專利名稱：用于監(jiān)測三維纖維蛋白凝塊形成的方法和儀器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于監(jiān)測多個樣本中的三維纖維蛋白凝塊形成(spatial fibrin clot formation)的方法和儀器。
背景技術(shù)：
為了診斷和基礎(chǔ)研究的目的在體外模擬血液凝結(jié)的問題長期存在。已經(jīng)提出了許 多用于測量血漿的凝血參數(shù)的方法和裝置；然而，這些方法中的大多數(shù)方法(例如激活部 分凝血激酶時間的測定、血栓彈性描記法、凝血酶生成試驗)監(jiān)測凝血時間或其它同質(zhì)參 數(shù)。換句話說，在血液(血漿)的樣本與激活劑均勻混合的這些實驗中，整體監(jiān)測樣本的凝 結(jié)。這是最簡單的方法，但是這種方法是非生理性的，因為體內(nèi)血液凝結(jié)是空間不均勻現(xiàn) 象。反應(yīng)劑的擴散在該過程中起著至關(guān)重要的作用。有少數(shù)方法考慮了空間不均勻性和擴散的作用。其中考慮這些參數(shù)的最相關(guān)的方 法是細(xì)胞凝結(jié)試驗(Monroe等人的Br J Haematol. 1994 ；88 (2) =364-371以及隨后的一系 列研究)。該方法基于常規(guī)熒光分光計的使用。該方法涉及通過在熒光底物的幫助下在血 漿蛋白和血小板的重組系統(tǒng)中二次取樣來監(jiān)測凝血酶的生成，其中凝結(jié)由單層組織因子表 達(dá)細(xì)胞(單核細(xì)胞)激活。盡管這是靈敏的方法，但是該方法的主要缺陷在于該方法并非 是真正三維的盡管反應(yīng)劑不均勻地分布，但是觀測信號是凝結(jié)過程的整體特征。在樣本采 集期間通過移液管混合也使空間不均勻性不太明顯。該方法是極其耗力和耗時的。該方法 僅用于基礎(chǔ)研究和藥理研究。該方法以目前的形式不可能用于診斷，因為該方法不能在不 修改的情況下用于血漿凝結(jié)，這是因為纖維蛋白凝塊的形成將阻止取樣的可能性。第二種方法是三維凝血方法(spatial clotting method) (Ataullakhanov 等人 的 Biochim Biophys Acta. 1998; 1425 (3) :453_468 ;Sinauridze 等人的 Biochim Biophys Acta. 1998 ； 1425 (3) :607_616 ；Ovanesov 等人的 Biochim Biophys Acta. 2002 ；1572(1) 45-57 ;0vanesov 等人的 Thromb Haemost. 2003 ；89 (2) :235_242 ；Ovanesov等人的 J Thromb Haemost. 2005 ；3 (2) :321_331 ;Panteleev 等人的 Biophys J. 2006 ；90 (5) :1489_1500。關(guān) 于三維凝血方法所引用的出版物通過參引包含在本文中)。該方法能夠在通過使血漿與激 活劑(玻璃或成纖維細(xì)胞單層)接觸產(chǎn)生的再鈣化血漿中通過視頻顯微鏡監(jiān)測血栓的形 成來進(jìn)行三維凝塊形成的研究。該方法被確立為靈敏的和可再現(xiàn)的方法。該方法有效地 用于血液凝結(jié)調(diào)節(jié)的研究。除了基礎(chǔ)研究之外，還研究了在各種異常狀態(tài)下的三維凝血異 常(血友病A、B和C ；凝血因子X、XII、II和纖維蛋白原的缺乏；敗血癥和大面積創(chuàng)傷；在 輸注治療期間的血漿稀釋等等)，并且還調(diào)查了治療劑(因子VIII濃縮劑、重組激活因子 VII (丹麥諾和諾德公司(NovoNordisc)的諾其(Novoseven ))、抗凝血酶III濃縮劑 等等)的作用機理。盡管有這些優(yōu)點，但是以前使用的用于三維凝血的方法和儀器不足以 實際使用。該方法并不允許同時測量一個以上的樣本，這對于基礎(chǔ)研究是不方便的并且完 全阻礙了大范圍的臨床使用。所需的最少血漿量為300μ 1，這超過了標(biāo)準(zhǔn)凝血實驗中的使 用量(ΙΟΟμΙ)的幾倍。激活通過成纖維細(xì)胞單層或玻璃進(jìn)行；前一種方法再現(xiàn)性差、昂貴并且耗時、耗力并且耗材(需要細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施)，后一種方法是非生理性的(通過玻璃的激 活經(jīng)由體內(nèi)路徑，這在體內(nèi)不起作用)。