專利名稱：篩選微生物生長中必需代謝物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用代謝通量分析篩選對于微生物生長必需的代謝物的方法，所述方法包括選擇目標(biāo)微生物，構(gòu)建所選微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，使構(gòu)建的代謝網(wǎng)絡(luò)模型中每種代謝物的消耗反應(yīng)停止，分析代謝物的代謝通量以篩選對于微生物生長所必需的代謝物，并通過對每種代謝物的利用確定篩選的代謝物，定義為通量和(Φ)。

背景技術(shù)：
當(dāng)免疫系統(tǒng)弱的人們感染病原微生物時(shí)，感染(所述的所有感染都不是難以治療時(shí))將非常難以治療并可導(dǎo)致死亡。因此，使用病原微生物的基因組信息發(fā)現(xiàn)目標(biāo)的努力以開發(fā)更有效地的抗病原體藥物已經(jīng)被積極地展開。但是，常常難以識別用于藥物靶標(biāo)(產(chǎn)品，其可被用作理想的藥物靶標(biāo)[你使用基因產(chǎn)品生產(chǎn)并用作藥物來殺死病原體或者用于藥物的基因以中斷了嗎？這是我們之前所寫的])的基因可以作為候選來殺死病原微生物，并且在技術(shù)上難以確定相關(guān)基因的致命性當(dāng)剔除所有病原微生物的單個(gè)基因時(shí)。藥物靶標(biāo)最通?？赏ㄟ^細(xì)胞成分之間的復(fù)雜相互作用來確定，而不是通過單個(gè)基因來確定，剔除多個(gè)基因顯示致命性，甚至當(dāng)每個(gè)基因都不具有致命性時(shí)也是如此。
因此，為了開發(fā)靶向病原微生物的有效藥物，非常重要的是理解細(xì)胞機(jī)制和微生物細(xì)胞成分之間的相互作用。通過遺傳信息和功能遺傳學(xué)的發(fā)展構(gòu)建的代謝物和代謝網(wǎng)絡(luò)在理解組成細(xì)胞成分的基因和蛋白質(zhì)之間的相互作用和構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)以開發(fā)有效藥物方面具有日益增加的重要性。
事實(shí)上，當(dāng)在哺乳動物細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)過的新的代謝物在病原微生物中通過遺傳信息使用代謝網(wǎng)絡(luò)信息識別時(shí)，能夠開發(fā)靶向代謝物特征的治療方法以專門攻擊病原細(xì)胞而不在人類細(xì)胞中引起副作用。如果這種病原體特異性代謝途徑被確認(rèn)為對于病原微生物的生存所必需的，則能夠開發(fā)藥物來抑制相關(guān)代謝途徑。據(jù)認(rèn)為，一旦開發(fā)了針對病原微生物的藥物，則可以使用與其類似的化合物很容易得到抑制其他類似病原微生物的藥物。隨著遺傳信息的可利用性的增加，基于代謝網(wǎng)絡(luò)的分析和預(yù)測技術(shù)近來已經(jīng)變得可行。特別是，隨著使用優(yōu)化技術(shù)的生物體代謝及其模擬的數(shù)學(xué)表示的發(fā)展，預(yù)測在特定基因缺失或添加之后發(fā)生的代謝途徑反應(yīng)正在變得可能(Lee等人，Trend.Biotechnol.，23349，2005)。代謝通量分析(MFA)技術(shù)顯示了細(xì)胞的理想代謝通量，并允許模擬和預(yù)測細(xì)胞的行為，甚至不需要生理參數(shù)(Papin，J.等人，Nature ReviewsMolecular Cell Biology，699，2005)。而且，代謝通量分析是通過測定各種代謝反應(yīng)方程的系數(shù)和代謝物的產(chǎn)生和消耗來確定內(nèi)部代謝通量變化的技術(shù)，并且其以準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)假設(shè)為基礎(chǔ)。
代謝通量分析被用于在僅僅使用質(zhì)量平衡方程和細(xì)胞組分信息得到細(xì)胞可達(dá)到的理想代謝通量空間，并通過優(yōu)化方法以最大化或最小化特定對象函數(shù)為目標(biāo)(例如，通過特定干擾的生物量形成的最大化或者代謝調(diào)節(jié)的最小化)。另外，代謝通量分析通?？杀挥糜谕ㄟ^菌株改進(jìn)計(jì)算對于所需代謝物的特定基因的致命性，并用于理解菌株代謝途徑的特性。而且，應(yīng)用代謝通量分析技術(shù)來預(yù)測基因缺失或添加之后發(fā)生的代謝通量變化的各種研究已經(jīng)被報(bào)道。
以前，發(fā)明人發(fā)展了使用代謝物的通量和來改進(jìn)生物體的in-silico方法，其中特定代謝物與有用物質(zhì)的產(chǎn)生的關(guān)系可被預(yù)測，并且具有在產(chǎn)生有用物質(zhì)方面增加的能力的生物體可通過引入或擴(kuò)增表達(dá)與特定代謝物有關(guān)的酶的基因來發(fā)展(韓國專利10-655495)。
美國專利公開US2002/0168654A1公開了用于細(xì)胞新陳代謝的in-silico方法，其可通過特定限制改善通量平衡分析(FBA)模型。在該專利的說明書中，試圖通過影響細(xì)胞生長的限制來識別能夠支持細(xì)胞生長的代謝反應(yīng)的最小組，但存在的問題是識別合成的致死基因，因?yàn)榇嬖谔嗟耐蛔兘M合。
因此，在本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域中，存在開發(fā)這樣的方法的需要，即可通過使用代謝通量分析技術(shù)以全面的觀點(diǎn)檢查復(fù)雜的微生物新陳代謝來精確地預(yù)測病原微生物中的靶基因，而不是使用基于利用部分代謝信息的菌株操作并確定特定基因?qū)φ麄€(gè)代謝通量的影響。
因此，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)付出了極大的努力來開發(fā)能夠有效預(yù)測病原微生物的靶基因的方法。結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對于微生物生長所必需的目標(biāo)基因可通過使代謝網(wǎng)絡(luò)模型中的每種代謝物的消耗反應(yīng)停止來分析每種代謝產(chǎn)物的代謝通量并篩選與其消耗反應(yīng)沒有停止的代謝物相比顯示細(xì)胞生長率下降的代謝物的微生物。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于提供使用代謝通量分析篩選對于微生物生長必需的代謝物的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供篩選對于微生物的生長所必需的基因的方法，所述方法包括從與篩選的代謝物有關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)中篩選在對于微生物的生長必需的代謝物中涉及的基因。
本發(fā)明的還一目的在于提供使用篩選的基因篩選抑制病原微生物生長的物質(zhì)的方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了使用代謝通量分析篩選對于微生物生長必需的代謝物的方法，所述方法包括下列步驟(a)選擇目標(biāo)微生物并構(gòu)建所選微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)模型；和(b)使所構(gòu)建的代謝網(wǎng)絡(luò)模型中每種代謝物的消耗反應(yīng)停止，分析每種代謝物的代謝通量，并使用下面的方程2選擇與正常細(xì)胞生長率相比顯示細(xì)胞生長率下降低于50％的代謝物作為對于微生物的生長所必需的代謝物 [方程2] 其中rwild代表正常細(xì)胞的生長率，rloss代表當(dāng)相關(guān)代謝物的消耗反應(yīng)停止時(shí)下降的細(xì)胞生長率。
