專利名稱：：放射性配基N₂S₂-Memantine和腦受體顯像劑^99mTc-Memantine的油水分配系數(shù)測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：放射性配基N2S2-Memantine和腦受體顯像劑99mTc-Memantine的油水分配系數(shù)測(cè)定方法，屬于核醫(yī)學(xué)分析檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：病理學(xué)研究證實(shí)，許多精神疾病包括癡呆、精神分裂、帕金森疾病等與腦內(nèi)NMDA(N-甲基天冬氨酸)受體異常有關(guān)。研究和開發(fā)能夠有效量化局部腦組織NMDA受體和該受體活性狀態(tài)改變的顯像劑,從分子水平上展現(xiàn)腦的生理、病理狀態(tài)，對(duì)與受體有關(guān)的疾病作出診斷，并用于指導(dǎo)合理用藥以及療效評(píng)價(jià)和預(yù)后判斷，是至關(guān)重要的。目前國外有用["F]、[UC]或[^I]標(biāo)記不同類型的N-甲基天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑的報(bào)道[6—1Q]，但""Tc標(biāo)記的NMDA受體顯像劑國內(nèi)外均無報(bào)道。美金剛胺(Memantine)是一種具有中等親和力的NMDA受體拮抗劑，可以抑制興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性而不干擾學(xué)習(xí)、記憶所需的短暫的谷氨酸生理性釋放，具有神經(jīng)元保護(hù)作用，我們以美金剛胺為原料，經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造，引入N2S2基團(tuán)，得到一種全新的雙功能化合物N-[2-(N-(2-巰基乙基))氨基甲酰甲基]-N-(2-巰基乙基)-3，5-二甲基金剛烷胺基乙酰胺(N2S2-Memantine)，與锝絡(luò)合得到新的锝標(biāo)記化合物99mTc-Memantine(結(jié)構(gòu)式見圖1)。經(jīng)改造后的拮抗劑與NMDA受體結(jié)合情況也會(huì)相應(yīng)的改變，能否成為一種更有效的NMDA受體拮抗劑，99mTc-Memantine能否成為一種新的SPECT顯像藥物，必須對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行深入研究，其中油水分配系數(shù)的測(cè)定極為重要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種放射性配基N2S2-Memantine和腦受體顯像劑99mTc-Memantine的油水分配系數(shù)測(cè)定方法，99mTc-Memantine的油水分配系數(shù)與藥物在體內(nèi)的溶解、吸收、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，是決定藥物能否進(jìn)腦的一個(gè)重要因素之一，通過油水分配系數(shù)測(cè)定，可推測(cè)新藥的一些藥理作用，因此通過體外測(cè)定N2S2-Memantine及99mTc-Memantine的油水分配系數(shù)，可以模擬生物體內(nèi)藥物在水相和生物相之間的分配情況。本發(fā)明的技術(shù)方案一種放射性配基N2S2-Memantine的油水分配系數(shù)測(cè)定方法，放射性配基99mTc標(biāo)記前體N-[2-(N-(2-巰基乙萄)氨基甲酰甲基]-N-(2-巰基乙基)-3，5-二甲基金剛烷胺基乙酰胺，簡(jiǎn)稱N2S2-Mernantine，采用N2S2-Memantine在正辛醇-水或正辛醇-磷酸鹽緩沖液體系中，用HPLC法測(cè)定N2S2-Memantine的油水分配系數(shù)，25。C時(shí)，N2S2-Memantine的油水分配系數(shù)lgP為1.70，步驟為(1)溶液配制精密稱取N2S2-Memantinel.0g，置于100mL量瓶中，加入適量甲醇溶解，加甲醇至刻度，搖勻，得濃度為10mg/mL的貯備液；(2)線性關(guān)系確定精密量取貯備液適量，置于10mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別得到質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取各系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20pL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積J;以N2S2-Memantine質(zhì)量濃度mg/mL計(jì)/為橫坐標(biāo)，峰面積^為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得N2S2畫Memantine的線性回歸方程為」=4><106/>+3173.1，r2=0.9996,結(jié)果表明N2S2-Memantine在0.1~1.0mg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系；另取0.1mg/mL的N2S2-Memantine溶液加流動(dòng)相稀釋配成0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取各系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20pL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積乂，得到N2S2-Memantine的回歸方程為」=4xl06/—1855.7，r2=0.9989，表明N2S2-Memantine在0.005~0.1mg/mL內(nèi)也呈良好的線性關(guān)系；色譜條件色譜柱LichospherC18(4.6x250mm)，流動(dòng)相為乙腈、水和三氟乙酸，其中乙腈水體積比為2:1，三氟乙酸為流動(dòng)相總體積的2%;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，流速1.00mL/min，柱溫25°C;(3)油水分配系數(shù)的測(cè)定精密稱取N2S2-Memantine適量溶于水飽和的正辛醇中配成質(zhì)量濃度為l.Omg/mL的溶液，取該溶液2mL于10mL具塞管中，加入2mL正辛醇飽和的水、氮?dú)獗Ｗo(hù)25'C搖床振搖72h，離心，分別取油相和水相各20mL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算N2S2-Memantine的濃度，油相濃度為AV水相濃度為Av，由公式P，n/z)w得25"C時(shí)N2S2-Memantine的正辛醇-水油水分配系數(shù)P為50.51，即lgP-I.70;或以正辛醇-磷酸鹽緩沖液體系代替正辛醇-水作為N2S2-Memantine的溶液配制液進(jìn)行油水分配系數(shù)的測(cè)定。一種腦受體顯像劑99mTC-Memantine的油水分配系數(shù)測(cè)定方法，步驟為(1)99fflTc標(biāo)記精密稱取N2S2-Memantine適量用70%乙醇配成N2S2-Memantine質(zhì)量濃度為5mg/mL的溶液，精密量取20pL，依次加入20pLlmg/mL用O.lmol/LHC1新鮮配制的SnF2，50!iL100mg/mL葡庚糖酸鈉，50pL10mg/mLEDTA和800pLpH二6.0的PBS，混勻，加入放射性強(qiáng)度約為lmCi"mTc淋洗液，沸水煮30min;(2)量取上述溶液O.lmL，加入3mL正辛醇和3mLO.lmol/LpH=7.4的PBS,渦旋5min，靜置分層，4000rpm離心10min，取有機(jī)相、水相各lmL，分別測(cè)y計(jì)數(shù)；(3)取步驟(2)的有機(jī)相l(xiāng)mL，加入2mL正辛醇和3mLO.lmol/LpH=7.4的PBS，渦旋5min，靜置分層，4000rpm離心10min，取油相、水相各lmL，分別測(cè)Y計(jì)數(shù)為Y油、^每次取油相進(jìn)行倍比稀釋，至少進(jìn)行5次，每次對(duì)倍比稀釋后的油相、水相進(jìn)行測(cè)Y計(jì)數(shù)Y油、Y水，測(cè)定分配系數(shù)P=y油/y水，至樣品在兩相中的分配比趨于穩(wěn)定，lgP趨于1.9。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用HPLC法測(cè)定N2S2-Memantine的油水分配系數(shù)和99mTc標(biāo)記測(cè)定99mTc-Memantine的油水分配系數(shù)。結(jié)果25'C時(shí)，N2S2-Memantine的油水分配系數(shù)lgP為1.70，99mTc-Memantine的油水分配系數(shù)為lgP為1.9，結(jié)論N2S2-Memantine和99mTc-Memantine呈脂溶性。圖1,Tc-Memantine的結(jié)構(gòu)式。圖2N2S2-Memantine色譜圖。圖3乙腈-水體系的油相色譜圖。圖4乙腈-水體系的水相色譜圖。