為了將樣本保持在37°C，通過將比色皿保持在水溫 箱中并用攪拌裝置熱穩(wěn)定比色皿；然而，這導(dǎo)致氣泡形成，從而降低信號質(zhì)量。第三種方法涉及血漿凝結(jié)以及血漿凝結(jié)從表面擴展的成像(參見Faxalv等人的 J Biomed Mater Res A. 2007 ；印刷中，在印刷前電子出版，DOI 10. 1002/jbm. a. 3152)。該 方法基本類似于上述的三維凝血方法并且依賴于從形成于比色皿中的纖維蛋白網(wǎng)散射的 光的定時間隔圖像采集。激活僅通過玻璃進(jìn)行。主要區(qū)別在于使用了標(biāo)準(zhǔn)分光光度比色皿 來代替用于三維凝血方法中的特定比色皿?？梢酝瑫r監(jiān)測若干比色皿，但是分辨率低并且 沒有自動化。盡管該方法允許使用標(biāo)準(zhǔn)分光光度比色皿并且能夠同時監(jiān)測若干樣本，但是 該方法的主要缺陷在于該方法需要數(shù)量很大的血漿(1500μ1)。此外，對于具有若干樣本 (100 μ 1而不是“三維凝血方法”中的10μ 1)的實驗，該方法的三維分辨率低，并且該方法 通過非生理激活(僅通過玻璃激活)進(jìn)行。沒有自動化，并且該方法是耗時和耗力的。該方 法設(shè)計成僅用于材料實驗，并且該方法對于診斷目的、基礎(chǔ)和藥理研究的適用性是有限的。第四種方法在于在帶有重組人體組織因子的構(gòu)型支撐膦脂雙層上的時空凝血 (spatiotemporal clotting) (Kastrup ^AW Proc Natl AcadSci USA. 2006 ； 103 (43) 15747-17752)。在該方法中，微流體室用于容納在構(gòu)型脂質(zhì)表面上的新再鈣化血漿。明視 野顯微鏡用于檢測纖維蛋白的形成。在該方法中，光軸垂直于激活劑表面，這不允許監(jiān)測沿 該方向的三維擴展。只能觀察到凝塊形成以及凝塊沿著激活劑的擴展。該方法的主要優(yōu)點 在于該方法能夠觀察在構(gòu)型激活表面上的凝血并且研究凝血引發(fā)的機理。然而，這是狹窄 和特定的問題。該方法對于其它類型的為了診斷目的基礎(chǔ)研究和藥理研究的適用性是有限 的。因此，在本領(lǐng)域中需要一種克服一個或多個上述缺陷的改進(jìn)方法，特別是需要一 種克服一個或多個上述缺陷的儀器。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的總的目的是提供允許靈敏地可再現(xiàn)地體外模擬血液凝結(jié)(具體地 是指纖維蛋白凝塊形成和/或溶解的過程)的高分辨率的方法，特別是儀器，其考慮了空間 不均勻性和擴散的作用并且適于同時監(jiān)測多個樣本，這在臨床監(jiān)測中是特別重要的。本新發(fā)明特別地公開了制造和使用更加簡單的比色皿組件(cuvette assembly) 26、比色皿保持器(cuvette holder) 13、包括比色皿保持器和光檢測裝置的儀器 14以及構(gòu)成三維凝血方法的進(jìn)一步的發(fā)展的方法，從而提供了更多信息、允許自動化并且 適于臨床環(huán)境中的使用。在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于光度分析的比色皿組件26，所述比色皿組件 26包括比色皿、插入物和凝血激活劑，其中比色皿1由分隔壁4分隔成多個腔室2 ；插入物5 包括從一個區(qū)域7突出的多個突出部6，所述突出部適于裝配到所述比色皿1的腔室2中； 并且所述激活劑選自生理性和非生理性凝血激活劑的類別，并且其中所述激活劑位于插入 物的突出部6上，優(yōu)選地在突出部6的底部邊緣24處。優(yōu)選地，比色皿1的腔室2在剖視圖中是平面平行形狀和/或矩形形狀。更優(yōu)選地，比色皿1的腔室2布置成一條線并且具有相等的容積。
