專利名稱：快速檢測呋喃西林代謝物的膠體金層析試紙條的制備方法
快速檢測呋喃西林代謝物的膠體金層析試紙條的制備方法技術(shù)領(lǐng)域快速檢測呋喃西林代謝物的膠體金層析試紙條的制備方法，屬于檢測技術(shù) 領(lǐng)域。
技術(shù)背景硝基呋喃類抗生素(Nitrofiiran antibiotics)主要是指呋喃唑酮(Furazolidone)， 呋喃西林(Nitrofiirazone)，呋喃妥因(Furantoin)和呋喃它酮(Furaltadone)，為一類 廣譜抗生素，對革蘭陽性及陰性菌均有一定抗菌作用。呋喃西林(Furantoin)，是 一種人工合成的硝基呋喃類廣譜抗菌藥物，對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性 菌及某些原蟲和真菌具有抑制或殺滅效果，而且藥效穩(wěn)定，在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖 中得到了廣泛的應(yīng)用。硝基呋喃類藥物及其對應(yīng)的代謝產(chǎn)物有呋喃唑酮(AOZ)、 呋喃它酮(AMOZ)、呋喃西林(SEM)和呋喃妥因(AHD)。硝基呋喃類藥物在動物 體內(nèi)代謝很快，在組織中結(jié)合的代謝產(chǎn)物滯留時間長。動物服用呋喃類藥物后， 原藥分子在動物體內(nèi)迅速代謝，其在體內(nèi)的穩(wěn)定性不超過幾小時；代謝的部分 化合物分子與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合成為結(jié)合態(tài)，結(jié)合態(tài)可長期保持穩(wěn)定，從而延緩 原藥在體內(nèi)的清除速度。而普通的食品加工方法(如燒烤、微波加工、烹調(diào)等) 難以使蛋白結(jié)合態(tài)呋喃唑酮?dú)埩粑锎罅拷到?，食用含有該殘留物的肉制品會?人體產(chǎn)生一定的毒副作用。硝基呋喃類藥物對畜禽有一定毒性，同時硝基呋喃類藥物也是一類具有潛 在致癌和誘導(dǎo)有機(jī)體產(chǎn)生突變的物質(zhì)。由于硝基呋喃類抗生素在體內(nèi)代謝迅速， 而代謝產(chǎn)物與蛋白結(jié)合形成穩(wěn)定化合物，但這些代謝物可以在弱酸性條件下(如 人類胃液的酸性條件)從蛋白質(zhì)中釋放出來，因此當(dāng)人類吃了含有硝基呋喃類 抗生素殘留的食品，這些代謝物就可以在人類的胃液的酸性條件下從蛋白質(zhì)中 釋放出來而被人體吸收，從而對人類健康造成嚴(yán)重的危害。1990年7月歐盟頒布2377/90/EEC條例，將硝基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物 列為A類禁用藥物。自1995年起歐盟全面規(guī)定禁止使用呋喃類抗菌物質(zhì)，在動 物源性食品中呋喃類殘留物的檢出限為不得檢出。歐盟(EU)從1997年開始將 所有的硝基呋喃類抗生素全部列為違禁藥物。2004年美國FDA公布了禁止在進(jìn) 口動物源性食品中使用的ll種藥物名單，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮。我國 農(nóng)業(yè)部文件農(nóng)牧發(fā)[2002] 1號也規(guī)定動物源性食品中呋喃唑酮的檢出限為不得 檢出。目前國內(nèi)外都對呋喃類物質(zhì)的控制相當(dāng)嚴(yán)格，各國對于測定的標(biāo)準(zhǔn)都有 明確的規(guī)定。盡管如此，但是由于其藥效確切，價格低廉，目前在畜牧和水產(chǎn)3養(yǎng)殖中違禁使用現(xiàn)象仍較嚴(yán)重。由于呋喃類藥物在動物體內(nèi)快速代謝，代謝物與組織蛋白結(jié)合物在體內(nèi)滯 留時間長，因此檢測呋喃類藥物殘留的最佳方法是檢測其代謝物而非檢測原藥。目前，檢測呋喃西林代謝物(SEM)的方法主要有儀器分析法和酶聯(lián)免疫分 析法(ELISA)。儀器分析法主要是有高效液相色譜(HPLC)、液相色譜一質(zhì)譜法 (LC-MS)、液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。