具體實(shí)施例方式材料600型高效液相色譜儀及色譜工作站(美國Waters公司)，pH300型pH計(jì)(上海天達(dá)儀器有限公司)，AC-2105型分析天平(德國sartorius)，80-2型離心機(jī)(上海手術(shù)機(jī)械廠)，1470型自動(dòng)，計(jì)數(shù)儀(美國PerkinElmer)，N2S2-Memantine(衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合成，純度大于95%)，甲醇、乙醇、乙腈(色譜純),正辛醇、磷酸二氫鈉(分析純)，水為二次蒸餾水。色譜條件色譜柱LichospherC18(4.6x250mm)，流動(dòng)相為乙腈、水和三氟乙酸，其中乙腈水體積比為2:1，三氟乙酸為流動(dòng)相總體積的2%;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，流速1.00mL/min，柱溫25°C。實(shí)施例1N2S2-Memantine的油水分配系數(shù)測(cè)定(1)溶液配制精密稱取N2S2-Memantinel.0g，置于100mL量瓶中，加入適量甲醇溶解，加甲醇至刻度，搖勻，得濃度為10mg/mL的貯備液。(2)線性關(guān)系精密量取貯備液適量，置于10mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別得到質(zhì)量濃度為O.l、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取各系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20nL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以N2S2-Memantine質(zhì)量濃度p(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積^為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得N2S2-Memantine的線性回歸方程為J=4xl06p+3173.1，r2=0.9996，結(jié)果表明N2S2-Memantine在0.1-1.Omg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系；另取O.lmg/mL的N2S2-Memantine溶液配成0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、O.lOmg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取各系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20|iL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，得到N2S2-Memantine的回歸方程為/4=4xl0>—1855.7，r2=0.9989，表明N2S2-Memantine在0.005-0.lmg/mL內(nèi)也呈良好的線性。(3)精密度實(shí)驗(yàn)取N2S2-Memantine質(zhì)量濃度分別為0.5mg/mL和0.04mg/mL的甲醇溶液按所述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果RSD分別為0.62%和1.08%，均小于2%，表明該方法的精密度良好。(4)回收率實(shí)驗(yàn)配制O.l、0.5、1.0mg/mL低、中、高3種質(zhì)量濃度的N2S2-Memantine樣品溶液，進(jìn)行色譜測(cè)定，每種質(zhì)量濃度測(cè)定5次，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算測(cè)定值，測(cè)定值(/>D)與真實(shí)值(/>T)的比值為回收率。結(jié)果見表l。表l回收率的測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(5)油水分配系數(shù)的測(cè)定精密稱取N2S2-Memantine適量溶于水飽和的正辛醇中配成質(zhì)量濃度約為1.0mg/mL的溶液，取該溶液2mL于lOmL具塞管中，加入2mL正辛醇飽和的水、25"C搖床振搖72h，離心，取油相和水相20|iL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算N2S2-Memantine的濃度分別為pn和/ow，由公式P=/V>w得25'C時(shí)N2S2-Memantine的正辛醇/水油水分配系數(shù)P為50.51(lgP=1.70)。N2S2-Memantine由于含巰基，不穩(wěn)定，需充氮?dú)獗Ｗo(hù)。經(jīng)氮?dú)獗Ｗo(hù)的試樣穩(wěn)定性較好，日間標(biāo)準(zhǔn)偏差仍小于2%。實(shí)施例2流動(dòng)相的選擇考察不同的流動(dòng)相對(duì)水相和油相分離條件的影響。