在本發(fā)明中，每種代謝物的消耗反應(yīng)的停止通過將消耗反應(yīng)的代謝通量值設(shè)為零(0)來進(jìn)行。
本發(fā)明提供了使用代謝通量分析篩選對于微生物生長必需的代謝物的方法，所述方法可在步驟(b)之后進(jìn)一步包括(c)定義在步驟(b)中選擇的代謝物的利用作為由下面的方程3表示的通量和(Φ)，然后計(jì)算每種代謝物的通量和(Φ)；和(d)然后確定當(dāng)每種所選代謝物的通量和(Φ)降低時(shí)顯示細(xì)胞生長下降或停止的代謝物，確認(rèn)對于微生物生長所必需的代謝物作為微生物生長必需的代謝物 [方程3] 其中Φi表示第ith種代謝物的通量和(Φ)，Sij表示在jth反應(yīng)中第ith種代謝物的化合系數(shù)，vj表示在jth反應(yīng)中的代謝物的通量，Pi表示產(chǎn)生第ith種代謝物的代謝反應(yīng)的集合，并且Ci表示消耗第ith種代謝物的代謝反應(yīng)的集合。
在本發(fā)明中，必需代謝物選自下組，包括H+，H2O，ATP，磷酸，ADP，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，CO2，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，丙酮酸，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，L-谷氨酸，輔酶A，銨，AMP，乙酰輔酶A，2-戊二酸，?；d體蛋白，磷酸烯醇式丙酮酸，L-天冬氨酸，L-谷氨酸，甘油醛3-磷酸，CMP，甘油3-磷酸，GTP，5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸，磷酸二羥基丙酮，L-丙氨酸，L-絲氨酸，D-果糖6-磷酸，丙二酰-[酰基-c載體蛋白]，D-葡萄糖1-磷酸，GDP，草酰乙酸，還原型硫氧還蛋白，F(xiàn)AD，D-葡萄糖6-磷酸，氧化型硫氧還蛋白，UMP，CTP，S-腺苷-L-蛋氨酸，L-半胱氨酸，α-D-核糖5-磷酸，UDP-葡萄糖，5，6，7，8-四氫葉酸，乙酰乙酰-ACP，UDP，UTP，琥珀酰輔酶A，L-蘇氨酸，腐胺，氨基乙酸，GMP，亞精氨，IMP，磷脂酰甘油，L-精氨酸，L-賴氨酸，5，10-亞甲基四氫葉酸，分支酸，D-丙氨酸，L-脯氨酸，L-天冬氨酸，UDP-N-乙酰-D-葡萄糖胺，D-葡萄糖胺6-磷酸，煙酸D-核糖核苷酸，dGTP，亞胺基天冬氨酸，D-核酮糖5-磷酸，十四酰-ACP(n-C14:0ACP)，3-甲基-2-乙酰乙酸乙酯，L-甲硫氨酸，L-色氨酸，dTMP，磷脂酸，L-纈氨酸，重碳酸鹽，dCTP，dUMP，L-谷氨酸5-半醛，內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酸，CMP-3-脫氧-D-甘露-乙酰乙酸乙酯，十一異戊二烯二磷酸，L-異亮氨酸，磷脂酰乙醇胺，L-亮氨酸，L-組氨酸，十六烯酰-ACP(n-C16:1ACP)，1-吡咯啉-5-羧酸，亞硫酸鹽，氨甲酰磷酸，D-赤蘚糖4-磷酸，3-磷酸-D-甘油酸，CDP-甘油二脂，黃苷5′-磷酸，dTTP，L-酪氨酸，L-高半胱氨酸，dATP，10-甲酰四氫葉酸，R-3-羥基-十四酰-ACP，十八烯酰-ACP(n-C18:1ACP)，棕櫚酰-ACP(n-C16:0ACP)，(S)-二氫乳清酸，十四烯酰-ACP(n-C14:1ACP)，2-乙酰乙酸乙酯，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺，L-苯丙氨酸，磷脂酰絲氨酸，UDP-2，3-二(3-羥基十四酰)葡萄糖胺，L-高絲氨酸，十一異戊二烯磷酸，(R)-泛酸，乳清酸，L-天冬氨酸4-半醛，景天庚糖7-磷酸，N2-甲酸-N1-(5-磷酸-D-核糖)甘氨酸，5-甲基四氫葉酸，硫化氫，7，8-二氫葉酸，dTDP，肝糖，十二酰-ACP(n-C12:0ACP)，4-(1-D-核糖醇氨)-5-氨基尿嘧啶，苯酚，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑，KDO(2)-脂IV(A)，N1-(5-磷酸-D-核糖)甘氨酸，5-[(5-磷酸-1-脫氧核酮糖-1-基氨基)亞甲基氨基]-1-(5-磷酸核糖)咪唑-4-甲酰胺，磷脂酰甘氨酸磷酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸，N-琥珀酰-LL-2，6-二氨基庚二酸，2-脫氫-3-脫氧-D-阿拉伯糖基-葡庚糖酸7-磷酸，O-磷酸-L-絲氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸，(S)-2-[5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺基]琥珀酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-γ-谷氨?；?內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酸，3-羧基-3-羥基-4-甲基戊酸，2，3-二(3-羥基十四酰)-β-D-葡糖氨基1-磷酸，3-脫氧-D-manno-辛酸8-磷酸，N-((R)-4-磷酸泛酰基)-L-半胱氨酸，大腸桿菌的肽聚糖亞單位，腺苷5′-磷酸硫酸，二氫葉酸，3-脫氫莽草酸脂，1-(5-磷酸核糖)-AMP，4-甲基-2-氧代戊酸，D-甘油-D-manno-庚糖7-磷酸，2，3，4，5-四氫甲基吡啶酸，3-磷酸羥基丙酮酸，D-甘油-D-manno-庚糖1-磷酸，D-赤式-1-(咪唑-4-基)甘油3-磷酸，硫酸，UDP-3-O-(3-羥基十四酰)-N-乙酰葡萄糖胺，2-氨基-4-羥基-6-(D-赤式-1，2，3-三羥基丙基)-7，8-二氫喋啶，UDP-3-O-(3-羥基十四酰)-D-葡糖胺，乳清酸核苷5′-磷酸，UDP-N-乙酰-3-O-(1-羧乙烯)-D-葡糖胺，6-羥基甲基二氫喋呤，O-乙酰-L-絲氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨酰基-內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨酸，心磷脂，(R)-2，3-二羥基-3-甲基丁酸，(S)-2-乙酰乳酸，3′-磷酸腺嘌呤硫酸，1-(5-磷酸核糖)-ATP，2，3，2′3′-四(β-羥基十四酰)-D-葡糖氨基-1，6-β-D-葡糖胺1，4′-二磷酸，莽草酸脂5-磷酸，(R)-泛解酸，2-脫氫泛解酸，CDP-乙醇胺，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-羧酸，5-磷酸-β-D-核糖胺，N-琥珀酰-2-L-氨基-6-氧代庚二酸，D-4′-磷酸泛酸酯，3-脫氧-D-manno-2-辛酸，ADP-L-甘油-D-manno-庚糖，β-丙氨酸，D-丙氨酰-D-丙氨酸，O-琥珀酰-L-高絲氨酸，羥基喹啉，2-(甲酰胺基)-N1-(5-磷酸-D-核糖)乙脒，D-阿拉伯糖基5-磷酸，1-(5-磷酸核糖)-5-[(5-磷酸核糖氨基)亞甲基氨基]咪唑-4-甲酰胺，脂多糖，6-羥基甲基-二氫喋呤焦磷酸，莽草酸脂，十一異戊二烯-二磷酸-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨酰基-內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸，十一異戊二烯-二磷酸-N-乙酰胞壁酸-(N-乙酰葡糖胺)-L-丙氨酸-D-谷氨酸-內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酸-D-丙氨酸，5-磷酸核糖-5-羧基氨基咪唑，3-羧基-2-羥基-4-甲基戊酸，N-乙酰-D-葡糖胺1-磷酸，L-胱硫醚，