專利名稱：：一種適用于硝西泮殘留分析的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種適用于硝西泮(NZP)殘留分析的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，屬于酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：硝西泮(Clonazepam)為苯二氮卓類鎮(zhèn)靜安眠藥，化學(xué)名稱為1，3-二氫-7-硝基-5-苯基-2H-l，4-苯并二氮卓-2-酮。曾用作動(dòng)物飼料添加劑，作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑,具有使動(dòng)物嗜睡少動(dòng)，生長(zhǎng)快且有改變?nèi)赓|(zhì)的作用。也用在屠宰和動(dòng)物檢疫之前,或?qū)?dòng)物轉(zhuǎn)移屠宰之前，起鎮(zhèn)靜作用，以減輕動(dòng)物緊張狀態(tài)，降低動(dòng)物傷害和死亡率。此類藥物常見嗜睡，可見無(wú)力、頭痛、暈眩、惡心、便秘，偶見皮疹、肝損害、骨髓抑制等不良反應(yīng)。若隨意在飼料中添加此類藥物，蓄積的藥物通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，將造成巨大的危害。為此許多國(guó)家將此類藥物列入禁用藥物名單。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)硝西泮的檢測(cè)主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、薄層色譜法(TLC)、氣-質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、液-質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)等，但這些方法不僅需要昂貴的儀器設(shè)備，對(duì)檢材的要求也比較高，需要進(jìn)一步的提純處理才能進(jìn)行，這已經(jīng)不能達(dá)到現(xiàn)代檢測(cè)對(duì)快速、方便、準(zhǔn)確的要求。近年來(lái)，國(guó)外已經(jīng)開展了對(duì)苯二氮卓類免疫分析方法的研究，但國(guó)內(nèi)在這方面的研究起步較晚，大部分的檢測(cè)產(chǎn)品還需要依賴國(guó)外進(jìn)口。為了加強(qiáng)對(duì)國(guó)內(nèi)肉制品的監(jiān)督力度和保障人民的身體健康，有必要展開對(duì)苯二氮卓類免疫分析方法的研究，有必要建立一種快速有效的硝西泮的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法。
發(fā)明內(nèi)容(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、高精確度、操作方法簡(jiǎn)單的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒，用于硝西泮殘留的批量、快速(二)技術(shù)方案為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種硝西泮殘留分析的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括包被了硝西泮包被抗原的酶標(biāo)板、海綿支架、硝西泮標(biāo)準(zhǔn)品、硝西泮多克隆抗體、濃縮洗滌液、酶標(biāo)二抗、顯色液、反應(yīng)終止液。其中，包被了硝西泮包被抗原的酶標(biāo)板的制備過(guò)程中，所用的包被原是硝西泮的半抗原7-氨基硝西泮與卵清蛋白(OVA)的偶聯(lián)復(fù)合物，所用包被液是0.05MpH9.6碳酸鈉緩沖液，所用封閉液是含2XOVA的上述包被液。其中，硝西泮多克隆抗體是用7-氨基硝西泮與牛血清白蛋白(BSA)的偶聯(lián)復(fù)合物常規(guī)方法免疫制備。其中，酶標(biāo)二抗是辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體。其中，濃縮洗滌液(PBST)的配方為20mL蒸餾水中加入8g氯化鈉，0.2g磷酸二氫鉀，3g磷酸氫二鈉，0.4g氯化鉀，0.5mL吐溫-20，濃縮洗滌液的濃度是正常使用時(shí)的50倍。其中，顯色液包括A液和B液，A液配方為每100mL水中加入0.933g檸檬酸，3.68gNa2HP04.12H20和18pL30%H2O2;B液配方為60mg四甲基聯(lián)苯胺溶于lOOmL乙二醇，使用時(shí)按A:B=5:1的比例使用。本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)分析原理是酶標(biāo)板上的每個(gè)孔均包被有相同量的硝西泮抗原，加入待測(cè)硝西泮樣品和硝西泮多克隆抗體后，固相包被抗原和待測(cè)硝西泮相互競(jìng)爭(zhēng)與多克隆抗體反應(yīng)，由于每個(gè)孔中的固相抗原和加入的多克隆抗體含量均一致，所以當(dāng)待測(cè)樣品的硝西泮濃度高時(shí)，則被結(jié)合在固相抗原上的多克隆抗體少，加入的酶標(biāo)二抗與被固定抗體結(jié)合量少，用洗滌液洗滌后加入底物液(即顯色液A液)和顯色液(即B液)，顯色反應(yīng)淺，用酶標(biāo)儀檢測(cè)的吸光值低，表明抑制率高；反之，當(dāng)待測(cè)樣品的硝西泮濃度低時(shí)，則所測(cè)的吸光值高，抑制率低。