專利名稱：治療幽門螺旋菌感染的新方法
治療幽門螺旋菌感染的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為幽門螺旋菌(He//c^^"^^_y/0W) Y谷氨酰基轉(zhuǎn)肽基 酶(HPGGT)片段的多肽；包含它們的免疫原性組合物，包含HPGGT失 活形式的免疫原性組合物；所述多肽和HPGGT失活片段的用途；針對(duì)和 特異性結(jié)合所述多肽和HPGGT失活形式的抗體、適體、和鏡像異構(gòu)適體 (spiegelmer);用于識(shí)別候選藥物的方法，用于開發(fā)疫苗的方法；HPGGT 的配體的用途。
幽門螺旋菌是革蘭氏-陰性病原菌，其選擇性定居于人的胃粘膜，并 普遍存在于世界人口的多于50%中。該感染通常持續(xù)一生，并在胃和十二
指腸潰瘍、胃粘膜-相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤、和胃癌的發(fā)病機(jī)制中有所涉及。 幽門螺旋菌感染的標(biāo)志是慢性的活躍性胃炎，其特征在于嗜中性粒細(xì)胞、 淋巴細(xì)胞、和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞對(duì)粘膜的密集浸潤。若干研究提供了這樣 的證據(jù)，即在幽門螺旋菌相關(guān)胃炎過程中，增加并活化T-輔助1型細(xì)胞， 顯示出體內(nèi)上調(diào)CD25和CD69。還引起了針對(duì)多種幽門螺旋菌抗原的強(qiáng) 烈體液應(yīng)答。盡管其是炎性應(yīng)答，宿主免疫系統(tǒng)不清除該感染。因此，似 乎幽門螺旋菌干擾免疫系統(tǒng)，后前仍不清楚其獨(dú)特的機(jī)制。
一些研究解決了這個(gè)問題，并描述了幽門螺旋菌逃脫免疫應(yīng)答的被動(dòng) 和主動(dòng)方式。報(bào)告了幽門螺旋菌對(duì)吞噬作用的抗性，并且其依賴于編碼IV 型分泌裝置組分的毒力基因，諸如v/r57和v/M77。 Zabaleta等報(bào)告幽門螺 旋菌精氨酸酶抑制T-細(xì)胞增殖并減少T-細(xì)胞受體匸鏈的表達(dá)。顯示出幽門 螺旋菌的促炎肽通過活化單核細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)性氧自由基誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞功 能異常。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了細(xì)菌和非-特異性免疫應(yīng)答的相互作用；然而，特 異性T-細(xì)胞應(yīng)答對(duì)消除細(xì)菌似乎是決定性的，因?yàn)樵赥細(xì)胞或干擾素i (IFN-力缺陷的小鼠中疫苗接種試驗(yàn)失敗了 。
盡管付出這些努力，但是關(guān)于胃病原菌的慢性持續(xù)性的原因仍不清 楚。1已經(jīng)顯示出CD4陽性T細(xì)胞對(duì)細(xì)菌消除是關(guān)鍵的2但它們的增殖受到幽門螺旋菌的抑制。在該上下文中，若干小組研究了來自幽門螺旋菌的 蛋白質(zhì)的免疫抑制作用。Knipp和同事部分純化了所謂的"增殖-抑制-蛋 白(PIP)"，其獨(dú)立于毒力因子CagA (細(xì)胞毒素相關(guān)基因A)和VacA (空 泡細(xì)胞毒素A)減少淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的增殖。4
相反地，兩個(gè)小組近期報(bào)告了淋巴細(xì)胞增殖在高濃度的純化的VacA 的存在下受到抑制。5'6然而，自相矛盾的是，VacA-缺陷型幽門螺旋菌突 變體在它們的增殖抑制特性上沒有缺陷。5另外，早期公認(rèn)了在受到VacA-表達(dá)的螺旋菌株感染的患者中胃炎不改變或甚至不增加。7，8
早期顯示，幽門螺旋菌的分泌產(chǎn)物通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1階段 來抑制T淋巴細(xì)胞增殖。3這種作用與已知的毒力因子包括蛋白質(zhì)VacA和 CagA無關(guān)。
盡管關(guān)于幽門螺旋菌逃脫宿主消除作用的可能機(jī)制的工作增加了，在 開發(fā)特異性治療或預(yù)防幽門螺旋菌感染的臨床方法中尚未獲得實(shí)質(zhì)的成 功。
作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問題是提供適合于在動(dòng)物或人中引起免疫應(yīng)答的
多肽，其中所述免疫應(yīng)答賦予針對(duì)幽門螺旋菌感染和與幽門螺旋菌有關(guān)或
由其引起的任何疾病的保護(hù)。
作為本發(fā)明基礎(chǔ)的另一個(gè)問題是提供適合于引起所述免疫應(yīng)答的免
疫原性組合物。
作為本發(fā)明基礎(chǔ)的另一個(gè)問題是提供確定用于治療和/或預(yù)防幽門螺
旋菌感染的新型候選藥物的方法，以及治療和預(yù)防這種感染的方法。
這些和其他問題是通過獨(dú)立權(quán)利要求的主題解決的。由從屬權(quán)利要求
可以獲得優(yōu)選的實(shí)施方案。
更具體地，在第一方面通過包括氨基酸序列的多肽解決問題，其中所
述多肽的氨基酸序列與HPGGT區(qū)域的一段連續(xù)氨基酸序列至少80%相
同，所述HPGGT區(qū)域包括對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列，其中通過
以下各項(xiàng)定義所述區(qū)域
(a) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置150-200，或
(b) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置410-480，和 其中所述多肽適合于引起能夠抑制HPGGT催化活性的免疫應(yīng)答。在第一方面的實(shí)施方案中，所述多肽包括約15-約30個(gè)氨基酸。 在第二方面，通過多肽，優(yōu)選地，按照第一方面的多肽解決問題，其 中所述多肽包括對(duì)應(yīng)下列各項(xiàng)的氨基酸序列
(a) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置150-200，或
(b) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置410-480， 其中所述多肽包括約15-約30個(gè)氨基酸。
在第二和第一方面的實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列與所述位置 的一段15-30個(gè)連續(xù)氨基酸的序列一致。
在第二和第一方面的實(shí)施方案中，所述多肽包括選自由下列各項(xiàng)組成 的組的一個(gè)序列
QRQAETLKEARERFLKY (SEQ.ID.No. 2), FDIKPGNPNLYGLVGGDANAI (SEQ.ID.No. 3), DFSIKPGNPNLYGLVGGDANAIEANKRPL (SEQ.ID.No.4)和 SSMSPTIVLKNNKVFLVVGSP (SEQ.ID.No.5)
在第三方面，通過免疫原性組合物解決問題，所述免疫原性組合物包 括一種或數(shù)種按照第一和第二方面的多肽。
在第四方面，通過免疫原性組合物解決問題，所述免疫原性組合物包 括HPGGT的失活形式。
在第五方面，通過免疫原性組合物解決問題，所述免疫原性組合物包 括HPGGT的片段，其中所述片段由包括HPGGT的氨基酸451和452的 一段連續(xù)氨基酸序列組成。
在第三、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述組合物用于動(dòng)物或人的 疫苗接種。
在第三、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述組合物能夠在動(dòng)物或人 中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
在第三、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述免疫應(yīng)答是抗體應(yīng)答。 在第三、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述抗體應(yīng)答包括對(duì) HPGGT，更優(yōu)選地，對(duì)HPGGT的特異性活性具有抑制作用和/或?qū)α馨图?xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑制具有消除作用的抗體。
在第三、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述組合物用于在患有幽門 螺旋菌感染或處于發(fā)展為幽門螺旋菌感染風(fēng)險(xiǎn)中的患者中促進(jìn)淋巴細(xì)胞 的活化和增殖。
在第三、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述淋巴細(xì)胞是B或T細(xì)胞。
在第三、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述組合物包括一種或數(shù)種 佐劑。
在第三、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述組合物包括一種或數(shù)種 來自幽門螺旋菌的抗原。
在第三、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述抗原選自包括外膜蛋白 的組。
在第三、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述抗原選自包括HpaA、 Ompl8和其組合的組。
在第三、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述組合物用于預(yù)防和/或 治療由幽門螺旋菌引起的或與之相關(guān)的疾病，更優(yōu)選地，由幽門螺旋菌感 染引起的或與之相關(guān)的疾病。
在第三、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述疾病選自包括下列各項(xiàng)
的組幽門螺旋菌感染、由幽門螺旋菌引起的胃與十二指腸病癥、胃炎、
慢性胃炎、胃或十二指腸潰瘍、胃癌和(MALT)淋巴瘤。
在第三、第四和第五方面的實(shí)施方案中，所述免疫原性組合物是疫苗。 按照第六方面，通過按照本發(fā)明第一方面的多肽用于制備藥物的用途
解決作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問題。
在第七方面，通過按照本發(fā)明第三、第四和第五方面的免疫原性組合
物用于制備藥物的用途解決作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問題。
在本發(fā)明第六和第七方面的實(shí)施方案中，所述藥物是疫苗。 在本發(fā)明第六和第七方面的實(shí)施方案中，所述藥物用于預(yù)防和/或治
療由幽門螺旋菌引起的或與之相關(guān)的疾病，更優(yōu)選地，由幽門螺旋菌感染
引起的或與之相關(guān)的疾病。
在第八方面，通過按照第一方面的多肽用于檢測樣品中抗體的用途解決作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問題，其中所述抗體針對(duì)HPGGT。
在第八方面的實(shí)施方案中，所述抗體能夠抑制HPGGT酶活性和/或
HPGGT對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制活性。
在第九方面，通過特異結(jié)合按照第一方面的多肽的抗體解決作為本發(fā)
明基礎(chǔ)的問題。
在第九方面的實(shí)施方案中，所述抗體具有對(duì)HPGGT，更優(yōu)選地，對(duì) HPGGT的特異性活性的抑制作用和/或?qū)α馨图?xì)胞增殖的HPGGT依賴性 淋巴細(xì)胞抑制的消除作用。
在第十方面，通過編碼按照第九方面的抗體的核酸解決作為本發(fā)明基 礎(chǔ)的問題。
在第十一方面，通過特異結(jié)合按照第一方面的多肽或結(jié)合HPGGT的 片段的核酸分子解決作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問題，其中所述片段由包括 HPGGT的氨基酸451和452的一段連續(xù)氨基酸序列組成，其中所述核酸 分子選自包括適體和鏡像異構(gòu)適體的組。
在第十一方面的實(shí)施方案中，所述核酸具有對(duì)HPGGT，更優(yōu)選地， 對(duì)HPGGT的特異性活性的抑制作用和/或?qū)α馨图?xì)胞增殖的HPGGT依賴 性抑制的消除作用。
在第十二方面，通過按照第九方面的抗體用于制備藥物的用途解決作 為本發(fā)明基礎(chǔ)的問題。
在第十三方面，通過按照第十一方面的核酸用于制備藥物的用途解決 作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問題。
在第十二和第十三方面的實(shí)施方案中，所述藥物用于治療和/或預(yù)防 由幽門螺旋菌引起的或與之相關(guān)的疾病，更優(yōu)選地，由幽門螺旋菌感染引 起的或與之相關(guān)的疾病。
在第十四方面，通過用于確定治療疾病的候選藥物的方法解決作為本 發(fā)明基礎(chǔ)的問題，所述方法包括評(píng)估候選藥物的下列各項(xiàng)的步驟
a. 對(duì)幽門螺旋菌的7-谷氨?；D(zhuǎn)肽基酶的特異性活性的抑制作用和
b. 對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑制的消除作用。 在第十四方面的實(shí)施方案中，所述疾病是由幽門螺旋菌引起的或與之
相關(guān)的疾病，更優(yōu)選地，由幽門螺旋菌感染引起的或與之相關(guān)的疾病，和更優(yōu)選地，人中的幽門螺旋菌感染。
在第十五方面，通過用于開發(fā)疫苗的方法解決作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問 題，所述方法包括下列步驟
a) 提供包括HPGGT或至少一個(gè)它的片段的免疫原性組合物；
b) 用所述免疫原性組合物免疫動(dòng)物，并由此產(chǎn)生抗體；
c) 評(píng)估所述抗體對(duì)幽門螺旋菌的Y-谷氨?；D(zhuǎn)肽基酶的特異性活性 的抑制作用和它們對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑制的消除作用和
d) 選擇合適的免疫原性組合物。
在第十五方面的實(shí)施方案中，所述疫苗是針對(duì)人中幽門螺旋菌感染的 疫苗。
在第十六方面，通過HPGGT配體制備用于預(yù)防和/或疾病的藥物的 用途解決作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問題，其中所述配體顯著抑制HPGGT活性并 消除淋巴細(xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑制。
