專利名稱:一種含氰基擬除蟲菊酯農(nóng)藥多殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法
一種含氰基擬除蟲菊酯農(nóng)藥多殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法 技術(shù)領(lǐng)域一種含氰基擬除蟲菊酯農(nóng)藥多殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法,具體地說,涉及一種適用于含氰基擬除蟲菊酯(a-Cyano-Pyrethroid)農(nóng)藥多殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法,屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
擬除蟲菊酯(Pyrethroid)是一類在天然除蟲菊酯化學(xué)結(jié)構(gòu)研究基礎(chǔ)上發(fā)展 而來的仿生藥物。天然除蟲菊的應(yīng)用已有悠久的歷史,由于其具有擊倒力強, 殺蟲作用快,廣譜性,易降解,對高等動物及鳥類低毒性,使用安全,對環(huán)境 污染小等特點,被廣泛用于茶園、果園、農(nóng)田等害蟲的防治,尤其含氰基擬除 蟲菊酯(a-Cyano-Pyrethroid)應(yīng)用更為廣泛。隨著國際標準的提高,我國貿(mào)易 的國際化,綠色壁壘森嚴,我國農(nóng)副產(chǎn)品特別是紡織品、茶葉、水果中的農(nóng)藥 殘留問題成為出口貿(mào)易的主要障礙,要求開發(fā)應(yīng)用快速殘留檢測技術(shù)來加強產(chǎn) 地農(nóng)副產(chǎn)品中多種農(nóng)藥殘留的監(jiān)控。而傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留分析主要依靠氣相色譜、 液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用等,這些方法需要有昂貴的儀器,而且需要經(jīng) 過繁瑣的前處理,很難達到快速簡便的現(xiàn)場檢測要求。因此,有必要研究更有 效快捷的檢測方法,即適用于含氰基擬除蟲菊酯農(nóng)藥多殘留分析的酶聯(lián)免疫吸 附檢測方法。 發(fā)明內(nèi)容(一) 要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于建立一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確 度、操作方法簡單的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法,用于含氰基擬除蟲菊酯農(nóng)藥多殘 留的批量、快速檢測。(二) 技術(shù)方案為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明建立了一種含氰基擬除蟲菊酯農(nóng)藥多殘留分析的 酶聯(lián)免疫吸附檢測方法,該方法包括對檢測方法的優(yōu)化。(1) 抗原的包被用半抗原間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯與卵清蛋白OVA的偶聯(lián)復(fù)合物作為包 被抗原,以0.05M、 pH9.6的碳酸鈉緩沖液稀釋包被抗原1:100 1:200,濃度為 4 8pg/mL作為包被液,在酶標板的每孔中加入100pL包被液,4'C孵育過夜, 用含2 % OVA的上述碳酸鈉緩沖液作為封閉液封閉;(2) 競爭反應(yīng)將免疫制備的間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯多克隆抗體用抗體稀釋液含 1%明膠、含0.5%吐溫-20、 pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液PBST,按1:100 1:200 比例稀釋后,加入酶標板中,每孔加5(HiL;同時每孔分別加入用標準品稀 釋液稀釋的0ng/mL, 0.1ng/mL, 1.0ng/mL, 10ng/mL, 100ng/mL, 1000ng/mL, 10000 ng/mL, 100000 ng/mL—系列濃度之一的含氰基擬除蟲菊酯農(nóng)藥標準品, 每孔加50pL, 37"C孵育lh后以PBST洗滌液洗滌3 5次;(3) 加酶標二抗加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔GAR-HRP,以抗體稀釋液稀釋為1:5000, 每孔加100nL, 37。