儀器分析法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn) 確，但是樣品需經(jīng)一系列復(fù)雜的處理凈化，繁瑣費(fèi)時，所需儀器設(shè)備價格昂貴， 而且只有特定的專業(yè)技術(shù)人員才能操作，不能進(jìn)行現(xiàn)場檢測，時效性差，難以 推廣。ELISA法以競爭性酶聯(lián)免疫反應(yīng)為檢測原理，縮短了檢測時間，可以定 性定量檢測。但ELISA方法需要配套的酶標(biāo)儀和配套試劑，操作過程仍較復(fù)雜， 而且國內(nèi)現(xiàn)處在研發(fā)階段，進(jìn)口國外產(chǎn)品價格昂貴，因而ELISA方法的應(yīng)用受 到了較大限制。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的針對現(xiàn)有檢測呋喃西林代謝物SEM的技術(shù)的不足和缺限，提供一種快速檢測呋喃西林代謝物的金標(biāo)層析試紙條的制備方法，使其能更加 快速、靈敏、簡便地檢測呋喃西林代謝物殘留。本發(fā)明的技術(shù)方案 一種呋喃西林代謝物膠體金層析檢測試紙條的制備方 法，含有襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜、吸水墊，金標(biāo)結(jié)合墊為吸附呋喃西林代謝物SEM衍生物金標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，在包被 膜上有用SEM衍生物偶聯(lián)載體蛋白的溶液印制的直線式隱形檢測線T線，用羊 抗兔IgG溶液印制的直線式隱形控制線C線，兩條線平行排列。所述的襯板為不吸水的韌性材料，選用硬質(zhì)塑膠條，或不吸水硬紙條；所 述的樣品墊選用玻璃纖維棉，或尼龍膜，或聚偏二氟乙烯膜，或聚酯膜；所述 的吸水墊選用吸水能力較強(qiáng)的吸水濾紙或濾油紙；所述的包被膜選用硝酸纖維 素膜或醋酸纖維素膜。所述的SEM衍生物金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的SEM衍生物多克隆抗體；所 述的偶聯(lián)SEM衍生物的載體蛋白選用牛血清白蛋白BSA，或卵清蛋白OVA。本發(fā)明的有益效果本檢測試紙條具有下列優(yōu)點(diǎn)① 特異性強(qiáng)，敏感性高。該膠體金層析檢測試紙條以膠體金標(biāo)記高親和力 的多克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形 成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金標(biāo)記對抗體的特異性和親 和力影響很小，且具有較高的標(biāo)記率。因此，試紙條具有較強(qiáng)的特異性和較高的敏感性，檢出最低限量可達(dá)到5ppb。② 簡便、快速、時效性強(qiáng)。使用膠體金層析檢測試紙條和試紙卡，無需任何其它試劑和儀器，可現(xiàn)場操作，試紙條加入被檢樣品液后，在15分鐘內(nèi)即可判定檢測結(jié)果。
③ 結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確。檢測試紙條均以顯示紅色線T線和C線作
為檢測結(jié)果陽性和陰性標(biāo)記，即在包被膜上顯示一條紅色線c線時，表示在被
檢樣品中含有被檢物，顯示兩條紅色線T線和C線時，表示在被檢樣品中不含 被檢物。結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確，簡單明了，不易出現(xiàn)假陽性和假陰性等 人為誤判。
④ 節(jié)省費(fèi)用，適用范圍廣，便于推廣。使用檢測試紙條，比用儀器分析和 ELISA試劑盒的費(fèi)用大幅下降。另外，試紙條的適用范圍廣，可滿足不同層次 人員需要，包括專業(yè)檢驗，海關(guān)檢疫，衛(wèi)生檢疫，質(zhì)量監(jiān)測，加工企業(yè)和養(yǎng)殖 場戶等，便于推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場前景和明顯的經(jīng)濟(jì)、社會效益。