(S)-3-甲基-2-戊酸，5-O-(1-羧乙烯)-3-磷酸莽草酸脂，2-氨基-4-羥基-6-(赤式-1，2，3-三羥基丙基)二氫喋啶三磷酸，D-甘油-D-manno-庚糖1，7-二磷酸，3-(咪唑-4-基)-2-丙基磷酸，3，4-二羥基-2-丁酮4-磷酸，具有月桂酸酯的KDO(2)-脂IV(A)，2-異丙基馬來酸，KDO-脂IV(A)，ADP-D-甘油-D-manno-庚糖，KDO(2)-脂(A)，N6-(1，2-二羧乙基)-AMP，5-甲酰胺基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺，脂A二糖，2，3-二氫吡啶而羧酸，3-脫氫奎尼酸，4-磷酸-L-天冬氨酸，S-腺苷甲硫氨酸胺，3-羧基-4-甲基-2-氧代戊酸，苯丙酮酸，D-葡糖胺1-磷酸，脫磷酸輔酶A，ADP-葡萄糖，4-氨基苯甲酸，L-組氨醇磷酸，LL-2，6-二氨基庚二酸，二氫喋呤單磷酸，泛酰巰基乙酸4′-磷酸，N-氨甲酰基-L-天冬氨酸，(R)-2，3-二羥基-3-甲基戊酸，丙二酰輔酶A，4-氨基-4-脫氧分支酸，D-谷氨酸，3-(4-羥基苯基)丙酮酸，L-組氨醇，去氨基-NAD+，以及(S)-2-乙酰基-2-羥基丁酸。
在本發(fā)明中，根據(jù)通量和(Φ)的下降的細(xì)胞生長下降類型優(yōu)選選自下組，包括其中細(xì)胞生長線性下降的類型；其中細(xì)胞生長降低到臨界值以下的類型；以及其中細(xì)胞生長非線性下降，于是細(xì)胞生長在通量和(Φ)達(dá)到零(0)之前停止的類型。而且，通量和(Φ)的擾動優(yōu)選基于細(xì)胞生長下降的類型而變化。
在另一方面，本發(fā)明提供了篩選對于微生物生長所需的基因的方法，所述方法包括篩選在上面篩選對于微生物生長必需的代謝物中涉及的基因。在本發(fā)明中，目標(biāo)微生物為大腸桿菌或者病原微生物。
在還一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)化微生物的方法，所述方法包括使用上面篩選的對于大腸桿菌或病原微生物的生長必需的基因轉(zhuǎn)化模型微生物。
在又一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)所述方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化微生物，所述微生物使用對于大腸桿菌或病原微生物的生長必需的基因轉(zhuǎn)化。
在再一方面，本發(fā)明提供了篩選可以抑制病原微生物的生長的物質(zhì)的方法，所述方法包括下列步驟(a)在病原微生物的候選抑制劑存在的情況下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的微生物；和(b)選擇在較之于生長抑制劑不存在情況下的顯示出對轉(zhuǎn)化微生物抑制作用的候選物作為病原體生長抑制物。
通過下列具體實(shí)施方式
和所附的權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征和方面將是顯而易見的。



圖1是確定必需代謝物的示意圖，其中，如果當(dāng)消耗相應(yīng)代謝物的代謝反應(yīng)停止時(shí)細(xì)胞生長的下降率(f)小于0.5，則相應(yīng)代謝物被歸類為必需代謝物，如果下降率大于0.5，則相應(yīng)代謝物歸類為非必需代謝物。
圖2顯示了根據(jù)通量和(Φ)擾動的細(xì)胞生長率變化的預(yù)測結(jié)果，在圖2中， A其中當(dāng)通量和(Φ)下降時(shí)細(xì)胞生長線性下降的類型；B其中當(dāng)通量和(Φ)下降時(shí)細(xì)胞生長降低到臨界值以下的類型；以及C其中當(dāng)通量和(Φ)下降時(shí)細(xì)胞生長非線性下降，即細(xì)胞生長在通量和(Φ)達(dá)到零(0)之前停止的類型。
圖3顯示了必需代謝物和非必需代謝物已經(jīng)從細(xì)胞中去除的細(xì)胞的生長率。在圖3中，y-軸基因缺失后細(xì)胞生長對正常細(xì)胞生長率的比值；x-軸缺失的基因(PpurN，LlpdA，GglyA，PLpurN/lpdA，PLGpurN/lpdA/glyA，和DXdxs/xylB)。

具體實(shí)施例方式 在本文中使用的術(shù)語“擾動”指的是通過特定外部因素的應(yīng)用干擾所有代謝物的組以便發(fā)現(xiàn)具有所需性質(zhì)的代謝物的操作。
在本文中使用的術(shù)語基因的“缺失”包括使特定基因在生物體中不起作用的所有操作，諸如去除或改變該基因的所有或部分堿基序列。
在本文中使用的術(shù)語“培養(yǎng)”被定義為不僅包括微生物諸如細(xì)菌、酵母、真菌和動植物細(xì)胞的培養(yǎng)，而且包括植物和動物飼養(yǎng)的培養(yǎng)。
在本文中使用的術(shù)語“目標(biāo)微生物”指的是用于篩選對于其生長必須的代謝物的微生物。
在本文中使用的術(shù)語“代謝網(wǎng)絡(luò)模型”指的是含有代謝途徑的模型，包括在目標(biāo)微生物中發(fā)生的所有生物化學(xué)反應(yīng)。
在本文中使用的術(shù)語“代謝物消耗反應(yīng)”指的是沿著其中在代謝網(wǎng)絡(luò)中存在的代謝物被消耗的方向發(fā)生的反應(yīng)。
1.代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在本發(fā)明中，使用大腸桿菌作為抑制細(xì)胞生長的模型菌株構(gòu)建新的代謝網(wǎng)絡(luò)。該系統(tǒng)包括絕大多數(shù)大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)。
2.必需代謝物的定義和必需代謝物的篩選 (1)必需代謝物的定義 為了利用數(shù)學(xué)方法表示所構(gòu)建的代謝網(wǎng)絡(luò)，代謝通量向量(vj，jth代謝反應(yīng)的代謝通量)可使用所有代謝物、它們的代謝途徑和相應(yīng)的化學(xué)模型(Sij；在jth反應(yīng)中的ith代謝物隨時(shí)間的理想化合系數(shù))來計(jì)算。也就是說，代謝物濃度X隨時(shí)間的變化可被表示為所有代謝反應(yīng)的通量和。
而且，如果X隨時(shí)間的變化為常數(shù)，即在準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)下，代謝物濃度X隨時(shí)間的變化可被定義為如下方程1 [方程1] S·v＝dX/dt＝0 其中S·v是X隨時(shí)間的變化，X是代謝物濃度，t為時(shí)間。
另外，通過代謝通量分析，每種代謝物的重要性可通過當(dāng)細(xì)胞不通過新陳代謝反應(yīng)消耗該代謝物時(shí)代謝物對細(xì)胞生長的影響來確定。在代謝通量分析過程中代謝物的重要性通過計(jì)算細(xì)胞在其中消耗各種代謝物的所有代謝反應(yīng)被停止的狀態(tài)下細(xì)胞的生長率與正常細(xì)胞生長率的比值來確定。
[方程2] 其中rwild表示正常細(xì)胞的生長率，并且rloss表示當(dāng)相關(guān)代謝物的消耗反應(yīng)停止時(shí)細(xì)胞生長率的下降。
2-2必需代謝物的篩選 產(chǎn)生給定代謝物而不消耗代謝物的代謝反應(yīng)在用于確定代謝物重要性的分析過程中不被停止的原因在于，即便代謝物不是必需的，產(chǎn)生代謝物的代謝反應(yīng)還可產(chǎn)生其他必需代謝物，因此，如果細(xì)胞生長由于所述代謝反應(yīng)而被抑制，則最初的非必需代謝物可被錯(cuò)誤地理解為必需的?？紤]到這種事實(shí)，當(dāng)計(jì)算的細(xì)胞生長率不能達(dá)到正常細(xì)胞生長率的一半時(shí)，相應(yīng)的代謝物被確定為必需的，當(dāng)計(jì)算的細(xì)胞生長率超過一半時(shí)，相應(yīng)的代謝物被確定為非必需的(圖1)。圖1是確定必需代謝物的示意性圖示，其中，如果當(dāng)消耗相應(yīng)代謝物的代謝反應(yīng)停止時(shí)細(xì)胞生長率的下降的比例小于0.5，則相應(yīng)代謝物被歸類為必需代謝物，如果比例大于0.5，則相應(yīng)代謝物被歸類為非必需代謝物。