在第十六方面的實(shí)施方案中，所述疾病是由幽門螺旋菌引起的或與之 相關(guān)的疾病，更優(yōu)選地，由幽門螺旋菌感染引起的或與之相關(guān)的疾病。
在第十六方面的實(shí)施方案中，所述配體是按照第九方面的抗體，或按 照第十一方面的核酸。
在第十六方面的實(shí)施方案中，在淋巴細(xì)胞增殖測定中評(píng)估淋巴細(xì)胞增 殖和/或活化。
在第十七方面，通過HPGGT用于制備免疫抑制刑組合物的用途解決 作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問題。
在第十八方面，通過免疫抑制劑組合物解決作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問題， 所述免疫抑制劑組合物是可以在容許HPGGT特異性活性的培養(yǎng)基中培養(yǎng) HPGGT和谷氨酰胺后作為上清液獲得的。
在不希望受到任何理論局限的條件下，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)針對(duì)幽門 螺旋菌的Y-谷氨?；D(zhuǎn)肽基酶(HPGGT) (E.C.2.3.2.2.)的配體可以用于治 療和/或預(yù)防幽門螺旋菌感染，具體地，胃與十二指腸病癥，其中所述配體 是HPGGT催化活性的抑制劑并與對(duì)照相比恢復(fù)淋巴細(xì)胞增殖，所述對(duì)照 在存在該酶的條件下受到抑制。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)與HPGGT—起培 養(yǎng)時(shí)，淋巴細(xì)胞的增殖受到HPGGT特異性活性的阻斷，所述HPGGT特異性活性導(dǎo)致淋巴細(xì)胞中的Gl細(xì)胞周期停滯，并由此抑制淋巴細(xì)胞增殖。
因此，HPGGT特異性活性的抑制消除淋巴細(xì)胞增殖的抑制，并因此使幽
門螺旋菌不可能逃脫宿主的免疫系統(tǒng)。因此，如本發(fā)明提示的配體的使用 預(yù)防或至少基本減少幽門螺旋菌定居在宿主/患者中。最后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)
幽門螺旋菌的Y谷氨酰基轉(zhuǎn)肽基酶(GGT)的催化活性對(duì)于抑制淋巴細(xì)胞增 殖，特別是宿主中T細(xì)胞增殖是必需的。這由下列證據(jù)清楚地證實(shí)，所述 證據(jù)顯示在GGT活性中有缺陷的突變細(xì)菌喪失消除淋巴細(xì)胞增殖的能力， 并同時(shí)不能定居在小鼠中。對(duì)淋巴細(xì)胞的抑制作用由重組HPGGT完全呈 現(xiàn)。關(guān)于其對(duì)T細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用的分析提示Ras信號(hào)傳導(dǎo)通路的中 斷，從而導(dǎo)致誘導(dǎo)Gl細(xì)胞周期停滯。重要地，注意到每種幽門螺旋菌株 具有HPGGT，且由抑制配體耙向該酶將提供適用于每種幽門螺旋菌感染 的新型療法，由此避免與抗生素療法相關(guān)的問題(抗性、副作用、突變體 選擇等)。按照本發(fā)明，優(yōu)選地，對(duì)幽門螺旋菌感染的保護(hù)是通過抑制 HPGGT的催化活性和由此破壞免疫抑制而賦予的，所述免疫抑制否則阻 止針對(duì)幽門螺旋菌的有效免疫應(yīng)答。
HPGGT廣泛分布于動(dòng)物、植物和細(xì)菌中。其代表異源二聚體蛋白， 其作為單多肽鏈翻譯，并在翻譯后分裂為兩個(gè)具有不同分子量的亞單位。 該酶的哺乳動(dòng)物形式是膜-結(jié)合的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)主要表達(dá)于全身的腺 體和導(dǎo)管腔表面上。 一些細(xì)菌性GGT，包括幽門螺旋菌同源物的細(xì)胞定位 與哺乳動(dòng)物的酶的細(xì)胞定位不同。先前顯示，HPGGT被分泌到細(xì)胞外培 養(yǎng)基中(Bumann等2002)。另外，不同GGT同源物氨基酸序列的排列揭 示HPGGT與人和其他哺乳動(dòng)物GGT之間22%的低同源性，而對(duì)細(xì)菌性 同源物的較高同源性。HPGGT和來自其他物種的同源物之間的另一個(gè)重 要區(qū)別是在HPGGT的C-末端缺乏GY-殘基(Chevalier等1999)。因此，關(guān) 于HPGGT和其哺乳動(dòng)物同源物之間的細(xì)胞定位和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本區(qū)別 是明顯的。
Y-谷氨?；D(zhuǎn)移酶還稱為谷氨?；D(zhuǎn)肽基酶；a-谷氨?；D(zhuǎn)肽基酶；g-谷氨酰基肽基轉(zhuǎn)移酶；g-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽基酶;g-GPT; g-GT; g-GTP; L-g-谷氨 ?；D(zhuǎn)肽基酶;L-g-谷氨?；D(zhuǎn)移酶;L-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶；GGT; g-谷氨酰基 轉(zhuǎn)肽基酶。特異性(催化)活性是如下概述的谷氨?；鶜埢D(zhuǎn)移(5-L-谷氨酰基)-肽+氨基酸=肽+ 5-L-谷氨?；被?br> 該反應(yīng)或進(jìn)行所述反應(yīng)的能力在本文中也指HPGGT的酶活性或 HPGGT的特異性活性。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員巳知的方法(例如，使用L-Y-谷氨酰基 -p-nitroanilide作為供體底物；見下)評(píng)估GTT活性。可以如本文中所詳 述地，在存在或缺乏HPGGT和/或配體的條件下進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖測定。
早期，其他小組已經(jīng)描述了 GGT作為來自幽門螺旋菌的因子對(duì)體內(nèi) 定居很重要。"，13然而，該發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)原因尚不清楚。
本發(fā)明提供關(guān)于人T淋巴細(xì)胞增殖的GGT-依賴性抑制和由幽門螺旋 菌誘導(dǎo)Gl停滯的明確證據(jù)。這在一方面通過使用細(xì)菌的同基因 (isogenic)GGT敲除突變體得到證實(shí)，其未能抑制抗原-刺激的初級(jí)人T細(xì) 胞以及PBMC的增殖。在另一 方面，大腸桿菌(Eco")中表達(dá)的重組HPGGT 在缺乏幽門螺旋菌分泌的其他蛋白的條件下，抑制T細(xì)胞增殖。有趣地， 我們的數(shù)據(jù)顯示哺乳動(dòng)物的GGT缺乏這種抑制功能。如上提及地，報(bào)告 了哺乳動(dòng)物和HPGGT的結(jié)構(gòu)和定位中的區(qū)別。我們的結(jié)果指出哺乳動(dòng)物 和HPGGT的催化機(jī)制和/或底物特異性的其他差別，這是哺乳動(dòng)物GGT 不能抑制淋巴細(xì)胞增殖的原因。
使用了結(jié)構(gòu)研究和誘變實(shí)驗(yàn)來確定絲氨酸殘基451和452對(duì)GGT催 化活性而言是必需的。21本文顯示HPGGT絲氨酸451/452位置-定向誘變 為丙氨酸導(dǎo)致完全消除其針對(duì)淋巴細(xì)胞的催化活性和特別地，抑制活性， 這與現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)教導(dǎo)相反，在現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)告了氨基酸位置380 (T380)對(duì)HPGGT的催化活性很關(guān)鍵31。因此，用GGT抑制劑阿西維 辛(acividn)培養(yǎng)HPGGT完全消除該酶的催化活性以及抑制功能。所以， 我們的數(shù)據(jù)證明HPGGT的催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)完整性是其免疫抑制作用的 必要先決條件。按照來自幽門螺旋菌的GGT在體內(nèi)定居過程中的重要作 用1U3，我們發(fā)現(xiàn)該酶甚至在宿主胃粘膜中存在的低pH值下是催化活性 的。
非常確定地，人胃中的上皮細(xì)胞形成連續(xù)的屏障，所述屏障限制分子在內(nèi)部和外部區(qū)室之間運(yùn)動(dòng)。另外，多種機(jī)制，包括緊密和粘著連接阻止 大分子被動(dòng)擴(kuò)散經(jīng)過該屏障的細(xì)胞旁空間。因此，出現(xiàn)了這樣的問題，即 幽門螺旋菌分泌的GGT蛋白如何能夠與上皮屏障另一側(cè)的宿主免疫系統(tǒng)
相互作用，從而抑制T細(xì)胞增殖。在該上下文中，先前己經(jīng)證明了HP能 夠通過若干機(jī)制減弱胃上皮的屏障功能。另外，以前已經(jīng)證明了由HP蛋 白VacA和CagA引起上皮連接復(fù)合物的破壞以及由幽門螺旋菌脲酶引起 增多的胞轉(zhuǎn)蛋白(tmnscytotic protein)穿過上皮屏障傳遞。這些機(jī)制最終 導(dǎo)致固有層中存在增多的HP蛋白，和它們與作為幽門螺旋菌感染的結(jié)果 浸潤胃粘膜的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的相互作用。支持HPGGT對(duì)胃粘膜中T細(xì)胞 的影響，我們的結(jié)果顯示明確的血清抗體應(yīng)答HP感染的而非未感染的對(duì) 照患者中的這種毒力因子。這支持抗原處理GGT蛋白組分和將這些抗原 呈遞給免疫系統(tǒng)的組分，包括胃粘膜中的T淋巴細(xì)胞的想法。因此，通過 HPGGT抑制胃粘膜中的T淋巴細(xì)胞增殖可以有助于幽門螺旋菌的免疫逃 脫機(jī)制，從而促進(jìn)其在人胃中的慢性持久性。
解釋本發(fā)明的研究的結(jié)果揭示了在與幽門螺旋菌野生型上清液和還 有與重組HPGGT溫育的過程中T細(xì)胞活化的重要機(jī)制是完整的。這與本 發(fā)明人先前的研究一致，所述先前的研究顯示細(xì)胞表面抗原CD69和CD25 (IL-2受體a-鏈)的表達(dá)在存在幽門螺旋菌上清液的條件下不減少。3另 夕卜，證明了 HPGGT對(duì)淋巴細(xì)胞的抑制功能受到與凋亡無關(guān)機(jī)制的介導(dǎo)， 因?yàn)橥ㄟ^Annexin V-FITC染色測量的磷脂酰絲氨酸的暴露，在存在幽門螺 旋菌上清液和重組HPGGT的條件下不增加。早期描述了 HPGGT誘導(dǎo)胃 上皮細(xì)胞中的氧化壓力和凋亡。12'16然而，先前沒有確定該酶對(duì)免疫系統(tǒng) 的細(xì)胞的作用，且觀察到的區(qū)別可以反映靶細(xì)胞之間的區(qū)別。
本發(fā)明人分析了在T細(xì)胞中用細(xì)胞周期進(jìn)展干擾HPGGT，并發(fā)現(xiàn) HPGGT通過引起細(xì)胞周期Gl階段中的停滯，抑制淋巴細(xì)胞的增殖。Gl 停滯的特征在于增多的Cdk-抑制子p27的量以及減低的細(xì)胞周期蛋白細(xì) 胞水平。Ras-和PDK-依賴性途徑在用它們的催化配偶體誘導(dǎo)、合成和裝 配D-型細(xì)胞周期蛋白的過程中非常重要。22'23 Ras-信號(hào)傳導(dǎo)的活化通過涉 及c-Raf和其他激酶的蛋白級(jí)聯(lián)誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白D-轉(zhuǎn)錄。24另外，確定 了誘導(dǎo)Ras信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致增強(qiáng)合成c-Myc蛋白25，這在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞生長、和轉(zhuǎn)化過程中起重要作用。26先前的研究證明了 PI3K-信號(hào)傳導(dǎo) 不依賴于T細(xì)胞中的Ras-信號(hào)傳導(dǎo)而進(jìn)行。17盡管重要介體PI3K-信號(hào)傳 導(dǎo)(AKT， p70S6K和Foxo3)的活化狀態(tài)在存在HPGGT的條件下不改變，我 們?cè)谟肏PGGT培養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了降低的c-Raf磷酸化和c-Myc蛋白水 平。因此，我們的數(shù)據(jù)提示由來自幽門螺旋菌的GGT引起的Ras-而非PI3K-依賴性信號(hào)傳導(dǎo)的中斷在誘導(dǎo)T細(xì)胞中細(xì)胞周期停滯的過程中起作用，從 而導(dǎo)致消除的細(xì)胞增殖。
另一個(gè)重要問題是酶，如HPGGT如何能夠影響導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和 抑制增殖的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)事件。在轉(zhuǎn)肽基反應(yīng)過程中，GGT催化Y-谷氨 ?；糠謴墓w轉(zhuǎn)移到受體基質(zhì)中。"通過系統(tǒng)氨基酸消耗分析，本發(fā)明 人發(fā)現(xiàn)在缺乏來自培養(yǎng)基的氨基酸谷氨酰胺的條件下完全消除HPGGT的 抑制作用，這提示來自幽門螺旋菌的GGT的抑制作用受到轉(zhuǎn)肽基作用過 程中形成代謝物的間接介導(dǎo)。這通過我們這樣的觀察得到支持，即與 HPGGT —起預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基并隨后在加入到細(xì)胞前使酶失活足以抑制淋巴 細(xì)胞增殖。
先前的研究描述了幽門螺旋菌的若干不同于GGT的因子，其抑制人 T淋巴細(xì)胞的增殖。Wang和同事顯示處于300的MOI (300個(gè)細(xì)菌/T細(xì) 胞)的幽門螺旋菌通過誘導(dǎo)凋亡，抑制T細(xì)胞的增殖。然而，這種高細(xì)菌 量是否接觸到人胃的固有層中的T細(xì)胞是不確定的。在我們先前的公開文 獻(xiàn)中(胃腸病學(xué)(Gastroenterology) 2005 2005;128(5):1327-39)，本發(fā)明 人顯示甚至比l (l個(gè)細(xì)菌/T細(xì)胞)低300倍的MOI足以在我們的系統(tǒng)中 抑制淋巴細(xì)胞增殖。當(dāng)與淋巴細(xì)胞一起培養(yǎng)的HP培養(yǎng)物上清液的濃度升 高超過100pg/ml時(shí)，觀察到與Wang等相似量的凋亡。這提示本文中所述 的HP對(duì)淋巴細(xì)胞的抑制作用與該小組所述的機(jī)制相比更明確 (pronounced)并且不同。