圖1、呋喃西林代謝物膠體金層析檢測試紙條剖面結(jié)構(gòu)示意圖。 圖2、呋喃西林代謝物膠體金層析檢測試紙條俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
實施例l:制備呋喃西林代謝物檢測試紙條。
首先需要制備偶聯(lián)呋喃西林代謝物衍生物載體蛋白，用于制備相應(yīng)的檢測 線(T線)和抗體；而且需要制備呋喃西林代謝物衍生物金標(biāo)抗體，用于制備相
應(yīng)的金標(biāo)抗體纖維棉；另外需要制備羊抗兔IgG抗體，用于制備控制線(C線)。 1、 SEM衍生物與載體蛋白偶聯(lián)
活性酯法將SEM對醛基苯甲酸衍生物(CPSEM)與載體蛋白BSA進(jìn)行偶 聯(lián)制備人工結(jié)合抗原CPSEM-BSA。具體制備方法如下
(1) 取CPSEM 20.7mg (O.lmmol)， N-羥基琥珀酰亞胺NHS 17.25mg (0.15mmo1)， 二環(huán)己基碳二亞胺DCC 30.9mg (0.15mmo1)溶解于2mL的DMF
中，室溫下攪拌18小時，4500 r/min離心后棄沉淀，清液為活性酯中間體，為 A液；
(2) 將134mg的BSA (2pmo1)溶解于10mL的PBS(0.1M， pH8.0)中，
為B液；
(3) 將A液逐滴滴入B液中，溶液維持在4'C，所有的A液加入后，繼續(xù) 攪拌4小時；
(4) 透析透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再 用6(TC的去離子水沖洗3min，保存在4"C去離子水中備用；
將(3)反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到透析袋中，用PBS(0.01M， pH7.4)透析3天，每天換 水兩次；
(5) 透析完后，離心取上清液，4"冷藏待用；
混合酸酐法Cl)17.24mg的CPSEM(0.083mmol)攪拌溶解于1800^iL的DMF中，4°C 下加入20pL的三正丁胺，繼續(xù)攪拌30min后加入11.2^iL的氯甲酸異丁酯，繼 續(xù)攪拌反應(yīng)lh，為A液；
(2) 將53.7mg的OVA攪拌溶解于6mL的硼酸鹽緩沖液(0.2M， pH9.0) 中，放入4"C的冰箱預(yù)冷30min，為B液；
(3) 4。C下，將A液逐滴滴入B液中，并在4"C下攪拌過夜；
(4) 透析透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再 用6(TC的去離子水沖洗3min，保存在4"C去離子水中備用；
將(3)反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到透析袋中，用超純水透析3天，每天換水兩次；
(5) 透析完后離心取上清液，4。C冷藏待用；
2、 抗SEM衍生物多克隆抗體的制備
用SEM衍生物載體蛋白結(jié)合抗原免疫白兔，制得抗SEM衍生物多克隆抗 體，-2(TC凍存?zhèn)溆谩?br> 3、 SEM衍生物金標(biāo)抗體和金標(biāo)物結(jié)合墊的制備
檸檬酸三鈉還原法制備膠體金由于氯化金極易吸濕，因此使用小劑量封 裝的氯化金時，必須一次配完。將lg的氯化金一次溶解于雙蒸水中配成1%的水 溶液。放在4'C冰箱內(nèi)保存，保存時間長達(dá)幾個月至l年左右。再取1%的氯金 酸溶液10mL,配制成濃度為O.lg/L的氯金酸溶液。取O.lg/L氯金酸溶液50 mL 放入錐形瓶，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰并持續(xù)2min，在100r/min磁力攪拌 下，加入l。/。檸檬酸三鈉水溶液2mL，保持溫度和攪拌速度不變，繼續(xù)攪拌加熱 6min，直至溶液呈透亮的酒紅色。室溫冷卻，4'C保存?zhèn)溆谩＋@得直徑為20nm 的膠體金溶液。