C溫育lh后以PBST洗滌液洗滌3~5次;(4) 顯色每孔加入100 顯色液,暗處37i:反應(yīng)15 min,取出后每孔加入100 ^L、 2mol/L的硫酸終止液,用酶標儀測定吸光值A(chǔ)450,與所作的標準曲線對比算出 待測含氰基擬除蟲菊酯的濃度。標準品稀釋液的配方為在體積含量30。/。甲醇的pH-6.5的PBS中加入質(zhì)量比 為5%的氯化鈉。PBST洗滌液的配方為1000 mL蒸餾水中加入氯化鈉4 6 g、磷酸二氫鉀 0.1 0.3g、磷酸氫二鈉2 4g、氯化鉀3 6g、吐溫-20 0.5 3mL。顯色液包括A液和B液,A液配方為每100 mL水中加入0.933 g檸檬酸, 3.68gNa2HP04'12H20, 18 nL30%H2O2; B液配方為60 mg四甲基聯(lián)苯胺溶于 100 mL乙二醇;使用時按A : B=l : 1的比例使用。含氰基擬除蟲菊酯多克隆抗體是用間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯與牛血清白 蛋白(BSA)的偶聯(lián)復(fù)合物免疫新西蘭大白兔制備。本發(fā)明方法的檢測分析原理是酶標板上的每個孔均包被有相同量的抗原,加入待測含氰基擬除蟲菊酯樣 品和間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯多克隆抗體后,固相包被抗原和待測含氰基擬 除蟲菊酯相互競爭與抗體反應(yīng),由于每個孔中的固相抗原和加入的抗體含量均 一致,所以當(dāng)待測樣品的含氰基擬除蟲菊酯濃度高時,則被結(jié)合在固相抗原上 的抗體少,加入的酶標二抗與被固定抗體結(jié)合量少,用洗滌液洗滌后加入底物 液(即顯色液A液)和顯色液(即B液),顯色反應(yīng)淺,用酶標儀檢測的OD值低, 表明抑制率高;反之,當(dāng)待測樣品的含氰基擬除蟲菊酯濃度低時,則所測的OD 值高,抑制率低。根據(jù)所作的標準曲線,可以推算出待測含氰基擬除蟲菊酯的 濃度。(三)有益效果本發(fā)明提供的含氰基擬除蟲菊酯多殘留檢檢測方法采用了間苯氧基苯甲氰 醇丁二酸酯多克隆抗體,能準確靈敏地檢測待測樣品中含氰基擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留,樣品的前處理過程簡單,耗時少,能同時檢測大量的樣品,樣品檢測成本遠低于傳統(tǒng)的儀器檢測方法,而且本發(fā)明方法穩(wěn)定性好,無放射性污染。本發(fā)明對解決大批量樣品的含氰基擬除蟲菊酯殘留現(xiàn)場監(jiān)控技術(shù)具有重要的現(xiàn)實意義。
圖1間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯的標準抑制曲線。
具體實施方式
實施例l:檢測方法的操作及結(jié)果計算(1) 抗原的包被用半抗原間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯與卵清蛋白(OVA)的偶聯(lián)復(fù)合物作為包被抗原,以0.05M、 pH9.6的碳酸鈉緩沖液稀釋包被抗原1:100 1:200,濃度 為4~8ng/ml作為包被液,在酶標板的每孔中加入100|iL包被液,4'C孵育過夜, 用含2 % OVA的上述碳酸鈉緩沖液作為封閉液封閉;(2) 競爭反應(yīng)將免疫制備的間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯多克隆抗體用抗體稀釋液(含 1%明膠、含0.5%吐溫-20、 pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液PBST)按1:100 1:200 比例稀釋后,加入酶標板中,每孔加50hL,同時分別加入一系列濃度0 ng/mL, 0.1ng/mL, 1.0ng/mL, 10ng/mL, 100ng/mL, 1000ng/mL, 10000 ng/mL, 100000 ng/mL的含氰基擬除蟲菊酯農(nóng)藥標準品,每孔50(iL, 37。