由Zabaleta等進(jìn)行另一項(xiàng)研究描述了細(xì)胞質(zhì)HP蛋白精氨酸酶抑制T 細(xì)胞增殖3、作者使用來自HP的全細(xì)胞溶解物，其包含細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)和 膜-結(jié)合蛋白。相反，本發(fā)明人使用來自HP包含其分泌的蛋白的培養(yǎng)物上 清液。由于HP不分泌精氨酸酶，所以該酶針對(duì)T細(xì)胞可能的抑制作用是 于此使用的系統(tǒng)中不可檢測的，且不太可能在體內(nèi)發(fā)生。Gebert等進(jìn)行的工作提示由幽門螺旋菌分泌的空泡細(xì)胞毒素A (VacA) 抑制T細(xì)胞增殖。作者使用了是我們?cè)谖覀兡壳肮ぷ髦惺褂脻舛?10pg/ml) 的25倍的濃度(250ng/ml)的細(xì)菌上清液。在先前的研究中，本發(fā)明人證明 了高HP培養(yǎng)物上清液濃度(2100嗎/ml)在淋巴細(xì)胞中誘導(dǎo)顯著量的凋亡。 另外，在我們的系統(tǒng)中存在或缺乏VacA對(duì)HP針對(duì)淋巴細(xì)胞的抑制沒有 影響(Gastro 2005)。
因此，不管前述由幽門螺旋菌引起T細(xì)胞抑制的其他方式，在本文 中使用的系統(tǒng)中，細(xì)菌分泌的GGT對(duì)抑制T細(xì)胞增殖是必需的和充分的。
總之，解釋本申請(qǐng)的數(shù)據(jù)提供一種由幽門螺旋菌應(yīng)用的免疫逃避的新 型機(jī)制，其利用分泌的蛋白質(zhì)抑制免疫效應(yīng)子細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)展。顯示 了酶GGT是造成幽門螺旋菌抑制T細(xì)胞增殖的原因，因?yàn)樵诩?xì)菌的GGT-缺陷型突變體中抑制作用完全消除。該作用明顯依賴于GGT的催化活性， 因?yàn)橹亟MHPGGT蛋白的酶失活突變體缺乏抑制T細(xì)胞增殖的能力。另外， 顯示了僅在存在來幽門螺旋菌的GGT條件下誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在T細(xì)胞 的Gl期。再一次，在不希望受到任何理論限制的條件下，其他結(jié)果指出 由HPGGT引起的Ras-而非PI3K-依賴性信號(hào)傳導(dǎo)的中斷是Gl停滯和抑制 的T細(xì)胞增殖的原因。將HPGGT鑒定為淋巴細(xì)胞抑制因子形成在動(dòng)物模 型中觀察的生物基礎(chǔ)，顯示HPGGT對(duì)于幽門螺旋菌定居的重要作用。在 WO 00/01825和WO98/17804中討論了 HPGGT及其在宿主細(xì)胞的定居中 的可能作用。然而，這兩篇文獻(xiàn)沒有提供這樣的證據(jù)，即HPGGT活性是 造成宿主免疫系統(tǒng)抑制的原因，且它們沒有記載HPGGT對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)T 細(xì)胞增殖和免疫抑制的影響。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)不僅所述HPGGT，優(yōu)選地，具有按照SEQ.ID.No.l的 氨基酸序列的野生型HPGGT，可以作為用于產(chǎn)生抗體、適體、和鏡像異 構(gòu)適體的抗原使用，而且其不同片段也可以，所述抗體、適體、和鏡像異 構(gòu)適體各自優(yōu)選地與所述抗原特異性結(jié)合，這適合于抑制HPGGT的特異 性活性禾卩/或?qū)α馨图?xì)胞增殖的淋巴細(xì)胞抑制的HPGGT依賴性抑制的消 除作用。
因此，在一方面，本發(fā)明涉及特異性多肽。所述多肽包括氨基酸序列， 其與HPGGT不同區(qū)域的一部分或一段氨基酸序列相同或相對(duì)應(yīng)。優(yōu)選地，HPGGT的氨基酸序列包括按照SEQ.ID.No.l的氨基酸序列。
優(yōu)選地用于本文時(shí)，如果氨基酸的序列或順序在氨基酸性質(zhì)和其彼此 間相對(duì)位置方面相同，則氨基酸序列與另一個(gè)氨基酸序列相同。
優(yōu)選地用于本文時(shí)，如果氨基酸的序列或順序在氨基酸性質(zhì)和其彼此 間相對(duì)位置方面相同，則氨基酸序列與另一個(gè)氨基酸序列相同。在另一個(gè) 實(shí)施方案中， 一致的序列的一級(jí)氨基序列是相同的。
如本文所優(yōu)選使用的，如果氨基酸的序列或順序在氨基酸性質(zhì)和其彼 此間相對(duì)位置方面相同，則氨基酸序列與另一個(gè)氨基酸序列相同。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，彼此對(duì)應(yīng)的序列的一級(jí)氨基酸序列相同，其中這兩個(gè)對(duì)應(yīng) 的氨基酸序列的全部鄰近序列(context)相同或不同。由該氨基酸序列的 一個(gè)或兩個(gè)末端相鄰的氨基酸定義氨基酸的全部鄰近序列。
本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該公認(rèn)彼此相同或?qū)?yīng)的序列具有至少80 %， 85%， 90%, 95 %或100 %的序列同源性。
在實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的多肽包括或由與HPGGT的一段保守氨 基酸序列相同或?qū)?yīng)的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，且對(duì)本發(fā)明的任何實(shí)施 方案和方面適用地，HPGGT具有按照SEQ.ID.No.l的氨基酸序列。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該公認(rèn)可以存在HPGGT的變體和突變體，其應(yīng)該包括在術(shù) 語HPGGT之內(nèi)。本發(fā)明還包括，如果HPGGT的序列與如SEQ.ID.No.l 中指定的HPGGT之一不同，則本文中關(guān)于具有如SEQ.ID.No.l中指定的 氨基酸序列的HPGGT所公開的內(nèi)容也適用于HPGGT的所述不同形式。 更具體地，本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該識(shí)別處于所述不同形式的氨基酸，其在 其位置、化學(xué)性質(zhì)和/或功能方面，與具有如SEQ.ID.No.l中指定的氨基酸 序列的HPGGT中確定的氨基酸和位置分別對(duì)應(yīng)。
如本文中公開地，按照本發(fā)明的多肽與HPGGT不同區(qū)域的氨基酸序 列相同或?qū)?yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述區(qū)域是由按照SEQ.ID.No.l的氨 基酸序列的氨基酸位置150-200定義的區(qū)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述 區(qū)域是由按照SEQ.ID.No.l的氨基酸序列的氨基酸位置410-480定義的區(qū) 域。
本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)由氨基酸150-200定義的HPGGT部分和由氨基 酸410-480定義的HPGGT部分特別有益于作為產(chǎn)生能夠抑制HPGGT的催化活性的抗體的抗原或疫苗使用，由此提供這樣的先決條件，即免疫應(yīng) 答是針對(duì)幽門螺旋菌，或至少針對(duì)受到幽門螺旋菌感染或處于其感染風(fēng)險(xiǎn) 中的生物體中的HPGGT引起的。
在不希望受到任何理論限制的條件下，本發(fā)明人假定由氨基酸位置
150-200和氨基酸位置410-480定義的區(qū)域都具有與HPGGT酶活性的特殊 關(guān)系。更具體地，認(rèn)為由氨基酸位置410-480定義的HPGGT區(qū)域與HPGGT 的活性中心有關(guān)或接近。更具體地，該HPGGT區(qū)域包括與所述活性中心 直接接觸的環(huán)區(qū)域和所述活性中心本身的一部分。因此，這部分HPGGT 的阻斷是抑制HPGGT酶活性的合適方法，大概是通過阻斷HPGGT催化 活性物質(zhì)的進(jìn)入。這些，在原則上，對(duì)于由氨基酸位置150-200定義的 HPGGT區(qū)域也是正確的。按照SEQ.ID.No.l的HPGGT的氨基酸位置 150-200的區(qū)域涉及或形成處于HPGGT活性中心外的環(huán)(的一部分)，然 而，其與底物的結(jié)合袋緊密空間接近。由于這些，所以任何特異干擾這些 區(qū)域的分子是如本文中更詳細(xì)描述地能夠關(guān)于具有這種類型結(jié)合特性的 抗體使用的試劑。除抗體外，可以分別產(chǎn)生和使用如現(xiàn)有技術(shù)中所述的肽 適體、抗促成素(anticaline)、適體和鏡像異構(gòu)適體，以獲得本文中關(guān)于 抗體公開的多種目的。
本申請(qǐng)?zhí)峁┒嚯?，其序列與下列氨基酸位置對(duì)應(yīng)或相同
(a) (150 + n) — (150 + n + m)，其中n是0-35之間的任何整數(shù)，且 m是15-30之間的任何整數(shù)。應(yīng)該理解由此定義的位置是由n和m的任意 組合產(chǎn)生的那些。還應(yīng)該理解所述組合優(yōu)選地僅限于這樣的范圍內(nèi)，即由 此定義的上游位置是約200;由(150 + n)定義的位置也稱為下游位置；且 由(150 + n + m)定義的位置也稱為上游位置。
(b) (410 + n) —(410 + n + m)，其中n是0-55之間的任何整數(shù)，且 m是15-30之間的任何整數(shù)。應(yīng)該理解由此定義的位置是由n和m的任意 組合產(chǎn)生的那些。還應(yīng)該理解所述組合優(yōu)選地僅限于這樣的范圍內(nèi)，即由 此定義的上游位置是約200;由(410 + n)定義的位置也稱為下游位置；且 由(410 + n + m)定義的位置也稱為上游位置。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的多肽是HPGGT的片段，優(yōu)選地， HPGGT的免疫原性片段，和更有效地，適合于在宿主生物體內(nèi)引起免疫應(yīng)答，優(yōu)選地抗體應(yīng)答的HPGGT免疫原性片段，其中所述抗體具有對(duì) HPGGT，更優(yōu)選地對(duì)HPGGT的特異性活性的抑制作用，和/或?qū)α馨图?xì) 胞增殖的HPGGT依賴性抑制的消除作用。優(yōu)選地，按照本發(fā)明的免疫原 性片段包括HPGGT的氨基酸451和或452。該片段可以是任何長度。然 而，使用10-約50個(gè)氨基酸殘基的肽，更優(yōu)選的10-40、 10-30，或最優(yōu)選 的10-20。為了基于肽的疫苗的設(shè)計(jì)，在此應(yīng)用表位預(yù)測算法。優(yōu)選地用 于本文時(shí)，宿主生物體是動(dòng)物，優(yōu)選地哺乳動(dòng)物，或人，其優(yōu)選地能夠針 對(duì)抗原形成免疫應(yīng)答。
優(yōu)選地用于本文時(shí)，氨基酸是a-氨基酸。也優(yōu)選地用于本文時(shí)，氨 基酸是D-或L-氨基酸，優(yōu)選地，L-氨基酸。更優(yōu)選地，氨基酸是天然存 在的氮基酸。
本發(fā)明人還意外地發(fā)現(xiàn)將HPGGT的絲氨酸殘基451和域452誘變 為丙氨酸完全消除重組HPGGT的酶活性，并消除其對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制。 然而，絲氨酸殘基385的取代(S385A)不減少對(duì)T細(xì)胞增殖的HPGGT 依賴性抑制作用，因管顯著降低這種突變HPGGT的催化活性(即，約 50%)。因此，治療幽門螺旋菌感染的合適藥物物質(zhì)需要滿足2個(gè)要求，即 (i)它必須表現(xiàn)出對(duì)HPGGT催化活性的抑制作用，且在與HPGGT—起 培養(yǎng)時(shí)還必須恢復(fù)T細(xì)胞增殖。按照本發(fā)明用于識(shí)別合適候選藥物的有效 方法因此包括這兩種評(píng)估。
由于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的另一方面涉及HPGGT失活形式的用途。 HPGGT的失活形式是HPGGT的一個(gè)實(shí)施方案，其缺乏如本文中所 示的HPGGT酶活性。本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該公認(rèn)，存在多種提供所述 HPGGT失活形式的方法，包括刪除一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸，改變一個(gè)或多個(gè) 氨基酸，總是與酶活性的HPGGT相比較。HPGGT失活形式的一個(gè)實(shí)施 方案是在按照SEQ.ID.No.l的氨基酸序列的位置451和452處缺少絲氨酸 氨基酸的HPGGT。在一個(gè)實(shí)施方案中，HPGGT的失活形式仍能夠引起如 本文中所述的免疫應(yīng)答，優(yōu)選地，動(dòng)物和/或人中的抗體應(yīng)答，其包括具有 對(duì)野生型HPGGT，更優(yōu)選地，對(duì)HPGGT的特異性活性的抑制作用和/或 對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑制的消除作用的抗體。優(yōu)選地用于本 文時(shí)，術(shù)語HPGGT的特異性活性與酶活性，和更具體地，如本文中所述的HPGGT的酶活性，.以同義方式使用。HPGGT失活形式的另一個(gè)實(shí)施 方案是具有野生型氨基酸序列的HPGGT，但通過向HPGGT的酶活性添 加抑制劑抑制酶活性。所述抑制劑可以是抗體、鏡像異構(gòu)適體、適體或剝 奪HPGGT的HPGGT酶活性所需的因子包括離子的任何分子。
應(yīng)該理解，多肽、HPGGT失活形式和HPGGT在本文中也稱為耙分 子，具體地，和與之特異結(jié)合的抗體、適體和鏡像異構(gòu)適體的產(chǎn)生有關(guān)。
本發(fā)明的另一方面涉及抗體，所述抗體針對(duì)按照本發(fā)明的多肽、 HPGGT的失活形式或HPGGT，優(yōu)選地典型具有按照SEQ.ID.No. 1的氨基 酸序列的野生型HPGGT。
本文中優(yōu)選使用的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體，其制備和產(chǎn)生 分別為本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所熟知。