用0.1 mol/L K2C03或0.1 mol/L HC1調(diào)節(jié)膠體金溶液為pH 9.0，將10 mL膠 體金溶液加入50mL燒杯中，用電磁攪拌器250rpm攪拌，逐滴加入150 ^iL多 克隆抗體溶液，平衡過夜。逐滴加入5。/。BSA，使BSA的終濃度為1%，持續(xù)攪 拌5 min，以BSA和游離的膠體金結(jié)合。再將金標(biāo)抗體溶液常溫低速(3000 rpm) 離心15min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀。取紅色上清溶液于4。C以11000 rpm離心40min。溶液分為二層透明上清，管底可流動的暗紅色沉淀。輕吸并 棄去上清液，將可流動的暗紅色沉淀用重懸液(0.002 mol/LpH9.0硼酸緩沖液含 5%蔗糖)混懸，恢復(fù)至棄上清前原體積后再離心。如此重復(fù)2 4次。以徹底除 去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。最后用重懸液將沉淀混懸為原體積的1/10， 4'C保存?zhèn)溆茫?獲得SEM衍生物膠體金標(biāo)記抗體。
將1:100 500稀釋的膠體金標(biāo)記抗體吸附于精制玻璃纖維棉中，37'C干燥， 制備SEM衍生物金標(biāo)物結(jié)合墊。
4、 膠體金層析試紙條檢測反應(yīng)原理氨基脲(SEM)，呋喃西林代謝物，因為分子量僅為75，屬于小分子物質(zhì)。 與硝基呋喃類其余代謝物檢測一樣，抗體對游離SEM不能捕獲，需要檢測其苯 甲醛衍生物PSEM。本發(fā)明采用競爭法，即樣品中的PSEM和固定在包被膜上 的包被抗原CPSEM-OVA競爭膠體金標(biāo)記的抗CPSEM多克隆抗體。
當(dāng)試紙條以樣品墊末端浸入樣本溶液后，樣品溶液沿著試紙條通過毛細(xì)作 用從下往上泳動，溶解金標(biāo)墊上干燥的金標(biāo)抗體，若待測樣品中不存在待測藥 物PSEM，則金標(biāo)抗體會直接泳動到檢測線和硝酸纖維膜上的CPSEM-OVA發(fā) 生免疫反應(yīng)，從而膠體金顆粒發(fā)生聚集，形成紅色的線條，然后其他未結(jié)合的 金標(biāo)抗體繼續(xù)通過毛細(xì)管作用向前泳動，與控制線上的羊抗兔二抗發(fā)生第二次 免疫反應(yīng)，同樣形成紅色線條，這樣包被膜上就會有兩條紅色線條，表示樣品 為陰性。若待測樣品中存在待測藥品PSEM，則金標(biāo)抗體首先會和樣品中的檢測 物發(fā)生免疫反應(yīng)，當(dāng)未發(fā)生反應(yīng)的金標(biāo)抗體有剩余時，才會在檢測線上與 CPSEM-OVA發(fā)生免疫反應(yīng)，形成紅色線條，其顏色強(qiáng)度弱于陰性時的線條強(qiáng)度； 而當(dāng)金標(biāo)抗體全部和樣品中的PSEM發(fā)生免疫結(jié)合時，就不會再有抗體與控制 線包被原結(jié)合，從而檢測線就不會有紅色線條出現(xiàn)?？刂凭€是為檢驗金標(biāo)免疫 層析方法本身是否有效而設(shè)定的，所以無論樣品中是否存在待測藥物PSEM，控 制線都應(yīng)該顯現(xiàn)。如果控制線不顯色，則說明試紙條失效。
實施例2、制備檢測試紙條。把濃度lmg/mL的包被抗原及羊抗兔IgG噴在 包被膜上，分別作為檢測線(T)和控制線(C)，在37。C烘箱干燥10 min。以 同樣方法，將濃度0.2mg/mL的金標(biāo)抗體包被在結(jié)合墊上。試紙條組成為一個襯 板，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、包被膜和吸水墊。將貼好的板 切割成3mm寬的條，然后將試紙條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)密封保存。
實施例3、試紙條的檢測方法。
