專利名稱：：弓形蟲循環(huán)抗原免疫金標(biāo)快速檢測試劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測弓形蟲循環(huán)抗原的免疫膠體金試劑，具體說是一種弓形蟲循環(huán)抗原免疫金標(biāo)快速檢測試劑條，本發(fā)明還包括該試劑的制備方法。技術(shù)背景現(xiàn)有檢測弓形蟲病的方法主要是檢測弓形蟲抗體，弓形蟲抗體在人和動物感染弓形蟲后體內(nèi)出現(xiàn)比較晚，檢測弓形蟲抗體無法做到早期診斷；而且弓形蟲抗體在人和動物體內(nèi)存留的時間長，有的動物可終身存留，因此弓形蟲抗體的檢測難以對現(xiàn)癥感染和既往感染進(jìn)行區(qū)分。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種同時可檢測人和各種動物的弓形蟲循環(huán)抗原，能夠早期診斷弓形蟲病，對現(xiàn)癥感染和既往感染進(jìn)行區(qū)分的一種弓形蟲循環(huán)抗原免疫金標(biāo)快速檢測試劑及其制備方法，該方法操作簡便，能有效降低檢測成本，減輕檢測人員的負(fù)擔(dān)。木發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種弓形蟲循環(huán)抗原免疫金標(biāo)快速檢測試劑條，該試劑條包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次粘附樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，其特征在于所述結(jié)合墊包被了帶有抗弓形蟲多克隆抗體的膠體金結(jié)合物，所述硝酸纖維素膜上以線形包被抗弓形蟲多克隆抗體作為檢測線，包被弓形蟲代謝分泌抗原作為滯控線。上述弓形蟲循環(huán)抗原免疫金標(biāo)快速檢測試劑條按下述方法制備a、制備弓形蟲代謝分泌抗原2025克體重小鼠每只按lxl05lxl()6弓形蟲速殖子腹腔接種，經(jīng)34日，小鼠出現(xiàn)精神沉郁、不食、被毛粗亂的癥狀時，脫頸致死小白鼠，浸泡于7075%酒精內(nèi)體表消毒；每只小鼠用23毫升20.15mol/LPBS緩沖液洗腹收集蟲體；將所收集的腹腔液以30004000rpin離心3040分種，收集上清液；將上清液在-2(TC溫度下放置2448小時，凍融化開后再次以30004000rpm離心3040分鐘，離心23次，收集上清液；上清液即為弓形蟲代謝分泌抗原；b、制備抗弓形蟲多克隆抗體用上述a步所得的弓形蟲抗原免疫羊，再用弓形蟲速殖子加強免疫，經(jīng)瓊擴檢測達(dá)1:3264時，采集免疫羊血清，用飽和硫酸銨粗提取羊抗弓形蟲抗體，再用凝膠層析法純化羊抗弓形蟲抗體，獲得抗弓形蟲多克隆抗體；C、制備膠體金用檸檬酸三鈉將氯金酸還原成4060納米的膠體金顆粒;d、制備抗弓形蟲多克隆抗體膠體金標(biāo)記物將上述C歩所得膠體金與上述b步所得抗弓形蟲多克隆抗體按1:0.04(ml/mg)比例攪拌混勻，混合液中每1000ml加入牛血清白蛋白2400mg，最后加入100g/L氯化鈉水溶液100ml，使其終濃度為10g/L，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，通過純化濃縮得到8%的濃縮液，即為抗弓形蟲多克隆抗體膠體金標(biāo)記物；e、將上述d步所得抗弓形蟲多克隆抗體膠體金標(biāo)記物包被在膠體金結(jié)合墊上，將上述b步所得抗弓形蟲多克隆抗體和上述a歩所得弓形蟲代謝分泌抗原以線形包被在硝酸纖維膜上，形成一條檢測線和一條滯控線，干燥后依次將樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維膜、吸水濾紙和不干膠保護(hù)層粘貼在PVC板上，在手持端粘貼彩色手柄紙，在進(jìn)樣端粘貼標(biāo)有MAX線的塑料紙，用斬切機切成0.3X8cm的試劑條，即制成檢測弓形蟲循環(huán)抗原免疫金標(biāo)快速檢測試劑條。