特異于所述靶標(biāo)的抗體的制備是本領(lǐng)域中技術(shù)人員己知的，例如，記 述在Harlow, E,，和Lane, D.,"抗體:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)"("Antibodies: A Laboratory Manual,")冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷 泉港，紐約(Cold Spring Harbor, NY) ,(1988)中。優(yōu)選地，單克隆抗體可 以連同本發(fā)明使用，其可以按照K6hlei"和Milsteiii的方案和基于此的其他 發(fā)展方案而制備?？贵w，用于本文時(shí)，包括，但不僅限于，完全抗體、抗 體片段或衍生物，諸如Fab片段、Fc片段和單鏈抗體或抗促成素，只要它 們適合于且能夠結(jié)合于所述靶標(biāo)。除單克隆抗體外，也可以使用和/或生成 多克隆抗體。多克隆抗體的生成也是本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的，例如，記 述在Harlow, E.,和Lane, D.,"抗體:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)"("Antibodies: A Laboratory Manual,")冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring Harbor Laboratory),冷 泉港，紐約(Cold Spring Harbor, NY) ,(1988)中。優(yōu)選地，用于治療目的 的抗體是人源化的或人抗體。
按照本發(fā)明可以使用的抗體可以具有一個(gè)或數(shù)個(gè)標(biāo)記或標(biāo)簽。所述標(biāo) 記或標(biāo)簽可以在其診斷應(yīng)用或其治療應(yīng)用中有效檢測抗體。優(yōu)選地，所述 標(biāo)記和標(biāo)簽選自包含抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、生物素、金和熒 光素的組，并用在例如ELISA法中。這些和其他標(biāo)記以及方法，例如記述 在Harlow, E.,和Lane, D.,"抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)"("Antibodies: A Laboratory Manual,")冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港，紐約(Cold Spring Harbor, NY) ,(1988)中。另外地或備選地，本文中所述的抗 體以及任何其他靶拮抗劑或相互作用配偶體可以是如本文中更一般描述 的帶有標(biāo)簽的拮抗劑。
本發(fā)明還包括所述標(biāo)簽或標(biāo)記表現(xiàn)出除檢測以外的其他功能，諸如與 其他分子相互作用。所述相互作用可以是，例如與其他化合物的特異性相 互作用。這些其他化合物可以是使用抗體的系統(tǒng)如人或動(dòng)物體中所固有的 那些，或在通過使用各自抗體進(jìn)行分析樣品中固有的那些。合適的標(biāo)記可 以，例如，是生物素或熒光素，其具有其特異性相互作用配偶體，諸如抗 生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白等，所述配偶體存在于與由此標(biāo)記或帶有 標(biāo)簽的抗體相互作用的各種化合物或結(jié)構(gòu)上。而且，這也應(yīng)用于本文中所 述的其他靶相互作用配偶體，諸如適體和鏡像異構(gòu)適體。
在實(shí)施方案中，所述抗體是具有針對(duì)HPGGT表位的特異性活性的抗 體，優(yōu)選地單克隆抗體，其包括重組HPGGT的氨基酸451和/或452。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體應(yīng)該靶向在空間上接近這些氨基酸位置的表 位，優(yōu)選地，靶向并特異結(jié)合于鄰近所述位置的環(huán)，更優(yōu)選地，所述表位 由下述序列所定義或包含在下述序列中由SEQ.ID.No. 1的HPGGT氨基 酸位置150-200，更優(yōu)選地，位置174-190定義的這段HPGGT序列，或通 過SEQ.ID.No. 1的HPGGT氨基酸位置410-480，更優(yōu)選地，位置423-443 所定義的這段HPGGT序列，和其在這樣的附帶條件下的衍生物，所述附 帶條件是它們顯示基本相同的免疫反應(yīng)性。
優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體以至少50%,更優(yōu)選地至少70%,最優(yōu)選地至少 80或90%,抑制HPGGT特異性活性并抑制宿主中淋巴細(xì)胞增殖的HPGGT 依賴性抑制。還優(yōu)選地，體外評(píng)估時(shí)，按照本發(fā)明的抗體還表現(xiàn)出對(duì) HPGGT特異性活性的抑制作用，并消除T細(xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑 制。
按照本發(fā)明可以 以與所述抗體相同方式并由此為了相同目的使用的 另一類相互作用配偶體是所謂的"抗促成素"，其為耙結(jié)合多肽的特殊形 式。其中，抗促成素及其制備方法，記述在德國專利申請(qǐng)DE 197 42 706 中。
可以以與所述抗體相同的方式并由此為了相同的目的使用的另一類分子是所謂的肽-適體。利用靶標(biāo)，可以使用篩選方法生成肽適體，所述篩選方法利用如本文中更詳細(xì)描述的多肽文庫。選擇標(biāo)準(zhǔn)是分泌的多肽實(shí)際上并特異地結(jié)合于所述靶標(biāo)。
更特別地，可以通過利用按照現(xiàn)有技術(shù)的方法，諸如噬菌體展示生成所述肽適體?；旧?，生成肽文庫，諸如處于噬菌體形式，且這類文庫與靶分子接觸。隨后，從各個(gè)反應(yīng)中去除這些結(jié)合靶分子的肽，優(yōu)選地，作為與靶分子的復(fù)合物。本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知結(jié)合特征，至少在一定程度上，依賴于具體實(shí)行的實(shí)驗(yàn)設(shè)置，諸如鹽濃度等。在將以較高親和性或較大強(qiáng)度結(jié)合靶分子的那些多肽與所述文庫中的非-結(jié)合成員分開后，且任選地，還在從耙分子和多肽的復(fù)合物中去除靶分子后，可以隨后表征各個(gè)多肽。表征前，任選地，實(shí)行擴(kuò)增步驟，諸如，例如，通過增殖編碼所述多肽的噬菌體。表征優(yōu)選地包括測序所述靶結(jié)合多肽，和最后對(duì)作為如本文中定義的靶標(biāo)的拮抗劑或相互作用配偶體的多肽進(jìn)行測序?；旧?，所述多肽不受其長度的限制，然而，優(yōu)選地，具有約8-20個(gè)氨基酸長度的多肽是在各種方法中優(yōu)選獲得的。所述文庫的尺寸可以是約102-1018，優(yōu)選地，108-1015個(gè)不同的多肽，然而，不受其限制。
本發(fā)明的另一方面涉及針對(duì)按照本發(fā)明的多肽，HPGGT的失活形式或HPGGT，優(yōu)選地，典型地具有按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的野生型HPGGT的適體。
適體是單鏈或雙鏈的D-核酸，且其與靶分子特異性相互作用。適體的制備或選擇，例如，記述在歐洲專利EP0 533 838中。基本上，實(shí)行下列步驟。第一，提供核酸混合物，即潛在的適體，其中每種核酸典型地包括若干，優(yōu)選地至少8個(gè)隨后的隨機(jī)化核苷酸的區(qū)段。該混合物隨后與靶分子接觸，其中與候選混合物相比，所述核酸，諸如基于對(duì)所述靶標(biāo)增強(qiáng)的親和性或與其更大的強(qiáng)度結(jié)合靶分子。隨后將結(jié)合核酸從混合物的殘余物中分離。任選地，利用，例如聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增由此獲得的核酸。這些步驟可以重復(fù)若干次，從而最終提供具有增高比例的特異性結(jié)合于靶標(biāo)的核酸的核酸混合物，然后任選地從所述核酸混合物中選擇最終結(jié)合核酸。這些特異性結(jié)合核酸指適體。顯然地，在生成或識(shí)別適體的方法的任何階段，可以采用各種核酸的混合物樣品，利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定其序列。本發(fā)明包括可以固定適體，諸如，例如通過引入定義的化學(xué)基，這些化學(xué)基是生成適體技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員己知的。所述修飾可以例如存在于核苷酸糖部分的2'-位置處的氨基引入中。目前使用適體作為治療和診斷劑。然而，本發(fā)明還包括由此選擇或生成的適體可以用于耙標(biāo)確認(rèn)和/或用作開發(fā)藥物，優(yōu)選地基于小分子的藥物的引導(dǎo)物質(zhì)。這實(shí)際上是通過競爭測定完成的，其中靶分子和適體之間的特異性相互作用受到候選藥物的抑制，其中根據(jù)從靶標(biāo)和適體的復(fù)合物中替換適體，可以假定各種候選藥物容許特異性抑制靶標(biāo)和適體之間的相互作用，且如果該相互作用是特異性的，則所述候選藥物應(yīng)該，至少原則上，適合于阻斷所述靶標(biāo)并由此在包括所述耙標(biāo)的各種系統(tǒng)中降低其生物學(xué)有效性或活性。然后，由此獲得的小分子可以進(jìn)行進(jìn)一步的衍生化和修飾，從而最優(yōu)化其物理、化學(xué)、生物學(xué)和/或醫(yī)學(xué)特性，諸如毒性、特異性、生物降解能力和生物有效性。
本發(fā)明的另一方面涉及針對(duì)按照本發(fā)明的多肽，HPGGT的失活形式或HPGGT，優(yōu)選地，典型地具有按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的野生型HPGGT的鏡像異構(gòu)適體。
鏡像異構(gòu)適體是特殊形式的適體?？梢园凑毡景l(fā)明利用所述耙標(biāo)使用
或生成的鏡像異構(gòu)適體的生成或制備基于相似的原則。鏡像異構(gòu)適體的制
備記述在國際專利申請(qǐng)WO 98/08856中。鏡像異構(gòu)適體是L-核酸，這意
味著它們由L-核苷酸組成，而不是向適體那樣由D-核苷酸組成。鏡像異
構(gòu)適體的特征在于這樣的事實(shí)，即它們?cè)谏飳W(xué)系統(tǒng)中具有非常高的穩(wěn)定
性，且類似于適體，與它們針對(duì)的靶分子特異性相互作用。為了生成鏡像
異構(gòu)適體的目的，在存在例如所述靶標(biāo)的天然存在的L-對(duì)映異構(gòu)體的D-
對(duì)映異構(gòu)體的情形中，創(chuàng)建了D-核酸的異源群體，且該群體與耙分子的光
學(xué)對(duì)映體接觸。隨后，分離不與靶分子的光學(xué)對(duì)映體相互作用的那些D-
核酸。然而，對(duì)與靶分子的光學(xué)對(duì)映體相互作用的那些D-核酸進(jìn)行分離、
任選地確定和/或測序，并且隨后基于獲自D-核酸的核酸序列信息合成相
應(yīng)的L-核酸。這些與前述與靶分子的光學(xué)對(duì)映體相互作用的D-核酸序列
相同的L-核酸應(yīng)該與天然存在的靶分子，而非其光學(xué)對(duì)映體特異性相互作
用。類似于生成適體的方法，還可能重復(fù)所述多種步驟若干次，并由此富集與靶分子的光學(xué)對(duì)映體特異性相互作用的那些核酸。在另一方面，本發(fā)明涉及免疫原性組合物。所述免疫原性組合物包括至少一種按照本發(fā)明的多肽和/或HPGGT的失活形式，具體地，如本文中
所述的HPGGT失活形式，和/或野生型HPGGT。應(yīng)該理解所述按照本發(fā)明的多肽和/或所述HPGGT的失活形式，具體地如本文中所述的HPGGT失活形式，和/或所述野生型HPGGT，在一個(gè)實(shí)施方案中，綴合于載體物質(zhì)，諸如KLH或匙孔血藍(lán)蛋白、BSA、卵清蛋白等，從而以這樣的方式對(duì)宿主的免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)各自的抗原，所述方式容許或促進(jìn)引起免疫應(yīng)答和引起高滴度抗體。
應(yīng)該理解，根據(jù)本發(fā)明，可以體外或體內(nèi)使用免疫原性組合物。在后者的情形中，所述免疫原性組合物典型地是疫苗，且優(yōu)選地配置為所述疫苗。免疫原性組合物、包括所述免疫原性組合物的藥物和疫苗，分別可以用于預(yù)防幽門螺旋菌感染，優(yōu)選地，在兒童中，或用于治療和/或預(yù)防患有或處于患有幽門螺旋菌感染和由所述生物體引起或與其相關(guān)的任何疾病的風(fēng)險(xiǎn)中動(dòng)物和人。
在實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包括一種或數(shù)種佐劑。優(yōu)選地，佐劑是提供免疫系統(tǒng)一般剌激的試劑。佐劑是本領(lǐng)域中已知的，且包括，但不僅限于，聚陽離子多聚體、免疫刺激脫氧核苷酸(ODN)、合成KLK肽、神經(jīng)活性化合物、alumn、弗氏完全或不完全佐劑、霍亂毒素。優(yōu)選地，聚陽離子多聚體是聚陽離子肽和/或其中神經(jīng)活性化合物是人生長激素。
在另一方面，免疫原性組合物包括幽門螺旋菌的外膜蛋白，諸如BabA、 HpaA、 Omp 18和其組合物。HpaA和Ompl8，例如，記述在Volandp.等.，感染和免疫性(Infection and Immunity) , 2003年7月，3837-3843頁中。本發(fā)明包括術(shù)語BabA,HpaA和Omp18，該術(shù)語不僅包括全長多肽，還包括其任何的免疫原性片段或肽。HpaA是推定的N-乙酰神經(jīng)氨糖酸基乳糖(N-acetylneumminyllactose)-結(jié)合血凝素，Bab A是與路易斯血型抗原結(jié)合的黏著蛋白。應(yīng)該理解，其他抗原和優(yōu)選地蛋白質(zhì)和多肽，和其各自的片段，可以用于增加針對(duì)幽門螺旋菌的免疫應(yīng)答?？梢栽诒景l(fā)明的實(shí)施方案中使用的優(yōu)選蛋白質(zhì)和多肽，分別是外膜蛋白，所述外膜蛋白典型地被引入幽門螺旋菌的外質(zhì)膜中，并對(duì)例如，離子運(yùn)輸、粘著、結(jié)構(gòu)和滲透穩(wěn)定性和細(xì)菌毒力很重要。
可以獲自幽門螺旋菌和可以是按照本發(fā)明的免疫原性組合物的一部
分的其他抗原是記述在公開的美國專利申請(qǐng)20070042448中的那些。
應(yīng)該承認(rèn)，優(yōu)選地配制本發(fā)明的多肽和蛋白質(zhì)，包括HPGGT的失活形式和野生型HPGGT，以及本文中所述的意欲施用于動(dòng)物或人體的任何其他化合物。所述制劑是本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑如美國專利6,838,089中所述。該美國專利中所述的制劑是包括許多多聚體粒子的遞送系統(tǒng)，其中不溶于水的蛋白質(zhì)抗原與所述多聚體粒子結(jié)合，所述多聚體粒子包括基質(zhì)多聚體，其包括一種或多種同聚物和/或共聚物，其中所述方法包括(a)混合水相(W)和有機(jī)相(0)，所述水相包括處于其臨界微團(tuán)濃度的0.1-100倍濃度的不溶于水的試劑諸如蛋白質(zhì)和一種或多種親水性表面活性劑，所述有機(jī)相包括處于有機(jī)溶劑中的基質(zhì)多聚體，所述溶劑不變性蛋白質(zhì)抗原且其中O與W不混溶，從而產(chǎn)w/o乳劑，其中W或O或二者還包括一種或多種穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑在混合前加入，從而在存在增溶劑的條件下穩(wěn)定w/o乳劑，并在步驟(b)