在一個優(yōu)選實施例中，比色皿1由透光的塑料材料制成，優(yōu)選由聚苯乙烯制成。然 而，可以使用其它生物惰性材料(諸如聚氯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯)。在另一優(yōu)選實施例中，插入物5的突出部6的數(shù)量對應(yīng)于比色皿1的腔室2的數(shù)量。在另一個優(yōu)選實施例中，插入物5在裝配到比色皿1中時使得插入物5的表面與 比色皿1的內(nèi)表面之間的有效距離減小到0. Imm或以下，優(yōu)選減小到0. 05mm。在又一優(yōu)選實施例中，插入物5在每個突出部6上載有相同或不同的激活劑，或者 其中并非所有突出部6都載有激活劑。在又一優(yōu)選實施例中，插入物5的突出部6是能更換的，以便可以通過將處于所需 組分中的突出部6設(shè)置到插入物5中而獲得用于特定實驗的激活劑的預(yù)期組合。因此，本 發(fā)明還涉及一種比色皿組件，其中插入物5的突出部6能拆卸地或不能拆卸地連接到所述 區(qū)域7。在一個有利的實施例中，插入物5由塑料制成，優(yōu)選由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚甲 基丙烯酸甲酯制成。本發(fā)明還包括用于插入物5的其它材料(諸如其它生物惰性材料)。在另一有利的實施例中，所述激活劑是生理性凝血激活劑(例如組織因子、凝血 酶、組織因子表達(dá)細(xì)胞層、組織樣本等)。對于涉及不僅監(jiān)測凝塊形成而且監(jiān)測凝塊溶解的 實驗，可以使用纖維蛋白溶解激活劑(組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)、尿激酶纖維蛋白 溶酶原激活劑(uPA)等)。為了生物材料相容性的研究，可以使用非生理性激活劑(例如玻 璃)、可植入裝置/材料和人工器官/材料的樣本等。激活劑(優(yōu)選蛋白質(zhì))通過已知的化 學(xué)過程(例如化學(xué)鍵合)固定在表面上。在本文中公開的比色皿組件26優(yōu)選地用于在體外監(jiān)測三維纖維蛋白凝塊的形 成。 在第二方面，本發(fā)明公開了 一種比色皿保持器。在本文中使用的術(shù)語“比色皿保持 器”是指一種裝置，該裝置固定比色皿使得在比色皿內(nèi)發(fā)生的化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)可以由 適當(dāng)?shù)脑O(shè)備監(jiān)測。本文描述的比色皿保持器包括熱穩(wěn)定比色皿1的恒溫器10和用于將比色皿1保 持在恒溫器10內(nèi)并沿著光路的裝置。在本文中使用的術(shù)語“恒溫器”指的是帶有溫度控制 流體28的室。恒溫器10充滿流體28 ；合適的流體28包括氣體(諸如N2和空氣)；液體 (諸如水、酒精或多元醇)，最優(yōu)選水。此外，包括流體28的恒溫器10至少部分是透光的， 使得在比色皿組件26內(nèi)的化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)可以經(jīng)由光學(xué)裝置記錄。流體28也在光路 內(nèi)。優(yōu)選地，比色皿保持器13被熱穩(wěn)定和熱絕緣。在一個優(yōu)選實施例中，比色皿保持器適于使比色皿1垂直于光路并且以相對于豎 直線優(yōu)選成10° -40°傾角的方式布置。然而，比色皿平面應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格地垂直于光路。在一個優(yōu)選實施例中，比色皿保持器尤其適用于上述比色皿。在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于在體外監(jiān)測三維纖維蛋白凝塊形成和/或溶 解的儀器14，所述儀器14包括本文描述的比色皿保持器和光學(xué)檢測裝置。在另一方面，本發(fā)明公開了一種儀器，特別是上述公開的儀器，所述儀器包括比色 皿保持器13和光學(xué)檢測裝置，其中比色皿保持器13垂直于光路地并且以相對于豎直線優(yōu) 選成10° -40°傾角的方式布置比色皿1。比色皿保持器優(yōu)選地是本文公開的比色皿保持器13。典型地，比色皿平面嚴(yán)格地垂直于光路。在另一方面，本發(fā)明描述了一種用于在體外監(jiān)測三維纖維蛋白凝塊形成和/或溶 解的方法，所述方法包括以下步驟A)在凝塊形成的情況下(a)提供容納血漿的一個或多個樣本的比色皿；(b)使血漿與生理性凝血激活劑接觸；和(c)記錄纖維蛋白凝塊隨時間的生長。