖例說(shuō)明那樣，使用單克 隆抗HA抗體或抗myc抗體進(jìn)行了免疫印跡。
圖7顯示了膀胱癌細(xì)胞增殖中MPHOSPH1和PRC1的重要作用。圖面 A顯示了通過(guò)半定量RT-PCR (左上)、集落形成測(cè)定(左下)、MTT測(cè)定(右) 分析出的si-PRCl或?qū)φ誷iRNA (si-EGFP)對(duì)J82細(xì)胞的效應(yīng)。圖面B顯示 了通過(guò)半定量RT-PCR (左上)、集落形成測(cè)定(左下)、MTT測(cè)定(右)分析出 的si-PRCl或?qū)φ誷iRNA (si-EGFP)對(duì)UMUC3細(xì)胞的效應(yīng)。圖面C顯示了 用si-MPHOSPHl、 si-PRCl、或作為對(duì)照的si-EGFP轉(zhuǎn)染的UMUC3細(xì)胞的 形態(tài)。對(duì)于用si-MPHOSPHl、 si-PRCl、或作為對(duì)照siRNA的si-EGFP轉(zhuǎn) 染的UMUC細(xì)胞的形態(tài)，通過(guò)顯微鏡下觀察(上圖)、或免疫細(xì)胞化學(xué)(下圖) 進(jìn)行了評(píng)價(jià)。為了區(qū)分核與細(xì)胞質(zhì)，使用DAPI和鬼筆環(huán)肽對(duì)用siRNA處 理的UMUC細(xì)胞進(jìn)行了染色。
發(fā)明的
具體實(shí)施例方式
在微陣列分析檢測(cè)出的在膀胱癌中上調(diào)的基因中，本發(fā)明注意到了在 絕大多數(shù)受檢查的膀胱癌細(xì)胞中高度過(guò)表達(dá)的基因——M尸7/OSP/f 7 (M畫phase phosphoprotein 1 ， M期磷酸蛋白1) (SEQ ID NO: 1) (NM—016195)。 Northern印跡分析顯示，在除睪丸外的任何受檢的正常人組織中均幾乎檢測(cè) 不到MPZ/OS尸///的表達(dá)。而且，使用抗MPHOSPHl多克隆抗體的免疫組 織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)明顯表明膀胱癌細(xì)胞中MPH0SPH1(SEQ ID NO: 2)表達(dá)的 上調(diào)。這提示MPH0SPH1是癌癥-睪丸抗原(Kanehira M et al., Cancer Res. 2007, 67(7): 3276-85)。綜合起來(lái)，這些結(jié)果還提示，MPHOSPH1基因可能 是膀胱癌抗癌劑或癌肽疫苗開(kāi)發(fā)的有價(jià)值的靶標(biāo)。而且，免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)^r顯示MPHOSPHl在間期定位于膀胱癌 細(xì)胞中的細(xì)胞核、在后期定位于中間區(qū)，在末期則定位于收縮環(huán)。而且， 已經(jīng)證實(shí)利用siKNA敲低內(nèi)源性MPHOSPHl,可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì) 分裂失敗，結(jié)果使得多核細(xì)胞蓄積，并導(dǎo)致其后的細(xì)胞死亡。因此，通過(guò) 鑒定與MPHOSPHl相互作用的蛋白質(zhì)，對(duì)膀胱癌細(xì)胞中MPHOSPHl的生 物學(xué)作用進(jìn)行了研究。
發(fā)現(xiàn)了 MHPOSPH1與PRC1 (SEQ ID NO: 36所編碼的SEQ ID NO: 37) (AF044588) (Protein regulator of Cytokinesis 1,胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)控因子1,) 相互作用，PRC1基因的表達(dá)也在膀胱癌中上調(diào)。由于它們功能相似且在膀 胱癌細(xì)胞中共同過(guò)表達(dá)，選擇PRC1作為與MPHOSPHl相互作用的候選物 質(zhì)。如圖5所示，在膀胱癌細(xì)胞中，從間期至后期的期間，顯示了 MPHOSPHl 和PRC1 (胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)控因子l)的體內(nèi)相互作用和共定位，但在末期細(xì) 胞中，MPHOSPHl包圍著定位在中間體中央的PRC1 (圖5C)。因此，紡錘 體中MPHOSPHl和PRC1的相關(guān)性和共定位進(jìn)一步支持了下述主張 MPHOSPHl是馬達(dá)蛋白分子，其在細(xì)胞分裂期間沿著紡錘體移動(dòng)PRCl。 它們?cè)诎螂装┎±械墓卜词郊せ?co-transactivation)提示(圖5A)它們的相 互作用在膀胱癌發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
而且，使用特異性siRNA抑制M尸Z/OS尸//7或尸i 。中任一個(gè)的表達(dá)可 誘導(dǎo)多核細(xì)胞形成，其后發(fā)生細(xì)胞死亡。為了評(píng)價(jià)MPHOSPHl或PRC 1對(duì) 于膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或存活是否有作用，在顯示高水平表達(dá)MPHOSPHl和 PRC1的膀胱癌細(xì)胞系——J82或UMUC3中用特異性siRNA敲低了內(nèi)源性 MPHOSPHl或PRC 1中任一個(gè)的表達(dá)。各特異性siRNA顯著抑制相應(yīng)基因 的表達(dá)，其結(jié)果是對(duì)這些細(xì)胞產(chǎn)生顯著的生長(zhǎng)抑制，這表明MPHOSPHl和 PRC1這兩者對(duì)于膀胱癌細(xì)胞的增殖都是必需的。而且，在UMUC3細(xì)胞中 敲低MPHOSPHl或PRC1表達(dá)引起多核細(xì)胞的顯著增加。這些結(jié)果支持了 文獻(xiàn)中向HeLa細(xì)胞顯微注射抗PRC1抗體引起的PRC1抑制可能造成雙核 細(xì)胞的增加的提議(Mollinari C et al.， J Cell Biol 2002， 157: 1175-86)。由于它 們之間相互作用的抑制可能最終誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)分裂失敗后細(xì)胞死 亡，因此，抑制它們的相互作用的作用劑作為針對(duì)膀胱癌的藥物開(kāi)發(fā)的靶 標(biāo)可能是有價(jià)值的本發(fā)明人等提供的微陣列數(shù)據(jù)闡明了膀胱癌中的限定性MPH0SPH1過(guò) 表達(dá)。但是，被發(fā)現(xiàn)與MPHOSPH1相互作用的蛋白PRCl,不僅在膀胱癌 細(xì)胞中、而且在其它數(shù)種類型的人腫瘤中也過(guò)表達(dá)(數(shù)據(jù)未給出)。已報(bào)導(dǎo) PRC1與數(shù)種有絲分裂事件特別是細(xì)胞質(zhì)分裂相關(guān)分子例如KIF4或KIF14 相互作用(Kurasawa Y et al" EMBO J 2004, 23: 3237-48; Mollinari C et al., Mol Biol Cell 2005， 16: 1043-55),但根據(jù)本發(fā)明人等獲得的膀胱癌表達(dá)才莫 式，KIF4和KIF14均不在膀胱癌中表達(dá)。這些結(jié)果提示，通過(guò)MPH0SPH1 與PRC1相互作用穩(wěn)定化中間區(qū)微管束并容許細(xì)胞分裂完成而進(jìn)行的細(xì)胞 分裂調(diào)節(jié)，是膀胱癌細(xì)胞中的特異性事件，雖然該相互作用對(duì)于細(xì)胞增殖 的貢獻(xiàn)以及其它結(jié)合配偶體的存在尚待闡明。
最后，本文的發(fā)現(xiàn)提示，MPH0SPH1/PRC1途徑可能在膀胱癌細(xì)胞中 具有致癌功能，并且可能成為膀胱癌抗癌劑開(kāi)發(fā)的有潛力的分子靶標(biāo)。抑 制或阻遏MPHOSPHl與PRC1的結(jié)合的作用劑的開(kāi)發(fā)可能是膀胱癌治療的 合理戰(zhàn)略。雖然對(duì)MPHOSPHl與PRC1的結(jié)合還有必要進(jìn)行進(jìn)一步分析， 但本說(shuō)明書中提供的認(rèn)識(shí)有助于更深入理解膀胱癌癌癥的發(fā)生以及開(kāi)發(fā)膀 胱癌的新治療方法。
除非另有說(shuō)明，本說(shuō)明書中使用的詞語(yǔ)"一個(gè)"或"一種"或"該" 是指至少一個(gè)或至少一種。
對(duì)于物質(zhì)(例如多肽、抗體、多核苷酸等)使用的術(shù)語(yǔ)"分離的"或"純化的" 是指該物質(zhì)基本上不含可能本包含在其天然供給源中的至少一種物質(zhì)。因 此，"分離的"或"純化的"抗體是基本上不含細(xì)胞物質(zhì)(例如糖類、脂質(zhì)或來(lái) 源于該蛋白(抗體)所由來(lái)的細(xì)胞或組織源的其它污染蛋白)的抗體，和/或在
不含細(xì)胞物質(zhì)"包括多肽的制備物，其中該多肽與細(xì)胞(該多肽分離自該細(xì)胞 或者在該細(xì)胞中重組表達(dá))的細(xì)胞組分分開(kāi)。因此，基本上不含細(xì)胞物質(zhì)的 多肽包括這樣的多肽制備物，其中多肽制備物含異源蛋白(本說(shuō)明書中也稱 為"污染蛋白")少于約30%、 20%、 10%或5%(以干重計(jì))。當(dāng)多肽為重組產(chǎn) 生時(shí)，還優(yōu)選其基本上不含培養(yǎng)基，包括培養(yǎng)基少于蛋白質(zhì)制備物體積的 約20%、 10%或5%的多肽制備物。當(dāng)多肽是由化學(xué)合成產(chǎn)生時(shí)，優(yōu)選基本 上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)，包括這樣的多肽制備物，其中蛋白合成 中涉及的化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)少于蛋白質(zhì)制備物體積的約30%、 20%、10%或5%(以干重計(jì))。例如，對(duì)蛋白制備物進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙 烯酰胺凝膠電泳及凝膠考馬斯亮藍(lán)等染色后，出現(xiàn)單一條帶，可以證明該 蛋白制備物含有分離的或純化的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗 體或其片段是分離的或純化的。
"分離的"或"純化的"核酸分子，例如cDNA分子，當(dāng)由重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)， 可基本上不含其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者當(dāng)其由化學(xué)合成時(shí)，其可基本 上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的抗 體或其片段的核酸分子是分離的或純化的。
術(shù)語(yǔ)"多肽"、"肽"和"蛋白(質(zhì))"在本說(shuō)明書中可互換使用，是指 氨基酸殘基的多聚體。這些術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是修飾 殘基或非天然存在的氨基酸殘基(例如相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué) 模擬物)的氨基酸多聚體，還適用于天然存在的氨基酸多聚體。
術(shù)語(yǔ)"氨基酸"指的是天然存在及合成的氨基酸，以及功能類似于天 然存在的氨基酸的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由 遺傳密碼編碼的那些，以及在細(xì)胞內(nèi)翻譯后被修飾的氨基酸，(例如羥脯氨 酸(hydroxyproline) 、 y-叛基谷氨酸(y-carboxyglutamate)和0-磷酸絲氛酸 (O-phosphoserine))。短語(yǔ)"氨基酸類似物"指的是具有與天然存在的氨基酸 相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)(例如與氫、羧基、氨基和R基結(jié)合的a碳)但具有修飾 的R基或修飾的肽骨架的化合物(例如高絲氨酸(homoserine)、正亮氨酸 (norleucine)、曱硫氨酸亞砜(methionine sulfoxide)、曱硫氨酸甲基銃 (methionine methyl sulfonium))。短語(yǔ)"氨基酸模擬物"指的是具有與氨基酸 的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)、但功能類似于天然存在的氨基酸的化合物。
在本說(shuō)明書中氨基酸可用其通常公知的3個(gè)字母符號(hào)表示，或用 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission(國(guó)際理論和應(yīng)用化學(xué)聯(lián) 合會(huì)-國(guó)際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)生物化學(xué)命名委員會(huì))推薦的單字母符號(hào)表示。
除非另外特別說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"、"寡核苷酸"、"核苷酸"、 "核酸"和"核酸分子"在可互換使用，而且，類似于氨基酸，也可以用 其通常公認(rèn)的單字母代碼表示。與氨基酸的情況類似，這其中包括天然的 核酸聚合物以及非天然存在的核酸聚合物這兩者。
人M尸/ZOSP//7的核苷酸序列示于SEQ ID NO: 1 (GenBank登錄號(hào) NM_016195)。在本i兌明書中，短語(yǔ)"M尸7/OS尸/i7基因，，包括人以及其他動(dòng)物的M尸/zas"/v/7基因，所述其他動(dòng)物包括非人靈長(zhǎng)類、小鼠、大鼠、狗、
貓、馬和牛。但是，本發(fā)明不限于上述，還包括相應(yīng)于M尸/ZOS尸/^基因的
等位突變體及在其他動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的基因。
人M尸/fOS尸///基因編碼的氨基酸序列示于SEQIDNO: 2(GenBank登 錄號(hào)NP—057279.2)。說(shuō)明書中的由M尸7/OS尸// 7基因編碼的多肽稱為 "MPHOSPH1",有時(shí)也稱"MPHOSPHl多肽"或"MPHOSPH 1蛋白"。
人尸i C7基因的核苦酸序列示于SEQIDNO: 36。而且，已知其具有分 別包括15、 14和14個(gè)外顯子的3個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄變體。變體的核苦酸序列 和氨基酸序列可以在GenBank上檢索(下文中，將GenBank登錄號(hào) NM—003981、 NM—199413、 NM—199414的變體的序列分別稱為VI、 V2和 V3 ，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列可分別以GenBank登錄號(hào)NM—003972.1 、 NP—955445.1、 NM—955446.1查得)。除去VI的外顯子13和14中的可變變 異(alternative variation),其它全部外顯子在3個(gè)變體中是共通的。V2變體 沒(méi)有VI的外顯子14,并在最后一個(gè)外顯子內(nèi)包含一個(gè)新的提前終止密碼 子(early stopcodon)。 V3變體的外顯子14完全缺失，V3的外顯子13比VI 的3'末端短77bp，并在最后一個(gè)外顯子中包含一個(gè)新的提前終止密碼子。 變體V1、 V2和V3分別編碼620、 606和566個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。
在本說(shuō)明書中，短語(yǔ)"尸i C7基因"包括人以及其他動(dòng)物的PRC1基因， 所述其他動(dòng)物包括但不限于非人靈長(zhǎng)類、小鼠、大鼠、狗、貓、馬和牛， 還包括相應(yīng)于尸i C7基因的等位突變體及在其他動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的基因。