過程中促進(jìn)多聚體粒子中的不溶于水的蛋白質(zhì)的引入；和(b)通過將所述乳劑分散在流動(dòng)的基質(zhì)中而形成所述W/0乳劑的小滴，和從所述W/O乳劑小滴的O相中去除所述溶劑，從而形成引入不溶于水的蛋白質(zhì)抗原的多聚體粒子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，關(guān)于本文中所述的試劑和化合物的制劑和遞送試劑是微球系統(tǒng)，諸如，如美國專利6,372260中所述的那些。
在本發(fā)明的一方面，按照本發(fā)明的多肽、HPGGT的失活形式、抗體、鏡像異構(gòu)適體和適體、包括按照本發(fā)明的任意這些的免疫原性組合物、藥物組合物優(yōu)選地用于預(yù)防和/或治療由幽門螺旋菌引起的或與之相關(guān)的，更優(yōu)選地由幽門螺旋菌感染引起的疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病是由幽門螺旋菌感染引起的胃與十二指腸病癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病是胃炎，大部分慢性胃炎。由于慢性胃炎涉及胃或十二指腸潰瘍或甚至胃癌和MALT淋巴瘤的發(fā)病機(jī)理，本發(fā)明的方法和以上試劑可以用于預(yù)防這些疾病。其還可以用于治療，例如胃和十二指腸潰瘍病和(MALT)淋巴瘤。按照本發(fā)明，使用一般術(shù)語"治療"一 除非另外明確定義一 作為任何形式的治愈、減輕、診斷或預(yù)防病理學(xué)病癥。
在另一方面，本發(fā)明和關(guān)于其對(duì)淋巴細(xì)胞增殖，具體地T細(xì)胞增殖
的抑制作用，HPGGT在宿主中誘導(dǎo)免疫抑制，并由此可以作為新型免疫
抑制劑來應(yīng)用。免疫抑制劑可以，例如，用于減小移植后的器官移植排異風(fēng)險(xiǎn)，或用于治療自體免疫疾病，諸如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性回腸炎或特
應(yīng)性濕疹。HPGGT的催化活性需要存在谷氨酰胺，以起到y(tǒng)谷氨?；墓w/受體的作用。因此，包括HPGGT的免疫抑制劑組合物優(yōu)選地還包括
谷氨酰胺。
而且，本發(fā)明人可以顯示用谷氨酰胺、亮氨酸和組氨酸和活性HPGGT預(yù)培養(yǎng)應(yīng)用于淋巴細(xì)胞增殖測定的細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)T細(xì)胞表現(xiàn)出抗-增殖作用，甚至在隨后對(duì)HPGGT進(jìn)行失活時(shí)。因此，總結(jié)出免疫抑制作用是HPPGT依賴性的；然而，尚未確定該作用模式中涉及酶反應(yīng)的直接或間接產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及能夠通過優(yōu)選地，在藥用培養(yǎng)基中，培養(yǎng)HPGGT和谷氨酰胺、亮氨酸和組氨酸和容許HPGGT特異性反應(yīng)獲得的免疫抑制組合物。然后將該反應(yīng)的上清液作為合適的免疫抑制組合物應(yīng)用。優(yōu)選地，該組合物包括谷氨?；?肽，例如，通過向所述物質(zhì)轉(zhuǎn)移谷氨?；a(chǎn)生的多-谷氨?；?谷氨酸(glutamate)或谷氨?；?衍生物。
本發(fā)明包括根據(jù)這個(gè)方面使用的HPGGT是任何具有本文中所述的特異性酶活性的HPGGT。在這種情況下，術(shù)語HPGGT包括野生型HPGGT、全長HPGGT和任何的衍生物和更特別地，其具有這種酶活性的任何片段。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可以通過利用本領(lǐng)域中熟知的方法生產(chǎn)所述衍生物和片段。
優(yōu)選地用于本文時(shí)，術(shù)語促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖意指在優(yōu)選的實(shí)施方案中促進(jìn)淋巴細(xì)胞的活化和增殖。
在另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)HPGGT，更具體地重組HPGGT的方法，所述重組HPGGT缺乏分泌序列(信號(hào)肽)或具有非-功能性分泌序列。所述缺乏功能性分泌序列，即氨基酸1-26，在pos. 26和27: LSA-AS之間的分裂位點(diǎn)的HPGGT有利地屬于這樣的范圍，即所述HPGGT在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生過程中不從所述宿主細(xì)胞中分泌出來。根據(jù)這個(gè)方面，宿主生物體優(yōu)選地是原核生物，諸如大腸桿菌(E.coli)，然而，不局限于此。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知制備所述缺乏功能性分泌序列的HPGGT的方法。例如，這可以通過表達(dá)編碼無分泌前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)的基因而實(shí)現(xiàn)。
所述修飾的HPGGT蛋白應(yīng)該保持在其宿主細(xì)胞中，并由此可以從中純化出來。
在另一方面，本發(fā)明涉及按照本發(fā)明的多肽和按照本發(fā)明的失活HPGGT用于制備抗體的用途。在密切相關(guān)的方面，用于免疫動(dòng)物，從而分別產(chǎn)生抗體和提供起始細(xì)胞和細(xì)胞系，產(chǎn)生本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的雜交瘤細(xì)胞系。本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)可以進(jìn)一步培養(yǎng)和進(jìn)一步選擇所述雜交瘤。因此，本發(fā)明還包括按照本發(fā)明的多肽和按照本發(fā)明的活性和失活HPGGT用于篩選測定，從而識(shí)別產(chǎn)生針對(duì)和/或特異性結(jié)合按照本發(fā)明的多肽和按照本發(fā)明的失活HPGGT的抗體的那些雜交瘤細(xì)胞系。具體地，可以通過應(yīng)用HPGGT活性測定進(jìn)行篩選來選擇雜交瘤，從而識(shí)別產(chǎn)生消除HPGGT催化和抑制功能的抗體的雜交瘤。
在另一方面，本發(fā)明涉及編碼按照本發(fā)明的多肽和按照本發(fā)明的失活HPGGT的核酸。本領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)已知在宿主生物體中是遺傳密碼和，任選地密碼子來表示所述核酸，本領(lǐng)域中的技術(shù)人員可以制備所述核酸。在另一方面，所述核酸包含在載體，優(yōu)選地表達(dá)載體中。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語載體包括質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體和通常用于遺傳工程領(lǐng)域中的其他載體。在另一方面，本發(fā)明涉及包括所述載體的宿主生物體。在實(shí)施方案中，所述宿主生物體和具體地宿主細(xì)胞是重組宿主細(xì)胞，其瞬時(shí)或穩(wěn)定地包含本發(fā)明的核酸分子或載體。理解宿主細(xì)胞或宿主生物體是能夠吸收體外重組DNA并，如果是這種情形，則合成由本發(fā)明核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的生物體。優(yōu)選地，這些細(xì)胞是原核或真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的宿主細(xì)胞的特征在于這樣的事實(shí)，即引入的本發(fā)明的核酸分子對(duì)于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞而言是異源的，即它不天然存在于這些細(xì)胞中，或局限于基因組中的一個(gè)位置，該位置與相應(yīng)的天然存在的序列的位置不同。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及分離的蛋白質(zhì)，其表現(xiàn)出HPgGT，優(yōu)選地，其中正常存在的分泌序列被除去或是非-功能性的，并由本發(fā)明的核酸分子編碼的HPgGT的生物學(xué)性質(zhì)，以及涉及用于它們的生產(chǎn)的方法，其中，例如，在容許合成所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞和隨后從培養(yǎng)的細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離所述蛋白質(zhì)。重組生成的蛋白質(zhì)的分離和純化可以通過常規(guī)方法，包括制備性層析法和涉及單克隆或多克隆抗體親合層析法的親合和免疫學(xué)分離執(zhí)行。用于本文時(shí)，術(shù)語"分離的蛋白質(zhì)"包括基本無與之天然結(jié)合的其他蛋白、核酸、脂質(zhì)、碳水化合物或其他物質(zhì)的蛋白。然而，所述蛋白質(zhì)不僅包括重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，還包括分離的天然存在的蛋白質(zhì)、合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、或通過這些方法的組合產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。用于制備所述蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的。本發(fā)明的蛋白質(zhì)優(yōu)選地處于基本純化的形式。
因此，本發(fā)明還涉及在原核或真核宿主細(xì)胞制造蛋白質(zhì)的一般方法，外部應(yīng)用時(shí)對(duì)所述細(xì)胞是有害的，所述方法包括(a)在一定條件下培養(yǎng)用編碼所述蛋白質(zhì)的核酸序列轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，所述蛋白質(zhì)具有刪除的或非-功能性分泌信號(hào)序列，所述條件是表達(dá)所述蛋白質(zhì)；和(b)從所述細(xì)胞中回收所述蛋白質(zhì)。也對(duì)用編碼按照本發(fā)明的多肽的核酸轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞應(yīng)用相同的方法，所述多肽是可以從所述細(xì)胞中回收的。
應(yīng)該理解，優(yōu)選地，可以將按照本發(fā)明的抗體、抗促成素、肽適體、
適體和鏡像異構(gòu)適體認(rèn)作為針對(duì)幽門螺旋菌的Y谷氨?；D(zhuǎn)肽基酶(HPGGT)的配體。
本發(fā)明包括術(shù)語野生型HPGGT或相似的表述優(yōu)選地意指野生型的HPGGT，其缺乏分泌序列，但是是催化活性的，更具體地，催化本文中關(guān)于HPGGT所述的酶反應(yīng)。
現(xiàn)在通過附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，從所述附圖和實(shí)施例可以獲得其他特征、實(shí)施方案和優(yōu)點(diǎn)。


圖1A是一個(gè)表，其指示根據(jù)Kim等和Bumann等9'1Q，從幽門螺旋菌中分泌的具有分子量30-66kDa的蛋白。
圖1B是銀染色后的SDS-PAGE，顯示了來自大小排阻層析的洗脫餾分中的蛋白質(zhì)，其中只有餾分b-f抑制了人T細(xì)胞的增殖，而所有其他餾分沒有；由箭頭標(biāo)記了與餾分的抑制特征相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)條帶。
圖1C是柱形圖，表示通過如實(shí)施例1中所述的分光光度測定確定的凝膠過濾餾分的酶GGT活性。(HP-幽門螺旋菌)。圖2A-C是柱形圖，顯示在通過311-胸苷引入測定確定存在或缺乏指定的HPSN的條件下受刺激的PBMC(A)和分離的初級(jí)人T淋巴細(xì)胞(C)的細(xì)胞增殖；構(gòu)建的敲除株的GGT表現(xiàn)型是通過酶活性測定和利用針對(duì)大GGT-亞單位的多克隆抗體的免疫印跡證實(shí)的(B)。為了免疫印跡，使用了 30jiig的HPSN蛋白。對(duì)抗-VacA抗體的免疫印跡用作裝載對(duì)照(見插入圖)。數(shù)據(jù)表示三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值± SD。認(rèn)為如通過StudenU-檢驗(yàn)確定的+P值〈001是顯著的。(m^幽門螺旋菌，SN:上清液，WT-野生型)。
圖3A和B描述對(duì)純化的具有針對(duì)其大亞單位的抗-GGT抗體的重組HPGGT餾分銀染色(A)和免疫印跡(B)后的凝膠，其顯示了 GGT的處理。星號(hào)表示***原-形式，**大和*小亞單位。
圖3C-3E是柱形圖，其顯示由大腸桿菌中表達(dá)的重組HPGGT(rHPGGT)引起的酶活性(C)和人PBMC的增殖抑制(D)。作為對(duì)照使用的來自大腸桿菌的LPS不抑制PBMC增殖。重組HPGGT在pH 2-10顯示出催化活性(E)。數(shù)據(jù)表示三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士 SD。認(rèn)為如通過StudenU-檢驗(yàn)確定的申P(guān)值〈.001是顯著的。(FT-流經(jīng)，ffi^幽門螺旋菌)。圖4A-D是柱形圖，顯示從馬腎中純化的GGT表現(xiàn)出催化GGT活性
(A) 但缺乏針對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖-抑制作用(B)。重組HPGGT在Ser451/452 (S451/452A)處的位點(diǎn)定向誘變消除GGT酶活性(A)和抑制作用
(B) 。用阿西維辛(50pM)在37。C預(yù)培養(yǎng)HPWTSN2小時(shí)消除GGT活性
(C) 和PBMC增殖的抑制(D)。數(shù)據(jù)表示三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值士SD。認(rèn)為如通過Studentf-檢驗(yàn)確定的申P(guān)值<.05是顯著的。(HP-幽門螺旋菌，SN-上清液，WT-野生型)。