B)在凝塊溶解的情況下(a)提供容納包括一個或多個纖維蛋白凝塊的血漿的一個或多個樣本的比色皿；(b)使血漿與纖維蛋白溶解激活劑接觸；和(c)記錄纖維蛋白凝塊隨時間的溶解。優(yōu)選地在控制溫度下，優(yōu)選地在生理溫度下，即37°C或37°C左右執(zhí)行所述方法。步驟(a)的比色皿優(yōu)選地是上面公開的比色皿1。樣本分配到比色皿1中可以使 用多道移液管進(jìn)行，這允許所述方法的自動化。更優(yōu)選地，比色皿1被放置在本文公開的比色皿保持器13中。最優(yōu)選地，所述方 法在本文公開的儀器14內(nèi)進(jìn)行。在一個優(yōu)選實施例中，通過將上述插入物5插入比色皿1中執(zhí)行步驟(b)。梳狀插 入物5在突出部6的表面上，優(yōu)選在突出部6的底部邊緣24處載有激活劑。當(dāng)存在于突出 部6的底部邊緣24上的激活劑與血漿接觸時，纖維蛋白凝塊開始形成于激活劑表面上并且 擴展到大量血漿中。優(yōu)選地，所述激活劑是組織因子；然而，可以使用其它激活劑(例如凝血酶、組織 因子表達(dá)細(xì)胞或組織樣本)。備選地，所述激活劑可以是非生理性的(例如正在測試其生物 相容性的玻璃或塑料)。對于血液凝塊溶解的實驗，可以使用纖維蛋白溶解激活劑(例如組 織纖維蛋白溶酶原激活劑)。在本文中使用的術(shù)語“血漿”包括血漿、富含血小板的血漿、再鈣化血漿和血漿成 分。為了特定的研究應(yīng)用，血漿可以與各種反應(yīng)劑(附加激活劑、抑制劑、藥物等)混合。為 了監(jiān)測纖維蛋白溶解，血漿可以與纖維蛋白溶解激活劑(例如尿激酶纖維蛋白溶酶原激活 劑或鏈激酶)的溶液混合。另外，為了研究目的，凝血蛋白質(zhì)、校準(zhǔn)溶液等的特定反應(yīng)劑混 合物可以用于代替血漿。因此術(shù)語“血漿”應(yīng)當(dāng)理解成是在該廣義范圍內(nèi)，也包括這些改性 血漿類型。纖維蛋白凝塊的生長例如由發(fā)光二極管照射。正在生長的纖維蛋白凝塊所散射的 光可以由光學(xué)檢測裝置15 (例如由CCD照相機)記錄。然后，優(yōu)選地通過計算機數(shù)字地分 析記錄數(shù)據(jù)(例如正在生長的血栓的采集定時間隔圖像)。例如，可以由本文公開的方法確 定的主要參數(shù)是凝塊生長的速度、滯后時間和凝血時間。在另一方面，本發(fā)明公開了一種固定在(例如化學(xué)鍵合到)一個表面上的血液凝 結(jié)或纖維蛋白溶解激活劑。這分別對于在體外監(jiān)測三維纖維蛋白凝塊的形成或溶解是有用 的。血液凝結(jié)激活劑可以是蛋白質(zhì)(諸如組織因子或凝血酶)或者細(xì)胞或組織表達(dá)組織因 子。用于纖維蛋白溶解的激活劑的例子包括tPA和uPA。本文公開的方法和用于監(jiān)測三維纖維蛋白凝塊形成的儀器14優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的主要優(yōu)點在于僅需要少量體積的血漿。使用少至20 μ 1 (而不是300至1500 μ 1，即為以前報 導(dǎo)的唯一另一個類似系統(tǒng)的1/75，并且是標(biāo)準(zhǔn)凝血實驗所需的最少血漿量的1/5)便可以 產(chǎn)生高分辨率的可靠結(jié)果。此外，本發(fā)明的比色皿1容易使用并且僅需要最少的操作步驟，這些操作不需要 任何特定技能。與之相比，現(xiàn)有技術(shù)的裝置需要具有平均水平以上的手部技能的專業(yè)生物 化學(xué)家進(jìn)行操作。與需要一個或兩個熟練生物化學(xué)家的現(xiàn)有技術(shù)的方案相比，儀器14操作簡單并 且可以由輔助人員使用。方便的非必需的比色皿1和插入物5的使用使所需操作步驟減小 到最小(插入比色皿1、裝載血漿、插入存在于插入物5上的激活劑)。所述方法和儀器不僅可以用于監(jiān)測凝塊形成，而且可以用于監(jiān)測纖維蛋白凝塊溶 解(“溶解”或纖維蛋白溶解)的過程。此外，實驗樣本快速地裝載到本文所述的比色皿1上。樣本裝載需要很少的時間， 不超過1-2分鐘。通常的實驗時間為25-30分鐘；每10秒拍攝圖像。血栓形成的通常模式 包括2-5分鐘的滯后時間(在激活之后的該時間期間什么也看不到；滯后時間大大取決于 激活劑的類型)，隨后是纖維蛋白凝塊以30-40 μ m/min的速度擴展到大量血漿中。在病理 條件下，滯后時間可以延長或縮短；凝塊生長速度可以增大或減小。