人戶i C/基因編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 37，在本說(shuō)明書中， 將尸AC7基因編碼的多肽稱為"PRC1",有時(shí)稱為"PRC1多肽"或"PRC1 蛋白"。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，功能等價(jià)物也被認(rèn)為是"MPHOSPH1多肽" 或"PRC1多肽"。在本說(shuō)明書中，蛋白質(zhì)的"功能等價(jià)物"是具有與蛋白 質(zhì)等價(jià)的生物活性，特別是結(jié)合活性的多肽。即，任何保留MPHOSPH1蛋 白針對(duì)PRC1蛋白的活性、或者PRC1蛋白針對(duì)MPHOSPH1蛋白的活性的 多肽都可以用作本發(fā)明中所述的功能等價(jià)物。所述功能等價(jià)物包括那些在 MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白天然存在的氨基酸序列中取代、缺失、添加 或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的多肽。通常已知蛋白質(zhì)中1個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)對(duì)該蛋白質(zhì)的功能造
成影響(Mark DF ef a/" Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller MJ & Smith M, Nucleic Acids Res 1982， 10: 6487-500; Wang A & <a/.， Science 1984, 224:1431-3; Dalbadie-McFarland G & a/" Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13)。而實(shí)際上，已知經(jīng)突變的蛋白或修飾的蛋白，具有通過(guò)在特定氨 基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而被修飾的 氨基酸序列的蛋白，保留原來(lái)的生物活性(Mark " a/.， Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984); Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982); Dalbadie-McFarland & a/" Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982))。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將承認(rèn)本發(fā)明的上下文中涵蓋氨基酸序列 的改變單個(gè)氨基酸或一小部分氨基酸的個(gè)別添加、缺失、插入或取代，或 者被認(rèn)為是"保守修飾"的修飾，即氨基酸的改變導(dǎo)致產(chǎn)生具有類似功能 的蛋白質(zhì)的修飾。
對(duì)于氨基酸突變的數(shù)目沒(méi)有特殊限制，只要能夠保持蛋白質(zhì)的活性即 可。但是，通常改變數(shù)目?jī)?yōu)選為氨基酸序列的5%或以下。因此，在優(yōu)選的 實(shí)施方式中，這樣的突變體中發(fā)生突變的氨基酸的數(shù)目通常為30個(gè)氨基酸 或更少，優(yōu)選20個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選10個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選6 個(gè)氨基酸或更少，更優(yōu)選3個(gè)氨基酸或更少。
優(yōu)選將待突變的氨基酸殘基突變?yōu)楸Ａ舭被醾?cè)鏈性質(zhì)的其他氨基酸 (該過(guò)程即公知的保守氨基酸取代)。氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的例子包括疏水氨基酸 (丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、曱硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪 氨酸、纈氨酸)、親水氨基酸(精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、天冬酰胺、半 胱氨酸(cystein)、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸、 蘇氨酸)以及具有以下共有官能團(tuán)或特性的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(甘氨酸、丙氨 酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸)；含羥基側(cè)鏈(絲氨酸、蘇氨酸、 酪氨酸)；含硫原子側(cè)鏈(C、 M);含羧酸和酰胺側(cè)鏈(天冬氨酸、天冬酰胺、 谷氨酸、谷氨酰胺)；含堿(base)側(cè)鏈(精氨酸、賴氨酸、組氨酸)和含芳香族 側(cè)鏈(組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)。給出功能上類似的氨基酸的保 守取代表是本領(lǐng)域公知的。例如，以下8組分別包含彼此互為保守取代的 氨基酸
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2) 天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);
3) 天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);
4) 精氨酸(R)、賴氨酸(K);
5) 異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、曱硫氨酸(M)、纈氨酸(V);
6) 苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);
7) 絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);及
8) 半胱氨酸(C)、曱硫氨酸(M)(參見(jiàn)例如Creighton、 Proteins (l984))。 本發(fā)明的MPHOSPHl或PRC1蛋白中包括這樣的保守修飾的多肽。但
本發(fā)明并不限于此，MPHOSPHl和PRC1蛋白還包括非保守性修飾，只要 它們保留原蛋白的結(jié)合活性。而且，修飾的蛋白不排除多態(tài)性變體 (polymorphic variants)、種間同源物、以及由這些蛋白的等位基因編碼的蛋 白。
通過(guò)添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基而修飾的蛋白的例子是融合蛋白。融 合蛋白是MPHOSPHl蛋白或PRCl蛋白與其他肽或蛋白質(zhì)的融合物，也可 以用于本發(fā)明。融合蛋白可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)來(lái)制備，例如
通過(guò)將編碼本發(fā)明的MPHOSPHl蛋白或PRCl蛋白的DNA與編碼其他肽 或蛋白的DNA連接，使得讀碼框一致，然后將融合DNA插入表達(dá)載體并 在宿主中表達(dá)所述融合DNA。對(duì)于與本發(fā)明的MPHOSPHl蛋白或PRCl 蛋白融合的肽或蛋白沒(méi)有限制，只要作為結(jié)果產(chǎn)生的融合蛋白保持用于相 互結(jié)合的原蛋白的活性即可。
可以用作與MPHOSPHl蛋白或PRC1蛋白融合的肽的已知肽包括例如 FLAG (Hopp等人，Biotechnology 6: 1204-10 (1988))、含有6個(gè)His (組氨酸) 殘基的6xHis、 10xHis、流感病毒凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP 片段、pl8HIV片段、T7-標(biāo)簽、HSV-標(biāo)簽、E-標(biāo)簽、SV40T抗原片段、lck 標(biāo)簽、a-微管蛋白片段、B-標(biāo)簽、蛋白C片段等?？梢耘c本發(fā)明的蛋白融 合的蛋白的例子包括GST (谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)、流感病毒凝集素(HA)、免 疫球蛋白恒定區(qū)、P-半乳糖苷酶、MBP(麥芽糖-結(jié)合蛋白)等。
通過(guò)將編碼上述融合肽或蛋白的可商購(gòu)的DNA與編碼MPHOSPHl或 PRC1蛋白的DNA融合，并表達(dá)所制備的融合DNA，即可制備出融合蛋白。
而且，修飾的蛋白不排除多態(tài)性變體、種間同源物、以及由這些蛋白 的等位基因編碼的蛋白。此外，本領(lǐng)域公知的分離功能上等價(jià)的蛋白的可選方法為例如使用雜
交技術(shù)的方法(Sambrook等人，Molecular Cloning 2nd ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989))。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地分離出與編碼 人MPHOSPHl蛋白或PRCl蛋白的Aff/ZOSP/W或T^C7 DNA序列(即SEQ ID NO: 1或36)的全部或部分具有高度同源性的DNA，并且由該分離的DNA 分離與人MPHOSPHl蛋白或PRC1蛋白功能上等價(jià)的蛋白。因此，本發(fā)明 使用的蛋白包括由與編碼人MPHOSPHl蛋白或PRCl蛋白的DNA序列的 全部或部分在嚴(yán)格條件下雜交的DNA編碼的、且在功能上等價(jià)于人 MPHOSPHl蛋白或PRCl蛋白的蛋白。這些蛋白包括對(duì)應(yīng)于人源或小鼠源 蛋白的哺乳動(dòng)物同系物(例如由猴、大鼠、兔和牛基因編碼的蛋白)。在從動(dòng) 物中分離與編碼人MPHOSPHl蛋白的DNA高度同源的cDNA時(shí)，特別優(yōu) 選使用來(lái)自睪丸或膀胱癌的組織。另一方面，在從動(dòng)物中分離與編碼人 PRCl蛋白的DNA高度同源的cDNA時(shí)，除來(lái)自睪丸或膀胱癌的組織外， 還可以使用來(lái)自乳腺癌的組織。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按常規(guī)選擇用于分離編碼與人MPHOSPHl蛋白或 PRCl蛋白功能上等價(jià)的蛋白的DNA的雜交條件。短語(yǔ)"嚴(yán)格(雜交)條件" 指的是這樣的條件，在此條件下核酸分子會(huì)與其靶標(biāo)序列雜交，通常在核 酸的復(fù)雜混合物中，但不與其他序列發(fā)生可檢測(cè)的雜交。嚴(yán)格條件是依賴 序列的，在不同環(huán)境下會(huì)不同。比較長(zhǎng)的序列在較高的溫度特異性雜交。 3十核酸雜交的全面指導(dǎo)可在 Tijssen， rec/w/^w&s a"<i Afo/ecw/ar 外6n.^fea/fow wzY/z iVwc/e/c /Vo6es， "Overview of principles
of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)中4戈3'J 。 通常, 對(duì)于確定的離子強(qiáng)度pH下的特定序列而言，嚴(yán)格條件選擇為比其熱解鏈溫
度Om)低約5-10°C。
Tm是這樣的溫度，在該溫度下，達(dá)到平衡時(shí)，同靶點(diǎn)
互補(bǔ)的探針中有50%與靶標(biāo)序列雜交(由于靶標(biāo)序列過(guò)量存在，在Tm， 50% 的探針被占據(jù))(在確定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)。還可以通過(guò)加入去 穩(wěn)定劑(例如曱酰胺)達(dá)到嚴(yán)格條件。對(duì)于選擇性或特異性雜交，陽(yáng)性信號(hào)為 背景的至少兩倍，優(yōu)選為背景雜交的10倍。示例性的嚴(yán)格雜交條件可以如 下述地獲得在50。/。曱酰胺、5xSSC、 1% SDS中于42。C溫育，或者在5xSSC、 1%SDS中于65。C溫育，在0.2xSSC、 0.1% SDS中于50。C洗滌。
在本發(fā)明的語(yǔ)境中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按常規(guī)選擇用于分離編碼與人MPHOSPHl蛋白或PRC1蛋白功能上等價(jià)的蛋白的DNA的合適雜交條 件。例如雜交可通過(guò)如下方式進(jìn)行使用"Rapid-hyb緩沖液"(Amersham LIFE SC正NCE)于68。C進(jìn)行預(yù)雜交30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，加入標(biāo)記的探針，并在 68。C保溫1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。其后的洗滌步驟例如可以在低度嚴(yán)格條件下 進(jìn)行。示例的低度嚴(yán)格條件為包括，例如，42°C、 2xSSC、 0.1%SDS，或優(yōu) 選50。C、 2xSSC、 0.1% SDS。更優(yōu)選使用高嚴(yán)格條件。示例的高嚴(yán)格條件 可包括，例如，室溫下用2xSSC、 0.01。/。SDS洗滌3次，每次20分鐘，然 后于37。C用lxSSC、0.1%SDS洗滌3次，每次20分鐘，再于50。C用lxSSC、 0.1。/。SDS洗滌2次，每次20分鐘。然而，幾種因素，如溫度和鹽濃度會(huì)影 響雜交的嚴(yán)格度，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)選擇這些因素以獲得所需的嚴(yán)格 度。
可以采用基因擴(kuò)增法，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法代替雜交來(lái)分離編碼 與人MPH0SPH1蛋白或PRC1蛋白功能上等價(jià)的蛋白的DNA,所述基因擴(kuò) 增法使用基于編碼人MPH0SPH1蛋白或PRC1蛋白(SEQ ID NO:2或37)的 DNA的序列信息(SEQIDNO: 1, MPH0SPH1; SEQIDNO:36, PRC1)合成
的引物。
由通過(guò)上述雜交技術(shù)或基因擴(kuò)增技術(shù)分離的DNA編碼的、與人 MPH0SPH1蛋白或PRC1蛋白功能上等價(jià)的蛋白 一般與所述人MPHOSPH1 蛋白或PRC1蛋白的氨基酸序列具有高度同源性(又稱序列同一性)。"高度 同源性"(或稱"高度同一性")典型地指2個(gè)最適比對(duì)的序列(多肽或多核 苷酸序列中)之間的同一性程度。典型地，高度同源性或同一性是指同源性 為40%或更高，優(yōu)選為60%或更高，更優(yōu)選為80%或更高，更優(yōu)選為85%、 90%、 95%、 98%、 99%或更高。2個(gè)多肽序列或多核香酸序列之間的同源 性或同 一性程度可例如依照"Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30(1983)"中的算法確定。
可用于本發(fā)明語(yǔ)境中的蛋白可能在氨基酸序列、分子量、等電點(diǎn)、存 在或不存在糖鏈、或形式等方面有差異，這取決于用于產(chǎn)生所述蛋白的細(xì) 胞或宿主或者采用的純化方法。無(wú)論如何，只要該蛋白保留等價(jià)于相應(yīng)的 天然蛋白(MPH0SPH1 (SEQ ID NO: 1);或PRC1 (SEQ ID NO: 37))所具有的 結(jié)合活性，就可以用于本發(fā)明。
本發(fā)明還包括應(yīng)用MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白的部分肽。部分肽具有MPH0SPH1或PRC1的蛋白的特有的氨基酸序列，并由少于約400個(gè)、 通常少于約200個(gè)、經(jīng)常少于約100個(gè)，且至少約7個(gè)，優(yōu)選由約8個(gè)或 更多，更優(yōu)選由約9個(gè)或更多氨基酸組成。適用于本發(fā)明的篩選的 MPHOSPH1部分肽至少包含MPH0SPH1蛋白的PRC1結(jié)合位點(diǎn)；適用于 本發(fā)明的篩選的PRC1部分肽至少包含PRC1蛋白的MPHOSPH1結(jié)合位點(diǎn)。 短語(yǔ)MPH0SPH1蛋白或PRC1蛋白"功能等價(jià)物"也包括這樣的部分肽。