選用不同比例的甲醇-水體系，主峰的保留時(shí)間在6.5min左右，但油相的主成分受雜質(zhì)峰干擾較嚴(yán)重，無法有效分開；改用乙腈-水體系，分離效果得到較大的改觀，選擇乙腈和水的比例為2:1時(shí),分離度大于1.5;加入一定比例的三氟乙酸，峰形較好并有合適的保留時(shí)間，油相和水相的色譜圖見圖3、圖4。實(shí)施例3pH對(duì)分配系數(shù)的影響將實(shí)施例1中步驟(5)方法中所用的水改成0.1mol/LpH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.4、8.0和9.0的磷酸鹽緩沖液，同法測(cè)定在不同的pH緩沖液中N2S2-Memantine的分配系數(shù)，見表2。結(jié)果正辛醇-磷酸鹽緩沖液體系分配系數(shù)受緩沖液的pH值影響不大。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例499mTc標(biāo)記的"，c-Memantine測(cè)定油水分配系數(shù)精密稱取N2S2-Memantine適量用70%乙醇配成質(zhì)量濃度為5mg/mL的溶液，精密量取20mL，依次加入20nLlmg/mL的SnF2(用O.lmol/LHC1配制)、50|iL100mg/mLGH(葡庚糖酸鈉)，50jiL10mg/mLEDTA和800nLPBS(pH-6.0)，混勻，加入放射性強(qiáng)度約為lmCi"mTc淋洗液，沸水煮30min。量取上述溶液O.lmL，加入3mL正辛醇和3mLO.lmol/LPBS(pH=7.4)，渦旋5min，靜置分層，4000rpm離心10min，取有機(jī)相、水相各lmL測(cè)Y計(jì)數(shù)。取上述有機(jī)相l(xiāng)mL，分別加入2mL正辛醇和3mLO.lmol/LPBS(pH=7.4)，渦旋5min，靜置分層，4000rpm離心10min，取油相、水相各lmL測(cè)y計(jì)數(shù)為Y油、Y水。開始時(shí)，樣品中含有未反應(yīng)的過量游離""Tc，加入兩相后，游離9^Tc幾乎全溶于水中，使第一次水相的測(cè)量值過高，而標(biāo)記后的樣品主要溶于有機(jī)相中，因此，對(duì)有機(jī)相多次進(jìn)行倍比稀釋，就可以逐步消除游離"mTc影響，從而得到比較準(zhǔn)確的油水分配系數(shù)。每次取油相進(jìn)行倍比稀釋，至少進(jìn)行5次，每次對(duì)倍比稀釋后的油相、水相進(jìn)行測(cè)Y計(jì)數(shù)Y油、Y水，測(cè)分配系數(shù)P，油/y水，至樣品在兩相中的分配比趨于穩(wěn)定，lgP趨于1.9。表399mTC-Memantine的分配系數(shù)測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>N2S2-Memantine和"mTc-Memantine的分配系數(shù)相近，均呈脂溶性，容易進(jìn)腦。權(quán)利要求1、一種放射性配基N2S2-Memantine的油水分配系數(shù)測(cè)定方法，其特征在于放射性配基99mTc標(biāo)記前體N-[2-(N-(2-巰基乙基))氨基甲酰甲基]N-(2-巰基乙基)-3，5-二甲基金剛烷胺基乙酰胺，簡(jiǎn)稱N2S2-Memantine，采用N2S2-Memantine在正辛醇-水或正辛醇-磷酸鹽緩沖液體系中，用HPLC法測(cè)定N2S2-Memantine的油水分配系數(shù)，25℃時(shí)，N2S2-Memantine的油水分配系數(shù)lgP為1.70，步驟為(1)溶液配制精密稱取N2S2-Memantine1.0g，置于100mL量瓶中，加入適量甲醇溶解，加甲醇至刻度，搖勻，得濃度為10mg/mL的貯備液；(2)線性關(guān)系確定精密量取貯備液適量，置于10mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別得到質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取各系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積A；以N2S2-Memantine質(zhì)量濃度mg/mL計(jì)ρ為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得N2S2-Memantine的線性回歸方程為A＝4×106ρ+3173.1，r2＝0.9996，結(jié)果表明N2S2-Memantine在0.1～1.0mg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系；另取0.1mg/mL的N2S2-Memantine溶液加流動(dòng)相稀釋配成0