另外，在血漿中的促凝 血素變化的情況下，可以在比色皿1中觀察到自發(fā)的、與激活劑無關(guān)的凝血。最重要的是，可以通過以自動方式使用不同的激活劑來同時監(jiān)測若干樣本使用 本文公開的比色皿1允許例如通過由常規(guī)多道移液管分配樣本而將血漿同時裝載到所有 腔室中，并且可插入激活劑的使用允許用單個動作同時激活凝血。因此，在專門設(shè)計的一次 性塑料比色皿1帶有四個腔室和一個相應(yīng)的插入物5的實施例中，可以同時用多達(dá)四種不 同的激活劑在多達(dá)四個不同的樣本中監(jiān)測三維凝塊的形成。可以同時裝載(例如用多道移 液管)樣品，并且同時用梳狀插入物激活樣本。該方法和儀器14的主要優(yōu)點在于能夠檢測凝血障礙(例如血漿中的促凝血素的 變化)，常規(guī)凝血試驗(例如激活部分凝血激酶時間的測定、凝血酶原時間的測定、血栓彈 性描記法或凝血酶生成試驗)不能檢測凝血障礙或檢測性差。盡管該優(yōu)點可能部分地由先 前所述的現(xiàn)有技術(shù)的時空方法所享有，但是所提出的方法和儀器是唯一方便實際用于臨床 環(huán)境中的。本發(fā)明可以用于診斷、生物材料實驗、血栓癥和止血的基礎(chǔ)和藥理研究。


當(dāng)考慮本發(fā)明的以下詳細(xì)描述時將更好地理解本發(fā)明并且將顯而易見除了上述 以外的目的。這樣的描述參考附圖，附圖中圖Ia示出比色皿1的主視圖，并且圖Ib示出比色皿1的內(nèi)部空間的剖視圖。圖2a示出用于比色皿1的梳狀插入物5的主視圖。圖2b提供了插入物5的側(cè)視 圖，并且圖2c提供了插入物5的透視圖。圖2d示出比色皿組件26的剖視圖。圖2e示出 圖2d的側(cè)視圖。圖3示出比色皿1放置在其中的比色皿保持器13。比色皿保持器包括可以經(jīng)由防 水門11接近的恒溫器10。
圖4示出儀器14的主要元件的透視圖。圖5a和5b示意性地示出了比色皿1傾斜定位在光路中的布置。
具體實施例方式圖Ia示出實驗比色皿1的主視圖。比色皿1具有基本為長方體的形狀。如圖Ib的剖視圖中可以看到的，比色皿1的內(nèi)部空間由分隔壁4分隔成相同大小 的四個腔室(well)2。每個腔室2都具有3X Imm2的矩形截面。然而，本發(fā)明并不限于所指 示的尺寸；例如可以有具有更小矩形截面的更多腔室2。在一個優(yōu)選實施例中，比色皿1和 腔室2的整體設(shè)計設(shè)計成僅需要少量的樣本體積來提供可靠的結(jié)果。在圖Ia和Ib所示的 實施例中，僅需要20μ 1的樣本體積來獲得可靠的結(jié)果。優(yōu)選地，分隔壁4將比色皿1分隔成多個平行且串聯(lián)地對準(zhǔn)的腔室2 (參見圖lb)。 室或腔室2的寬度優(yōu)選相等。在該實施例中，分隔壁4不與比色皿1的總高度等高。然而，分隔壁4可以具有不 同的高度，例如與比色皿的頂部等高。能夠?qū)⒉迦胛?固定到比色皿1的保持裝置19在比色皿1的頭部18中。這里， 保持裝置19設(shè)計成凸起(knub) 19 ；然而，其它實施例也是可以的。在主視圖中，頭部18基本為帶傾斜邊緣的正方形。然而，頭部18也可以具有不同 的形狀。傾斜邊緣區(qū)域8為比色皿1提供定向，使得使用者可以確定地將他的樣本和/或 插入物5定位到比色皿1中。在另一實施例中，為了定向比色皿1，比色皿1可以具有不同 的定向裝置8，諸如彩色標(biāo)記、符號或突出區(qū)域。在圖Ia中，比色皿1外表面上的邊緣27也用于校正定位并且是可選的。當(dāng)邊緣 8幫助校正插入物5在比色皿1內(nèi)的定向時，這些定向裝置27是防止錯誤定向的導(dǎo)向器。在另一優(yōu)選實施例中，比色皿的寬度比深度大，優(yōu)選地，寬度僅為1. Imm或大約為 1. Imm0比色皿1由聚苯乙烯制成。然而，本發(fā)明還包括其它透光塑料(諸如聚甲基丙烯 酸甲酯或聚苯乙烯)。分隔壁4由與比色皿1相同的材料制成；然而，在一個備選實施例中，所述分隔壁 4可以由不同的材料制成。如圖Ib中所示，比色皿具有四個腔室2。然而，本發(fā)明包括在技 術(shù)上可行并且有用的任何其它數(shù)量的腔室2。此外，在一個備選實施例中，比色皿1可以在它的外表面3上具有用于穩(wěn)定地和可 移除地插入如下文描述的比色皿保持器中的裝置。圖2a示出用于比色皿1的梳狀插入物5的主視圖。插入物5具有以平行方式從 支撐部7突出的四個突出部6。本發(fā)明的插入物5并不限于四個突出部，本發(fā)明包括在技 術(shù)上可行并且有用的任何其它數(shù)量的突出部6。最優(yōu)選地，突出部6的數(shù)量對應(yīng)于比色皿1 中的腔室2的數(shù)量。此外，突出部6可以是能更換的，以便能夠在現(xiàn)場容易地組成特定實驗設(shè)計所需 的激活劑的組合。區(qū)域7 (支撐部)基本為矩形，并且在左上邊界具有斜面8，一旦插入物5要插入 比色皿1中，所述斜面使得能夠定向插入物5。通過握持區(qū)域7可以抓握和操縱插入物5。