本發(fā)明具有下述有益效果(1)應(yīng)用范圍廣，可檢測人和各種動物的弓形蟲循環(huán)抗原；(2)快捷迅速，全過程只需30分鐘；(3)靈敏準(zhǔn)確，敏感性和準(zhǔn)確性高，結(jié)果受外閑影響較小，可在養(yǎng)殖場現(xiàn)場進(jìn)行檢測；(4)操作簡單，不需要任何特殊儀器和設(shè)備，檢測人員無需專業(yè)培訓(xùn)，適合在基層推廣應(yīng)用；(5)價格低廉，(6)保存和運輸方便，一般保存于4'C冰箱即可；(7)安全穩(wěn)定，膠體金、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯均無毒性，絕對不會造成環(huán)境污染。表l弓形蟲抗原金標(biāo)試劑條特異性試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>從表1可以看出，用同一批次金標(biāo)試劑條分別檢測豬衣原體陽性血清、豬瘟陽性血清、豬傳染性胸膜肺炎陽性血清各5Q、46、38份，結(jié)果全為陰性，無交叉反應(yīng)，證實該試劑條特異性良好。表2弓形蟲抗原金標(biāo)試劑條敏感性試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>從表2可以看出，人工感染弓形蟲后，弓形蟲循環(huán)抗原檢測試劑在24h后即可部分檢出，72h后感染動物全部為陽性，而其他試劑的檢出時間明顯遲于抗原金標(biāo)檢測試劑條，并且弓形蟲循環(huán)抗原金標(biāo)檢測試劑條可以檢出IO個速殖子以內(nèi)的抗原。具體實施方式實施例1(1)制備弓形蟲代謝分泌抗原2007年1月28H以lxlOA6弓形蟲速殖子/只，腹腔接種20克體重小鼠20只，1月31日，小鼠出現(xiàn)丫精神沉郁、被毛粗亂等癥狀，將小白鼠脫頸致死，浸泡于75%酒精內(nèi)進(jìn)行體表消毒。每只小鼠用2毫升PH7.20.15mol/LPBS緩沖液洗腹收集蟲體，共收集腹腔液45ml，將所收集的腹腔液以每分鐘3000轉(zhuǎn)的速度離心40分鐘，收集上清液，上清液置-20"C冰箱內(nèi)，2月1日從冰箱取出上清，融化后再以每分鐘4000轉(zhuǎn)的速度離心3次，每次離心30分鐘，收集上清液，上清液即為弓形蟲代謝分泌抗原，置_20'C冰箱內(nèi)備用。(2)制備抗弓形蟲多克隆抗體2007年2月18H用弓形蟲代謝分泌抗原皮下免疫羊，半個月后用弓形蟲速殖子lxl0八6/只腹腔加強免疫，再經(jīng)過7天后采集血清進(jìn)行瓊擴檢測，效價為1:16，又用弓形蟲速殖子lxl0八7/只腹腔加強免疫，再經(jīng)過7天后采集血清進(jìn)行瓊擴檢測，效價為1:64，采集免疫羊血100ml，分離血清40ml，血清分別用50%、33%、33%的飽和硫酸銨提取羊抗弓形蟲抗體，粗提的羊抗弓形蟲抗體經(jīng)S印hacrylS-300服凝膠層析法純化。純化的羊抗弓形蟲多克隆抗體用蛋白檢測儀檢測蛋白含量，蛋白含量為15mg/ml。置一15"C冰箱內(nèi)備用。(3)制備膠體金及抗弓形蟲多克隆抗體膠體金標(biāo)記物2007年4月18曰取HAuCl40.lg，用1000ml三蒸餾水將HAuCl4配成0.lg/L的溶液，煮沸后加新配制的10gZL檸檬酸三鈉7.5ml;繼續(xù)煮沸5min，直至溶液變成葡萄酒紅色，冷卻后用0.2mol/LK2C03將膠體金pH值調(diào)至8.9左右，制成4060納米的膠體金顆粒；將1000ml膠體金加入抗弓形蟲多克隆抗體40mg混勻，置超凈臺磁力攪拌20min，4。C靜置30min，然后1000ml加入牛血清白蛋白2400mg，繼續(xù)攪拌5min，最后加入IOOg/L氯化鈉水溶液100ml，使其終濃度為10g/L;混勻，以2000r/min，4。C離心10min，棄沉淀，10000r/min重復(fù)離心3060min，將沉淀復(fù)溶于80ml金稀釋液中形成膠體金與抗弓形蟲多克隆抗體結(jié)合物，冷藏備用。(4)2007年4月30日，取金標(biāo)抗弓形蟲多克隆抗體均勻浸透無紡布，37。C溫箱烘干過夜；硝酸纖維膜分別用0.Olmol/LpH7.4PBS稀釋成4g/L抗弓形蟲多克隆抗體和2g/L的弓形蟲代謝分泌抗原包被成兩條線即檢測線和滯控線，37。C溫箱烘干過夜，再用含10g/L小牛血清白蛋白的PBS，37。C封閉30min，再用0.01mol/LpH7.4PBS漂洗3次，干燥后依次將樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維膜、吸水濾紙和不干膠保護(hù)層粘貼在PVC板上，在手持端粘貼彩色手柄紙，在進(jìn)樣端粘貼標(biāo)有MAX線的塑料紙，用斬切機切成0.3X8cm的試劑條，即制成檢測弓形蟲循環(huán)抗原免疫金標(biāo)快速檢測試劑。檢測時，從鋁箔袋中取出檢測試劑條(板)，按MARK線下箭頭所示的方向?qū)⒃噭l浸入樣本溶液中，液面不得超過MARK線，1520秒后取出，平放在操作臺上；如果是試劑板從鋁箔袋中取出檢測試劑板，平放在操作臺上，往加樣孔中滴加三滴(約樣品溶液(血清)；315分鐘內(nèi)即可判斷結(jié)果，30分鐘后判斷的結(jié)果無效。判斷標(biāo)準(zhǔn)檢測區(qū)、質(zhì)控區(qū)均出現(xiàn)紅色條帶者為陽性結(jié)果；檢測區(qū)無條帶、質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)紅色條帶者為陰性結(jié)果；檢測區(qū)、質(zhì)控區(qū)均未出現(xiàn)紅色條帶出現(xiàn)，則產(chǎn)品為無效。實施例2(1)制備弓形蟲代謝分泌抗原2007年2月28日以lxlO八5弓形蟲速殖子/只，腹腔接種25克體重小鼠20只，3月4日，小鼠出現(xiàn)了精神沉郁、被毛粗亂等癥狀，將小白鼠脫頸致死，浸泡于70%酒精內(nèi)進(jìn)行體表消毒。每只小鼠用3毫升PH7.20.15mol/LPBS緩沖液洗腹收集蟲體，共收集腹腔液45ml,將所收集的腹腔液以每分鐘4000轉(zhuǎn)的速度離心30分鐘，收集上清液，上清液置-15'C冰箱內(nèi)，3月6日從冰箱取出上清，融化后再以每分鐘3000轉(zhuǎn)的速度離心4次，每次離心40分鐘，收集上清液，上清液即為弓形蟲代謝分泌抗原，置_15'C冰箱內(nèi)備用。(2)制備抗弓形蟲多克隆抗體2007年3月18日用弓形蟲代謝分泌抗原疫苗皮下免疫羊，半個月后用弓形蟲速殖子lxlOA6/只腹腔加強免疫，再經(jīng)過7天后采集血清進(jìn)行瓊擴檢測，效價為1:16，又用弓形蟲速殖子lxl(T7/只腹腔加強免疫，再經(jīng)過7天后采集血清進(jìn)行瓊擴檢測，效價為l:32，采集免疫羊血100ml，分離血清40ml，血清分別用50%、33%、33%的飽和硫酸銨提取羊抗弓形蟲抗體，粗提的羊抗弓形蟲抗體經(jīng)S印hacrylS-300HR凝膠層析法純化。純化的羊抗弓形蟲抗體用蛋白檢測儀檢測蛋白含量，蛋白含量為15mg/ml。置一15。C冰箱內(nèi)備用。(3)制備膠體金及抗弓形蟲多克隆抗體膠體金標(biāo)記物2006年5月6日取HAuCl在lg,用1000ml三蒸餾水將HAuCl4配成0.lg/L的溶液，煮沸后加新配制的10g/L檸檬酸三鈉7.5ml;繼續(xù)煮沸5min，直至溶液變成葡萄酒紅色，冷卻后用0.2molZLK2C03將金溶膠pH值調(diào)至8.9左右，制成4060納米的膠體金顆粒；將1000ml金溶膠加入抗弓形蟲多克隆抗體40mg混勻，置超凈臺磁力攪拌20min，/TC靜置30min，然后1000ml加入牛血清白蛋白2400mg，繼續(xù)攪拌5min，最后加入100g/L氯化鈉水溶液100ml，使其終濃度為10g/L;混勻，以2000r/min，4。C離心10min，棄沉淀，10000r/min重復(fù)離心3060min，將沉淀復(fù)溶于80ml金稀釋液中形成膠體金與抗弓形蟲多克隆抗體結(jié)合物，冷藏備用。(4)2007年5月22日，取金標(biāo)抗弓形蟲多克隆抗體均勻浸透無紡布，37'C溫箱烘干過夜；硝酸纖維膜分別用0.Olmol/LpH7.4PBS稀釋成4g/L抗弓形蟲多克隆抗體和2g/L的弓形蟲代謝分泌抗原包被成兩條線即檢測線和滯控線，37。C溫箱烘干過夜，再用含10g/L小牛血清白蛋白的PBS，37。C封閉30min，再用0.01mol/LPH7.4PBS漂洗3次，干燥后依次將樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維膜、吸水濾紙和不干膠保護(hù)層粘貼在PVC板上，在手持端粘貼彩色手柄紙，在進(jìn)樣端粘貼標(biāo)有MAX線的塑料紙，用斬切機切成0.3X8cm的試劑條，即制成檢測弓形蟲循環(huán)抗原免疫金標(biāo)快速檢測試劑。