本發(fā)明人等揭示了 SEQIDNO:2的第1188~1465位和第1662~1718位 氨基酸殘基作為MPH0SPH1的PRC1結(jié)合區(qū)的功能。因此，要在本發(fā)明的 篩選中使用的MPHOSPH1部分肽至少應(yīng)包含SEQ ID NO: 2的第1188-1465 位或第1662 1718位氨基酸殘基。而且，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，用 于所述篩選方法的MPHOSPH1蛋白至少包含SEQ ID NO: 2的第1188 1718 位氨基酸殘基。
而且，在本發(fā)明的語(yǔ)境中，短語(yǔ)"M尸i/OSP//7基因"包括編碼 MPHOSPH1蛋白或MPHOSPH1蛋白的任何功能等價(jià)物的多核苷酸。相似 地，短語(yǔ)"尸AC7基因"包括編碼PRC1蛋白或PRC1蛋白的任何功能等價(jià) 物的多核苷酸。
在本發(fā)明的語(yǔ)境中，要用本發(fā)明的篩選方法鑒定的作用劑可以是任何 化合物和包含多種化合物的組合物。而且，根據(jù)本發(fā)明的篩選方法暴露于 細(xì)胞或蛋白質(zhì)的受試作用劑可以是單一化合物或者化合物的組合。當(dāng)本發(fā) 明中使用化合物的組合時(shí)，這些化合物可以依次或同時(shí)接觸。
在本發(fā)明的篩選方法中可以使用任何受試作用劑，例如細(xì)胞提取物、 細(xì)胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵微生物的產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化 或粗制蛋白、肽、非肽化合物、合成的微分子化合物(包括核酸構(gòu)建物、如 反義RNA、 siRNA、核酶等)以及天然化合物。本發(fā)明的受試作用劑還可以 使用本領(lǐng)域已知的多種組合文庫(kù)方法中的任一種獲得，所述方法包括(1) 生物學(xué)文庫(kù)，(2)空間可尋址平行固相或溶液相文庫(kù)(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), (3)需要去巻積(deconvolution) 的合成文庫(kù)法，(4)"一珠一化合物(one bead one compound)"文庫(kù)法，和(5)使 用親和層析選擇的合成文庫(kù)法。使用親和層析選擇的生物學(xué)文庫(kù)法僅限于 肽文庫(kù)，而其它四種方法適用于肽、非肽寡聚體或化合物小分子文庫(kù)(Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145)。合成分子文庫(kù)的方法的例子可見(jiàn)于本技術(shù)領(lǐng)域(DeWitt等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb等 人(1994)Proc.Nat1. Acad. Sci. USA, 1994, 91: 11422-6; Zuckermann等人J. Med. Chem. 37: 2678-85, 1994; Cho等人(1993) Science 261: 1303-5; Carell 等人(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell等人，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994， 33: 2061; Gallop等人，J. Med. Chem. 1994， 37: 1233-51)。 化合物文庫(kù)可存在于溶液中(參見(jiàn)Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21) 或珠子(Lam， Nature 1991, 354: 82-4)、芯片(Fodor, Nature 1993, 364: 555-6)、 細(xì)菌(美國(guó)專利5,223,409),孢子(美國(guó)專利5,571,698; 5,403,484和 5,223,409)、質(zhì)粒(Cull等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992， 89: 1865畫9)或噬菌 體(Scott and Smith Science 1990, 249: 386-90; Delvin Science 1990， 249: 404-6; Cwirla等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87: 6378-82; Felici J. Mol. Biol. 1990, 222: 301-10;美國(guó)專利申請(qǐng)2002103360)上。
何篩選方法篩選的化合物中的部分結(jié)構(gòu)進(jìn)行添加、缺失和/或取代而轉(zhuǎn)變而 成的化合物。
而且，當(dāng)被篩選的受試作用劑是蛋白時(shí)，為了獲得編碼該蛋白的DNA, 可以測(cè)定該蛋白的全氨基酸序列來(lái)推定編碼該蛋白的核酸序列，或者可以 分析所得蛋白的部分氨基酸序列、基于該序列制備寡聚DNA作為探針，使 用該探針對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，從而得到編碼該蛋白的DNA。所得DNA 確認(rèn)了在制備作為治療或預(yù)防癌癥的候選物的受試作用劑中的有用性。
在本說(shuō)明書描述的篩選方法中有用的受試作用劑可以是下述抗體，所 述抗體與MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白特異性結(jié)合，或者所述蛋白的喪失 了原蛋白體內(nèi)生物活性的部分肽特異性結(jié)合。例如，可以試驗(yàn)抗體(例如多 克隆抗體)抑制MPHOSPH1蛋白與PRC1蛋白的結(jié)合的能力。
本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)"抗體"是指具有特定結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白分子， 其僅與用于合成該抗體的抗原或該抗原的近緣抗原相互作用(即結(jié)合)。而 且，抗體可以是抗體片段或修飾的抗體，只要其結(jié)合M/WOS尸//7或尸7 C7 基因編碼的蛋白。例如，所述抗體片段可以是Fab、 F(ab，)2、 Fv或?qū)?lái)自H 鏈和L鏈的Fv片段通過(guò)合適的接頭連接而成的單鏈Fv (scFv) (Huston等人， ProcNatlAcadSci USA 1988， 85:5879-83)。更具體地，可以用酶如木瓜蛋 白酶或胃蛋白酶處理抗體以產(chǎn)生抗體片段。或者，可以構(gòu)建編碼抗體片段的基因，將其插入合適的表達(dá)載體，并在適合的宿主細(xì)胞中表達(dá)(參見(jiàn)例如
Co等人，J Immunol 1994, 152: 2968-76; Better and Horwitz， Methods Enzymol 1989, 178: 476-96; Pluckthun and Skerra， Methods Enzymol 1989, 178: 497-515; Lamoyi, Methods Enzymol 1986， 121: 652-63; Rousseaux等人,Methods Enzymol 1986, 121: 663-9; Bird and Walker, Trends Biotechnol 1991, 9: 132-7)。
抗體可以通過(guò)與各種分子如聚乙二醇(PEG)綴合來(lái)進(jìn)行修飾。這樣的修 飾抗體也可以用于本發(fā)明的語(yǔ)境中。可通過(guò)將抗體進(jìn)行化學(xué)修飾來(lái)獲得修 飾抗體。這些修飾方法是本領(lǐng)域常規(guī)的?；蛘?，本發(fā)明的抗體可以是嵌合 抗體或人源化抗體的形式，所述嵌合抗體具有源自非人抗體的可變區(qū)與源 自人抗體的恒定區(qū)，所述人源化抗體具有源自非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) 以及源自人抗體的框架區(qū)(FR)和恒定區(qū)。所述抗體可利用已知技術(shù)制備。人 源化可以通過(guò)下述方法進(jìn)行用嚙齒類的CDR序列取代人抗體的對(duì)應(yīng)序列 (Verhoeyen等人，Science 1988， 239:1534-6)。由此，這樣的人源化抗體是嵌
所取代。
除人框架區(qū)和恒定區(qū)外還包含人可變區(qū)的完整人抗體也是可以利用 的。這樣的抗體可利用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)制備。例如，體外方法包括 使用在噬菌體上展示的人抗體片段的重組文庫(kù)(例如，Hoogenboom & Winter, (1992) J. Mol. Biol. 227:381-8)。類似地，可通過(guò)將人免疫球蛋白基因座引入 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如內(nèi)源性免疫球蛋白基因已經(jīng)被部分或完全致失活的小鼠， 來(lái)制備人抗體。該方法描述于例如美國(guó)專利Nos. 6,150,584; 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5，661，016。
雖然受試作用劑文庫(kù)的構(gòu)建是本技術(shù)領(lǐng)域公知的，下文中還是提供了 有關(guān)受試作用劑鑒定以及用于本篩選方法的這些作用劑的文庫(kù)構(gòu)建的進(jìn)一 步指導(dǎo)。 (i)分子建才莫
對(duì)具有目標(biāo)性質(zhì)的化合物的分子結(jié)構(gòu)和/或?qū)Υ种瓢蟹肿蛹?MPHOSPH1和PRC1的分子結(jié)構(gòu)的知識(shí)，方便了受試作用劑文庫(kù)的構(gòu)建。 預(yù)篩選適于進(jìn)一步評(píng)估的受試作用劑的方法之一 ，是對(duì)受試作用劑與其靶 標(biāo)的相互作用進(jìn)行計(jì)算機(jī)建模。在本發(fā)明中，MPHOSPH1與PRC1相互作用的建模提供了對(duì)相互作用本身細(xì)節(jié)的認(rèn)識(shí)，并提示了干擾該相互作用的 可能策略，包括潛在的相互作用分子抑制劑。
計(jì)算機(jī)建模技術(shù)為所選分子的三維原子結(jié)構(gòu)的可視化以及與該分子相 互作用的新化合物的合理設(shè)計(jì)提供了可能。三維構(gòu)建典型地依賴于從所選
分子的x-射線晶體分析或NMR成像而來(lái)的數(shù)據(jù)。分子動(dòng)力學(xué)需要力場(chǎng)數(shù) 據(jù)。計(jì)算機(jī)圖形系統(tǒng)為預(yù)測(cè)新化合物如何連接靶分子，以及實(shí)驗(yàn)操作化合 物和靶分子的結(jié)構(gòu)以優(yōu)化結(jié)合特異性提供了可能。為了預(yù)測(cè)當(dāng)分子和化合 物之一或二者中產(chǎn)生細(xì)小改變時(shí)分子-化合物相互作用是什么樣的，需要分 子力學(xué)軟件和計(jì)算密集型計(jì)算機(jī)，它們通常關(guān)聯(lián)著分子設(shè)計(jì)程序和用戶之 間的用戶友好的、菜單驅(qū)動(dòng)的界面。
上文一般性描述的分子建模系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例包括CHARMm和 QUANTA程序，Polygen Corporation, Waltham, Mass。 CHARMm 4丸行能量最 小化和分子動(dòng)力學(xué)功能。QUANTA執(zhí)行構(gòu)建、圖形建模和分子結(jié)構(gòu)分析。 QUANTA可幫助進(jìn)行分子相互行為的分析、可視化、修飾和相互作用性構(gòu) 建。
大量文獻(xiàn)綜述了與特定蛋白質(zhì)相互作用的藥物的計(jì)算機(jī)建模，例如 Rotivinen, a/.爿cto /Vzamwcewf/ca Fe"m'ca 97, 159-166 (1988); Ripka, iVew Sc/ew"M 54-57 (Jun. 16、 1988); McKinlay and Rossmann, ^www. Aev. /V2armoc0/. 7b:d"'o/. 29 , 111-122 (1989); Perry and Davies , Prog Clin Biol Res.291:189-93(1989); Lewis and Dean,i . 5bc.丄om/5所o/ 236, 125-40和141-62 (1989);以及關(guān)于核酸組分的4莫型受體，有Askew, da/., /力m. C7ze肌5bc. Ill, 1082-卯(1989)。
其他篩選和圖形描述化學(xué)物質(zhì)的計(jì)算沖幾程序可以例如BioDesign Inc.， Pasadena, Calif" Allelix Inc., Mississauga, Ontario, Canada禾口 Hypercube Inc., Cambridge, Ontario等公司獲得。見(jiàn)例如DesJarlais "a/. (1988) J. Med. Chem. 31:722-9; Meng & a/. (1992) J. Computer Chem. 13:505-24; Meng " a/. (1993) Proteins 17:266-78; Shoichet a/. (1993) Science 259:1445-50。
一旦鑒定了 MPHOSPH1/PRC1相互作用的假定抑制劑，就可以根據(jù)已 鑒定的假定抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)使用組合化學(xué)技術(shù)構(gòu)建任何數(shù)目的變體，如 下文所述。對(duì)于最終的假定抑制劑或"受試作用劑"文庫(kù)可使用本發(fā)明的方法 進(jìn)行篩選，以鑒定該文庫(kù)中破壞MPHOSPHl/PRCl結(jié)合的受試作用劑。(ii)組合化學(xué)合成
受試作用劑的組合文庫(kù)可作為合理藥物設(shè)計(jì)程序的 一部分而產(chǎn)生，該 程序涉及了對(duì)于在已知MPHOSPH1/PRC1相互作用抑制劑中存在的核心結(jié) 構(gòu)的知識(shí)。這種方法使文庫(kù)保持合理的大小，便于高通量篩選?；蛘呖赏?過(guò)筒單合成組成該庫(kù)的分子家族的全部排列構(gòu)建簡(jiǎn)單的，特別是短的聚合 物分子文庫(kù)。后一種方法的實(shí)例是由所有長(zhǎng)度為6個(gè)氨基酸的肽組成的文 庫(kù)。這種肽文庫(kù)可包括每一個(gè)6氨基酸序列排列。這種類型的文庫(kù)稱作線 性組合化學(xué)文庫(kù)。
組合化學(xué)文庫(kù)的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，并可通過(guò)化學(xué)或生 物合成產(chǎn)生。組合化學(xué)庫(kù)包括，但不限于肽文庫(kù)(見(jiàn)例如美國(guó)專利5,010,175， Furka， /尸ra/. 37:487-93 (199l)和Houghten ef a/., TV^we 354:84-6(1991))。也可以采用其他用于產(chǎn)生化學(xué)多樣性庫(kù)的化學(xué)。這類化學(xué) 包括，但不僅限于肽(例如PCT公開(kāi)第WO 91/19735號(hào))，被編碼的肽(例 如WO 93/20242),隨機(jī)生物寡聚體(例如WO 92/00091)，苯并二氮卓 (benzodiazepine)(例如美國(guó)專利第5,288，514號(hào))，diversomers如乙內(nèi)酰脲類 (hydantoins)， 苯并二氮卓類(benzodiazepines)和二肽(dipeptides) (DeWitt d a/.,尸rac.扁.Jc^/. 5W.園90:6909-13 (1993)),插蜂(vinylogous)多肽 (Hagihara " a/, / CTzew. 114:6568-70 (1992))，具有葡萄糖骨架的