C孵育lh后 以PBST洗滌液洗滌3~5次;(3) 加酶標二抗加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(GAR-HRP),以抗體稀釋液稀釋為 1:5000,每孔加100^iL, 37。C溫育lh后以PBST洗滌液洗滌3~5次;(4) 顯色每孔加入100 顯色液,暗處37 。C反應(yīng)15 min,取出后每孔加入100 終止液(2 mol/L的硫酸),用酶標儀測定吸光值A(chǔ)450。將含0 ng/mL標準品孔的OD值減去含最大濃度100000 ng/mL標準品孔的 OD值定為Bo,其余各孔經(jīng)同樣方法校正后的OD值(0 ng/mL標準品孔的OD 值減去各孔測定的OD值)定為B;以B/B。值為縱坐標,相應(yīng)標準品濃度為 橫坐標,繪制間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯標準抑制曲線。根據(jù)曲線的回歸方程 可以求出對應(yīng)樣品的濃度,也可以求出間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯IC5o(B/Bo-50 %)及最小檢測限IC9o(B/Bo=90%)。 IC5Q為70.12 ng/mL, LOD (90%抑制率對應(yīng) 的濃度)為4.31ng/mL,線性范圍(20% 80%)抑制率對應(yīng)的濃度為5~1000 ng/mL。實施例2:檢測方法的特異性實驗選擇含氰基擬除蟲菊酯作為待測物,測得各種物質(zhì)的抑制中濃度(IC5。),再用下式計算抗體對這些物質(zhì)的交叉反應(yīng)性;交叉反應(yīng)率愈大,則抗體對含氰基 擬除蟲菊酯的親和性愈強,反之則抗體的親和性差。交叉反應(yīng)率(CR^)氣iC5。(間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯yiC5C)(:含氰基擬除蟲菊酯)]><100%。實驗測定結(jié)果見表l,采用間接ELISA法,含間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯 多克隆抗體對含氰基擬除蟲菊酯的中間體衍生物間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯, 和8種含氰基擬除蟲菊酯都具有交叉反應(yīng)。但對不含氰基擬除蟲菊酯如氯菊酯 等交叉反應(yīng)率均在0.1%以下??偟膩碚f,對含氰基擬除蟲菊酯農(nóng)藥具有一定的 群選擇性。表1交叉反應(yīng)_反應(yīng)物質(zhì)_交叉反應(yīng)率(%)間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯氟胺氰菊酯 94.5氯氟氰菊酯 82甲氰菊酯 74氟氯氰菊酯 54.4苯醚氰菊酯 42.3氰戊菊酯 27.1溴氰菊酯 24.5氟氰戊菊酯 17.8氯菊酯 <0.1生物丙烯菊酯 <0.1苯醚菊酯 <0.1胺菊酯 <0.1_咔呋菊酯_<0.1實施例3 :添加回收實驗:(1) 樣品的添加:5.0ng/g、 10,0ng/g、 50.0ng/g、 100.0ng/g的水平加入含 氰基擬除蟲菊酯樣品到剪碎的棉花中,在室溫下至少靜置15min。(2) 樣品的提取凈化分別取lg已經(jīng)添加不同濃度標準品的棉花樣品, 于50mL離心管中。再加入30mL含飽和乙腈的乙酸乙酯,超聲提取30分鐘, 用玻璃注射器擠壓出提取液,重復(fù)三次后合并提取液,氮氣吹干,加入lmL的 標準品稀釋液,作為試樣供分析。各濃度分別制備樣品五份,測定其含量,將 實測濃度與添加濃度進行比較?;厥章实挠嬎愀鶕?jù)不同添加濃度的樣品OD值計算相應(yīng)的抑制率,再根 據(jù)相應(yīng)的抑制率從標準曲線上査到各自的濃度。檢測濃度與真實濃度之比為對應(yīng)濃度的回收率。結(jié)果見表2,可以看出,含氰基擬除蟲菊酯在棉花中的回收率在61.32% 80.20%之間。該分析方法重復(fù)性良好,相對標準偏差低于3.30%。表2添加回收率的測定添加濃度(ng/g)實觀'J濃度(ng/g)回收率(%)5.03.133.082.89 2.973.2661.32±3.3010.06.726.196.47 6.746.3064.84±2.4650.034.836.135.7 37.335.771.84±1.81100.081.379.878.5 77.183.480.20±2.4權(quán)利要求