9在另一優(yōu)選實施例中，代替傾斜邊緣或者附加地，區(qū)域7載有其它定向裝置8，例如物理標(biāo) 記(諸如彩色標(biāo)記、符號或突出區(qū)域)。由此，使用者可以容易地將插入物5定向到比色皿 1的腔室2中，從而將每個突出部6分配給特定的腔室2。在一個實施例中，定向裝置8可 以形成為從區(qū)域7突出的導(dǎo)向區(qū)域，當(dāng)插入時所述導(dǎo)向區(qū)域沿著比色皿1的頭部18引導(dǎo)插 入物5。典型地，插入物的突出部6比比色皿1的腔室2的寬度窄，使得插入物5可以插入 比色皿1中，同時也使得空氣能夠排出。當(dāng)插入物5被放置到比色皿1中時，在插入物5的 表面與比色皿1的內(nèi)表面之間的剩余空間28優(yōu)選為0. 05mm，這允許可能下沉的空氣逸出。突出部6在被放置到裝載有樣本的比色皿1中時與樣本直接接觸。然而，突出部6 的長度應(yīng)當(dāng)使得這些突出部不會到達(dá)腔室2的底部9。形成的纖維蛋白凝塊將從突出部6 的底部邊緣24朝著比色皿1的底部(即在形成于突出部6與腔室2的底部9之間的剩余 空間28中)生長。存在于區(qū)域7中的圓孔20用作允許插入物5與比色皿1的內(nèi)表面上的保持裝置 19連接的固定裝置。固定裝置20可以具有不同的設(shè)計。然而，保持裝置19和固定裝置20 優(yōu)選彼此匹配。如圖2b和圖2c中可以看到的，插入物5比寬度更窄。插入物5由聚苯乙烯制成；然而，本發(fā)明還包括其它材料，優(yōu)選為塑料(諸如聚甲 基丙烯酸甲酯)。插入物5在它的表面上，優(yōu)選地在突出部6的底部邊緣24上載有凝血激活劑或纖 維蛋白溶解激活劑。各種類型的凝血激活表面可以用作激活劑，但是優(yōu)選使用允許可再現(xiàn) 生理引發(fā)凝血的生理性激活劑(例如固定的組織因子(immobilized tissue factor))。備 選地，插入物5由玻璃制成，并且生理性激活劑的存在可以不是必須的。插入物5的每個突 出部6可以載有相同或不同濃度的相同的激活劑，或者每個突出部6可以載有不同的激活 劑。因此，當(dāng)使用如圖Ib和圖2a-2c中所示的實施例時，可以同時用多達(dá)四種不同的激活 劑在多達(dá)四個不同的樣本中監(jiān)測三維凝塊的形成。在圖2d的剖視圖中，示出被放置在比色皿1中的插入物5。插入物5在比色皿1 內(nèi)的位置被固定，因為插入物用它的固定裝置20安裝在比色皿1的保持裝置19上。在突出 部6與分隔壁4之間留出小空間28，該空間允許可能俘獲的空氣逸出。插入物5以及比色 皿1的定向裝置8對準(zhǔn)。如可以看到的，突出部6的底部邊緣24沒有到達(dá)腔室2的底部。 圖2e示出被放置在比色皿1中的插入物5的側(cè)視圖。圖3示出一個實施例的拆卸開的比色皿保持器13，其中比色皿組件26被放置到恒 溫器10中。恒溫器10提供熱穩(wěn)定和熱絕緣，從而最小化位于比色皿中的不同樣本內(nèi)的可能 的對流。流體28存在于恒溫器10內(nèi)，所述流體優(yōu)選被再循環(huán)和過濾和/或包括抗菌劑，以 便保證良好的可見性。然而，沒有熱穩(wěn)定和/或熱絕緣發(fā)生的其它實施例也是可以的。經(jīng)由防水門11可以接近恒溫器10從而允許維護(hù)。門11和恒溫器10經(jīng)由連接裝 置22 (諸如圖3中所示的螺釘)連接。恒溫器10具有允許成像和監(jiān)測凝塊形成的可視部分21。恒溫器10可以具有一個 或多個可視部分21或者完全是透明的。