非肽性肽才莫擬物(Hirschmann da/.， J! CTzem. Soc. 114:9217-8 (1992)),
小化合物文庫(kù)的類似有機(jī)合成(Chen a/.， / ^證Oz昆116:2661 (1994))，寡聚氨基曱酸酯(oligocarbamates) (Cho " a/. ， 5We"ce 261:1303 (1993))，和/或肽基膦酸鹽或酉旨(peptidylphosphonate) (Campbell W a/. ， /Og. CTzem. 59:658 (1994))，核酸文庫(kù)(見(jiàn)Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement; Sambrook et al" Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989， Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA),肽核酸文庫(kù) (見(jiàn)例如美國(guó)專利5,539,083)，抗體文庫(kù)(見(jiàn)例如Vaughan d a/. ， A^ww B/ofec/z"o/ogy, 14(3):309-14 (1996)和PCT/US96/10287)，糖文庫(kù)(見(jiàn)例如Liang efa/.、 5W置e， 274:1520-2 (1996)和美國(guó)專利5,593,853),小有機(jī)分子庫(kù)(見(jiàn) 例如，苯并二氮卓，Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6):624-31.;類異戊二烯，美國(guó)專利5,569,588;噻嗪烷酮類(thiazanones)和間 噻。秦烷酮類(metathiazanones),美國(guó)專利5,549,974;吡咯烷類，美國(guó)專利5,525,735和5，519，134;嗎啉代化合物，美國(guó)專利5,506,337;苯并二氮卓、
5,288,514等)。
(iii)噬菌體展示
另一種方法使用重組噬菌體產(chǎn)生文庫(kù)。使用"噬菌體方法"(Scott and Smith, 5We腳1990 249:386-90; Cwirla, W a/,尸rac.腺/. ^cad 5W, 1990, 87:6378-82; Devlin ^,5We"ce， 1990， 249:404-6)可以構(gòu)建非常大的文庫(kù)(例 如106 -108個(gè)化學(xué)實(shí)體)。另一種方法主要使用化學(xué)方法，其實(shí)例是Geysen 》'去(Geysen ef a/,, A/o/ecM/or /m附wwo/ogv 1986， 23:709-15; Geysen d a/. / /mmw"o/og/c MeAoof 1987, 102:259-74)和Fodor等人的方法(5Wewce 1991 251:767-73)。 Furka等(第14屆國(guó)際生物化學(xué)會(huì)議，第5巻，摘要FR:013、 1988; Furka, /"f. /尸e/ "A尸rafe/" i 仏1991 37:487-493), Houghten (美國(guó)專 利No. 4，631,211)和Rutter等(美國(guó)專利No. 5，010,175)描述了產(chǎn)生能夠作為激 動(dòng)劑或拮抗劑加以測(cè)試的肽混合物的方法。
制備組合文庫(kù)的設(shè)備可以商業(yè)獲得(見(jiàn)例如357 MPS、 390 MPS、 Advanced Chem Tech, Louisville KY， Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433AAppliedBiosystems， Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA)。此外，大量組合文庫(kù)本身也可商業(yè)獲得(見(jiàn)例如ComGenex， Princeton, N丄，Tripos, Inc., St. Louis， MO, 3D Pharmaceuticals, Exton， PA， Martek Biosciences, Columbia, MD， 等)。
本發(fā)明提供抑制MPHOSPH1與PRC1之間的結(jié)合的作用劑的篩選方 法。抑制MPHOSPH1與PRC1之間的結(jié)合的作用劑可望抑制膀胱癌細(xì)胞的 增殖，從而可用于膀胱癌的治療或預(yù)防。因此，本發(fā)明還提供抑制膀胱癌 細(xì)胞增殖的化合物的篩選方法和用于膀胱癌的治療或預(yù)防的作用劑的篩選 方法。
更具體地，該方法包括以下步驟。
(a) 在作用劑的存在下使MPHOSPHl蛋白質(zhì)與PRC1蛋白質(zhì)接觸；
(b) 檢測(cè)MPHOSPH1與PRC1蛋白質(zhì)間的結(jié)合水平；
(c) 將MPHOSPHl與PRC1蛋白質(zhì)間的結(jié)合水平與不存在所述作用劑 的條件下檢測(cè)到的水平相比較；(d)選擇降低MPHOSPHl和PRC1蛋白質(zhì)的結(jié)合水平的作用劑作為抑 制MPHOSPHl和PRCl蛋白質(zhì)的結(jié)合的作用劑，即可用于抑制膀胱癌細(xì)胞 增殖和治療或預(yù)防膀胱癌的作用劑。
在本發(fā)明的說(shuō)明書中，對(duì)兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的"結(jié)合(的)抑制"是指至少 降低所述蛋白質(zhì)間的結(jié)合。因此，在有些情況下，樣品的結(jié)合對(duì)的比例與 合適的對(duì)照(即未經(jīng)受試作用劑處理的、或來(lái)源于非癌樣品的、或來(lái)源于癌 樣品的)相比較減少。與對(duì)照樣品中的結(jié)合對(duì)相比，發(fā)生結(jié)合的蛋白質(zhì)的量 的減少可以為90%、 80%、 70%、 60%、 50%、 40%、 25%、 10%、 5°/。、 1% 或其以下(即0%)。
在本說(shuō)明書中，MPHOSPHl蛋白質(zhì)和PRCl蛋白質(zhì)包括前述蛋白質(zhì)的 功能等價(jià)物。用于篩選的MPHOSPHl或PRCl蛋白質(zhì)或者它們的功能等價(jià) 物可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員7>知的方法以重組蛋白或天然蛋白的形式來(lái)制 備。這些蛋白可以采用任何公知的用于產(chǎn)生多肽的基因工程方法來(lái)獲得(例 ^口， Morrison J.， J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark畫Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (Wu等人編)1983, 101: 347-62)。例如，可通過(guò)下述 方法制備重組蛋白將編碼該蛋白的DNA (例如具有SEQ ID NO: 1或36的 核苷酸序列的DNA)插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，將載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，獲 得提取物，然后對(duì)提取物進(jìn)行層析以純化多肽，所述層析例如離子交換層 析、反相層析、凝膠過(guò)濾或利用固定了針對(duì)本發(fā)明蛋白的抗體的層析柱的 親和層析，或上述多于一種柱子的組合。
此外，當(dāng)在宿主細(xì)胞(例如動(dòng)物細(xì)胞和大腸桿菌)中將可用于本發(fā)明語(yǔ)境 中的蛋白表達(dá)成與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶蛋白的融合蛋白或添加多個(gè)組氨酸的 重組蛋白時(shí)，可以使用谷胱甘肽柱或鎳柱來(lái)純化所表達(dá)的重組蛋白。
純化融合蛋白之后，通過(guò)用凝血酶(thrombin)或因子X(jué)a切割融合蛋白 來(lái)除去目的多肽之外的區(qū)域也是可能的。
可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法分離出天然蛋白，例如使結(jié)合有 可與前述的MPHOSPHl或PRCl蛋白結(jié)合的抗體的親和柱與表達(dá)所述蛋白 的組織或細(xì)胞的提取物接觸。所述抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體， 也可以是任何修飾抗體，只要其與MPHOSPHl或PRCl蛋白結(jié)合。
MPHOSPHl或PRCl蛋白或者它們的功能等價(jià)物也可以采用體外翻譯 系統(tǒng)在體外產(chǎn)生。而且，MPHOSPH1蛋白和PRC1蛋白的部分肽也可以用于本發(fā)明，只 要它們保持相互結(jié)合的活性。通過(guò)基因工程、已知的肽合成法或用適當(dāng)?shù)?肽酶消化天然的MPHOSPH1蛋白和PRC1蛋白，均可以產(chǎn)生所述部分肽。 例如，肽合成可以采取固相合成或液相合成?？捎糜诤铣傻某Ｒ?guī)肽合成法 包括
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可進(jìn)一步將多肽或其片段與其他物質(zhì)連接，只要多肽和片段保留其本 身相互結(jié)合的能力。可用的物質(zhì)包括肽、脂質(zhì)、糖和糖鏈、乙?；?、天 然和合成的多聚物等?？梢赃M(jìn)行這些種類的修飾來(lái)賦予額外的功能或穩(wěn)定 多肽和片段。
要與受試作用劑接觸的MPHOSPH1及PRC1多肽或它們的功能等價(jià)物 可以是例如純化多肽、可溶性蛋白、或者與其它多肽相融合的融合蛋白。
本發(fā)明的篩選方法可高效而快速地鑒定針對(duì)具有較高的干擾 MPHOSPH1與其結(jié)合配偶體PRC1之間結(jié)合的可能性的受試作用劑。 一般 地，任何確定受試作用劑干擾MPHOSPHl與PRC1的結(jié)合的能力的方法均 適用于本發(fā)明。例如，可以采用ELISA樣式的竟?fàn)幮院头蔷範(fàn)幮砸种茰y(cè)定。 應(yīng)當(dāng)進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)以確定系統(tǒng)的最大結(jié)合能力(例如，使已結(jié)合的 MPHOSPH1與PRC1接觸，并確定結(jié)合于MPHOSPH1的PRC1的量)。
作為鑒定抑制本發(fā)明的結(jié)合的作用劑的方法，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人 員公知的多種方法。這樣的鑒定可以作為體外測(cè)定系統(tǒng)，如在細(xì)胞系統(tǒng)中 進(jìn)行。更具體地，首先使MPHOSPHl蛋白或其結(jié)合配偶體PRC1結(jié)合在支 持物上，然后將另一種蛋白同受試作用劑一起添加。然后，對(duì)該混合物進(jìn) 行溫育并清洗，再對(duì)結(jié)合在支持物上的另一種蛋白進(jìn)行檢測(cè)和/或測(cè)定。可用于結(jié)合蛋白的支持物(support)的實(shí)例包括例如不溶性多糖，如瓊脂 糖、纖維素和葡聚糖；及合成樹(shù)脂，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；可優(yōu) 選使用由上述材料制備的商業(yè)上可得到的珠子和板(例如多孔板，生物傳感 器芯片等)。使用珠子時(shí)，可以將它們填入柱子?；蛘撸胖榈氖褂靡彩潜?技術(shù)領(lǐng)域公知的，該方法可以借助磁力容易地將結(jié)合在珠子上的蛋白分離 出來(lái)。
蛋白質(zhì)與支持物的結(jié)合可根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行，這些方法例如化學(xué)結(jié)合 或物理吸附?；蛘?，蛋白質(zhì)可通過(guò)特異性識(shí)別它的抗體而與支持物結(jié)合。 此外，還可以利用相互作用性的多種分子，如抗生物素蛋白和生物素的組 合來(lái)進(jìn)行多肽與支持物的結(jié)合。
蛋白間的結(jié)合可以在緩沖液中進(jìn)行，緩沖液的例子包括但不限于磷酸 緩沖液和Tris緩沖液，只要緩沖液不抑制蛋白間的結(jié)合即可。
在本發(fā)明中，可以將利用表面等離子體共振現(xiàn)象(surface plasmon r6son肌C6 phenomenon)的生物傳感器(biosensor)用作對(duì)結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)4亍檢 測(cè)或定量的手段。當(dāng)使用這類生物傳感器時(shí)，只使用極少量的多肽且不需 標(biāo)記，即可實(shí)時(shí)觀察表現(xiàn)為表面等離子體共振信號(hào)的蛋白質(zhì)之間的相互作 用(例如BIAcore， Pharmacia)。因此，可以使用生物傳感器諸如BIAcore來(lái) 評(píng)價(jià)MPHOSPH1和PRC1之間的結(jié)合。
或者，還可以對(duì)MPHOSPHl或PRC1中的任一種進(jìn)行標(biāo)記，利用結(jié)合 的蛋白的標(biāo)記來(lái)檢測(cè)或測(cè)定結(jié)合的蛋白。具體地，預(yù)先對(duì)蛋白中的一種進(jìn) 行標(biāo)記，然后在受試作用劑的存在下使標(biāo)記的蛋白與另一種蛋白接觸，并 且在進(jìn)行了洗滌后根據(jù)標(biāo)記來(lái)檢測(cè)或測(cè)定結(jié)合的蛋白。
本發(fā)明方法中用于標(biāo)記蛋白質(zhì)的標(biāo)記物質(zhì)可以使用放射性同位素(例如 3H、 14C、 32P、 33P、 35S、 125I、 131I)、酶(例如堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、 卩-半乳糖苷酶、|3-葡糖苷酶)、熒光物質(zhì)(例如異硫氰酸熒光素(FITC)、熒光 素、德克薩斯紅、綠色熒光蛋白和羅丹明)、磁珠(例如DYNABEADSTM)、 量熱標(biāo)記物(如膠體金或者有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等) 制的珠子)、以及生物素/抗生物素蛋白。教導(dǎo)這樣的標(biāo)記的使用的專利包括 美國(guó)專利3,817,837; 3，850，752; 3,939,350; 3,996,345; 4,275，149;和4,366,241。 但是，本發(fā)明并不限于此，任何可采用分光學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫 化學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)方法檢出的標(biāo)記均可以使用。當(dāng)使用放射性同位素標(biāo)記蛋白時(shí)，可以通過(guò)液體閃爍來(lái)進(jìn)行檢測(cè)或測(cè)定?；蛘?，對(duì)于酶標(biāo)記的蛋白可以這樣;險(xiǎn)測(cè)或測(cè)定添加酶的底物，使用 吸光光度計(jì)(absorptiometer)來(lái)檢測(cè)底物的酶促變化如顯色等。而且，當(dāng)使用 熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物時(shí)，可以使用熒光光度計(jì)來(lái)^r測(cè)或測(cè)定結(jié)合的蛋白。而且，本發(fā)明篩選方法中的結(jié)合，可以使用針對(duì)MPHOSPHl或PRC 1 的抗體來(lái)進(jìn)行檢測(cè)或測(cè)定。例如，在使固定在支持物上的MPHOSPHl與受 試化合物和PRC1接觸后，對(duì)該混合物進(jìn)行溫育并清洗，然后可以使用針對(duì) PRC1的抗體進(jìn)行檢測(cè)或測(cè)定?；蛘撸梢詫RC1固定在支持物上，并可 4吏用針對(duì)MPHOSPHl的抗體作為抗體。當(dāng)在本發(fā)明的篩選中使用抗體時(shí)，優(yōu)選將抗體用上述標(biāo)記物質(zhì)中的任 一種進(jìn)行標(biāo)記，并基于標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)或測(cè)定?；蛘?