根據(jù)用已知的硝西泮濃度檢測(cè)所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以推算出待測(cè)樣品的硝西泮的濃度。(三)有益效果本發(fā)明提供的硝西泮殘留檢測(cè)試劑盒采用了硝西泮多克隆抗體，能準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)尿液或組織中硝西泮及其他結(jié)構(gòu)相似的苯二氮卓類殘留，樣品的前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，能同時(shí)檢測(cè)大量的樣品，樣品檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)方法，而且本發(fā)明試劑保存時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)放射性污染。本發(fā)明對(duì)解決大批量樣品的硝西泮殘留現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。圖l為硝西泮的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。具體實(shí)施例方式以下是實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。實(shí)施例1試劑盒操作及結(jié)果計(jì)算待測(cè)樣品經(jīng)前處理后，用PBST定容備用。拆開真空包裝袋并取出酶標(biāo)板，在室溫下平衡5分鐘備用。配制Ong/mL，0.15ng/mL,0.5ng/mL，1.5ng/mL，5ng/mL，15ng/mL，50ng/mL，100ng/mL的硝西泮標(biāo)準(zhǔn)液，加入50(iL標(biāo)樣或處理好的待測(cè)樣品到各孔中，標(biāo)樣和樣品做4個(gè)重復(fù)，加入50pL稀釋的抗體，37"C孵育30分鐘；倒出孔中的液體，用稀釋好的PBST洗5次，將酶標(biāo)板倒置4:1000稀釋好的酶標(biāo)羊抗兔二抗100pL，37。C孵育30分鐘；倒出孔中的液體，用稀釋好的PBST洗板5次，拍干；取A液和B液按5:1混勻，每孔加100piL，在暗處顯色10~15分鐘，每孔加入50pL的終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在波長(zhǎng)為450nm處的吸光值。將含Ong/mL標(biāo)準(zhǔn)品孔的吸光值定為B。，其余孔的吸光值定為B;以B/B0值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度的LOG值為橫坐標(biāo)，繪制硝西泮標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。根據(jù)曲線的回歸方程可以求出對(duì)應(yīng)待測(cè)樣品中硝西泮的濃度，也可以求出硝西泮IC5o(B/B(^50X)及最小檢測(cè)限LOD(90%抑制率對(duì)應(yīng)的濃度)。IC5Q為2.547ng/mL，LOD為0.118ng/mL，線性范圍為0.15-15ng/mL，線性方程y=-29.936x+62.164，R2=0.9928。實(shí)施例2硝西泮殘留分析酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒的組建本例中，試劑盒包含如下部分(1)包被了硝西泮抗原的酶標(biāo)；(2)海綿支架；(3)1mg/mL硝西泮標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)；(4)硝西泮多克隆抗體；(5)辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗兔抗體(康成生物工程公司)；(6)濃縮洗滌液配方為8g氯化鈉，0.2g磷酸二氫鉀，3g磷酸氫二鈉，0.4g氯化鉀，0.5mL吐溫-20和20mL蒸餾水；(7)顯色液A液配方0.933g擰檬酸，3,68gNa2HP04'12H20，18^30%11202和100mL超純水(8)顯色液B液配方60mg四甲基聯(lián)苯胺溶于100mL乙二醇實(shí)施例3保存期實(shí)驗(yàn)將試劑盒放置于4。C保存，分別取0、10、20、30、60、90、120、150和180d的試劑盒，以2.05pg/mL抗原工作濃度和0.3pg/mL抗體工作濃度為工作濃度，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)以測(cè)定其檢測(cè)效果。保存期測(cè)定結(jié)果見表l，表明IQo變化不大，試劑盒在4'C下可保存6個(gè)月以上。表1試劑盒保存實(shí)驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實(shí)施例4試劑盒特異性實(shí)驗(yàn):選擇硝西泮的結(jié)構(gòu)類似物作為待測(cè)物，測(cè)得各種物質(zhì)的抑制中濃度(IC^，再用下式計(jì)算抗體對(duì)這些物質(zhì)的交叉反應(yīng)性；交叉反應(yīng)率愈小，則抗體對(duì)硝西泮的特異性愈強(qiáng)，反之則抗體的特異性差。