3.通量和和擾動的定義 在本發(fā)明中，每種代謝物每小時(shí)產(chǎn)生或消耗的總量或通量和(Φ)由方程3定義，并且當(dāng)通量和偏離正常水平時(shí)，相應(yīng)代謝物對細(xì)胞生長的影響系統(tǒng)地被分析。
[方程3] 其中Φi表示ith代謝物的通量和(Φ)，Sij在jth反應(yīng)中的ith代謝物隨時(shí)間的化合系數(shù)，vj表示jth代謝反應(yīng)的代謝通量，Pi表示產(chǎn)生ith代謝物的代謝反應(yīng)組，并且Ci表示消耗ith代謝物的代謝反應(yīng)。
通量和(Φ)是新定義的量以表達(dá)代謝物的利用，其在現(xiàn)有的代謝分析方法中未被采用過。相關(guān)代謝物的利用越多，Φ值變得越高，并且相關(guān)代謝物的利用越少，Φ值變得越低。
可以看到，當(dāng)代謝網(wǎng)絡(luò)被擾動時(shí)，如果細(xì)胞的生長率相對于正常水平?jīng)]有顯著變化，則必需代謝物的通量和(Φ)也不顯著偏離正常水平，這與非必需代謝物的情況不同。這意味著細(xì)胞的生長率可通過將對于細(xì)胞生長所必需的代謝物的產(chǎn)生和消耗保持在恒定水平來穩(wěn)定。如果必需代謝物的通量和(Φ)與正常水平相比降低，則可導(dǎo)致細(xì)胞生長的下降。例如，如果必需代謝物的通量和(Φ)下降到正常水平的一半，則在大多數(shù)情況下(大約85％)細(xì)胞的生長率將下降到一半或更少，如果必需代謝物的通量和(Φ)下降到接近零的值，則可預(yù)測細(xì)胞生長停止。
在現(xiàn)有的代謝通量分析中，通過特定基因缺失得到的細(xì)胞生長率一般通過使相應(yīng)反應(yīng)停止的方法來確定。但是，這種方法具有的缺點(diǎn)在于，為了檢查通過兩個(gè)以上的基因缺失造成的細(xì)胞生長的降低，與兩種以上基因的結(jié)合相關(guān)的情況必需都被計(jì)算。相反，在其中每種代謝物的特征通過定義每種代謝物的重要性并定義其利用來檢查的情況下，存在的優(yōu)點(diǎn)是由兩個(gè)以上基因的缺失導(dǎo)致的細(xì)胞生長的下降可以很容易被分析。
實(shí)施例 此后，將進(jìn)一步參照實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行詳細(xì)描述。但是本領(lǐng)域技術(shù)人可以理解，這些實(shí)施例僅僅出于解釋的目的，本發(fā)明的范圍并不限于此。
特別是，下面的實(shí)施例僅僅使用大腸桿菌作為模型系統(tǒng)解釋了篩選對于微生物生長必需的代謝物的方法，但對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，通過本說明書公開的內(nèi)容，除大腸桿菌以外，其他細(xì)菌、酵母。真菌、動物和植物也可被用作模型系統(tǒng)。
實(shí)施例1模型系統(tǒng)的構(gòu)建 作為用于篩選對于微生物的生長必需的代謝物的目標(biāo)菌株，大腸桿菌突變菌株被用于構(gòu)建新的代謝通量分析系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括大多數(shù)大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)。對于大腸桿菌來說，新的代謝網(wǎng)絡(luò)由979種生物化學(xué)反應(yīng)和814種代謝物組成(Lee等人，Biotechnol.Bioproc.Eng.，10425-431，2005)。
實(shí)施例2必需代謝物的篩選 在實(shí)施例1中構(gòu)建的代謝通量系統(tǒng)中，進(jìn)行了對于大腸桿菌的814種代謝物的代謝通量分析。在代謝通量分析過程中，代謝物的重要性根據(jù)方程2通過計(jì)算在其中所有消耗相應(yīng)代謝物的代謝反應(yīng)被停止的狀態(tài)下，即在其中相關(guān)消耗反應(yīng)的代謝通量被設(shè)定為零(0)的狀態(tài)下的細(xì)胞生長率與正常細(xì)胞生長率的比值來確定。
[方程2] 其中rwild代表正常細(xì)胞的生長率，rloss代表當(dāng)相關(guān)代謝物的消耗反應(yīng)停止時(shí)下降的細(xì)胞生長率。
當(dāng)消耗代謝物的代謝反應(yīng)被停止時(shí)檢查細(xì)胞生長率的下降，如果比值小于0.5，則相應(yīng)代謝物被歸類為必需代謝物。而且，大腸桿菌的下列814種代謝物的重要性在下表1中描述的19種細(xì)胞生長條件下被檢查H+，H2O，ATP，磷酸，ADP，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，CO2，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，丙酮酸，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，L-谷氨酸，輔酶A，銨，AMP，乙酰輔酶A，2-戊二酸，?；d體蛋白，磷酸烯醇式丙酮酸，L-天冬氨酸，L-谷氨酸，甘油醛3-磷酸，CMP，甘油3-磷酸，GTP，5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸，磷酸二羥基丙酮，L-丙氨酸，L-絲氨酸，D-果糖6-磷酸，丙二酰-[?；?c載體蛋白]，D-葡萄糖1-磷酸，GDP，草酰乙酸，還原型硫氧還蛋白，F(xiàn)AD，D-葡萄糖6-磷酸，氧化型硫氧還蛋白，UMP，CTP，S-腺苷-L-蛋氨酸，L-半胱氨酸，α-D-核糖5-磷酸，UDP-葡萄糖，5，6，7，8-四氫葉酸，乙酰乙酰-ACP，UDP，UTP，琥珀酰輔酶A，L-蘇氨酸，腐胺，氨基乙酸，GMP，亞精氨，IMP，磷脂酰甘油，L-精氨酸，L-賴氨酸，5，10-亞甲基四氫葉酸，分支酸，D-丙氨酸，L-脯氨酸，L-天冬氨酸，UDP-N-乙酰-D-葡萄糖胺，D-葡萄糖胺6-磷酸，煙酸D-核糖核苷酸，dGTP，亞胺基天冬氨酸，D-核酮糖5-磷酸，十四酰-ACP(n-C14:0ACP)，3-甲基-2-乙酰乙酸乙酯，L-甲硫氨酸，L-色氨酸，dTMP，磷脂酸，L-纈氨酸，重碳酸鹽，dCTP，dUMP，L-谷氨酸5-半醛，內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酸，CMP-3-脫氧-D-甘露-乙酰乙酸乙酯，十一異戊二烯二磷酸，L-異亮氨酸，磷脂酰乙醇胺，L-亮氨酸，L-組氨酸，十六烯酰-ACP(n-C16:1ACP)，1-吡咯啉-5-羧酸，亞硫酸鹽，氨甲酰磷酸，D-赤蘚糖4-磷酸，3-磷酸-D-甘油酸，CDP-甘油二脂，黃苷5′-磷酸，dTTP，L-酪氨酸，L-高半胱氨酸，dATP，10-甲酰四氫葉酸，R-3-羥基-十四酰-ACP，十八烯酰-ACP(n-C18:1ACP)，棕櫚酰-ACP(n-C16:0ACP)，(S)-二氫乳清酸，十四烯酰-ACP(n-C14:1ACP)，2-乙酰乙酸乙酯，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺，L-苯丙氨酸，磷脂酰絲氨酸，UDP-2，3-二(3-羥基十四酰)葡萄糖胺，L-高絲氨酸，十一異戊二烯磷酸，(R)-泛酸，乳清酸，L-天冬氨酸4-半醛，景天庚糖7-磷酸，N2-甲酸-N1-(5-磷酸-D-核糖)甘氨酸，5-甲基四氫葉酸，硫化氫，7，8-二氫葉酸，dTDP，肝糖，十二酰-ACP(n-C12:0ACP)，4-(1-D-核糖醇氨)-5-氨基尿嘧啶，苯酚，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑，KDO(2)-脂IV(A)，N1-(5-磷酸-D-核糖)甘氨酸，5-[(5-磷酸-1-脫氧核酮糖-1-基氨基)亞甲基氨基]-1-(5-磷酸核糖)咪唑-4-甲酰胺，磷脂酰甘氨酸磷酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸，N-琥珀酰-LL-2，6-二氨基庚二酸，2-脫氫-3-脫氧-D-阿拉伯糖基-葡庚糖酸7-磷酸，O-磷酸-L-絲氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸，(S)-2-[5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺基]琥珀酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-γ-谷氨?