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圖3還示出帶有開口 23的外殼12，當(dāng)帶有門11的恒溫器10插入外殼12中時，所 述開口用于插入比色皿1。所述外殼優(yōu)選地具有至少一個連接裝置(諸如螺紋)，所述連接 裝置能夠?qū)⒈壬蟊３制?3連接到另一個物品(諸如板17)。圖4示出一個實施例的拆卸開的儀器14的透視圖，儀器14包括識別裝置15 (在 這里是帶有物鏡16的CXD照相機)、前板17和帶有比色皿1的實驗比色皿保持器13。識別裝置15是光學(xué)檢測裝置(諸如CXD照相機、攝像機、膠片)或者當(dāng)前的裝置 (諸如激光掃描裝置、顯微鏡或其它光檢測器)。前板17的存在是可選的。比色皿保持器13附連到儀器14內(nèi)可以以不同的方式 解決。在使用前板17的情況下，比色皿保持器13可以經(jīng)由連接裝置25 (諸如螺紋25)被 附連。典型地，比色皿保持器13定位成(例如附連到前板17)使得比色皿1被放置在非 豎直的位置上，以便當(dāng)插入物5插入比色皿1中時防止空氣滯留。優(yōu)選地，相對于豎直軸線 的傾角是10° -40° (參見圖4和5)?？蛇x地(未示出)，一個外殼可以保護(hù)儀器14。在圖5a中，示意性地示出了比色皿1或比色皿組件26定位在比色皿保持器13中。 比色皿保持器和可選的檢測裝置二者在沿χ軸方向的光路上對準(zhǔn)。垂直于光路的平面沿y 和ζ軸方向形成。如可以看到的，比色皿1或比色皿組件26垂直于光路布置。圖5b是圖 5a的示意性主視圖并且示出比色皿1或比色皿組件26不僅垂直于光路，而且相對于豎直線 傾斜。應(yīng)當(dāng)理解的是，各個實施例、參數(shù)選擇和范圍可以任意組合。此外，根據(jù)特定實施 例，選定的定義、實施例或范圍可能不適用。盡管示出和描述了本發(fā)明的當(dāng)前優(yōu)選的實施例，但是顯然應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明并 不局限于此，而是可以在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)以另外的方式變化地實施和實踐。
權(quán)利要求
一種用于光度分析的比色皿組件，所述比色皿組件包括比色皿、插入物和激活劑，其中所述比色皿(1)由分隔壁(4)分隔成多個腔室(2)；所述插入物(5)包括從一個區(qū)域(7)突出的多個突出部(6)，所述突出部適于裝配到所述比色皿(1)的腔室(2)中；并且所述激活劑選自生理性凝血激活劑、非生理性凝血激活劑、生理性纖維蛋白溶解激活劑或非生理性纖維蛋白溶解激活劑的類別，并且其中所述激活劑位于插入物的突出部(6)上，優(yōu)選地在突出部(6)的底部邊緣(24)處。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的比色皿組件，其中腔室(2)在剖視圖中是平面平行形狀和/ 或矩形形狀。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的比色皿組件，其中比色皿⑴的腔室(2)布置成 一條線并且具有相等的容積。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的比色皿組件，其中比色皿(1)由透光的塑料材料 制成，優(yōu)選由聚苯乙烯制成。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的比色皿組件，其中插入物(5)的突出部(6)的數(shù) 量對應(yīng)于比色皿(1)的腔室(2)的數(shù)量。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的比色皿組件，其中插入物(5)在裝配到比色皿 ⑴中時使得插入物(5)的表面與比色皿(1)的內(nèi)表面之間的有效距離減小到0. Imm或以 下，優(yōu)選減小到0. 05mm。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的比色皿組件，其中插入物(5)在每個突出部(6) 上載有相同或不同的激活劑，或者其中并非所有突出部(6)都載有激活劑。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的比色皿組件，其中插入物(5)由塑料制成，優(yōu)選 由聚苯乙烯制成。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的比色皿組件，其中所述激活劑是例如組織纖維蛋 白溶酶原激活劑的生理性激活劑，或者是例如玻璃的非生理性激活劑。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的比色皿組件，其中所述突出部(6)能拆卸地或 不能拆卸地連接到插入物(5)的所述區(qū)域(7)。