交叉反應(yīng)(CR^)=1<:5。(硝西泮yiC5o(供試物)xioo%。實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見表2，采用間接ELISA法，硝西泮多克隆抗體對(duì)分子結(jié)構(gòu)相似的硝西泮，地西泮和2種代謝物7-氨基硝西泮、7-氨基硝西泮都具有交叉反應(yīng)。但對(duì)其他類鎮(zhèn)靜劑如鹽酸異丙嗪則具有較好的特異性，交叉反應(yīng)率均在0.1%以下?？偟膩?lái)說(shuō)，對(duì)苯二氮卓類藥物具有一定的群選性。表2交叉反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例5添加回收實(shí)驗(yàn):(1)樣品的提取凈化取lmL尿樣于離心管中，加入4mL、0.1MNaOH溶液振蕩2-5min，加入5mL的正己烷，漩渦5min后，15°C3000rpm離心5min，取上層有機(jī)相，氮?dú)獯蹈?，加?mL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，作為試樣供分析。(2)在空白的人尿中添加標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)液，使其濃度為1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL。各濃度分別制備樣品五份，測(cè)定其含量，將實(shí)測(cè)濃度與添加濃度進(jìn)行比較。在空白尿樣中添加不同濃度的硝西泮，按上述的前處理方法進(jìn)行提取，濃縮后分析。結(jié)果見表3?？梢钥闯?，尿樣中的回收率在65.8%~84.7%之間。該分析方法重復(fù)性良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于4.78%。表3添加回收率的測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1.一種適用于硝西泮殘留分析的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于包含包被了硝西泮包被抗原的酶標(biāo)板、海綿支架、硝西泮標(biāo)準(zhǔn)品、硝西泮多克隆抗體、酶標(biāo)二抗、濃縮洗滌液、顯色液和反應(yīng)終止液；所述硝西泮包被抗原為7-氨基硝西泮與卵清蛋白的偶聯(lián)復(fù)合物；所述酶標(biāo)二抗是辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于濃縮洗滌液的配方為20mL蒸餾水中加入8g氯化鈉，0.2g磷酸二氫鉀，3g磷酸氫二鈉，0.4g氯化鉀和0.5mL吐溫-20。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于顯色液包括A液和B液，A液配方為每100mL水中加入0.933g檸檬酸，3.68gNa2HPCV12H20和18pL30%H202;B液配方為60mg四甲基聯(lián)苯胺溶于100mL乙二醇。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于反應(yīng)終止液為2mol/L的硫酸液。全文摘要一種適用于硝西泮殘留分析的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，屬于酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明試劑盒，包含包被了硝西泮包被抗原的酶標(biāo)板、海綿支架、硝西泮標(biāo)準(zhǔn)品、硝西泮多克隆抗體、酶標(biāo)二抗、濃縮洗滌液、顯色液和反應(yīng)終止液；硝西泮包被抗原為7-氨基硝西泮與卵清蛋白的偶聯(lián)復(fù)合物；酶標(biāo)二抗是辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體。本發(fā)明試劑盒采用了硝西泮多克隆抗體，能準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)尿液或組織中硝西泮及其他結(jié)構(gòu)相似的苯二氮類殘留，樣品的前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，能同時(shí)檢測(cè)大量的樣品，樣品檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)方法，而且本發(fā)明試劑盒保存時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)放射性污染，對(duì)解決大批量樣品的硝西泮殘留現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。文檔編號(hào)G01N33/543GK101315375SQ200810022160公開日2008年12月3日申請(qǐng)日期2008年6月30日優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日發(fā)明者劉麗強(qiáng),彭池方,李秋生,胡擁明,胥傳來(lái),緩袁申請(qǐng)人:江南大學(xué)