圖5A和B是圖表，顯示由PBMC產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-2 (A)和IFN-y(B)，如實(shí)施例中所述地，這是在通過ELISA24小時(shí)后測量的。數(shù)據(jù)表示三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土 SD。指示通過Student ,-檢驗(yàn)確定的P值。
圖5C描述Jurkat T細(xì)胞的FACS-分析結(jié)果，所述Jurkat T細(xì)胞是如所示(灰色曲線)處理了24小時(shí)，并用膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙錠染色的。通過測試10000個(gè)事件的FACS-分析確定凋亡Jurkat T細(xì)胞的比率?？拱┧幮切捂呔?空白曲線)，用作陽性對(duì)照，在lpM的濃度時(shí)強(qiáng)烈誘導(dǎo)凋亡。(^>=幽門螺旋菌，WT^野生型)。
圖6A顯示在存在或不存在指定的HPSN的條件下處理了 24小時(shí)的JurkatT細(xì)胞的細(xì)胞周期分析結(jié)果。描述了處于Gl-期(左下)、早和晚S-期(左上和右上)和G2-期(右下)中的細(xì)胞的百分比(y-軸BrdU-FITC;x-軸PI)。通過免疫印跡在相同細(xì)胞中確定細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的細(xì)胞水平。
圖6B是獲自107 PBMC的蛋白質(zhì)的SDS PAGE,所述PBMC是在不同濃度的HPWT和HPAGGTSN或rHPGGT中培養(yǎng)了 24小時(shí)和48小時(shí)并隨后被溶解的。通過SDS-PAGE分離并通過免疫印跡分析35pg總蛋白。利用相應(yīng)的抗體確定指定的蛋白質(zhì)的水平。以相似結(jié)果重新數(shù)據(jù)2次。(HP-幽門螺旋菌，SN-上清液，WT:野生型)。
圖7是來自幽門螺旋菌陽性(泳道l-9)和陰性(泳道10-14)的血清的免疫印跡，其中通過如實(shí)施例1中所述的免疫印跡測試患者是否存在針對(duì)HPGGT的抗體。使用兔抗-GGT抗體(aGGT)作為陽性對(duì)照。星號(hào)表示HPGGT蛋白的"f原-形式和**大亞單位。
圖8是柱形圖，顯示HPGGT抑制淋巴細(xì)胞增殖依賴于谷氨酰胺，但不受谷氨酸或g-谷氨?；劝滨０罚膊皇芄劝滨０废牡慕閷?dǎo)。用PMA/伊屋諾霉素(除基礎(chǔ)外的所有)刺激并如所示處理PBMC。以2pg/ml使用的Rek. HPGGT在24小時(shí)后失活。然后，改變培養(yǎng)基并在刺激后，將HPGGT-處理的培養(yǎng)基加入到PBMC中。同時(shí)(未顯示)或也在24小時(shí)后，以2mM加入谷氨酰胺，從而研究可能的谷氨酰胺消耗。BPMC刺激后加入谷氨酸或g-谷氨?；劝滨０罚瑥亩芯靠赡艿囊种谱饔?。不具有(w/o)谷氨酰胺的氨基酸用于顯示抑制作用對(duì)谷氨酰胺的依賴性。
圖9是圖表，顯示來自免疫的或感染的小鼠的血清對(duì)HPGGT酶活性的抑制作用。小鼠受到指定的制劑的免疫，或接受PBS作為對(duì)照，或受到活的幽門螺旋菌的感染。免疫或感染后6周時(shí)，從尾靜脈獲取血清，并分析針對(duì)GGT催化活性的抑制活性。CT—GGT，可溶性CT和失活GGT蛋白，[CT—GGT]enc，包封在微球中的CT和失活GGT蛋白。
實(shí)施例1:材料和方法
細(xì)菌培養(yǎng)。本研究中使用的幽門螺旋菌野生型菌株G27 WT (VacA+cagA+)獲自A. Covacd (IRIS,錫耶納，意大利)。將該細(xì)菌培養(yǎng)在增補(bǔ)了前述登特增補(bǔ)劑抗生素混合物的(Dent supplement antibiotic mix) (Oxoid,Wesel,德國)Wilkins-Chalgren或腦心浸液(BHI)板上。29在增補(bǔ)了 10%FCS(西格瑪，慕尼黑，德國)和1。/。登特增補(bǔ)劑的BHI肉湯中進(jìn)行HP的液體培養(yǎng)。為了生產(chǎn)HP上清液，使細(xì)菌在板上生長48小時(shí)，在磷酸鹽緩沖液
(PBS)中清洗3次，并調(diào)節(jié)至OD6,m為K對(duì)應(yīng)于大約2xl()S個(gè)細(xì)菌/ml)。在微需氧條件下，在PBS中劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)所述細(xì)菌2小時(shí)，并通過隨后以3000xg和10000xg離心步驟沉淀去除細(xì)菌和膜。隨后，利用超濾濃縮上清液(Amicon UltraMWCO 10kDa,微孔(Millipore) , Schwalbach,德國)。以牛血清清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，通過布氏測定(Bradfordassay) (Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室
(Bio-Rad Laboratories) ， Richmond, VA)測量上清液的總蛋白含量，并保存在-80。C。在Luria肉湯(LB)瓊脂板(USB, Cleveland, OH)上，并且對(duì)于液體培養(yǎng)物在具有相關(guān)抗生素的LB肉湯中(USB)培養(yǎng)大腸桿菌。
幽門螺旋菌上清液的凝膠過濾層析。如上所述制備來自幽門螺旋菌野生型菌株G27的上清液。如前所述進(jìn)行大小排阻層析3。簡要地，將500)ig蛋白質(zhì)加載到Superdex 200 10/300柱(GE衛(wèi)生保健(GE Healthcare),慕尼黑，德國)上，并在4。C用脫氣的PBS洗脫。標(biāo)準(zhǔn)蛋白a-淀粉酶(200kDa),乙醇脫氫酶(150 kDa),牛血清清蛋白(66 kDa)，和碳酸酐酶(29 kDa)用于進(jìn)行洗脫的蛋白質(zhì)的分子量評(píng)估。如下所述測試每種餾分的增殖抑制和GGT活性。
生成GGT突變菌株。通過天然轉(zhuǎn)化將GGT k.o.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到幽門螺旋菌菌株G27中。在包含25 jug/ml卡那霉素(西格瑪)的瓊脂板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株。3天后，挑取克隆并涂布在具有卡那霉素的新鮮瓊脂板上。質(zhì)粒的插入是通過細(xì)菌 DNA 的 PCR (引物有義鏈5'-AAACGATTGGCTTGGGTGTGATAG-3' (SEQ.ID.No.6); 反義鏈5'-GACCGGCTTAGTAACGATTTGATAG-3' (SEQ.ID.No.7))和來自幽門螺旋菌AGGT上清液的蛋白質(zhì)的Western印跡證實(shí)的。
細(xì)胞培養(yǎng)如前所述進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)的分離3。在37。C，5% C02下培養(yǎng)所有的細(xì)胞。在具有10% FCS的RPMI 1640 (Invitrogen,Karlsruhe，德國)中培養(yǎng)Jurkat T細(xì)胞和PBMC。在增補(bǔ)了 10%馬血清(Cambrex， Verviers,比利時(shí))的DMEM(Invitrogen)培養(yǎng)EL-4 T細(xì)胞。
分離初級(jí)人T淋巴細(xì)胞。通過按照制造商的說明書，使用PanT細(xì)胞分離試劑盒II (Miltenyi生物技術(shù)(Miltenyi Biotech) , Bergisch Gladbach，德國)，通過陰性選擇，從來自未感染幽門螺旋菌的健康志愿者的暗黃覆蓋層或肝素化的外周靜脈血中分離初級(jí)人T細(xì)胞。
細(xì)胞增殖測定在96-孔平底板的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞(l()SpBMC,純化的初級(jí)T細(xì)胞或104 Jurkat/EL-4細(xì)胞/孔)。用PMA(20ng/ml;西格瑪)和伊屋諾霉素(100ng/ml;西格瑪)一式三份地刺激PBMC，并使所有細(xì)胞在具有或不具有指定的幽門螺旋菌上清液或重組蛋白的總蛋白濃度下生長。如上所述用PMA/伊屋諾霉素或用處于1個(gè)珠/T細(xì)胞的抗-CD3/CD28珠(Invitrogen)刺激初級(jí)人T細(xì)胞。48小時(shí)后，使用Packard直接(3計(jì)數(shù)器矩陣9600 (Packard Direct Beta Counter Matrix 9600) (Packard儀器公司(Packard Instruments Co) ， Downer's Grove, IL)，通過甲基-[3司-胸苷(GEHealthcare)的引入確定細(xì)胞增殖。
制備重組蛋白。按照制造商的說明書，將幽門螺旋菌的GGT蛋白表達(dá)為6xHis-標(biāo)記的蛋白質(zhì)(Qiagen，Hilden,德國)。通過PCR擴(kuò)增來自幽門螺旋菌的 GGT 蛋白的編碼區(qū)(引物有義鏈5'-TGAAAGGAAAACCCATGGGACGGAG-3' (SEQ:ID.No.8);反義鏈5'-CAAAGGTACCAAATTCTTTCCTTGG-3' (SEQ，ID.No.9))。通過瓊脂糖凝膠電泳分離并通過凝膠提取純化PCR產(chǎn)物(Qiagen)。然而，用Ncol和Kpnl (新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(New England Biolabs) , Ipswich, MA)對(duì)其進(jìn).行限制性酶切，并隨后在重新-純化后將其連接到pQE-Tri系統(tǒng)載體(Qiagen)中。將由此產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株M15中。用轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的過夜培養(yǎng)物接種增補(bǔ)了 lOOpg/ml氨芐青霉素(西格瑪)和25pg/ml卡那霉素的LB肉湯，并在劇烈搖動(dòng)下，在37。C生長，直到OD,達(dá)到0.6。重組HPGGT的表達(dá)通過添加最終濃度為lmM的異丙基(3-D-l-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG; Applichem， Darmstadt,德國)受到誘導(dǎo)，并在25。C進(jìn)行4小時(shí)，從而最小化內(nèi)含體的量。然后，在4。C離心(5000xg)全部培養(yǎng)物10分鐘。為了在自然條件下的細(xì)胞溶解，將沉淀溶解在包含蛋白酶抑制劑(關(guān)于His-標(biāo)記的蛋白質(zhì)的蛋白酶抑制劑混合物，西格瑪)的冰冷的結(jié)合緩沖液(20mM Tris/HCl, 500mM NaCl, 20mM咪唑(西格瑪)，pH 7.4)中。然后，通過在液N2中進(jìn)行的兩個(gè)冷凍和融化循環(huán)和隨后在冰上進(jìn)行的超聲波降解法(2xl分鐘超聲波降解，它們之間在冰上間隔5分鐘)溶解細(xì)胞。離心(17500xg，在4。C)10分鐘后，對(duì)上清液進(jìn)行DNA和RNA消化。進(jìn)一步離心步驟(22000xg， IO分鐘，4。C)后，準(zhǔn)備上清液，以進(jìn)行純化。在第一純化步驟中，使用5ml HisTrapHP柱(GE衛(wèi)生保健(GE Healthcare))。在RT下進(jìn)行純化，并將樣品始終保持在冰上。將大腸桿菌的溶解產(chǎn)物，以lml/分鐘，加載到Ni-瓊脂糖柱上，并收集流出液。樣品加載后，用10倍柱體積(cv)的結(jié)合緩沖液、10倍cv的清洗緩沖液(20mMTris/HCl， 900mMNaCl, 20mM咪唑，pH 7.4)和另外的10倍cv的結(jié)合緩沖液清洗該柱。利用階梯式咪唑梯度(100mM階梯)，用洗脫緩沖液(20mMTris/HCl， 500mMNaCl, 100-1000mM咪唑,pH 7.4)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。將洗出液收集在一份餾分/階梯度中。然后測試每份餾分的GGT酶活性，并進(jìn)行SDS-PAGE和免疫印跡分析。為了進(jìn)一步純化重組的HPGGT，匯集來自Ni-瓊脂糖親合層析的酶活性餾分，在4°C針對(duì)20mM Tris/HCl pH 7.5透析1小時(shí)，并進(jìn)行第二純化步驟。將透析的樣品加載到Affi-Gel Blue (BioRad)柱(cv: 12.3ml)上。用2倍cv的結(jié)合緩沖液清洗該柱，并用洗脫緩沖液(20mMTris/HCl,50-1000mMNaCl， pH 7.5)，利用階梯式NaCl梯度(50mM階梯)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過利用抗-GGT抗體的免疫印跡(見下)和通過GGT酶活性測定(見下)分析所有收集的餾分是否存在重組HPGGT。匯集活性餾分，;在4。C針對(duì)20mMTris/HClpH7.5透析90分鐘，分成等分試樣，并保存在-80。C直至進(jìn)一步使用。
位點(diǎn)定向誘變。按照制造商的說明書，利用QuikChange位點(diǎn)定向誘變?cè)噭┖?Stratagene,阿姆斯特丹，荷蘭)進(jìn)行HPGGT的位點(diǎn)定向誘變。引物 序 列 如 下 W5〃45Z4 有 義 鏈 5'畫CCAATAAGCGCCCTTTAGCCGCCATGTCGCCTACGATTGTG-3，(SEQ.ID:No. 10); W5〃CZ4 反義鏈
5'-CACAATCGTAGGCGACATGGCGGCTAAAGGGCGCTTATTGG-3'(SEQ:ID:No. 11)。通過測序證實(shí)了成功的誘變。