，可以使用針對(duì) MPHOSPHl或PRC1的抗體作為第一抗體，通過(guò)用標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的第二抗 體對(duì)該第一抗體進(jìn)行檢測(cè)。而且，本發(fā)明的篩選中，與蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體 可以使用蛋白G或蛋白A柱來(lái)進(jìn)行才企測(cè)或測(cè)定?；蛘?，在本發(fā)明的鑒定方法的另一實(shí)施方案中，可以使用利用細(xì)胞的 雙雜交系統(tǒng)(two-hybrid system) ("MATCHMAKER雙雜交系統(tǒng)"、"哺乳動(dòng)物 MATCHMAKER雙雜交測(cè)定試劑盒"、"MATCHMAKER單雜交系統(tǒng)" (Clontech); "HybriZAP雙雜交載體系統(tǒng)"(Stratagene);參照"Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612(1992)，，， "Fields and Sternglanz， Trends Genet 10: 286-92(1994)")。在雙雜交系統(tǒng)中，例如，將MPHOSPHl與SRF-結(jié)合區(qū)或 GAL4-結(jié)合區(qū)融合，并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。將PRCl與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄 活化區(qū)域(transcriptional activation region)融合?；蛘?，可將PRClSRF-結(jié)合 區(qū)或GAL4-結(jié)合區(qū)融合，而將MPHOSPHl與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄活化區(qū)融 合。當(dāng)受試作用劑不抑制MPHOSPHl與PRCl的結(jié)合時(shí)，這兩者的結(jié)合激 活報(bào)道基因，使得陽(yáng)性克隆能夠被檢出。就報(bào)道基因而言，除HIS3基因外， 還可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。在本說(shuō)明書中，MPHOSPHl與PRC1之間的結(jié)合水平也可以作為 MPHOSPHl與PRCl結(jié)合后發(fā)生的任何變化來(lái)加以測(cè)定。具體地，這樣的 篩選可以通過(guò)使受試作用劑與表達(dá)MPHOSPHl與PRCl的細(xì)胞(諸如J82或 UNUC細(xì)胞)接觸來(lái)進(jìn)行。例如，可以檢測(cè)細(xì)胞增殖的抑制來(lái)確定受試作用 劑在MPHOSPHl與PRCl的結(jié)合中的影響。1. 竟?fàn)幮詼y(cè)定樣式竟?fàn)幮詼y(cè)定可用于篩選本發(fā)明的受試作用劑。作為實(shí)例，竟?fàn)幮訣LISA 樣式可以包括與固體支持物結(jié)合的MPHOSPHl (或PRC1)。可將結(jié)合的 MPHOSPHl (或PRCl)與PRCl (或MPHOSPHl)及受試作用劑共溫育。經(jīng)過(guò) 足夠的時(shí)間以容許受試作用劑和/或PRCl (或MPHOSPHl)結(jié)合MPHOSPHl (或PRC1)后，可清洗底物以除去未結(jié)合材料。然后確定與MPHOSPHl結(jié) 合的PRC1的量。這可以用本領(lǐng)域已知的多種方法中的任何一種來(lái)實(shí)現(xiàn)，例 如使用帶有可檢測(cè)標(biāo)記物作為標(biāo)簽的PRCl (或MPHOSPHl)種類，或者使 經(jīng)過(guò)清洗的底物與標(biāo)記的抗PRCl (或MPHOSPHl)抗體接觸。與 MPHOSPHl (或PRC1)結(jié)合的PRC1 (或MPHOSPHl)的量將與受試作用劑干 擾MPHOSPHl對(duì)PRC1的結(jié)合的能力成反比。關(guān)于蛋白質(zhì)——包括但不僅限于抗體--的標(biāo)記，如下面的文獻(xiàn)所記載Harlow & Lane, Antibodies,A Laboratory Manual (1988)。在一種變化形式中，用親和標(biāo)簽標(biāo)記MPHOSPHl (或PRC1)。然后，將 標(biāo)記的MPHOSPHl (或PRC1)與受試作用劑和PRC1 (或MPHOSPHl)—起溫 育，然后進(jìn)行免疫沉淀。然后用抗PRC1 (或MPHOSPHl)抗體對(duì)免疫沉淀 物進(jìn)行Western印跡。與前面的竟?fàn)幮詼y(cè)定樣式一樣，被發(fā)現(xiàn)與MPHOSPHl (或PRCl)結(jié)合的PRCl (或MPHOSPHl)的量與受試作用劑干擾PRCl與 MPHOSPHl結(jié)合的能力成反比。2. 非竟?fàn)帨y(cè)定形式對(duì)于構(gòu)建樣式不適于直接利用竟?fàn)幮詼y(cè)定加以篩選的受試作用劑文庫(kù) (如本文所述的那些)而言，非竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定作為初始篩選可能也是有用 的。上述文庫(kù)的實(shí)例是噬菌體展示文庫(kù)(見(jiàn)例如Barret， " a/. (1992) Anal, Biochem204， 357-364)。噬菌體文庫(kù)有用之處在于能夠快速產(chǎn)生可工作量的很多種不同重組 肽。噬菌體文庫(kù)不適于本發(fā)明的竟?fàn)幮詼y(cè)定，但是可以以非竟?fàn)帢邮礁咝?地進(jìn)行篩選，確定何種重組肽受試作用劑結(jié)合MPHOSPHl或PRCl。然后 可以制備已鑒定為結(jié)合性的受試作用劑，并用竟?fàn)幮詼y(cè)定樣式加以篩選。 噬菌體和細(xì)胞展示文庫(kù)的產(chǎn)生和篩選在本領(lǐng)域是公知的，在例如如下文獻(xiàn) 中有討論Ladner " a/.， WO 88/06630; Fuchs " a/. (1991) Biotechnology" a/. (1993) TIBS 18:136-40; Charbit W a/. (1986) EMBO J 5， 3029-37; Cull "a/. (1992) PNAS USA 89:1865-9; Cwirla, "a/. (19卯)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87， 6378-82。示例性的非竟?fàn)幮詼y(cè)定遵循與上述竟?fàn)幮詼y(cè)定相似的程序，只是不添 加其中一種組分(MPHOSPHl或PRC1)。然而，由于非竟?fàn)帢邮酱_定的是受 試作用劑對(duì)MPHOSPH1或PRC1的結(jié)合，需要對(duì)于每個(gè)候選物確定受試作 用劑結(jié)合MPHOSPHl和PRC1 二者的能力。因此，例如，可通過(guò)下列步驟 確定受試作用劑與固定化的MPHOSPHl的結(jié)合清洗掉未結(jié)合的受試作用 劑；從支持物洗脫結(jié)合的受試作用劑，隨后通過(guò)例如質(zhì)譜，蛋白測(cè)定(Bradford 或Lowry測(cè)定，或280nm吸光度測(cè)定)對(duì)洗脫物進(jìn)行分析?；蛘呖梢允÷韵?脫步驟，通過(guò)監(jiān)測(cè)支持物表面上有機(jī)層光語(yǔ)學(xué)性質(zhì)的變化確定受試作用劑 的結(jié)合。監(jiān)測(cè)表面光譜學(xué)性質(zhì)的方法包括，但不限于吸光度、反射率、透 光度、雙折射、折光率、衍射、表面等離子體共振、橢圓偏振測(cè)量、共振 鏡(resonantmirror)技術(shù)、光柵耦合波導(dǎo)^t支術(shù)和多極共振光譜，所有這些對(duì)于 本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。在測(cè)定中還可使用標(biāo)記的受試作用劑，從 而省去洗脫步驟。在這種情況下，洗去未結(jié)合材料后與支持物結(jié)合的標(biāo)記 的量與受試作用劑的結(jié)合成正比。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了大量公知的機(jī)器人系統(tǒng)，用于溶液相化學(xué)。這些系統(tǒng)包括成裝置，以及許多利用機(jī)器手的機(jī)器人系統(tǒng)(Zymate II、 Zymark公司、 Hopkinton, Mass.; Orca， Hewlett Packard, Palo Alto, Calif,)，它們才莫擬化 學(xué)技術(shù)人員的手工合成操作。上面的任何一種設(shè)備均適合于利用本發(fā)明。 為使其能夠如本文所述地工作而對(duì)這些設(shè)備所作的修改(如果有的話)的性 質(zhì)和實(shí)施，對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。此外，大量的組 合文庫(kù)本身可以商業(yè)獲得(見(jiàn)例如ComGenex， Princeton、 N.J., Asinex, Moscow, Ru， Tripos, Inc., St. Louis, MO、 ChemStar， Ltd， Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton， PA， Martek Biosciences, Columbia, MD，等)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本篩選方法所必需的組分可以作為試劑盒來(lái) 提供，用于篩選抑制MPHOSPH1與PRC1的結(jié)合的作用劑、抑制膀胱癌細(xì) 胞增殖的作用劑、或者用于膀胱癌的治療或預(yù)防的作用劑。本發(fā)明的試劑 盒可以包含，例如，MPHOSPH1多肽或其功能等價(jià)物和/或PRC1多肽或其功能等價(jià)物。而且，本試劑盒還可以包含對(duì)照試劑(陽(yáng)性和/或陰性)、可檢 測(cè)標(biāo)記物、細(xì)胞培養(yǎng)基或緩沖液、篩選所必需的容器、用于實(shí)施本方法的說(shuō)明書(例如書面文件、磁帶、VCR、 CD-ROM、其它)等等。組分和試劑可 以分別包裝在不同的容器中。通過(guò)本發(fā)明的任何方法分離得到的作用劑，可以作為藥物施用，或者 可以用于制備藥物(治療性或預(yù)防性)組合物，用于人及其它哺乳動(dòng)物如小 鼠、大鼠、豚鼠(guinea-pig)、兔、貓、狗、綿羊、豬、牛、猴、狒狒(baboon) 和黑猩猩(chimpanzee))來(lái)治療或預(yù)防膀胱癌。本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)"預(yù)防"是指為了延緩或抑制腫瘤的形成、或者延 緩、抑制或減輕癌癥的至少一種臨床癥狀，而預(yù)防性地施用作用劑。對(duì)受 試者中胂瘤狀態(tài)的評(píng)價(jià)可以采用標(biāo)準(zhǔn)臨床規(guī)程來(lái)進(jìn)行。預(yù)防性施用可以在 顯現(xiàn)明顯的疾病的臨床癥狀之前進(jìn)行，以預(yù)防疾病或疾患和/或延遲它的進(jìn) 展。在本發(fā)明的語(yǔ)境中，"預(yù)防"包括減少疾病的死亡率或罹患率負(fù)擔(dān)的 一切活動(dòng)。預(yù)防可以在初級(jí)、次級(jí)或三級(jí)預(yù)防水平上進(jìn)行。初級(jí)預(yù)防避免 疾病的發(fā)生(development),而次級(jí)和三級(jí)預(yù)防水平包括以防止疾病進(jìn)展和癥 狀出現(xiàn)為目的的活動(dòng)，還包括以通過(guò)恢復(fù)功能和減少疾病相關(guān)的并發(fā)癥來(lái) 減少既發(fā)疾病的負(fù)面影響為目的的活動(dòng)。本發(fā)明包括多種多樣的以減輕癌 癥特別是膀胱癌的嚴(yán)重程度為目的的預(yù)防療法。分離的作用劑可以直接給藥，或者可以利用已知的藥物制備方法配制 成劑型。藥物制劑可包括適于口服、直腸、鼻、局部(包括頰或舌下)、陰道 或非消化道(包括肌內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi))施用的制劑，以及適于通過(guò)吸入或吹 入(insufflation)施用的制劑。例如，4艮據(jù)需要，作用劑可以作為糖衣片劑、 膠嚢劑、酏劑和微膠嚢口服施用；或者用水或任何其它藥學(xué)可接受的液體 配制成無(wú)菌溶液或懸浮液，以注射劑的形式非口服施用。例如，可以將作 用劑與藥理學(xué)可接受的載體或介質(zhì) 一起混合成通常接受的藥物配制方式 (drug implementation)所要求的單位劑型，所述載體或介質(zhì)具體為無(wú)菌水、 生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑、賦 形劑(excipient)、溶媒(vehicle)、防腐劑、粘合劑等。這些制劑中活性成分的 量構(gòu)成(make)可獲得的指定范圍內(nèi)的合適劑量。能夠混合到片劑和膠嚢中的添加劑的例子有粘合劑如明膠、玉米淀 粉、黃蓍膠(tragacanthgum)和阿拉伯膠；賦形劑例如結(jié)晶纖維素；溶脹劑例如玉米淀粉、明膠和海藻酸(alginic acid);潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂；增甜劑例 如蔗4唐、乳4唐或并唐4青；調(diào)p未劑例長(zhǎng)口薄荷(peppermint)、 Gaw/Aen'a at/e"of/zn'x 油和櫻桃。當(dāng)單位劑型為膠嚢劑時(shí)，上述成分中還可以包括液體載體，例 如油。注射用無(wú)菌組合物可以使用溶媒例如注射用蒸餾水按照標(biāo)準(zhǔn)的藥物 配制方式進(jìn)行配制。生理鹽水、葡萄糖以及包含輔料(adjuvants)如D-山梨醇、D-甘露糖、 D-甘露醇和氯化鈉的其它等滲液體，可用作注射用水溶液。這些可以與合 適的增溶劑組合使用，所述增溶劑例如醇，特別是乙醇、多元醇例如丙二 醇和聚乙二醇，非離子表面活性劑，例如Polysorbate 80 (TM)和HCO-50。芝麻油或大豆油可以作為油質(zhì)液體使用，并且可以與苯曱酸千酯或苯 曱醇組合使用作為增溶劑，還可與緩沖劑，如磷酸鹽緩沖劑和乙酸鈉緩沖 劑；鎮(zhèn)痛劑，如鹽酸普魯卡因；穩(wěn)定劑，如苯曱醇、苯酚；以及抗氧化劑 一起配制。制備好的注射劑可以裝入到合適的安瓿(ampoule)中。適于口服施用的藥物制劑可便宜地作為離散單位提供，所述離散單位 例如膠嚢劑、扁嚢劑(cachet)或片劑，每個(gè)單位含有預(yù)定量的活性成分； 作為粉末或顆粒；或作為溶液，懸浮液或作為乳液?；钚猿煞诌€可以以大 丸劑(bolus)、藥糖劑(electuary)或糊劑(paste)的形式提供，以及純的形式，即 沒(méi)有載體。用于口服給藥的片劑和膠嚢劑可含有常規(guī)賦形劑諸如結(jié)合劑、 填充劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑或濕潤(rùn)劑。片劑可通過(guò)壓縮或模制來(lái)制備，其中 任選含有一種或多種配方成分。壓縮片劑可通過(guò)如下方法制備將活性成 分以自由流動(dòng)的形式(如粉末或顆粒)任選地與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、 潤(rùn)滑劑、表面活性劑或分散劑混合，并在適當(dāng)?shù)臋C(jī)器中進(jìn)行壓縮。模制片 劑可通過(guò)如下方法制備在適當(dāng)?shù)臋C(jī)器中對(duì)利用惰性液體稀釋劑濕潤(rùn)過(guò)的 粉末化合物的混合物進(jìn)行模制。所述片劑可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行包 覆(coated)。 口服液體制備物可以是例如水性或油性的懸濁液、溶液、乳液、 糖漿或酏劑的形式，或者也可以作為干燥產(chǎn)物提供，以便在使用前用水或 其它適宜溶媒加以構(gòu)成。所述液體制備物可含有常規(guī)添加劑諸如懸浮劑， 乳化劑，非水性溶媒(可包括食用油)或防腐劑。片劑可任選地配制以提供其 中活性成分的緩釋或控釋。