檢測樣品前處理:取lg豬肉組織均質(zhì)物，加入5mL蒸餾水，1M的HC1 0.5mL 和0.01M的苯甲醛(乙醇溶液)IOOjiL，充分振蕩，置于60。C過夜。然后加入 1M的K2HP04 5mL， 1M的NaOH 0.4 mL以及5mL的乙酸乙酯，劇烈振蕩30 秒。室溫下4000 rpm離心10分鐘，然后取2.5mL乙酸乙酯上清液轉(zhuǎn)移到新容 器中。在45'C下用氮?dú)鈱⑵浯蹈?，然后用正己垸重新溶解后與lmL的0.01M PBST (pH7.4，0.05%Tween-20)混勻。室溫下4000rpm離心10分鐘，最后取底 部水相測定。
檢測操作方法將SEM膠體金層析檢測試紙條樣品端插入待測樣品液中， 插入深度不超過標(biāo)記線，約10 20秒鐘取出檢測試紙條，水平放置，15分鐘左 右觀察判定檢測結(jié)果。
結(jié)果判定如果在包被膜上僅有C線一條紅線顯現(xiàn)，表示檢測結(jié)果為陽性， 說明在待測樣品中含有PSEM;如果在包被膜上C線和T線兩條紅線都顯現(xiàn)， 表示檢測結(jié)果為陰性，說明在待測樣品中不含PSEM或含量低于檢測限；如果 在包被膜上C線紅線不顯現(xiàn)，則表明試紙條已失效。
權(quán)利要求
1.一種呋喃西林代謝物膠體金層析檢測試紙條的制備方法，其特征是含有襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜、吸水墊，金標(biāo)結(jié)合墊為吸附呋喃西林代謝物SEM衍生物金標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用SEM衍生物偶聯(lián)載體蛋白的溶液印制的直線式隱形檢測線T線，用羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形控制線C線，兩條線平行排列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的試紙條的制備方法，其特征是所述的襯板為 不吸水的韌性材料，選用硬質(zhì)塑膠條，或不吸水硬紙條；所述的樣品墊選用玻 璃纖維棉，或尼龍膜，或聚偏二氟乙烯膜，或聚酯膜；所述的吸水墊選用吸水 能力較強(qiáng)的吸水濾紙或濾油紙；所述的包被膜選用硝酸纖維素膜或醋酸纖維素 膜。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l中所述的試紙條的制備方法，其特征是所述的SEM衍 生物金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的SEM衍生物多克隆抗體；所述的偶聯(lián)SEM衍生 物的載體蛋白選用牛血清白蛋白BSA，或雞卵清白蛋白OVA。
全文摘要
快速檢測呋喃西林代謝物的膠體金層析試紙條的制備方法，屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明是含有襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜、吸水墊組成，金標(biāo)結(jié)合墊為吸附呋喃西林代謝物SEM衍生物金標(biāo)抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用SEM衍生物偶聯(lián)載體蛋白的溶液印制的檢測線(T)，用羊抗兔IgG溶液印制的控制線(C)，兩條線平行排列。該膠體金層析檢測試紙條以膠體金標(biāo)記高親和力的多克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，本試紙條特異性強(qiáng)，敏感性高，檢出最低限量可達(dá)到5ppb；簡便、快速、時效性強(qiáng)，無需任何其它試劑和儀器，可現(xiàn)場操作，試紙條加入被檢樣品液后，在15分鐘內(nèi)即可判定檢測結(jié)果；結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確；節(jié)省費(fèi)用，適用范圍廣，便于推廣。
文檔編號G01N33/52GK101320037SQ200810022138
公開日2008年12月10日 申請日期2008年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日
發(fā)明者劉麗強(qiáng), 徐一平, 胥傳來 申請人:江南大學(xué)