專(zhuān)利名稱(chēng)：丁草胺極化熒光免疫檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物免疫檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種除草劑的 快速均相熒光免疫檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，因不合理使用農(nóng)藥而引起的群體性中毒和農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)殘超 標(biāo)事件屢有發(fā)生，農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)也成為發(fā)達(dá)國(guó)家貿(mào)易技術(shù)壁壘的主要 內(nèi)容。農(nóng)藥殘留問(wèn)題在嚴(yán)重危害人民群眾身體健康的同時(shí)，也嚴(yán)重影 響了我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。
丁草胺是一種高效的芽前選擇性氯乙酰苯胺類(lèi)除草劑，在我國(guó)主 要被用于去除水稻田中的雜草，是生產(chǎn)和使用量最大的除草劑品種之 一，但丁草胺在環(huán)境中穩(wěn)定性強(qiáng)、殘留期長(zhǎng)，對(duì)環(huán)境、生物表露出一 定危害性，逐漸引起人們關(guān)注。目前，用于檢測(cè)除草劑丁草胺的主要 方法有氣相色譜法、液相色譜法和色質(zhì)聯(lián)用等理化儀器方法，這些方 法需要昂貴的設(shè)備和熟練操作的技術(shù)人員和復(fù)雜的樣品前處理，并且 l次只能檢測(cè)l個(gè)樣品，不適合大量樣品的篩選檢測(cè)。因此，開(kāi)發(fā)快 速、低成本、操作簡(jiǎn)單的分析方法就具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
免疫分析技術(shù)是一種以抗原-抗體間反應(yīng)為基礎(chǔ)的生物化學(xué)分析 方法，利用抗原抗體間的高特異性和高親和性，就可以達(dá)到從復(fù)雜組 份中特異性識(shí)別待測(cè)物及滿足檢測(cè)高靈敏度的要求。目前，非均相的
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)以其
高效、低成本和高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用最廣。雷紅濤等公開(kāi)了丁草胺
直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法(除草劑丁草胺直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法 研究，農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006， 25(4) :1018 1023)，但是該方法 每反應(yīng)一步，就要分離一次反應(yīng)結(jié)合物和未反應(yīng)的游離試劑，而且需 多步反應(yīng)、洗滌，比較繁瑣；萬(wàn)積成的專(zhuān)利"快速檢測(cè)甲草胺、乙草 胺、丁草胺殘留的膠體金試紙"(ZL 200520142627.7)公開(kāi)了另一種 非均相的丁草胺膠體金檢測(cè)方法，但該法只能定性測(cè)定，不能定量， 且l條試紙只能測(cè)l個(gè)樣品，檢測(cè)通量很低。因此，很有必要發(fā)展一 種能夠一歩完成的高通量均相檢測(cè)法。
極化熒光免疫分析作為一種均相免疫檢測(cè)方法，反應(yīng)只需一歩， 通常時(shí)間僅需幾分鐘到十幾分鐘，無(wú)需分離洗滌操作，采用微孔板l 次可以檢測(cè)幾十甚至幾百個(gè)樣品，便于高通量、自動(dòng)化免疫檢測(cè)，應(yīng) 用前景非常良好。目前，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)農(nóng)藥極化熒光免疫分析的相關(guān)報(bào) 道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)中非均相免疫分析方法的缺點(diǎn)，建立一 種新型均相免疫分析丁草胺的方法，即建立一種用于除草劑丁草胺快 速檢測(cè)的極化熒光免疫分析方法。
本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)予以實(shí)現(xiàn) 提供一種丁草胺極化熒光免疫檢測(cè)方法，包括以下步驟
(1) 將待分析樣品和熒光標(biāo)記半抗原混合；
(2) 往歩驟(1)混合物中加入丁草胺抗體；(3)
:反應(yīng)體系的極化熒光信號(hào);