；?內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酸，3-羧基-3-羥基-4-甲基戊酸，2，3-二(3-羥基十四酰)-β-D-葡糖氨基1-磷酸，3-脫氧-D-manno-辛酸8-磷酸，N-((R)-4-磷酸泛?；?-L-半胱氨酸，大腸桿菌的肽聚糖亞單位，腺苷5′-磷酸硫酸，二氫葉酸，3-脫氫莽草酸脂，1-(5-磷酸核糖)-AMP，4-甲基-2-氧代戊酸，D-甘油-D-manno-庚糖7-磷酸，2，3，4，5-四氫甲基吡啶酸，3-磷酸羥基丙酮酸，D-甘油-D-manno-庚糖1-磷酸，D-赤式-1-(咪唑-4-基)甘油3-磷酸，硫酸，UDP-3-O-(3-羥基十四酰)-N-乙酰葡萄糖胺，2-氨基-4-羥基-6-(D-赤式-1，2，3-三羥基丙基)-7，8-二氫喋啶，UDP-3-O-(3-羥基十四酰)-D-葡糖胺，乳清酸核苷5′-磷酸，UDP-N-乙酰-3-O-(1-羧乙烯)-D-葡糖胺，6-羥基甲基二氫喋呤，O-乙酰-L-絲氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨?；?內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨酸，心磷脂，(R)-2，3-二羥基-3-甲基丁酸，(S)-2-乙酰乳酸，3′-磷酸腺嘌呤硫酸，1-(5-磷酸核糖)-ATP，2，3，2′3′-四(β-羥基十四酰)-D-葡糖氨基-1，6-β-D-葡糖胺1，4′-二磷酸，莽草酸脂5-磷酸，(R)-泛解酸，2-脫氫泛解酸，CDP-乙醇胺，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-羧酸，5-磷酸-β-D-核糖胺，N-琥珀酰-2-L-氨基-6-氧代庚二酸，D-4′-磷酸泛酸酯，3-脫氧-D-manno-2-辛酸，ADP-L-甘油-D-manno-庚糖，β-丙氨酸，D-丙氨酰-D-丙氨酸，O-琥珀酰-L-高絲氨酸，羥基喹啉，2-(甲酰胺基)-N1-(5-磷酸-D-核糖)乙脒，D-阿拉伯糖基5-磷酸，1-(5-磷酸核糖)-5-[(5-磷酸核糖氨基)亞甲基氨基]咪唑-4-甲酰胺，脂多糖，6-羥基甲基-二氫喋呤焦磷酸，莽草酸脂，十一異戊二烯-二磷酸-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨?；?內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸，十一異戊二烯-二磷酸-N-乙酰胞壁酸-(N-乙酰葡糖胺)-L-丙氨酸-D-谷氨酸-內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酸-D-丙氨酸，5-磷酸核糖-5-羧基氨基咪唑，3-羧基-2-羥基-4-甲基戊酸，N-乙酰-D-葡糖胺1-磷酸，L-胱硫醚，(S)-3-甲基-2-戊酸，5-O-(1-羧乙烯)-3-磷酸莽草酸脂，2-氨基-4-羥基-6-(赤式-1，2，3-三羥基丙基)二氫喋啶三磷酸，D-甘油-D-manno-庚糖1，7-二磷酸，3-(咪唑-4-基)-2-丙基磷酸，3，4-二羥基-2-丁酮4-磷酸，具有月桂酸酯的KDO(2)-脂IV(A)，2-異丙基馬來酸，KDO-脂IV(A)，ADP-D-甘油-D-manno-庚糖，KDO(2)-脂(A)，N6-(1，2-二羧乙基)-AMP，5-甲酰胺基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺，脂A二糖，2，3-二氫吡啶而羧酸，3-脫氫奎尼酸，4-磷酸-L-天冬氨酸，S-腺苷甲硫氨酸胺，3-羧基-4-甲基-2-氧代戊酸，苯丙酮酸，D-葡糖胺1-磷酸，脫磷酸輔酶A，ADP-葡萄糖，4-氨基苯甲酸，L-組氨醇磷酸，LL-2，6-二氨基庚二酸，二氫喋呤單磷酸，泛酰巰基乙酸4′-磷酸，N-氨甲?；?L-天冬氨酸，(R)-2，3-二羥基-3-甲基戊酸，丙二酰輔酶A，4-氨基-4-脫氧分支酸，D-谷氨酸，3-(4-羥基苯基)丙酮酸，L-組氨醇，去氨基-NAD+，以及(S)-2-乙?；?2-羥基丁酸。
表1 結(jié)果，可以觀察到所有必需代謝物的大約87.7％在19種生長條件下通常是必需的。相反，必需代謝物的12.2％是必需或非必需的，這取決于19種細(xì)胞生長條件。另外，可以確定與其他代謝物相比沒有被廣泛研究的十六烯酰-ACP(hexadecenoyl-ACP)、磷脂酸甘油和2-異丙基馬來酸對于細(xì)胞生長都是必需的。
實(shí)施例3通過通量和的減少篩選必需代謝物 在實(shí)施例2中篩選的必需代謝物的通量和被計(jì)算，因此代謝物被確定為對于微生物生長來說是必需的。也就是說，在實(shí)施例2中篩選的231種代謝物每小時(shí)產(chǎn)生或消耗的總量(通量和；Φ)通量和(Φ)被定義為如方程3所示，當(dāng)通量和偏離正常水平時(shí)，其對細(xì)胞生長的影響系統(tǒng)地被分析。
[方程3] 其中Φi表示第ith種代謝物的通量和(Φ)，Sij表示在jth反應(yīng)中第ith種代謝物的理想化合系數(shù)，vj表示jth代謝反應(yīng)的代謝通量，Pi表示產(chǎn)生第ith種代謝物的代謝反應(yīng)的集合，并且Ci表示消耗第ith種代謝物的代謝反應(yīng)。
通量和(Φ)是新定義的量以表達(dá)對代謝物的利用，其在現(xiàn)有的代謝分析方法中未被采用過。相關(guān)代謝物的利用越多，Φ值變得越高，并且相關(guān)代謝物的利用越少，Φ值變得越低。
可以看到，當(dāng)代謝網(wǎng)絡(luò)被擾動時(shí)，如果細(xì)胞的生長率相對于正常水平?jīng)]有顯著變化，則必需代謝物的通量和(Φ)也不顯著偏離正常水平，這與非必需代謝物的情況不同。也就是說，這被認(rèn)為細(xì)胞的生長率可通過將對于細(xì)胞生長所必需的代謝物的產(chǎn)生和消耗保持在恒定水平來穩(wěn)定。
如果必需代謝物的通量和(Φ)與正常水平相比降低，則可導(dǎo)致細(xì)胞生長的極大下降。例如，如果必需代謝物的通量和(Φ)下降到正常值的一半，則在大多數(shù)情況下(大約85％)細(xì)胞的生長率將下降到一半或更少。這與非必需代謝物的情況形成顯著對照，僅僅少數(shù)非必需代謝物顯示這種影響(大約28.9％)。也就是說，如果必需代謝物的通量和(Φ)下降到接近零的值，則可預(yù)測細(xì)胞生長停止的效果。這種變化可被歸類為如圖2中所示的類型。
在圖2中，A組是其中細(xì)胞生長隨著通量和(Φ)下降而線性下降的情況；B組是其中細(xì)胞生長隨著通量和(Φ)下降而降低到臨界值以下情況；C組是其中細(xì)胞生長隨著通量和(Φ)下降而非線性下降，于是細(xì)胞生長在通量和(Φ)達(dá)到零(0)之前停止的情況。
A到C組的生長顯示了基于甚至對于相同代謝物的生長條件而變化的趨勢，結(jié)果在表2中顯示。表2顯示了在表1中顯示的條件中的通量和(Φ)的降低導(dǎo)致大腸桿菌生長的抑制。如表2中所示，可以看出，為了實(shí)質(zhì)上抑制細(xì)胞的生長，通量和(Φ)的擾動必須基于每種生長條件下每組的特性而被改變。