供非消化道施用的制劑包括水性和非水性的無(wú)菌注射溶液，其可含有 抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑(bacteriostat)和使得制劑與目標(biāo)受者的血液等張(isotonic)的溶質(zhì)；以及水性和非水性的無(wú)菌懸浮液，其可含有懸浮劑和增稠 劑。所述制劑可以以單位劑量或多劑量容器提供，例如密封的安瓿和小瓶； 還可以在冷凍-干燥(凍干的)條件下保存，這樣僅需要在即將使用前添加無(wú) 菌液體載體例如鹽水、注射用水?；蛘撸商峁┧鲋苿┯糜谶B續(xù)輸注 (continuous infUsion)?？捎汕笆龅臒o(wú)菌粉末、顆粒及片劑的類型制備即配即 用的注射溶液和懸浮液。適于直腸給藥的制劑可提供為含有常用載體如可可脂或聚乙二醇的栓 劑(suppository)。用于口內(nèi)局部給藥，例如頰(buccal)或舌下給藥的制劑包括 錠劑(lozenge)和軟錠劑(pastille),其中錠劑在調(diào)味基質(zhì)，如蔗糖和阿拉伯膠 (acacia)或黃蓍膠中包含活性成分，而軟錠劑在基質(zhì)，如明膠和甘油或蔗糖 和阿拉伯膠中包含活性成分。鼻內(nèi)給藥時(shí)，通過(guò)本發(fā)明得到的化合物可以 用作液體噴霧劑或可分散粉末，或采取滴劑(drop)的形式。滴劑可用水性或非水性基質(zhì)配制，該基質(zhì)中也含有一種或多種分散劑、增溶劑或懸浮劑。 液體噴霧劑便宜地從加壓包裝中遞送。吸入給藥時(shí)，可以由吹入器、霧化器、加壓包裝(pressurized pack)或其它輸送氣溶膠噴霧的便利裝置方便地輸送化合物。加壓包裝可含有適宜的 推進(jìn)劑，如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它 適宜氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可通過(guò)提供輸送計(jì)量量(metered amount) 的閥門來(lái)確定劑量單位?；蛘?，通過(guò)吸入或吹入給藥時(shí)，化合物可以是干粉組合物的形式，例 如該化合物與適宜粉末基質(zhì)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末組合物可以 以單位劑型提供，這些劑型例如膠嚢、藥筒(cartridge)、凝膠(gelatin)或發(fā)泡 包(blisterpack)，借助吸入器或吹入器，可由上述劑型施用所述4^分末。需要時(shí)，可以采用經(jīng)過(guò)改造而適于緩釋活性成分的上述制劑。藥物組 合物中還可以含有其它活性成分，諸如抗微生物劑，免疫抑制劑或防腐劑。優(yōu)選的單位劑型包含以下列舉的有效量、或活性成分的適宜部分?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知方法將采用本發(fā)明的方法鑒別出的作用 劑施用于患者，所述方法例如動(dòng)脈注射、靜脈注射、皮內(nèi)注射的形式，以 及作為鼻腔內(nèi)給藥、經(jīng)支氣管給藥、肌肉給藥或口服給藥的形式。施用劑 量和施用方法因患者的體重和年齡、以及施用方法而有變化，但本領(lǐng)域^支 術(shù)人員能夠按常規(guī)對(duì)它們進(jìn)行選擇。若該作用劑可^皮DNA編碼，則可以將該DNA插入基因治療用載體，并施用該載體來(lái)實(shí)施治療。施用劑量和施用 方法因患者的體重、年齡和癥狀而有變化，但本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)?對(duì)它們進(jìn)行選擇。采用本發(fā)明的方法鑒別出的作用劑的用量依賴于癥狀等，對(duì)于成人而 言，其組合物可在0.1-約250mg/kg每天的范圍內(nèi)施用。成人的劑量范圍通 常為約5 mg-約17.5 g/天，優(yōu)選為約5 mg-約10 g/天，更優(yōu)選為約100 mg-約3 g/天。片劑或其它以離散單位提供的包裝規(guī)格的單位劑量形式可以方便 地包含在該劑量有效的量，或是作為多個(gè)這樣的劑量有效的量，例如，含 有約5 mg至約500 mg，通常為約100 mg至約500 mg的單位。當(dāng)以注射劑形式向標(biāo)準(zhǔn)成年人(體重60 kg)非胃腸道給藥時(shí)，雖然根據(jù)患 者、靶器官、癥狀和給藥方法存在一些差異，但便宜地靜脈內(nèi)注射約O.Ol mg-約30mg每天，優(yōu)選約O.l mg-約20mg每天，更優(yōu)選約O.l mg-約10 mg每天的 劑量。而且，在其它動(dòng)物的情況下，可以按換算為60kg體重的量施用。作用劑優(yōu)選通過(guò)口服或注射(靜脈內(nèi)或皮下)來(lái)施用，給患者施用的確切 的量將由主治醫(yī)師在考慮包括患者年齡和性別、治療的確切疾患及其嚴(yán)重 程度在內(nèi)的多種因素的基礎(chǔ)上，在其職權(quán)范圍內(nèi)確定。或者，施用途徑也 可能因病情或其嚴(yán)重程度而不同。通過(guò)施用，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)患有MPH0SPH1蛋白與PRC1蛋白的結(jié)合相關(guān)的疾 病、或者存在患病風(fēng)險(xiǎn)(或可能性)的患者中的疾病進(jìn)行預(yù)防或治療。該方法 中包括減少膀胱癌細(xì)胞中MPHOSPH1與PRC1的結(jié)合。通過(guò)施用采用本發(fā) 明的篩選方法獲得的作用劑，可以抑制其功能。除非另有說(shuō)明，本文使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普 通技術(shù)人員通常所理解的意思相同。如有沖突，以本說(shuō)明書中包含的定義 為準(zhǔn)。以下，更具體地描述本發(fā)明的實(shí)施例。但是，以下的材料、方法、實(shí) 施例僅僅是對(duì)發(fā)明的方面進(jìn)行說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明范圍的限定。因此， 與本說(shuō)明書中描述的方法和材料類似或等同的方法和材料也可以用于本發(fā) 明的實(shí)施或測(cè)試。實(shí)施例
1.材沖+和方法
(1) 膀胱癌細(xì)胞系和組織樣品
人膀胱癌細(xì)胞系HT1197、 UM-UC-3、 J82、 HT1376、 SW780和RT4購(gòu)
自美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(America Type Culture Collection)(ATCC; Rockville，
MD)。所用膀胱癌細(xì)胞系COS7和NIH3T3細(xì)胞均在合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行單
層培養(yǎng)，即對(duì)于HT1197、 UMUC3、 J82和HT1376使用含0.1 mM必需氨
基酸(Roche)、 1 mM丙酮酸鈉(Roche)的EMEM(Sigma、 St. Louis， MO);對(duì)
于SW78(H吏用L-15;對(duì)于RT-44吏用McCoy，s5a(sigma);對(duì)于COS7和NIH3T3
使用Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(Invitrogen、 Carlsbad， CA)。各培養(yǎng)基中
添加了 10Q/。胎牛血清(Cansem)和1。/。抗生素/抗真菌溶液(Sigma)。 SW 780細(xì)
胞在不含C02的濕潤(rùn)空氣氣氛中于37。C維持。其它細(xì)胞系在含5% C02的
濕潤(rùn)空氣氣氛中于37'C維持。
外科切除的浸潤(rùn)性或淺表性膀胱癌組織樣品以及它們的相應(yīng)臨床信息 是在取得各患者書面知情同意后獲得的。
(2) 半定量RT-PCR分析
使用RNeasy微試劑盒(Qiagen， Valencia, CA)從培養(yǎng)細(xì)胞和臨床組織提 取總RNA。提取的RNA和正常人組織PolyA十RNA用DNase I (Nippon Gene、東京、日本)處理，然后使用寡聚(dT)引物和Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶 (Invitrogen， Carlsbad, CA)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)實(shí)驗(yàn)使 用以下MP7/OSPT^特異性引物或作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的04戶D7/特異性引物實(shí) 施；即， MPHOSPH1
5'-CCGGGAAAGTAAACTGACTCAC-3' (SEQ ID NO: 3)和 5'-TTCTAGCTCCTCAACCAAATCCT-3' (SEQ ID NO: 4);以及 GADH
5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3' (SEQ ID NO: 5)和
5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3' (SEQ ID NO: 6)。
PCR反應(yīng)中循環(huán)數(shù)經(jīng)過(guò)最優(yōu)化以保證對(duì)產(chǎn)物強(qiáng)度在擴(kuò)增的線性范圍內(nèi)。
(3) Northern印跡分才斤將由6個(gè)膀胱癌細(xì)胞系和8個(gè)正常人器官的mRNA組成的膀胱癌細(xì)胞 印跡以及人多組織部印跡(Takara Clontech、 Palo Alto, CA)與32P標(biāo)記的 M尸/70S尸//7 cDNA進(jìn)行了雜交。探針即MPHOSPHl cDNA是使用引物 5'-TGCTGGTTCAGAACGAACTATG-3' (SEQ ID NO: 7) 和 5'畫TCCTCGTGGCTAATGAAAGC-3' (SEQ ID NO: 8)通過(guò)RT-PCR制備的。預(yù) 雜交、雜交和清洗按廠商的推薦進(jìn)行。印跡的放射自顯影使用增感屏在-8(TC 進(jìn)行14曰。 (4)表達(dá)載體的構(gòu)建
和尸i C/的開(kāi)放閱讀框序列是使用KOD-Plus DNA聚合酶 (東洋紡、大阪、日本)和以下引物通過(guò)PCR擴(kuò)增的
5'-ATAAGAATGCGGCCGCAATGGAATCTAATTTTAATCAAGAGG-3'(SEO ID NO: 9)和
反向5'-ATAAGAATGCGGCCGCTTTGGCTGTTTTTGTTCGA-3' (SEQ ID NO: 10)(下劃線為限制酶位點(diǎn))；以及 尸7 C7，正向
5 ，-CCGGAATTCTCCGCCATGAGGAGAAGTGA-3， (SEQ ID NO: 11)(下劃 線部為￡coRI限制酶位點(diǎn))和
反向5，-TTGCCGCTCGAGGGACTGGATGTTGGTTGAA-3' (SEQ ID NO: 12) (下劃線部為Iol限制酶位點(diǎn))。
將M尸7/OS尸///和尸i C7的PCR產(chǎn)物分別插入HA標(biāo)簽pCAGGS表達(dá) 載體的位點(diǎn)和FLAG標(biāo)簽pCAGGS的五coRI和屈ol位點(diǎn)。通過(guò)DNA 序列測(cè)定確證了這些構(gòu)建體的DNA序列。用于擴(kuò)增截短的M尸/ZOS尸///的 序列的引物如下所示
1182至1302
正向
C-3，(SEQIDNO: 13)和
反向5，-ATAAGAATGCGGCCGCACCTGAATGGTTCGCTGTTTCAT-3 ， (SEQ ID NO: 14);以及
1295至1465正向5，國(guó)CCGGAATTCATGAAACAGCGAACCATTCAG-3, (SEQ ID NO:
15)
和
反向
5 ，-ATAAGAATGCGGCCGCTGTGTCAGTATTTCCATTTCATTCTGTT-3 ，(SE Q ID NO: 16);以及 1456至1662
正向5 ，-CCGGAATTCATGAAGCAACAGAATGAAATGGAAATACT-3, (SEQIDNO: 17)和
反向5，國(guó)ATAAGAATGCGGCCGCTCTGGACGTATGGCAACCTTTT隱3， (SEQIDNO: 18);以及
1655至1725
正向
5，-ATAAGAATGCGGCCGCTATGGAACAAAAGGTTGCCATACGTC-3' (SEQIDNO: 19)和 反向
5 ，-ATAAGAATGCGGCCGCTGTGCTTCTACATTTGAGAGCTTTGA-3 ， (SEQ ID NO: 20);以及 1718至1780
正向5，-CCGGAATTCATGTCAAAGCTCTCAAATGTAGAAGCA-3' (SEQ ID NO: 21)和
反向5，-ATAAGAATGCGGCCGCTTTGGCTGTTTTTGTTCGA-3， (SEQ ID NO: 10)(下劃線分為或五coi I限制酶位點(diǎn))。
(5)抗MPHOSPHl特異性多克隆抗體
使用pET21載體(Novagen、 Madison, WI)制備了下述質(zhì)粒，所述質(zhì)粒凈皮 設(shè)計(jì)成表達(dá)在C末端具有His標(biāo)簽表位的MPHOSPHl部分(第1612 1780 位氨基酸)或PRC1部分(第234 360位氨基酸)。在大腸桿菌BL21 codon-plus 抹(Stratagene、 La Jolla, CA)中分別表達(dá)這些重組肽，使用Ni-NTA樹(shù)脂瓊脂 糖(Qiagen)和TALON(Takara Clontech)按廠商的規(guī)程進(jìn)4亍純化。將純化的重 組蛋白接種于兔，按標(biāo)準(zhǔn)方法用親和柱純化了免疫血清。將親和純化的抗MPHOSPHl抗體和抗PRC1抗體用于下文所述的western印跡、免疫沉淀法 和免疫細(xì)胞化學(xué)染色中。通過(guò)western印跡分析確認(rèn)了這些抗體在UMUC3 膀胱癌細(xì)胞中特異性識(shí)別內(nèi)源性PHOSPHl。
(6) 同步化和流式細(xì)胞術(shù)分析
轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，用阿非迪霉素(2 ng/ml)進(jìn)一步作用，使細(xì)胞停滯在G1 期16個(gè)小時(shí)。通過(guò)用PBS(-)清洗5次解除細(xì)胞周期停滯。解除細(xì)胞周期停 滯后，在所示的時(shí)間點(diǎn)回收細(xì)胞。為了進(jìn)行FACS分析，將400 (al等4分的 同步化的貼壁細(xì)胞和脫壁細(xì)胞混合，4。C用70%乙醇進(jìn)行固定。用PBS(-)清 洗后，將細(xì)胞與含RNase I 1 mg的PBS 1 ml —起在37。C溫育30分鐘。然 后將細(xì)胞在含碘化丙錠(PI) 50 mg的PBS 1 ml中進(jìn)行染色。使用流式細(xì)胞4義 (FACScalibur; Becton Dickinson、 San Diego， CA)測(cè)定至少10000個(gè)細(xì)月包中 細(xì)胞周期各階段的部分的比例。為了進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析，在所示時(shí)間 點(diǎn)對(duì)同步化細(xì)胞進(jìn)行固定，并如下述地進(jìn)行了染色。
(7) 免疫細(xì)胞化學(xué)分析
以lxl(^個(gè)細(xì)胞每孔接種了 UMUC3細(xì)月包。24小時(shí)后，4吏用含4°/。多聚 曱醛(paraformaldehyde)的PBS固定細(xì)胞，并用含0.1% Triton X-100的PBS 于室溫處理2分鐘以使細(xì)胞可通透。接下來(lái)，于4。C用含3% BSA的PBS 覆蓋細(xì)胞12小時(shí)，以阻斷非特異性抗體結(jié)合位點(diǎn)。接著，再將細(xì)胞與用封 閉液1:100稀釋的親和純化的抗MPHOSPHl特異性多克隆抗體一起溫育。 用PBS清洗后，將UMUC3細(xì)胞用1:1000稀釋的Alexa 488-偶聯(lián)抗兔第二 抗體(Molecular Probe)染色。用4'， 6'-二脒基-2'-苯基吲哚二鹽酸(DAPI)對(duì)細(xì) 胞核進(jìn)行了復(fù)染。在顯微鏡(Leica， Tokyo, Japan)下獲取了熒光影像。