11.一種比色皿保持器，所述比色皿保持器包括熱穩(wěn)定比色皿的恒溫器(10)；和用于 將比色皿保持在恒溫器(10)內(nèi)并沿著光路的裝置，其中恒溫器(10)充滿流體(28)；并且其中包括流體(28)的恒溫器(10)至少部分是透光的；并且其中流體(28)也在光路內(nèi)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的比色皿保持器，所述比色皿保持器適于使得比色皿垂直于 光路并且以相對于豎直線優(yōu)選地成10° -40°傾角的方式布置。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的比色皿保持器，所述比色皿保持器尤其適用于根據(jù)權(quán) 利要求1-10所述的比色皿組件(26)。
14.一種用于在體外監(jiān)測三維纖維蛋白凝塊形成和/或溶解的方法，所述方法包括以 下步驟A)在凝塊形成的情況下(a)提供容納血漿的一個或多個樣本的比色皿；(b)使血漿與生理性凝血激活劑接觸；和(c)記錄纖維蛋白凝塊隨時間的生長。B)在凝塊溶解的情況下(a)提供容納包括一個或多個纖維蛋白凝塊的血漿的一個或多個樣本的比色皿；(b)使血漿與纖維蛋白溶解激活劑接觸；和(c)記錄纖維蛋白凝塊隨時間的溶解。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中在控制溫度下，優(yōu)選在37°C執(zhí)行所述方法。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的方法，其中步驟(a)的比色皿是權(quán)利要求1_9中任一 項所述的比色皿(1)。
17.根據(jù)權(quán)利要求14-16中任一項所述的方法，其中通過將根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一 項所述的插入物(5)插入比色皿⑴中執(zhí)行步驟(C)。
18.根據(jù)權(quán)利要求14-17中任一項所述的方法，其中所述激活劑位于插入物(5)的突 出部(6)的底部邊緣(24)上，并且當(dāng)插入物(5)插入比色皿(1)中時所述激活劑與血漿接 觸。
19.根據(jù)權(quán)利要求14-18中任一項所述的方法，其中所述激活劑是組織纖維蛋白溶酶 原激活劑。
20.一種根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的比色皿組件的用途，所述比色皿組件用于 在體外監(jiān)測三維纖維蛋白凝塊的形成或溶解。
21.一種固定的血液凝結(jié)或纖維蛋白溶解激活劑、特別是組織因子的用途，用于在體外 監(jiān)測三維纖維蛋白凝塊的形成。
22.一種用于在體外監(jiān)測三維纖維蛋白凝塊形成和/或溶解的儀器，所述儀器包括根 據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項所述的比色皿保持器(13)和光學(xué)檢測裝置。
23.一種儀器，特別是根據(jù)權(quán)利要求23所述的儀器，所述儀器包括比色皿保持器(13) 和光學(xué)檢測裝置，其中比色皿保持器(13)垂直于光路地并且以相對于豎直線優(yōu)選地成 10° -40°傾角的方式布置比色皿(1)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于在多個樣本中監(jiān)測三維纖維蛋白的形成或溶解的方法、專用比色皿(1)和帶有載有激活劑的突出部(6)的插入物(5)。
文檔編號G01N33/49GK101903772SQ200780101862
公開日2010年12月1日 申請日期2007年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月2日
發(fā)明者F·阿陶拉克哈諾夫, M·奧瓦涅索夫, M·潘特利夫, V·薩巴什 申請人:醫(yī)學(xué)塑料股份有限公司;醫(yī)學(xué)創(chuàng)新有限公司