1.一種含氰基擬除蟲菊酯農(nóng)藥多殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法,其特征在于(1)抗原的包被用半抗原間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯與卵清蛋白OVA的偶聯(lián)復(fù)合物作為包被抗原,以0.05M、pH 9.6的碳酸鈉緩沖液稀釋包被抗原1∶100~1∶200,濃度為4~8μg/mL作為包被液,在酶標板的每孔中加入100μL包被液,4℃孵育過夜,用含2%OVA的上述碳酸鈉緩沖液作為封閉液封閉;(2)競爭反應(yīng)將免疫制備的間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯多克隆抗體用抗體稀釋液含1%明膠、含0.5%吐溫-20、pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液PBST,按1∶100~1∶200比例稀釋后,加入酶標板中,每孔加50μL;同時每孔分別加入用標準品稀釋液稀釋的0ng/mL,0.1ng/mL,1.0ng/mL,10ng/mL,100ng/mL,1000ng/mL,10000ng/mL,100000ng/mL一系列濃度之一的含氰基擬除蟲菊酯農(nóng)藥標準品,每孔加50μL,37℃孵育1h后以PBST洗滌液洗滌3~5次;(3)加酶標二抗加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔GAR-HRP,以抗體稀釋液稀釋為1∶5000,每孔加100μL,37℃溫育1h后以PBST洗滌液洗滌3~5次;(4)顯色每孔加入100μL顯色液,暗處37℃反應(yīng)15min,取出后每孔加入100μL、2mol/L的硫酸終止液,用酶標儀測定吸光值A(chǔ)450,與所作的標準曲線對比算出待測樣品的含氰基擬除蟲菊酯濃度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法,其特征是標準品稀釋液 的配方為在體積含量30。/。甲醇的p1^6.5的PBS中加入質(zhì)量比為5%的氯化鈉。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法,其特征是PBST洗滌液 的配方為1000 mL蒸餾水中加入氯化鈉4~6 g、磷酸二氫鉀0.1 0.3 g、磷酸氫二 鈉2 4g、氯化鉀3 6g、吐溫-20 0.5 3mL。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法,其特征是顯色液包括A 液和B液,A液配方為每100 mL水中加入0.933 g檸檬酸,3.68 g Na2HP04'12H20, 18 pL30%H2O2; B液配方為60mg四甲基聯(lián)苯胺溶于100 mL 乙二醇;使用時按A : B=l : 1的比例使用。
全文摘要
一種含氰基擬除蟲菊酯農(nóng)藥多殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法,屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明用半抗原間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯與卵清蛋白偶聯(lián)復(fù)合物作包被抗原,加入待測含氰基擬除蟲菊酯樣品和間苯氧基苯甲氰醇丁二酸酯多克隆抗體后,包被抗原和待測含氰基擬除蟲菊酯競爭與抗體反應(yīng),加入酶標二抗與被固定抗體結(jié)合,用洗滌液洗滌后加入顯色液,用酶標儀檢測OD值,與含氰基擬除蟲菊酯標準品所作標準曲線對比,算出待測樣品的含氰基擬除蟲菊酯濃度。本發(fā)明能準確靈敏地檢測待測樣品中含氰基擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留,樣品的前處理過程簡單,耗時少,能同時檢測大量的樣品,樣品檢測成本遠低于傳統(tǒng)的儀器檢測方法,而且本發(fā)明方法穩(wěn)定性好,無放射性污染。
文檔編號G01N21/77GK101334408SQ20081002122
公開日2008年12月31日 申請日期2008年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月22日
發(fā)明者李雅麗, 殷祥剛, 胥傳來, 媛 袁, 郝曉蕾 申請人:江南大學(xué)