(8) 免疫組織化學(xué)分析
從外科標(biāo)本獲得了常規(guī)石蠟包埋膀胱癌組織切片。為了研究臨床材料 中的MPHOSPHl蛋白表達(dá)，將組織切片脫石蠟后用高壓滅菌器在高pH抗 原修復(fù)溶液(DAKO)中于108。C處理15分鐘進(jìn)行抗原修復(fù)，然后用 ENVISION+ Kit/HRP (DakoCytomation, Glostmp, Denmark)進(jìn)行染色。在封 閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和蛋白質(zhì)后，將這些切片與1:80稀釋的抗MPHOSPHl 多克隆抗體一起溫育。使用過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗兔免疫球蛋白(EnvisionKit, Dako Cytomation， Carpinteria， CA)進(jìn)行了免疫檢測(cè)。最后，將反應(yīng)物用3,3，-二氨基聯(lián)苯胺(Dako)顯色，將細(xì)胞用蘇木精進(jìn)行復(fù)染。(9)小分子干擾RNA測(cè)定
基于載體的RNA干擾(RNAi)系統(tǒng)——psiU6BX3.0是以前建立的，該系 統(tǒng)被設(shè)計(jì)成在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中合成小分子干擾RNA (Shimokawa T et al.， Cancer Res 2003, 63: 6116-20)。通過(guò)將雙鏈寡核苦酸克隆到psiU6BX栽體 中，制備了設(shè)計(jì)為表達(dá)siRNA的質(zhì)粒。分別按廠商的推薦使用 Lipofectamine2000 (Invitrogen)或FuGENE6 (Roche),用siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn) 染了 J82或UMUC3細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別在0.6或1.0 mg/ml遺傳霉素 (G418)存在下培養(yǎng)28日或21日，采用Giemsa染色分別測(cè)定了集落數(shù)。處 理后28日或14日，采用MTT測(cè)定評(píng)價(jià)了細(xì)胞存活力。
為了確認(rèn)MPH0SPH1蛋白表達(dá)的抑制，使用親和純化的抗MPHOSPHl 特異性多克隆抗體進(jìn)行了 western印跡分析，并且按標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)程進(jìn)行了半定 量RT-PCR。而且，使用特異性引物通過(guò)半定量RT-PCR確認(rèn)了 PRC1特異 性siRNA的敲低效果。作為內(nèi)部對(duì)照的G^PD/HI物同前。尸i C7特異性引 物如下。5'-GTTTGTCCCTTGGCTCTCATC-3' (SEQ ID NO: 22)和
5'陽(yáng)AGTCCACACTGGTAAGCTTTTGA-3'(SEQ ID NO: 23)。 RNAi用合成 寡核苷酸的靶標(biāo)序列如下。作為對(duì)照的EGFP: 5'-GAAGCAGCACGACTTCTTC畫3'(SEQ ID NO: 24); siRNA-MPHOSPHl: 5'-GTGAAGAAGTGCGACCGAA-3'(SEQ ID NO: 25); siRNA-MPHOSPHl錯(cuò)酉己5'-TTGTAGAAGTGCGACCGAG-3'(SEQ ID NO: 26);
siRNA-PRC 1# 1 5'-GGAAAGACTCATCAAAAGC-3'(SEQ ID NO: 27); siRNA-PRCl#2 5'-GCATATCCGTCTGTCAGAAT-3'(SEQ ID NO: 3 l)和 siRNA-PRCl#2錯(cuò)配 5'-TCATATCCCTCTGTAAGAT-3'(SEQ ID NO: 35)。
(10)穩(wěn)定表達(dá)MPHOSPHl的NIH3T3細(xì)胞的建立
使用FUGENE6,如上述地用MPHOSPH1表達(dá)載體或才莫擬載體轉(zhuǎn)染 NIH3T3細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在含0.9 mg/ml遺傳霉素(G418) (Invitrogen) 的培養(yǎng)基中溫育。采用有限稀釋法對(duì)克隆的NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行了亞克隆。通 過(guò)使用抗HA單克隆抗體的western印跡分析評(píng)價(jià)了 HA標(biāo)簽MPHOSPH1 的表達(dá)。最后，建立了數(shù)個(gè)克隆并命名為MPH0SPH1-NIH3T3。為了研究體外的MPHOSPHl生長(zhǎng)促進(jìn)效果，接種了 3種獨(dú)立的 MPH0SPH1-NIH3T3細(xì)胞和3種獨(dú)立的模擬-NIH3T3細(xì)胞各5000個(gè)，在5 日內(nèi)每日通過(guò)MTT測(cè)定法測(cè)定了細(xì)胞數(shù)。
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是按照機(jī)構(gòu)指導(dǎo)方針(institutional guidelines)在動(dòng)物設(shè)施內(nèi)進(jìn) 行的。為了進(jìn)一步研究MPHOSPHl對(duì)棵小鼠中腫瘤生長(zhǎng)的效果，對(duì)于16 只BALB/cA Jcl-nu小鼠(雌、7周齡)皮下注射NIH3T3-MPHOSPHl-#l、 NIH3T3-MPHOSPHl-#3、 NIH3T3-模擬-弁l或NIH3T3-模擬-弁3(5x106個(gè)細(xì) 胞)。在3周內(nèi)，每3日對(duì)腫瘤進(jìn)行測(cè)定，用以下公式估算其體積0.5x(長(zhǎng) 徑(longer diameter))x(短徑(shorter diameter))2, 如前所述。
(11) 免疫沉淀法和western印跡
將細(xì)胞用裂解緩沖液(50 mM Tris-HCL(pH8.0)、 150 mM NaCl、 0.5% NP-40、蛋白酶抑制劑合劑組(Calbiochem、 SanDiego, CA))裂解。將相等量 的總蛋白與大鼠抗HA抗體(Roche)或小鼠抗c-myc抗體(Sigma) 2嗎 一起于 4。C溫育2小時(shí)。將免疫復(fù)合物與蛋白G Sepharose (Zymed Laboratories, South SanFrancisco, CA)—起溫育2小時(shí)，其后，用裂解緩沖液清洗。對(duì)于共沉淀 的蛋白，用SDS-PAGE進(jìn)行了分離。
將用SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，其后，與小鼠 抗c-myc抗體(Sigma)或大鼠抗HA抗體(Roche)—起溫育。接著，與HRP偶 聯(lián)的第二抗體一起溫育，然后用ECLKit (Amersham Biosciences)使信號(hào)可視 化。
(12) MPHOSPHl和PRC1對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的敲低效果
使用FuGENE6(Roche),用下述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了 UMUC3細(xì)胞，所述質(zhì)粒凈皮 設(shè)計(jì)成表達(dá)si-EGFP (陰性對(duì)照)、si-MPHOSPHl或si-PRC 1 (參照上述的 siRNA測(cè)定)，然后，在4日內(nèi)考察細(xì)胞形態(tài)。轉(zhuǎn)染后第4日，用Alexa594 鬼筆環(huán)肽(Molecular probes)和DAPI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了免疫細(xì)胞化學(xué)染色。在共 聚焦顯微鏡(Leica,日本，東京)下獲得了焚光影像。為了研究siRNA對(duì) MPHOSPHl表達(dá)的抑制效果，使用親和純化的抗MPHOSPHl抗體按標(biāo)準(zhǔn) 規(guī)程進(jìn)行了 western 印跡分析。 2.結(jié)果
n)鑒定MP/7asP7/7作為膀胱癌中的上調(diào)基因?yàn)榱髓b定可能適用于新治療劑的靶標(biāo)的分子，先前使用代表27,648個(gè) 基因或EST的cDNA微陣列進(jìn)行了 26個(gè)浸潤(rùn)性膀胱癌的病例的全基因組表 達(dá)才莫式分析(Takata R et al.， Clin Cancer Res April 1, 2005， 11(7): 2625-36)。
通過(guò)該分析，鑒定出了 一組在所研究的大多數(shù)膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào) 的基因。這其中，M/WOSP/W (M期磷蛋白l)基因在臨床膀胱癌病例中與 膀胱癌細(xì)胞系中(數(shù)據(jù)未給出)通過(guò)半定量RT-PCR分析確認(rèn)都有上調(diào)(圖 1A)，而其表達(dá)在除睪丸外的任何被檢查的正常器官中均未檢出，因此，選 擇該基因用于進(jìn)一步研究。隨后的Northern印跡分析中證明，約7kb的 MPHOSPH1基因轉(zhuǎn)錄物在測(cè)試的6個(gè)膀胱癌細(xì)胞系中全部上調(diào)，而在除睪 丸外的被檢查的正常器官中不表達(dá)(圖1B、 IC)。
然后，開(kāi)發(fā)了針對(duì)MPHOSPHl的多克隆抗體以考察膀胱癌組織中該蛋 白質(zhì)的表達(dá)(參照"材料和方法")。
利用親和純化的抗MPHOSPH1多克隆抗體進(jìn)行的免疫組織化學(xué)分析， 在被檢的臨床浸潤(rùn)性膀胱癌組織切片的膀胱癌細(xì)胞中顯示陽(yáng)性染色，但在 被檢的正常膀胱組織中未檢出(圖1D)。而且，在被檢的初期階段的膀胱癌 中檢出了 M/WOS尸/W的上調(diào)表達(dá)(圖ID),盡管M/W(9S/W/的上調(diào)最初是 通過(guò)浸潤(rùn)性膀胱癌表達(dá)模式分析而鑒定的，上述事實(shí)提示MPHOSPHl與膀 胱癌的發(fā)生而不是進(jìn)展相關(guān)。
(2) 膀胱癌細(xì)胞中MPHOSPH1的細(xì)胞定位
為了進(jìn)一步闡明iWPi/OS尸/i7基因的性質(zhì)，通過(guò)4吏用抗MPH0SPH1抗 體的免疫組織化學(xué)分析研究了膀胱癌細(xì)胞系UMUC3中的內(nèi)源性 MPHOSPH1的細(xì)胞定位。內(nèi)源性MPHOSPH1在間期主要定位在細(xì)胞核， 但在核膜消失后的M期細(xì)胞中見(jiàn)于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)。由于免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯 示MPHOSPHl的表達(dá)圖式依賴于細(xì)胞周期，因此用阿非迪霉素使UMUC3 細(xì)胞同步化以研究細(xì)胞周期中不同點(diǎn)上的MPH0SPH1定位。如圖2所示， 內(nèi)源性MPHOSPHl定位在前期、中期和早后期的細(xì)胞質(zhì)。且該蛋白質(zhì)于晚 后期蓄集在細(xì)胞的中間區(qū)，最后于末期濃縮到收縮環(huán)。這些認(rèn)識(shí)提示 MPH0SPH1在細(xì)胞質(zhì)分裂中的重要功能。
(3) MPHOSPHl的致癌活性
為了評(píng)價(jià)M尸/ZOSPH7的致癌功能，在顯示MPHOSPHl高表達(dá)水平的 膀胱癌細(xì)胞系J82和UMUC3中，采用基于哺乳動(dòng)物載體的RNA干擾(RNAi)技術(shù)，敲低了 M戶7/OS73//7內(nèi)源表達(dá)(參照"材料和方法")。通過(guò)半定量 RT-PCR和western印跡分析考察了 MPHOSPHl表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì) 照siRNA構(gòu)建體(si-EGFP)相比，MPHOSPHl特異性siRNA (si-MPHOSPHl) 顯著抑制了該基因表達(dá)(圖3A)。使用siRNA構(gòu)建體進(jìn)行的集落形成測(cè)定和 MTT測(cè)定顯示MPHOSPHl特異性siRNA的導(dǎo)入抑制了 J82和UMUC3 細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖3B 、 3C)。而且，構(gòu)建了 si-MPHOSPHl的含3個(gè)堿基替換 的siRNA(si-MPHOSPHl錯(cuò)配、參照材料和方法)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其 其不具有對(duì)MPHOSPHl表達(dá)或膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果(圖3A)。
為了進(jìn)一步確認(rèn)M尸/ZOSP//7的生長(zhǎng)促進(jìn)效果，建立了穩(wěn)定表達(dá)外源性 M尸7/OS75//7的NIH3T3衍生細(xì)胞(NIH3T3-MPH0SPH1-1 、' 2和3細(xì)胞)。在 western印跡顯示3個(gè)衍生克隆具有高水平的外源性MPHOSPHl蛋白(圖 4A)。其后的MTT測(cè)定顯示與轉(zhuǎn)染了模擬質(zhì)粒的細(xì)胞(NIH3T3模擬-1、 2、 3細(xì)胞)相比，3個(gè)衍生細(xì)胞系NIH3T3-MPH0SPH1-1、 2、 3生長(zhǎng)快得多(圖 4B),這暗示MPHOSPHl表達(dá)很可能提高細(xì)胞生長(zhǎng)。然后，進(jìn)行了 FACS 分析以考察表達(dá)外源性MP/fOS7W7的NIH3T3衍生細(xì)胞是否加快細(xì)胞周期 的運(yùn)行。如圖4C所示，NIH3T3-MPH0SPH1細(xì)胞的細(xì)胞周期運(yùn)行在全部時(shí) 間點(diǎn)，特別是G2/M期細(xì)胞(6小時(shí))中，比NIH3T3-模擬細(xì)胞更快(MPH0SPH1: 模擬=35.71%:22.10%)。最終NIH3T3-模擬細(xì)胞在12小時(shí)時(shí)基本上回到 G0/G1期，而NIH3T3-MPHOSPH1細(xì)胞在12小時(shí)時(shí)經(jīng)過(guò)G0/G1期移至了 S 期(圖4C)。
為了考察M尸/^OSP//7 的體內(nèi)功能，通過(guò)皮下注射將 NIH3T3-MPHOSPH1細(xì)胞或NIH3T3-模擬細(xì)胞移植到BALB/cA Jcl-nu小鼠 (雌性，7周齡)中。與移植了 NIH3T3-模擬(-弁l或-#2)細(xì)胞的小鼠相比較，移 植了 NIH3T3-MPHOSPHl纟田胞(-#1或-#2)的全部12只小鼠，在棵小鼠中顯 著更迅速地形成了更大的腫瘤(圖4D)。該認(rèn)識(shí)顯示了 MPHOSPHl體內(nèi)和體 外在膀胱癌形成中的致癌功能。 (4)MPHOSPHl與PRC1的相互作用
為了進(jìn)一步研究膀胱癌細(xì)胞中MPHOSPHl的功能，考察了與 MPHOSPHl相互作用的蛋白質(zhì)。搜尋的結(jié)果是鑒定了胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)控因 子1 (protein-regulating cytokinesis 1, PRCl)作為與MPHOSPHl相互作用的 可能候選，因?yàn)橐阎摰鞍子谕砗笃诨蚰┢诩?xì)胞中定位在中間體中或收縮環(huán)附近，并在中間區(qū)形成(midzone formation)和細(xì)胞質(zhì)分裂中發(fā)揮功能。而且，已經(jīng)報(bào)道PRC1與數(shù)個(gè)驅(qū)動(dòng)蛋白家族蛋白質(zhì)相互作用(BanRetal.， JBiolChem 2004， 279: 16394-402; Kurasawa Y et al" EMBO J 2004， 23: 3237-48;Zhu C & Jiang W， Proc Natl Acad Sci USA 2005， 102: 343-8; Gruneberg U et al.,J Cell Biol 2006, 172: 363-72)。