免疫印跡。為了免疫印跡分析，使用了 10"urkatT細(xì)胞或PBMC。在實(shí)驗(yàn)前，使Jurkat細(xì)胞在包含0.2% FCS的培養(yǎng)基中血清缺乏培養(yǎng)18小時(shí)。然后，用10。/。FCS釋放并如所述地處理細(xì)胞。在指定的時(shí)間點(diǎn)處，收獲細(xì)胞，用冰冷的PBS清洗一次，重新混懸在包含蛋白酶抑制劑(2.5mM焦磷酸鈉，lmMJ3-甘油磷酸，lmMNa3V04, lpg/ml擬酶醛肽，lmMPMSF;西格瑪)的lx細(xì)胞溶解緩沖液Cell Signaling Technology, Danvers, MA)中，并用微尖端超聲波降解器在冰上超聲波處理30秒。在4°C，以lOOOOxg離心溶解產(chǎn)物10分鐘，上清液用于免疫印跡。通過Tricine-SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)(通過Bradford測定確定，BioRad)，并將其電轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上(BioRad)。為了檢測，用初級(jí)抗體抗-p27、抗-細(xì)胞周期蛋白D3、抗-細(xì)胞周期蛋白E、抗-c-Myc (Dianova,漢堡，德國)，抗-Cdk2(Santa-Cruz生物技術(shù)(Santa-CruzBiotechnology),海德堡，德國)，抗-磷-AKT (Ser 473)，抗-磷-c-Raf (Ser 338),抗-磷-p70S6K (Thr 389;細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)(Cell Signaling)),抗-磷-FKHRLl/Foxo3 (Thr 32;上州，Placid湖，NY),抗-肌動(dòng)蛋白(西格瑪)和抗-VacA(南部生物學(xué)(Austral Biologicals) , SanRamon, CA)探測膜。利用合適的過氧化物酶綴合的第二抗體(Dianova)和化學(xué)發(fā)光試劑(Perbio Science, Bonn,德國)顯示初級(jí)抗體的結(jié)合。為了檢測HPGGT蛋白的大亞單位，使用多克隆兔-抗-GGT抗體，所述抗體是針對(duì)包括HP 1118基因產(chǎn)物(Charles River, Kisslegg,德國)的氨基酸殘基356-371的合成肽IQPDTVTPSSQIKPGM產(chǎn)生的。
血清印跡。為了檢測人血清中的HPGGT特異性抗體，通過SDS-PAGE分離0.1 純化的重組HPGGT蛋白，并如上所述轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。用麗春紅S溶液(處于H20中的0.2%麗春紅S， 3%三氯乙酸)對(duì)該膜進(jìn)行染色，并切割成條帶。封閉(lxTBS + 5Q/。低脂奶粉)后，在4。C，隨著攪拌，分別用感染和未感染幽門螺旋菌的患者的血清(1:20000稀釋在封閉緩沖液中)培養(yǎng)每個(gè)條帶過夜。清洗后，用HRP-綴合的抗-兔二級(jí)抗體(Dianova;稀釋1:10000)培養(yǎng)膜條帶，并最后，在另一次清洗步驟后，如上所述，通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)顯示血清抗體與HPGGT蛋白的結(jié)合。利用常規(guī)幽門螺旋菌IgG ELISA評(píng)估患者幽門螺旋菌感染的狀況。
細(xì)胞周期分析。分析前，使JurkatT細(xì)胞(5乂106細(xì)胞/分析)在包含0.2% FCS的培養(yǎng)基中血清缺乏培養(yǎng)18小時(shí)。用10% FCS釋放并用指定的幽門螺旋菌菌株上清液處理細(xì)胞24小時(shí)后，通過使用FITC-綴合抗隱BniU抗體(BD生物科學(xué)(BD Bioscience),海德堡，德國)，按照制造商的說明書，通過BrdU-FITC/PI(西格瑪)染色，進(jìn)行細(xì)胞周期分析。在隨后的熒光-活化細(xì)胞分類器(FACS)分析過程中，利用Becton-DickinsonFACScan流式細(xì)胞儀，獲得10000個(gè)事件。利用Cell Quest軟件包(生物科學(xué)(BD Biosciences))分析數(shù)據(jù)。
y-谷氨?；D(zhuǎn)肽基酶(GGT)活性測定。根據(jù)Mdster等的方法改進(jìn)了GGT活性的測定。27簡要地，制備由20mM作為受體的甘氨酰甘氨酸(西格瑪)、2.5 mM作為供體物質(zhì)的L卞谷氨?；?p-硝基酰苯胺(anilide)(Calbiochem, Schwalbach，德國)和100 mM Tris-HCl (pH 8.0)組成的反應(yīng)緩沖液。在一些實(shí)驗(yàn)中，測定緩沖液的pH在2-10之間變化。加入不同幽門螺旋菌菌株的上清液、純化的重組HPGGT或馬腎GGT(西格瑪)，且在37°C進(jìn)行反應(yīng)30分鐘。通過分光光度法，在405nm處監(jiān)測p-硝基酰苯胺的釋放。將1活性單位定義為在37°C釋放1 pmol p-硝基酰苯胺/分鐘/mg蛋白的酶量。
ELISA。如所述地處理PBMC(各5xl()S)24小時(shí)。在指定的時(shí)間點(diǎn)，通過離心去除細(xì)胞，并按照制造商的說明書，通過ELISA分析上清液的IL-2 (eBioscience,圣地亞哥，CA)和IFN-y (生物來源(Biosource),索林根,德國)的量。檢測的下限是4pg/ml。
分析凋亡。如所示處理5x105 JurkatT細(xì)胞。24小時(shí)后，通過離心收獲細(xì)胞，清洗，重新混懸在500|^1 AnnexinV-結(jié)合緩沖液(10mMHEPES/NaOH, pH7.4, 140mM NaCl， 2.5mM CaCl2)中，并用5pl重組的Annexin V-FITC (Caltag， Burlingame， CA)和0.5pg/ml PI在室溫，黑暗下各染色10分鐘。通過FACS分析測量凋亡的細(xì)胞(見上)。利用Cell Quest軟件分析數(shù)據(jù)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)。將數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。為了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Student Mt驗(yàn)。認(rèn)為P-值〈0.05是顯著的。
實(shí)施例2:確定作為幽門螺旋菌假定T細(xì)胞增殖抑制蛋白的GGT
先前顯示了從幽門螺旋菌中分泌的低分子量蛋白抑制T淋巴細(xì)胞的增殖。3為了確定免疫抑制因子，對(duì)來自幽門螺旋菌菌株G27的上清液進(jìn)行大小排阻層析。符合先前的工作，只有洗脫具有分子量30-66kDa的餾分抑制淋巴細(xì)胞的增殖，而所有其他餾分不抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。
先前，兩個(gè)獨(dú)立的小組通過不同的蛋白質(zhì)組技術(shù)進(jìn)行分泌的幽門螺旋菌蛋白的系統(tǒng)分析。9，10利用這些數(shù)據(jù)，列出了具有分子量30-66 kDa的所有分泌的幽門螺旋菌蛋白(圖1A)。通過SDS-PAGE和銀染色進(jìn)一步分析所獲得的層析餾分的蛋白質(zhì)(圖1A)。發(fā)現(xiàn)四種具有30-66 kDa尺寸的潛在候選者，其表現(xiàn)出與該餾分的抑制活性特征相匹配的洗脫特征(圖1B;由箭頭表示)。抑制餾分中的所有其他蛋白質(zhì)條帶也出現(xiàn)在非-抑制的餾分中，并因此可以不對(duì)T細(xì)胞增殖抑制負(fù)責(zé)。這四種候選蛋白中的兩種的分子量(圖1B)對(duì)應(yīng)于分泌的幽門螺旋菌蛋白y-谷氨?；D(zhuǎn)肽基酶(GGT,HP1118)的片段。位于60 kDa的第一條帶可能代表GGT-原-形(MW 61kDa)，且位于38kDa的另一個(gè)條帶可能代表GGT的大亞單位。"為了研究這些上清液餾分中催化活性HPGGT的存在，進(jìn)行光度GGT活性測定。圖1C顯示只有抑制淋巴細(xì)胞增殖的餾分(b-f)也表現(xiàn)出GGT活性。
實(shí)施例3: GGT-缺陷型幽門螺旋菌突變體缺乏抑制T細(xì)胞增殖的能力
為了確定GGT是否對(duì)觀察到的淋巴細(xì)胞增殖抑制負(fù)責(zé)，產(chǎn)生幽門螺旋菌的同基因GGT敲除突變體。如其他小組所述地，所述突變體正常體外生長，這說明GGT對(duì)幽門螺旋菌的存活不是必需的。"，。"測試這些突變體的上清液，以獲得它們與相應(yīng)的野生型菌株相比，對(duì)受到抗-CD3/CD28或PMA/伊屋諾霉素刺激的分離的人T細(xì)胞和PBMC的增殖抑制活性(圖2A、 C)。與野生型菌株相反，完全消除了AGGT細(xì)菌針對(duì)初級(jí)人T細(xì)胞和PBMC的抑制潛力。為了排除GGT的自發(fā)重組和再活化，通過測量酶活性和通過利用我們針對(duì)HPGGT的大亞單位生成的多克隆抗體的免疫印跡驗(yàn)證來自GGT-缺陷型細(xì)菌的上清液。加載對(duì)照顯示來自野生型和GGT-缺陷型細(xì)菌的上清液中存在分泌的VacA蛋白質(zhì)(圖2B)。因此，GGT對(duì)由幽門螺旋菌引起的T細(xì)胞增殖抑制負(fù)責(zé)。
實(shí)施例4:重組HPGGT抑制淋巴細(xì)胞的增殖。為了進(jìn)一步顯示觀察到的抑制作用是通過HPGGT單獨(dú)介導(dǎo)的，表
達(dá)了大腸桿菌中的重組His-標(biāo)記的HPGGT蛋白。如"材料和方法"部分 中所述，通過層析法將蛋白質(zhì)純化為同質(zhì)性。SDS-PAGE和銀染色以及免 疫印跡顯示將重組HPGGT合成為原-形，并隨后分別處理為具有分子量 38和 20kDa的大和小亞單位(圖3A、 B)。重組蛋白質(zhì)顯示強(qiáng)GGT活 性(圖3C)并有效抑制PBMC增殖(圖3D)。另夕卜，其他實(shí)驗(yàn)顯示HPGGT 在pH2-10范圍內(nèi)的催化活性(圖3E)支持感染位點(diǎn)存在功能酶。
實(shí)施例5: HPGGT的抑制作用依賴于催化GGT活性。
由于GGT也通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括人T細(xì)胞表達(dá)，所以我試圖確定 哺乳動(dòng)物GGT是否也抑制淋巴細(xì)胞增殖。從馬腎中純化的GGT表現(xiàn)出催 化活性(圖4A)。然而，與HPGGT相比甚至4倍更高量的馬GGT不能 抑制PBMC增殖(圖4B)。為了探究抑制T細(xì)胞增殖是否需要GGT的催 化轉(zhuǎn)肽基酶活性，我們生成了重組蛋白質(zhì)的突變體。我們發(fā)現(xiàn)將絲氨酸殘 基451和452誘變?yōu)楸彼?S451/452A)完全消除重組HPGGT的酶活性(圖 4A)，并且還消除淋巴細(xì)胞增殖抑制(圖4B)。
為了證實(shí)這些結(jié)果，用GGT抑制劑阿西維辛預(yù)培養(yǎng)來自幽門螺旋菌 野生型菌株G27的重組HPGGT和上清液。該化合物起到GGT的不可逆 轉(zhuǎn)的競爭性抑制劑的作用。顯示出由阿西維辛引起的GGT抑制涉及其在 結(jié)合附著于GGT的指定羥基的抑制種類中的酶后的轉(zhuǎn)化。14，15酶GGT活 性的測量和淋巴細(xì)胞增殖的確定顯示利用阿西維辛的預(yù)處理通過幽門螺 旋菌野生型上清液，完全抑制GGT活性(圖4C)和PBMC增殖的抑制(圖 4D)。對(duì)重組HPGGT獲得了相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例6: HPGGT在不減少IL-2和IFN，分泌物的條件下和在不誘導(dǎo)凋亡 的條件下抑制淋巴細(xì)胞增殖。
至今尚不知HPGGT在抑制宿主免疫應(yīng)答過程中的作用。本文中報(bào) 告的由HPGGT引起的淋巴細(xì)胞增殖抑制可以由干擾人PBMC的細(xì)胞因子 分泌而產(chǎn)生。為了測試該假說，用PMA和伊屋諾霉素刺激細(xì)胞，并在具 有或不具有處于不同濃度的幽門螺旋菌野生型和AGGT上清液或重組HPGGT的條件下進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)。與受刺激的對(duì)照相比，這些處理中沒 有一種導(dǎo)致IL-2分泌物的減少(圖5A)，已知這對(duì)于淋巴細(xì)胞增殖是必需 的。另外，IFN-Y分泌物沒有減少(圖5B)。因此，我們顯示由HPGGT引 起的T細(xì)胞增殖抑制不是由這些細(xì)胞減少的活化引起的。先前的報(bào)告提示 在胃上皮細(xì)胞中由HPGGT誘導(dǎo)氧化壓力和凋亡。12'16然而，尚不知來自 幽門螺旋菌的GGT對(duì)淋巴細(xì)胞的作用。
另外的報(bào)告提示由幽門螺旋菌在T細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡作為通過該細(xì) 菌抑制T細(xì)胞增殖的機(jī)制(Wang等免疫學(xué)雜志(J Immunol) 2001)。為了 檢查凋亡是造成由本文所述HPGGT引起的淋巴細(xì)胞增殖減少的原因的可 能性，利用JurkatT細(xì)胞進(jìn)行了 Annexin V-FITC/PI染色和隨后的FACS分 析(圖5C)。來自幽門螺旋菌野生型和AGGT菌株的上清液或以導(dǎo)致強(qiáng)烈 淋巴細(xì)胞增殖抑制的濃度使用的重組HPGGT均不誘導(dǎo)凋亡的增加。因此， 由HPGGT消除T細(xì)胞增殖是由凋亡-依賴性機(jī)制介導(dǎo)的。
實(shí)施例7: HPGGT對(duì)T細(xì)胞中的細(xì)胞周期進(jìn)展的作用。
接下來，我們?cè)噲D進(jìn)一步表征HPGGT對(duì)T細(xì)胞增殖中涉及的細(xì)胞 過程的作用。利用BrdU/PI-染色的分析顯示由來自幽門螺旋菌的野生型而 非由GGT-缺陷型上清液誘導(dǎo)的Jurkat T細(xì)胞中的Gl細(xì)胞周期停滯(圖 6A)。該停滯的特征在于在存在幽門螺旋菌GGT條件下，Gl期(圖6A; 左下象限)中細(xì)胞從35°/。增加至46%。因此，在用幽門螺旋菌的野生型而 非GGT-缺陷型上清液處理過程中，與對(duì)照(基礎(chǔ)的，55%)相比，S-期(左 上和右上象限)中的細(xì)胞量減少至38%。于此相符合地，相同樣品的免疫 印跡分析顯示細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白D3以及E1蛋白水平的明確減少。另外， Cdk-抑制劑p27Kipl的量以GGT-依賴性方式升高(圖6A)。用10和 5pg/ml HP WT上清液處理的細(xì)胞之間的細(xì)胞周期蛋白水平的差別說明 為了對(duì)抗淋巴細(xì)胞增殖，必須超過GGT活性的閾值。這在上清液中總蛋 白濃度為10pg/ml的情形中非常明顯。在較低濃度5pg/ml時(shí)，GGT需要 更長時(shí)間抑制淋巴細(xì)胞中的細(xì)胞周期進(jìn)展。利用重組HPGGT蛋白，我們 觀察到在低至2pg/ml濃度時(shí)細(xì)胞周期蛋白水平的完全減少。
在人PBMC情形中證實(shí)了這些結(jié)果，其在受到重組HPGGT或來自幽門螺旋菌野生型而非AGGT菌株的不同濃度上清液處理時(shí)，表現(xiàn)出相同
細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白甚至更強(qiáng)烈的減少(圖6B)。我們的結(jié)果清楚的指出 GGT是造成由幽門螺旋菌誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞中的Gl細(xì)胞周期停滯的因 素。
實(shí)施例8:在T細(xì)胞中用Ras-依賴性信號(hào)傳導(dǎo)干擾HPGGT。