表2




















在現(xiàn)有代謝通量分析中，由特定基因的缺失得到的細(xì)胞生長率通常通過使相應(yīng)反應(yīng)停止的方法確定。但是，該方法具有的缺點(diǎn)在于，為了檢查通過兩個(gè)以上的基因缺失造成的細(xì)胞生長的降低，與兩種以上基因的結(jié)合相關(guān)的情況必需都被計(jì)算。相反，在其中每種代謝物的特征可通過定義每種代謝物的重要性并定義其利用來檢查的情況下，存在的優(yōu)點(diǎn)是由兩個(gè)以上基因的缺失導(dǎo)致的細(xì)胞生長的下降可以很容易被分析。
因此，本發(fā)明提供了被施加到每種代謝物上的擾動量可通過將通量和(Φ)定義為代謝物的利用并定量評估通量和降低對細(xì)胞生長的影響而系統(tǒng)性地確定的基礎(chǔ)。
實(shí)施例4細(xì)胞生長抑制以及與相應(yīng)代謝物相關(guān)的基因缺失的實(shí)驗(yàn)分析 當(dāng)必需代謝物的通量和(Φ)降低到零(0)時(shí)，也就是說，當(dāng)代謝物沒有被產(chǎn)生或消耗時(shí)，對細(xì)胞生長的影響通過實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。特別是，當(dāng)在必需代謝物的產(chǎn)生或消耗中涉及的一些基因從細(xì)胞中被除去時(shí)，檢查細(xì)胞生長率是否變化。當(dāng)基因中的每一種缺失時(shí)，細(xì)胞可繼續(xù)生長，當(dāng)所述基因同時(shí)被缺失時(shí)，產(chǎn)生或消耗相應(yīng)代謝物的途徑被阻斷，可使細(xì)胞生長停止。必需且同時(shí)被歸類為當(dāng)通量和(Φ)降低到零(0)時(shí)影響細(xì)胞生長的四氫葉酸代謝物在實(shí)驗(yàn)中被使用。據(jù)預(yù)測，如果在與這些代謝物有關(guān)的8種代謝反應(yīng)中的3種代謝反應(yīng)中涉及的基因(purN，lpdAand glyA)同時(shí)被缺失，則必需的四氫葉酸代謝物的消耗將被阻斷，從而使細(xì)胞停止生長。
為了在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上構(gòu)建大腸桿菌突變菌株，使用DNA操縱標(biāo)準(zhǔn)方案(Sambrook等人，Molecular Cloninga Laboratory Manual，3rdedition，2001)，并且使用目標(biāo)基因通過使用表3的引物序列同源重組經(jīng)一步失活法取代大腸桿菌K-12 W3110中的抗生素抗性基因(Warner等人，PNAS，97(12)6640-6645，2000)，從而去除對抗生素的抗性。在表3中，Cmr表示氯霉素抗性，Kmr表示卡那霉素抗性。
表3

通過上述結(jié)果可以觀察到，當(dāng)每種基因被獨(dú)立缺失或者當(dāng)兩種基因(purN和lpdA)同時(shí)被缺失時(shí)，細(xì)胞繼續(xù)生長，但當(dāng)所有三種基因同時(shí)被缺失時(shí)，則細(xì)胞的生長停止(見表4和圖3)。
表4 相反，在理論上被歸類為非必需的代謝物1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸的情況下，觀察到即便當(dāng)產(chǎn)生代謝物的基因(dxs和xylB)被缺失，細(xì)胞與正常狀態(tài)也沒有很大的不同(圖3)。在圖3中，P表示purN基因；L，lpdA基因；G，glyA基因；PL，purN/lpdA基因；PLG，purN/lpdA/glyA基因；以及DX，dxs/xylB基因。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，必需代謝物的通量和(Φ)的下降可對細(xì)胞生長具有顯著影響，但非必需代謝物的通量和(Φ)下降對于細(xì)胞生長沒有任何特別的影響。
工業(yè)實(shí)用性 如上所述，根據(jù)本發(fā)明，對于微生物生長必需的代謝物和在必需代謝物中涉及的基因可以方便的方式被篩選出來，由必需代謝物的代謝利用(通量和，Φ)的下降導(dǎo)致的細(xì)胞生長率可被預(yù)測。因此，根據(jù)本發(fā)明，針對病原微生物的藥物目標(biāo)基因可通過與篩選的代謝物有關(guān)的基因缺失來預(yù)測。
雖然已經(jīng)參照具體特征對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，該描述僅僅用于優(yōu)選實(shí)施方式，而不是限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實(shí)際范圍將由所附的權(quán)利要求書及其等同物來限定。
序列表
<110>韓國科學(xué)技術(shù)院
<120>篩選微生物生長中必需代謝物的方法
<130>FP09KR848
<140>PCT/KR2007/006708
<141>2007-12-21
<150>10-2006-0133119
<151>2006-12-22
<160>8
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>72
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>KOpurNup primer
<400>1
atgaatattg tggtgcttat ttccggcaac ggaagtaatt tacaggcaat gattgcagca60
ttacacgtct tg72
<210>2
<211>71
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>KOpurNdo primer
<400>2
tttcgtgcat tttcagacga ccatcggcaa accagctaat caccagtgga cacttaacgg60
ctgacatggg a 71
<210>3
<211>77
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>UPKOlpd1 primer
<400>3
agcgctggct gaacacggta tcgtcttcgg cgaaccgaaa accgatatcg acaaggattg60
cagcattaca cgtcttg 77
<210>4
<211>71
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>DOKOlpd1 primer
<400>4
tcaacgcgga tgaaaccacg gtcgtcaact tccacgcctg ctttgcctgc cacttaacgg60
ctgacatggg a 71
<210>5
<211>70
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>UPKOlpd2 primer
<400>5
atcccttcta aagcactgct gcacgtagca aaagttatcg aagaagccaa agcgctggct60
gaacacggta 70
<210>6
<211>75
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>DOKOlpd2 primer
<400>6
accgacgata tcgccgatag caaagatgtg cggtacgttg gtacgcagct gtttgtcaac60
gcggatgaaa ccacg 75
<210>7
<211>70