檢測方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)同實施例1。權(quán)利要求1、一種弓形蟲循環(huán)抗原免疫金標(biāo)快速檢測試劑條，該試劑條包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次粘附樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，其特征在于所述結(jié)合墊包被了帶有抗弓形蟲多克隆抗體的膠體金結(jié)合物，所述硝酸纖維素膜上以線形包被抗弓形蟲多克隆抗體作為檢測線，包被弓形蟲代謝分泌抗原作為滯控線。2、一種制備如權(quán)利要求1所述弓形蟲循環(huán)抗原免疫金標(biāo)快速檢測試劑條的方法，其特征在于按下述方法制備a、制備弓形蟲代謝分泌抗原2025克體重小鼠每只按lxl05lxl(f弓形蟲速殖子腹腔接種，經(jīng)34日，小鼠出現(xiàn)精神沉郁、不食、被毛粗亂的癥狀時，脫頸致死小白鼠，浸泡于7075%酒精內(nèi)體表消毒；每只小鼠用23毫升ra7.20.15mol/LPBS緩沖液洗腹收集蟲體；將所收集的腹腔液以30004000rpm離心3040分種，收集上清液；將上清液在-15°C-20。C溫度下放置2448小時，凍融化開后再次以30004000rpm離心3040分鐘，離心23次，收集上清液；上清液即為弓形蟲代謝分泌抗原；b、制備抗弓形蟲多克隆抗體用上述a步所得的弓形蟲抗原免疫羊，再用弓形蟲速殖子加強免疫，經(jīng)瓊擴檢測達(dá)1:3264時，采集免疫羊血清，用飽和硫酸銨粗提取羊抗弓形蟲抗體，再用凝膠層析法純化羊抗弓形蟲抗體，獲得抗弓形蟲多克隆抗體；c、制備膠體金用檸檬酸三鈉將氯金酸還原成4060納米的膠體金顆粒；d、制備抗弓形蟲多克隆抗體膠體金標(biāo)記物將上述C步所得膠體金與上述b步所得抗弓形蟲多克隆抗體按1:0.04(ml/mg)比例攪拌混勻，混合液中每1000ml加入牛血清白蛋白2400mg，最后加入100g/L氯化鈉水溶液100ml,使其終濃度為10g/L，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，通過純化濃縮得到8%的濃縮液，即為抗弓形蟲多克隆抗體膠體金標(biāo)記物；e、將十.述d步所得抗弓形蟲多克隆抗體膠體金標(biāo)記物包被在膠體金結(jié)合墊上，將上述b步所得抗弓形蟲多克隆抗體和上述a步所得弓形蟲代謝分泌抗原以線形包被在硝酸纖維膜上，形成一條檢測線和一條滯控線，干燥后依次將樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、硝酸纖維膜、吸水濾紙和不干膠保護(hù)層粘貼在PVC板上，在手持端粘貼彩色手柄紙，在進(jìn)樣端粘貼標(biāo)有MAX線的塑料紙，用斬切機切成0.3X8cm的試劑條，即制成檢測弓形蟲循環(huán)抗原免疫金標(biāo)快速檢測試劑條。全文摘要一種弓形蟲循環(huán)抗原免疫金標(biāo)快速檢測試劑，包括樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次粘附樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，結(jié)合墊包被帶有抗弓形蟲多克隆抗體的膠體金結(jié)合物，硝酸纖維素膜上以線形包被抗弓形蟲多克隆抗體和弓形蟲代謝分泌抗原。通過制備抗弓形蟲多克隆抗體；制備弓形蟲代謝分泌抗原；制備膠體金；制備抗弓形蟲多克隆抗體膠體金標(biāo)記物；將抗弓形蟲多克隆抗體膠體金標(biāo)記物包被在膠體金結(jié)合墊上，將抗弓形蟲多克隆抗體和弓形蟲代謝分泌抗原以線形包被在硝酸纖維膜的檢測區(qū)和滯控區(qū)，充分干燥等工序制成。本發(fā)明可檢測人和各種動物的弓形蟲循環(huán)抗原；靈敏準(zhǔn)確，操作簡單，安全穩(wěn)定。文檔編號G01N33/543GK101271109SQ20081001794公開日2008年9月24日申請日期2008年3月29日優(yōu)先權(quán)日2008年3月29日發(fā)明者張德林,才學(xué)鵬,李學(xué)瑞,王艷華申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所