Ras-和PI3K-依賴性途徑是細(xì)胞周期進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子。由于顯示出 這些途徑在T細(xì)胞中不彼此依賴地發(fā)生17，我們研究了幽門螺旋菌上清液 以及重組HPGGT對(duì)這兩個(gè)途徑中重要成員活化狀態(tài)的影響。免疫印跡分 析來自Jurkat T細(xì)胞和PBMC的細(xì)胞溶解產(chǎn)物顯示AKT、 p70S6k和Foxo 3,即PI3K-信號(hào)傳導(dǎo)的重要介體的細(xì)胞水平和磷酸化在存在HPGGT的條 件下不減少(圖6A)。相反，c-Myc的細(xì)胞水平以及c-Raf蛋白，艮卩Ras-依賴性途徑的中心介導(dǎo)子的磷酸化在相同細(xì)胞中存在HPGGT的條件下減 少(圖6A、 B)。
實(shí)施例9:針對(duì)HP-陽性患者血清中HPGGT的抗體應(yīng)答
盡管顯示出來自幽門螺旋菌的GGT由該細(xì)菌分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng) 基中(Bumann等)，但是該蛋白質(zhì)是否到達(dá)固有層中的T細(xì)胞，從而發(fā)揮 其免疫抑制作用尚不清楚。為了解決這個(gè)問題，我們測試了來自14名患 者(9名感染幽門螺旋菌的和5名未感染幽門螺旋菌的)的血清是否存在 HPGGT特異性抗體。結(jié)果顯示在幽門螺旋菌-陽性(圖7， 1-9)而非未感 染的患者(圖7， 10-14)中針對(duì)HPGGT的原形和大亞單位的強(qiáng)烈抗體應(yīng) 答，這提示了HPGGT與人免疫系統(tǒng)的相互作用。
實(shí)施例10:免疫而非感染后針對(duì)HPGGT的抑制免疫應(yīng)答
用位于距幽門螺旋菌Y-谷氨酰基-轉(zhuǎn)肽基酶(HPGGT)的催化中心遠(yuǎn) 程(fare distance)的肽356 IQPDTVTPSSQIKPGM 371或用與作為佐劑的 CT聯(lián)合的失活重組HPGGT蛋白接種動(dòng)物。只有在用HPGGT失活形式接 種的動(dòng)物中，血清中的抑制性抗體是可以利用標(biāo)準(zhǔn)HPgGT活化測定檢測 的。在僅接受緩沖液的對(duì)照動(dòng)物中、在感染的動(dòng)物中或在用肽356-371接種的動(dòng)物中沒有檢測到抑制性免疫應(yīng)答。這些結(jié)果證明針對(duì)HPGGT的抑 制性免疫應(yīng)答是可以實(shí)現(xiàn)的，且高度依賴于抗原的選擇。此外，幽門螺旋 菌的感染不引起所述抑制性應(yīng)答。 結(jié)果顯示在圖9中。
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說明書、權(quán)利要求和/或附圖中公開的本發(fā)明特征可以獨(dú)立地和以其 任何組合作為以其多種形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的材料。
權(quán)利要求
1.包括氨基酸序列的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列與由包括對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的HPGGT區(qū)域的一段連續(xù)氨基酸序列至少80％相同，其中所述區(qū)域通過以下各項(xiàng)定義(a)按照SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的氨基酸位置150-200，或(b)按照SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的氨基酸位置410-480，和其中所述多肽適合于引起能夠抑制HPGGT催化活性的免疫應(yīng)答。
2. 按照權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包括約15-約30個(gè)氨基酸。
3. 多肽，優(yōu)選地，按照權(quán)利要求1或2的多肽，其中所述多肽包括對(duì)應(yīng)于下列各項(xiàng)的氨基酸序列-(a) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置150-200，或(b) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置410-480， 其中所述多肽包括約15-約30個(gè)氨基酸。
4. 按照權(quán)利要求3的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于所述位 置的一段15-30個(gè)連續(xù)氨基酸的序列。
5. 按照權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽包括選自包括下 列各項(xiàng)組中的一個(gè)序列QRQAETLKEARERFLKY (SEQ.ID.No. 2), FDIKPGNPNLYGLVGGDANAI (SEQ.ID.No. 3), DFSIKPGNPNLYGLVGGDANA正ANKRPL (SEQ.ID.No.4)禾口 SSMSPTIVLKNNKVFLVVGSP (SEQ.ID.No.5)
6. 免疫原性組合物，包括一種或數(shù)種按照權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的多肽。
7. 免疫原性組合物，包括HPGGT的失活形式。
8. 免疫原性組合物，包括HPGGT的片段，其中所述片段由包括 HPGGT的氨基酸451和452的一段連續(xù)氨基酸序列組成。
9. 按照權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物用 于動(dòng)物或人的疫苗接種。
10. 按照權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物能夠在動(dòng)物或人中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
11. 按照權(quán)利要求6-10中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述免疫應(yīng) 答是抗體應(yīng)答。
12. 按照權(quán)利要求6-11中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述抗體應(yīng) 答包括對(duì)HPGGT，更優(yōu)選地，對(duì)HPGGT的特異性活性具有抑制作用和/ 或?qū)α馨图?xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑制具有消除作用的抗體。
13. 按照權(quán)利要求6-12中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物 用于在患有幽門螺旋菌(//. j^/on')感染或處于發(fā)展幽門螺旋菌感染風(fēng)險(xiǎn) 中的患者中促進(jìn)淋巴細(xì)胞的活化和增殖。
14. 按照權(quán)利要求13的免疫原性組合物，其中所述淋巴細(xì)胞是B或T 細(xì)胞。
15. 按照權(quán)利要求6-14中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物 包括一種或數(shù)種佐劑。
16. 按照權(quán)利要求6-15中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物 包括一種或數(shù)種來自幽門螺旋菌的抗原。
17. 按照權(quán)利要求16的免疫原性組合物，其中所述抗原選自包括外膜 蛋白的組。
18. 按照權(quán)利要求17的免疫原性組合物，其中所述抗原選自包括 HpaA、 Ompl8和其組合的組。
19. 按照權(quán)利要求6-18中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物 用于預(yù)防和/或治療由幽門螺旋菌引起的或與之相關(guān)的疾病，更優(yōu)選地，由 幽門螺旋菌感染引起的或與之相關(guān)的疾病。
20. 按照權(quán)利要求19的免疫原性組合物，其中所述疾病選自包括下列 各項(xiàng)的組幽門螺旋菌感染、由幽門螺旋菌引起的胃與十二指腸病癥、胃 炎、慢性胃炎、胃或十二指腸潰瘍、胃癌和(MALT)淋巴瘤。
21. 按照權(quán)利要求6-20中任一項(xiàng)的免疫 性組合物，其中所述免疫原 性組合物是疫苗。
22. 按照權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的多肽用于制備藥物的用途。
23. 按照權(quán)利要求6-21中任一項(xiàng)的免疫原性組合物用于制備藥物的用途。
24. 按照權(quán)利要求22-23中任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物是疫苗。
25. 按照權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物用于預(yù)防和/ 或治療由幽門螺旋菌引起的或與之相關(guān)的疾病，更優(yōu)選地，由幽門螺旋菌 感染引起的或與之相關(guān)的疾病。
26. 按照權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的多肽用于檢測樣品中抗體的用途， 其中所述抗體針對(duì)HPGGT。
27. 按照權(quán)利要求26的用途，其中所述抗體能夠抑制HPGGT酶活性 和/或HPgGT對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制活性。
28. 特異性結(jié)合按照權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的多肽的抗體。
29. 按照權(quán)利要求28的抗體，其中抗體具有對(duì)HPGGT，更優(yōu)選地， 對(duì)HPGGT的特異性活性的抑制作用和/或?qū)α馨图?xì)胞增殖的HPGGT依賴 性淋巴細(xì)胞抑制的消除作用。
30. 編碼按照權(quán)利要求28-29中任一項(xiàng)的抗體的核酸。
31. 特異性結(jié)合按照權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的多肽或結(jié)合HPGGT的片 段的核酸，其中所述片段由包括HPGGT的氨基酸451和452的一段連續(xù) 氨基酸序列組成，其中所述核酸分子選自包括適體和鏡像異構(gòu)適體的組。
32. 按照權(quán)利要求31的核酸，其中所述核酸具有對(duì)HPGGT，更優(yōu)選 地，對(duì)HPGGT的特異性活性的抑制作用和/或?qū)α馨图?xì)胞增殖的HPGGT 依賴性抑制的消除作用。
33. 按照權(quán)利要求28-29中任一項(xiàng)的抗體用于制備藥物的用途。
34. 按照權(quán)利要求31-32中任一項(xiàng)的核酸用于制備藥物的用途。
35. 按照權(quán)利要求33-34中任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物用于治療和/ 或預(yù)防由幽門螺旋菌引起的或與之相關(guān)的疾病，更優(yōu)選地，由幽門螺旋菌 感染引起的或與之相關(guān)的疾病。
36. 用于確定治療疾病的候選藥物的方法，所述方法包括評(píng)估候選藥 物的下列各項(xiàng)的步驟a.對(duì)幽門螺旋菌的Y-谷氨?；D(zhuǎn)肽基酶的特異性活性的抑制作用和b.對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑制的消除作用。
37. 按照權(quán)利要求36的方法，其中所述疾病是由幽門螺旋菌引起的或 與之相關(guān)的疾病，更優(yōu)選地，由幽門螺旋菌感染和更優(yōu)選地，人中的幽門 螺旋菌感染引起的或與之相關(guān)的疾病。
38. 用于開發(fā)疫苗的方法，所述方法包括下列步驟a) 提供包括HPGGT或其至少一個(gè)片段的免疫原性組合物；b) 用所述免疫原性組合物免疫動(dòng)物，并由此產(chǎn)生抗體；c) 評(píng)估所述抗體關(guān)于它們對(duì)幽門螺旋菌的丫-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽基酶的特 異性活性的抑制作用和它們對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑制的消除 作用和d) 選擇合適的免疫原性組合物。
39. 按照權(quán)利要求38的方法，其中所述疫苗是針對(duì)人中幽門螺旋菌感 染的疫苗。
40. HPGGT的配體制備用于預(yù)防和/或疾病的藥物的用途，其中所述配 體顯著抑制HPGGT活性并消除淋巴細(xì)胞增殖的HPGGT依賴性抑制。
41. 按照權(quán)利要求40的用途，其中所述疾病是由幽門螺旋菌引起的或 與之相關(guān)的疾病，更優(yōu)選地，由幽門螺旋菌感染引起的或與之相關(guān)的疾病。
42. 按照權(quán)利要求40-41中任一項(xiàng)的用途，其中所述配體是按照權(quán)利 要求28或29中任一項(xiàng)的抗體，或按照權(quán)利要求31-32中任一項(xiàng)的核酸。
43. 按照權(quán)利要求40或42中任一項(xiàng)的用途，其中在淋巴細(xì)胞增殖測 定中評(píng)估淋巴細(xì)胞增殖。 —
44. HPGGT用于制備免疫抑制組合物的用途。
45. 免疫抑制組合物，所述免疫抑制組合物是在容許HPGGT特異性 活性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)HPGGT和谷氨酰胺后作為上清液獲得的。
全文摘要
本發(fā)明涉及包括氨基酸序列的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列與包括對(duì)應(yīng)于SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的HPGGT區(qū)域的一段連續(xù)氨基酸序列至少80％相同，其中所述區(qū)域通過以下各項(xiàng)定義(a)按照SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的氨基酸位置150-200，或(b)按照SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的氨基酸位置410-480，和其中所述多肽適合于引起能夠抑制HPGGT催化活性的免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)G01N33/50GK101594880SQ200780046762
公開日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2007年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月19日
發(fā)明者克里斯蒂安·施梅斯, 馬爾庫斯·格哈德 申請(qǐng)人:馬爾庫斯·格哈德