利用半定量RT-PCR進(jìn)行的膀胱癌病例PRC1表達(dá)圖式分析發(fā)現(xiàn)在膀胱癌病例中PRC1與MPHOSPH1均上調(diào)(圖5A)。然后，使用HA標(biāo)簽MPHOSPH1和FLAG標(biāo)簽PRC1共轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，進(jìn)行了共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。在使用抗FLAG抗體或抗HA抗體時(shí)，發(fā)現(xiàn)HA標(biāo)簽MPHOSPH 1與FLAG#簽PRC1共沉淀，或者，也發(fā)現(xiàn)FLAG標(biāo)簽PRC1相反地與HA標(biāo)簽MPHOSPH1的共沉淀(圖5B),這顯示了這2種蛋白的相互作用。隨后的細(xì)胞免疫化學(xué)分析顯示在UMUC細(xì)胞的間期，外源性PRC1定位于被染色的纖維陣列絲(fiber array filament),并且與內(nèi)源性MPHOSPH1共定位(圖5C)。
而且，觀察到這些蛋白在M期、特別是晚后期中共定位，轉(zhuǎn)移至紡錘體中間區(qū)，在中間區(qū)以一組狹長(zhǎng)的微管束條的形式共定位。但是，令人感興趣的是，2種蛋白質(zhì)在末期細(xì)胞中的定位卻是分離的。PRCl(紅)如前述地定位在中間體的中央，而MPHOSPHl(綠)存在于微小管的正向末端(plusend)附近。該發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈地提示，除膀胱細(xì)胞末期外，MPHOSPH1在細(xì)胞周期期間都與PRC1相互作用。
(5) MPHOSPHl與PRC1的相互作用的鑒定
為了鑒定與PRC1相互作用的MPHOSPH1區(qū)域，使用一系列帶HA標(biāo)簽的MPHOSPH1截短型與帶FLAG標(biāo)簽的全長(zhǎng)PRC1共轉(zhuǎn)染COS7細(xì)月包，進(jìn)行了共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(圖6A)。使用抗FLAG或抗HA抗體進(jìn)行的免疫印跡分析顯示2個(gè)MPHOSPHl構(gòu)建體(第1188-1456位和第1662-1718位的氨基酸)結(jié)合于PRC1，這提示MPHOSPH1通過(guò)MPHOSPHl的莖柄(stalk)區(qū)域的C末端和尾部(tail)區(qū)域這2個(gè)結(jié)合區(qū)域與PRC1相互作用(圖6B)。
(6) 膀胱癌中PRC1特異性siRNA的生長(zhǎng)抑制效果
為了進(jìn)一步確認(rèn)膀胱癌發(fā)生過(guò)程中PRC1的生物學(xué)作用，構(gòu)建了 PRC1特異性siRNA表達(dá)載體，用于考察過(guò)表達(dá)PRC1的膀胱癌細(xì)胞系J82和UMUC3中各構(gòu)建體的敲低效果。在半定量RT-PCR中，si-PRCl#l與si-PRC 1-#2顯著地敲低了 PRC1表達(dá)，而si-PRCl#l的包含3個(gè)堿基取代的si-PRCl錯(cuò)配構(gòu)建體或陰性對(duì)照si-EGFP完全或者基本上未顯示出敲低效果。將si-PRCl#l或si-PRCl#2導(dǎo)入J82和UMUC3細(xì)胞，結(jié)果集落數(shù)與細(xì)胞存活率顯著減少，而對(duì)照siRNA和si-PRCl錯(cuò)配對(duì)集落形成與細(xì)胞存活力完全或基本上沒(méi)有效果(圖7A和7B)。這些發(fā)現(xiàn)提示PRCl在膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)中具有重要功能。
而且，如圖7C所示，實(shí)施了免疫細(xì)胞化學(xué)分析來(lái)考察癌細(xì)胞中MPHOSPH1和PRCl的敲低對(duì)細(xì)胞質(zhì)分裂的效果。分別用MPHOSPH1或PRCl特異性siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染UMUC3細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后4天的時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。令人感興趣的是，在轉(zhuǎn)染后第4天，在轉(zhuǎn)染2種siRNA中的任一種的細(xì)胞中均觀察到多核形成(圖7C)。該發(fā)現(xiàn)提示，MPHOSPH1或PRC1的缺失導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)分裂失敗，結(jié)果形成多核細(xì)胞，最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
工業(yè)實(shí)用性
本發(fā)明涉及通過(guò)檢測(cè)抑制MPHOSPH1蛋白與PRCl的結(jié)合的化合物來(lái)鑒定和篩選用于治療和預(yù)防癌癥特別是膀胱癌的作用劑的方法。根據(jù)本發(fā)明證明，通過(guò)敲低MPH0SPH1和PRC1，觀察到細(xì)胞質(zhì)分裂失敗以及多核形成。因此，本篩選方法將會(huì)可望幫助開(kāi)發(fā)膀胱癌治療或預(yù)防的新治療戰(zhàn)略。
本說(shuō)明書中報(bào)告的數(shù)據(jù)加深了對(duì)膀胱癌的整體認(rèn)識(shí)，為鑒定用于治療用藥物和預(yù)防劑的分子靶標(biāo)提供了線索。這種信息為更深入理解癌發(fā)生作出了貢獻(xiàn)，為面向膀胱癌的治療以及最終的預(yù)防的新戰(zhàn)略的開(kāi)發(fā)提供了指標(biāo)。
本說(shuō)明書提及的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物皆以提述方式全文并入本i兌明書。
另外，盡管已經(jīng)詳細(xì)地并且參考本發(fā)明的具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但可理解的是上述說(shuō)明書實(shí)際上是例示性和解釋性的，意欲闡明本發(fā)明及其優(yōu)選實(shí)施方案。通過(guò)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地想到，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明并不意^:受到上述說(shuō)明的限定，而由如下權(quán)利要求及其等同物限定。
權(quán)利要求
1.一種鑒定抑制MPHOSPH1與PRC1之間的結(jié)合的作用劑的方法，該方法包括下述步驟a)使第一多肽與第二多肽在作用劑的存在下相接觸；其中，所述第一多肽選自下組i)包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽；ii)包含添加、取代、缺失或插入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO2的氨基酸序列構(gòu)成的多肽等價(jià)的對(duì)PRC1的結(jié)合活性，iii)包含與SEQ ID NO2至少約80％同源的氨基酸序列的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO2的氨基酸序列組成的多肽等價(jià)的對(duì)PRC1的結(jié)合活性，和vi)與由SEQ ID NO1的核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO2的氨基酸序列組成的多肽等價(jià)的對(duì)PRC1的結(jié)合活性；所述第二多肽選自下組i)包含SEQ ID NO37的氨基酸序列的多肽；ii)包含添加、取代、缺失或插入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的SEQ ID NO37的氨基酸序列的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO37的氨基酸序列組成的多肽等價(jià)的對(duì)MPHOSPH1的結(jié)合活性；iii)包含與SEQ ID NO37至少約80％同源的氨基酸序列的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO37的氨基酸序列組成的多肽等價(jià)的對(duì)MPHOSPH1的結(jié)合活性；和vi)與由SEQ ID NO36的核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO37的氨基酸序列組成的多肽等價(jià)的對(duì)MPHOSPH1的結(jié)合活性；b)檢測(cè)所述第一多肽與第二多肽之間的結(jié)合水平；c)將所述第一和第二多肽的結(jié)合水平與不存在作用劑的條件下檢出的所述第一和第二多肽的結(jié)合水平相比較；以及d)選擇降低所述第一與第二多肽之間的結(jié)合水平的作用劑。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中所述第一多肽包含SEQIDNO:2的第1188 1718位的氨基酸殘基。
3. —種鑒定抑制膀胱癌細(xì)胞增殖的作用劑的方法，該方法包括下述步驟a) 使第一多肽與第二多肽在作用劑的存在下相接觸；其中，所述第一多肽 選自下組i) 包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的多肽；ii) 包含添加、取代、缺失或插入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的SEQIDNO: 2的 氨基酸序列的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列 組成的多肽等價(jià)的對(duì)PRC1的結(jié)合活性；iii) 包含與SEQ ID NO: 2至少約80%同源的氨基酸序列的多肽，條件是該 多肽具有與由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列組成的多肽等價(jià)的對(duì)PRC1的 結(jié)合活性；和vi)與由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列組成的多核苦酸在嚴(yán)格條件下雜交的 多核苷酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQIDNO:2的氨基酸 序列組成的多肽等價(jià)的對(duì)PRC1的結(jié)合活性； 所述第二多肽選自下組i) 包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列的多肽、ii) 包含添加、取代、缺失或插入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的SEQIDNO:37的 氨基酸序列的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO: 37的氨基酸序列 組成的多肽等價(jià)的對(duì)MPHOSPHl的結(jié)合活性，iii) 包含與SEQ ID NO: 37至少約80%同源的氨基酸序列的多肽，條件是 該多肽具有與由SEQ ID NO: 37的氨基酸序列組成的多肽等價(jià)的對(duì) MPHOSPH1的結(jié)合活性，和vi)與由SEQ ID NO: 36的核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交 的多核苷酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO: 37的氨基 酸序列組成的多肽等價(jià)的對(duì)MPHOSPH1的結(jié)合活性；b) 檢測(cè)所述第一多肽與第二多肽之間的結(jié)合水平；c) 將所述第一和第二多肽的結(jié)合水平與不存在作用劑的條件下檢出的所述 第一和第二多肽的結(jié)合水平相比較；以及d) 選擇降低所述第一與第二多肽之間的結(jié)合水平的作用劑作為抑制膀胱癌 細(xì)胞增殖的作用劑。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中所述第 一多肽包含SEQ ID NO: 2的第1188~1718位的氨基酸殘基。
5. —種筌定用于治療或預(yù)防膀胱癌的作用劑的方法，該方法包括下述步驟a) 使第一多肽與第二多肽在作用劑的存在下相接觸；其中，所述第一多肽 選自下組i) 包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的多肽；ii) 包含添加、取代、缺失或插入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的SEQ ID NO: 2的 氨基酸序列的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列 組成的多肽等價(jià)的對(duì)PRC1的結(jié)合活性；iii) 包含與SEQIDNO:2至少約80%同源的氨基酸序列的多肽，條件是該 多肽具有與由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列組成的多肽等價(jià)的對(duì)PRC1的 結(jié)合活性；和iv) 與由SEQ ID NO: 1的核酸序列組成的多核苦酸在嚴(yán)格條件下雜交的多 核苷酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO: 2的氨基酸序 列組成的多肽等價(jià)的對(duì)PRC1的結(jié)合活性；所述第二多肽選自下組i) 包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列的多肽、ii) 包含添加、取代、缺失或插入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的SEQ ID NO: 37的 氨基酸序列的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO: 37的氨基酸序列 組成的多肽等價(jià)的對(duì)MPHOSPHl的結(jié)合活性，iii) 包含與SEQ ID NO: 37至少約80%同源的氨基酸序列的多肽，條件是 該多肽具有與由SEQ ID NO: 37的氨基酸序列組成的多肽等價(jià)的對(duì) MPHOSPH1的結(jié)合活性，和vi)與由SEQ ID NO: 36的核苷酸序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交 的多核苷酸所編碼的多肽，條件是該多肽具有與由SEQ ID NO: 37的氨基 酸序列組成的多肽等價(jià)的對(duì)MPHOSPH1的結(jié)合活性；b) 檢測(cè)所述第一多肽與第二多肽時(shí)間的結(jié)合水平；c) 將所述第一和第二多肽的結(jié)合水平與不存在作用劑的條件下檢出的所述 第一和第二多肽的結(jié)合水平相比較；以及d) 選擇降低第一與第二多肽之間的結(jié)合水平的作用劑作為用于預(yù)防或治療 膀胱癌的作用劑。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述第一多肽包含SEQIDNO:2的第1188~1718 位的氨基酸殘基。
全文摘要
本發(fā)明提供用于鑒定阻礙或抑制MPHOSPH1與PRC1的結(jié)合的作用劑的方法。這樣的作用劑預(yù)期可作為抑制表達(dá)MPHOPH1和PEC1的細(xì)胞的增殖、以及預(yù)防或治療癌癥特別是膀胱癌的藥物發(fā)揮作用。
文檔編號(hào)G01N33/574GK101558307SQ20078003992
公開(kāi)日2009年10月14日 申請(qǐng)日期2007年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月25日
發(fā)明者中村佑輔, 中鶴修一, 片桐豐雅 申請(qǐng)人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司