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>KOdlyAup primer
<400>7
caggaaaaag tacgtcagga agagcacatc gaactgatcg cctccgaaga ttgcagcatt60
acacgtcttg 70
<210>8
<211>69
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>KOglyAdo primer
<400>8
ctcgataacg gcttcatcat tgatgctgtc cagcacgtca cacatccaca cttaacggct60
gacatggga69
權(quán)利要求
1、一種使用代謝通量分析篩選對微生物生長必需的代謝物的方法，所述方法包括下列步驟
(a)選擇目標(biāo)微生物并構(gòu)建所選微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)模型；和
(b)使所構(gòu)建的代謝網(wǎng)絡(luò)模型中每種代謝物的消耗反應(yīng)停止，分析每種代謝物的代謝通量，并使用下面的方程2選擇與正常細(xì)胞生長率相比顯示細(xì)胞生長率下降低于50％的代謝物作為對于微生物的生長必需的代謝物
[方程2]
其中rwild代表正常細(xì)胞的生長率，rloss代表當(dāng)相關(guān)代謝物的消耗反應(yīng)停止時(shí)下降的細(xì)胞生長率。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用代謝通量分析篩選對微生物生長必需的代謝物的方法，其特征在于，每種代謝物的消耗反應(yīng)的停止通過將消耗反應(yīng)的代謝通量值設(shè)為零(0)來進(jìn)行。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用代謝通量分析篩選對微生物生長必需的代謝物的方法，其特征在于，所述方法可在步驟(b)之后進(jìn)一步包括
(c)定義在步驟(b)中選擇的代謝物的利用作為由下面的方程3表示的通量和(Φ)，然后計(jì)算每種代謝物的通量和(Φ)；
[方程3]
其中Φi表示第ith種代謝物的通量和(Φ)，Sij表示在jth反應(yīng)中第ith種代謝物的化合系數(shù)，vj表示在jth反應(yīng)中的代謝物的通量，Pi示產(chǎn)生第ith種代謝物的代謝反應(yīng)的集合，并且Ci表示消耗第ith種代謝物的代謝反應(yīng)的集合；以及
(d)然后確定當(dāng)每種所選代謝物的通量和(Φ)降低時(shí)顯示細(xì)胞生長下降或停止的代謝物，確認(rèn)對于微生物生長所必需的代謝物作為微生物生長必需的代謝物
4、根據(jù)權(quán)利要求1-3任意之一所述的使用代謝通量分析篩選對微生物生長必需的代謝物的方法，其特征在于，必需代謝物選自下組，包括H+，H2O，ATP，磷酸，ADP，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，CO2，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，丙酮酸，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，L-谷氨酸，輔酶A，銨，AMP，乙酰輔酶A，2-戊二酸，?；d體蛋白，磷酸烯醇式丙酮酸，L-天冬氨酸，L-谷氨酸，甘油醛3-磷酸，CMP，甘油3-磷酸，GTP，5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸，磷酸二羥基丙酮，L-丙氨酸，L-絲氨酸，D-果糖6-磷酸，丙二酰-[?；?c載體蛋白]，D-葡萄糖1-磷酸，GDP，草酰乙酸，還原型硫氧還蛋白，F(xiàn)AD，D-葡萄糖6-磷酸，氧化型硫氧還蛋白，UMP，CTP，S-腺苷-L-蛋氨酸，L-半胱氨酸，α-D-核糖5-磷酸，UDP-葡萄糖，5，6，7，8-四氫葉酸，乙酰乙酰-ACP，UDP，UTP，琥珀酰輔酶A，L-蘇氨酸，腐胺，氨基乙酸，GMP，亞精氨，IMP，磷脂酰甘油，L-精氨酸，L-賴氨酸，5，10-亞甲基四氫葉酸，分支酸，D-丙氨酸，L-脯氨酸，L-天冬氨酸，UDP-N-乙酰-D-葡萄糖胺，D-葡萄糖胺6-磷酸，煙酸D-核糖核苷酸，dGTP，亞胺基天冬氨酸，D-核酮糖5-磷酸，十四酰-ACP(n-C14:0ACP)，3-甲基-2-乙酰乙酸乙酯，L-甲硫氨酸，L-色氨酸，dTMP，磷脂酸，L-纈氨酸，重碳酸鹽，dCTP，dUMP，L-谷氨酸5-半醛，內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酸，CMP-3-脫氧-D-甘露-乙酰乙酸乙酯，十一異戊二烯二磷酸，L-異亮氨酸，磷脂酰乙醇胺，L-亮氨酸，L-組氨酸，十六烯酰-ACP(n-C16:1ACP)，1-吡咯啉-5-羧酸，亞硫酸鹽，氨甲酰磷酸，D-赤蘚糖4-磷酸，3-磷酸-D-甘油酸，CDP-甘油二脂，黃苷5′-磷酸，dTTP，L-酪氨酸，L-高半胱氨酸，dATP，10-甲酰四氫葉酸，R-3-羥基-十四酰-ACP，十八烯酰-ACP(n-C18:1ACP)，棕櫚酰-ACP(n-C16:0ACP)，(S)-二氫乳清酸，十四烯酰-ACP(n-C14:1ACP)，2-乙酰乙酸乙酯，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺，L-苯丙氨酸，磷脂酰絲氨酸，UDP-2，3-二(3-羥基十四酰)葡萄糖胺，L-高絲氨酸，十一異戊二烯磷酸，(R)-泛酸，乳清酸，L-天冬氨酸4-半醛，景天庚糖7-磷酸，N2-甲酸-N1-(5-磷酸-D-核糖)甘氨酸，5-甲基四氫葉酸，硫化氫，7，8-二氫葉酸，dTDP，肝糖，十二酰-ACP(n-C12:0ACP)，4-(1-D-核糖醇氨)-5-氨基尿嘧啶，苯酚，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑，KDO(2)-脂IV(A)，N1-(5-磷酸-D-核糖)甘氨酸，5-[(5-磷酸-1-脫氧核酮糖-1-基氨基)亞甲基氨基]-1-(5-磷酸核糖)咪唑-4-甲酰胺，磷脂酰甘氨酸磷酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸，N-琥珀酰-LL-2，6-二氨基庚二酸，2-脫氫-3-脫氧-D-阿拉伯糖基-葡庚糖酸7-磷酸，O-磷酸-L-絲氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸，(S)-2-[5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺基]琥珀酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-γ-谷氨?；?內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酸，3-羧基-3-羥基-4-甲基戊酸，2，3-二(3-羥基十四酰)-β-D-葡糖氨基1-磷酸，3-脫氧-D-manno-辛酸8-磷酸，N-((R)-4-磷酸泛?；?-L-半胱氨酸，大腸桿菌的肽聚糖亞單位，腺苷5′-磷酸硫酸，二氫葉酸，3-脫氫莽草酸脂，1-(5-磷酸核糖)-AMP，4-甲基-2-氧代戊酸，D-甘油-D-manno-庚糖7-磷酸，2，3，4，5-四氫甲基吡啶酸，3-磷酸羥基丙酮酸，D-甘油-D-manno-庚糖1-磷酸，D-赤式-1-(咪唑-4-基)甘油3-磷酸，硫酸，UDP-3-O-(3-羥基十四酰)-N-乙酰葡萄糖胺，2-氨基-4-羥基-6-(D-赤式-1，2，3-三羥基丙基)-7，8-二氫喋啶，UDP-3-O-(3-羥基十四酰)-D-葡糖胺，乳清酸核苷5′-磷酸，UDP-N-乙酰-3-O-(1-羧乙烯)-D-葡糖胺，6-羥基甲基二氫喋呤，O-乙酰-L-絲氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨?；?內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸，UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨酸，心磷脂，(R)-2，3-二羥基-3-甲基丁酸，(S)-2-乙酰乳酸，3′-磷酸腺嘌呤硫酸，1-(5-磷酸核糖)-ATP，2，3，2′3′-四(β-羥基十四酰)-D-葡糖氨基-1，6-β-D-葡糖胺1，4′-二磷酸，莽草酸脂5-磷酸，(R)-泛解酸，2-脫氫泛解酸，CDP-乙醇胺，5-氨基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-羧酸，5-磷酸-β-D-核糖胺，N-琥珀酰-2-L-氨基-6-氧代庚二酸，D-4′-磷酸泛酸酯，3-脫氧-D-manno-2-辛酸，ADP-L-甘油-D-manno-庚糖，β-丙氨酸，D-丙氨酰-D-丙氨酸，O-琥珀酰-L-高絲氨酸，羥基喹啉，2-(甲酰胺基)-N1-(5-磷酸-D-核糖)乙脒，D-阿拉伯糖基5-磷酸，1-(5-磷酸核糖)-5-[(5-磷酸核糖氨基)亞甲基氨基]咪唑-4-甲酰胺，脂多糖，6-羥基甲基-二氫喋呤焦磷酸，莽草酸脂，十一異戊二烯-二磷酸-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酰-D-谷氨?；?內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸，十一異戊二烯-二磷酸-N-乙酰胞壁酸-(N-乙酰葡糖胺)-L-丙氨酸-D-谷氨酸-內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酰-D-丙氨酸-D-丙氨酸，5-磷酸核糖-5-羧基氨基咪唑，3-羧基-2-羥基-4-甲基戊酸，N-乙酰-D-葡糖胺1-磷酸，L-胱硫醚，(S)-3-甲基-2-戊酸，5-O-(1-羧乙烯)-3-磷酸莽草酸脂，2-氨基-4-羥基-6-(赤式-1，2，3-三羥基丙基)二氫喋啶三磷酸，D-甘油-D-manno-庚糖1，7-二磷酸，3-(咪唑-4-基)-2-丙基磷酸，3，4-二羥基-2-丁酮4-磷酸，具有月桂酸酯的KDO(2)-脂IV(A)，2-異丙基馬來酸，KDO-脂IV(A)，ADP-D-甘油-D-manno-庚糖，KDO(2)-脂(A)，N6-(1，2-二羧乙基)-AMP，5-甲酰胺基-1-(5-磷酸-D-核糖)咪唑-4-甲酰胺，脂A二糖，2，3-二氫吡啶而羧酸，3-脫氫奎尼酸，4-磷酸-L-天冬氨酸，S-腺苷甲硫氨酸胺，3-羧基-4-甲基-2-氧代戊酸，苯丙酮酸，D-葡糖胺1-磷酸，脫磷酸輔酶A，ADP-葡萄糖，4-氨基苯甲酸，L-組氨醇磷酸，LL-2，6-二氨基庚二酸，二氫喋呤單磷酸，泛酰巰基乙酸4′-磷酸，N-氨甲?；?L-天冬氨酸，(R)-2，3-二羥基-3-甲基戊酸，丙二酰輔酶A，4-氨基-4-脫氧分支酸，D-谷氨酸，3-(4-羥基苯基)丙酮酸，L-組氨醇，去氨基-NAD+，以及(S)-2-乙酰基-2-羥基丁酸。
5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的使用代謝通量分析篩選對微生物生長必需的代謝物的方法，其特征在于，根據(jù)通量和(Φ)的下降的細(xì)胞生長下降類型優(yōu)選選自下組，包括其中細(xì)胞生長線性下降的類型；其中細(xì)胞生長降低到標(biāo)準(zhǔn)值以下的類型；以及其中細(xì)胞生長非線性下降，于是細(xì)胞生長在通量和(Φ)達(dá)到零(0)之前停止的類型。
6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的使用代謝通量分析篩選對微生物生長必需的代謝物的方法，其特征在于，通量和(Φ)的擾動基于細(xì)胞生長下降的類型而變化。
7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用代謝通量分析篩選對微生物生長必需的代謝物的方法，其特征在于，目標(biāo)微生物為大腸桿菌。
8、根據(jù)權(quán)利要求1-3任意之一所述的使用代謝通量分析篩選對微生物生長必需的代謝物的方法，其特征在于，目標(biāo)微生物為病原微生物。
9、一種篩選對于微生物生長所需的基因的方法，所述方法包括篩選在通過在權(quán)利要求1-3中任意之一的權(quán)利要求的方法篩選的微生物的生長必需的代謝物中涉及的基因。
10、根據(jù)權(quán)利要求9的篩選對于微生物生長所需的基因的方法，其特征在于，目標(biāo)微生物為大腸桿菌。
11、根據(jù)權(quán)利要求9的篩選對于微生物生長所需的基因的方法，其特征在于，目標(biāo)微生物為病原微生物。
12、一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)化微生物的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求10的方法篩選的對于大腸桿菌的生長必需的基因轉(zhuǎn)化的模型微生物。
13、一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)化微生物的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求11的方法篩選的對于病原微生物的生長必需的基因轉(zhuǎn)化的模型微生物。
14、一種根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法并使用對于大腸桿菌的生長必需的基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化微生物。
15、一種根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法并使用對于病原微生物的生長必需的基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化微生物。
16、一種篩選抑制病原微生物的生長的物質(zhì)的方法，所述方法包括下列步驟
(a)在病原微生物的候選抑制劑存在的情況下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的微生物；和
(b)選擇與其中轉(zhuǎn)化微生物在不存在生長抑制劑候選物時(shí)培養(yǎng)的情況下相比顯示已知轉(zhuǎn)化微生物生長的候選物作為抑制病原微生物生長的物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了使用代謝通量分析篩選對于微生物生長必需的代謝物的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及通過選擇目標(biāo)微生物、構(gòu)建所選微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)模型、使所構(gòu)建的代謝網(wǎng)絡(luò)模型中每種代謝物的消耗反應(yīng)停止、分析每種代謝物的代謝通量，并通過對每種代謝物的利用(定義為通量和(Φ))確定所選的代謝物來篩選對于微生物的生長必需的代謝物的方法。根據(jù)本發(fā)明，對于微生物生長必需的代謝物和在必需代謝物中涉及的基因可以方便的方式篩選，并且根據(jù)本發(fā)明，針對病原微生物的藥物目標(biāo)基因可通過缺失與代謝物有關(guān)的基因來預(yù)測。
文檔編號G01N33/48GK101611312SQ200780047644
公開日2009年12月23日 申請日期2007年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月22日
發(fā)明者李相燁, 鄭夏雄, 金兌勇, 金潘俊, 李光浩 申請人:韓國科學(xué)技術(shù)院