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取各系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積A，得到N2S2-Memantine的回歸方程為A＝4×106ρ-1855.7，r2＝0.9989，表明N2S2-Memantine在0.005～0.1mg/mL內(nèi)也呈良好的線性關(guān)系；色譜條件色譜柱LichospherC18，4.6×250mm，流動(dòng)相為乙腈、水和三氟乙酸，其中乙腈∶水體積比為2∶1，三氟乙酸為流動(dòng)相總體積的2％；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，流速1.00mL/min，柱溫25℃；(3)油水分配系數(shù)的測(cè)定精密稱取N2S2-Memantine適量溶于水飽和的正辛醇中配成質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的溶液，取該溶液2mL于10mL具塞管中，加入2mL正辛醇飽和的水、氮?dú)獗Ｗo(hù)25℃搖床振搖72h，離心，分別取油相和水相各20μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算N2S2-Memantine的濃度，油相濃度為ρn，水相濃度為ρw，由公式P＝ρn/ρw得25℃時(shí)N2S2-Memantine的正辛醇-水油水分配系數(shù)P為50.51，即lgP＝1.70；或以正辛醇-磷酸鹽緩沖液體系代替正辛醇-水作為N2S2-Memantine的溶液配制液進(jìn)行油水分配系數(shù)的測(cè)定。2、一種腦受體顯像劑99mTc-Memantine的油水分配系數(shù)測(cè)定方法，其特征是，步驟為(1)"，c標(biāo)記精密稱取N2S2-Memantine適量用70%乙醇配成N2S2-Memantine質(zhì)量濃度為5mg/mL的溶液，精密量取20pL，依次加入20pLlmg/mL用0.1mol/LHC1新鮮配制的SnF2，50(xLlOOmg/mL葡庚糖酸鈉，50jiLlOmg/mLEDTA和800(xLpH=6.0的PBS，混勻，加入放射性強(qiáng)度為lmCi"""Tc淋洗液，沸水煮30min;(2)量取上述溶液0.1mL，加入3mL正辛醇和3mL0.lmol/LpH=7.4的PBS，渦旋5min，靜置分層，4000rpm離心10min，取有機(jī)相、水相各lmL，分別測(cè)y計(jì)數(shù)；(3)取步驟(2)的有機(jī)相l(xiāng)mL，加入2mL正辛醇和3mL0.1mol/LpH=7.4的PBS，渦旋5min，靜置分層，4000rpm離心10min，取油相、水相各lmL，分別測(cè)y計(jì)數(shù)為y油、y水；每次取油相進(jìn)行倍比稀釋，至少進(jìn)行5次，每次對(duì)倍比稀釋后的油相、水相進(jìn)行測(cè)y計(jì)數(shù)y油、y水，測(cè)定分配系數(shù)P，油/y水，至樣品在兩相中的分配比趨于穩(wěn)定，lgP趨于1.9。全文摘要放射性配基N₂S₂-Memantine和腦受體顯像劑^99mTc-Memantine的油水分配系數(shù)測(cè)定方法，屬于核醫(yī)學(xué)分析檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
。放射性配基^99mTc標(biāo)記前體N-[2-(N-(2-巰基乙基))氨基甲酰甲基]-N-(2-巰基乙基)-3，5-二甲基金剛烷胺基乙酰胺，簡(jiǎn)稱N₂S₂-Memantine。本發(fā)明方法采用在正辛醇-水或正辛醇-磷酸鹽緩沖液體系中，用HPLC法測(cè)定N₂S₂-Memantine的油水分配系數(shù)，25℃時(shí)，N₂S₂-Memantine的油水分配系數(shù)lgP約為1.70，及腦受體顯像劑^99mTc-Memantine的油水分配系數(shù)測(cè)定方法，采用N₂S₂-Memantine先進(jìn)行^99mTc標(biāo)記，再在正辛醇-水體系中用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)定^99mTc-Memantine的油水分配系數(shù)，lgP趨于1.9。結(jié)論N₂S₂-Memantine和^99mTc-Memantine均呈脂溶性。文檔編號(hào)G01N30/02GK101339169SQ20081002176公開日2009年1月7日申請(qǐng)日期2008年8月12日優(yōu)先權(quán)日2008年8月12日發(fā)明者周杏琴,張建康,徐希杰,曹國憲,鄒美芬,欽曉峰,顏成龍申請(qǐng)人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所