(4 )根據(jù)丁草胺標(biāo)準(zhǔn)樣品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待分析樣品中丁 草胺濃度。
將丁草胺待檢樣品和熒光標(biāo)記半抗原混合，隨后加入丁草胺抗 體，經(jīng)短暫時(shí)間反應(yīng)，直接測(cè)量反應(yīng)體系的極化熒光值。極化熒光信 號(hào)隨分析物濃度的變化而變化，用己知濃度的丁草胺標(biāo)準(zhǔn)樣品建立的 標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算分析物中丁草胺濃度。
步驟(1)所述的熒光標(biāo)記半抗原是氨基熒光素或者異硫氰酸熒 光素與丁草胺半抗原的偶聯(lián)物，熒光標(biāo)記半抗原包括氨基熒光素標(biāo)記 半抗原、異硫氰酸熒光素標(biāo)記半抗原兩類(lèi)結(jié)構(gòu)
氨基熒光素標(biāo)記半抗原的結(jié)構(gòu)如下
<formula>formula see original document page 6</formula>
其中，n二0 6。
異硫氰酸熒光素標(biāo)記半抗原的結(jié)構(gòu)如下:
<formula>formula see original document page 6</formula>
其中，n=2 8。
本檢測(cè)方法中，優(yōu)選的熒光標(biāo)記半抗原為異硫氰酸熒光素標(biāo)記半 抗原(n二2 8)，最優(yōu)化的為異硫氰酸熒光素標(biāo)記半抗原(n二6); 所述的丁草胺半抗原結(jié)構(gòu)如下
O O
本發(fā)明所述的待分析樣品包括水樣、土壤提取液、農(nóng)產(chǎn)品或食品 提取液。
本發(fā)明所述的丁草胺抗體包括抗丁草胺的多克隆抗體、單克隆抗 體、重組抗體或抗體片段。
本發(fā)明的有益效果是 O)本發(fā)明所建立的方法，室溫即可操作，整個(gè)反應(yīng)時(shí)間很短；
(2) 本發(fā)明方法可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，例如96孔微孔板上可同 時(shí)檢測(cè)96個(gè)樣品， 一步完成，不需洗滌；
(3) 本發(fā)明方法配備機(jī)械手后可實(shí)現(xiàn)加樣、讀數(shù)自動(dòng)化，是一 種高通量、自動(dòng)化免疫檢測(cè)方法。


圖1為利用已二胺化異硫氰酸熒光素(n=6)標(biāo)記丁草胺半抗原 建立的丁草胺極化熒光免疫檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線
圖2為用緩沖液和5種水樣配制樣品作的檢測(cè)曲線
具體實(shí)施例方式
為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，以下從熒光標(biāo)記半抗原制備、活性鑒定、 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立，基質(zhì)效應(yīng)考察、添加回收率考察等方面的實(shí)施例來(lái)予 以說(shuō)明。
實(shí)施例l熒光標(biāo)記半抗原制備方法
以下以己二胺化異硫氰酸熒光素(簡(jiǎn)稱(chēng)HDF， n=6)標(biāo)記半抗原 制備方法為例具體說(shuō)明，其他異硫氰酸熒光素標(biāo)記半抗原以及氨基熒 光素標(biāo)記半抗原方法與此類(lèi)似。
將15.2 mg 丁草胺半抗原(BMPA)， 16.0 mg N,N， -二環(huán)己基碳 二亞胺和9. 7 mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于N，N-二甲基甲酰胺
(DMF)中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜，在所得上清中加入4.5 mg HDF，室溫下 避光攪拌反應(yīng)過(guò)夜，產(chǎn)物用薄層層析硅膠板分離用三氯甲烷+甲醇
(4:04， v/v)作展開(kāi)劑。將不同Rf的產(chǎn)物用甲醇提取，所得提取物
(命名為BMPA-HDF)用于活性鑒定。 實(shí)施例2熒光標(biāo)記半抗原活性鑒定
在PE Victor-3儀器上測(cè)定熒光標(biāo)記半抗原與100倍稀釋抗血 清結(jié)合后的極化熒光值，通過(guò)比較熒光標(biāo)記半抗原與結(jié)合特異性抗體 后mp值的變化來(lái)鑒定熒光標(biāo)記半抗原活性。如表1所示，Rf值不同 的產(chǎn)物與抗體反應(yīng)后的極化值變化不一樣，Rf=0.9的產(chǎn)物反應(yīng)前后 信號(hào)差異最大，能與抗體特異結(jié)合，說(shuō)明該產(chǎn)物具有活性，因此R，O. 9 的產(chǎn)物作為隨后研究的熒光標(biāo)記半抗原(MBPA-HDF)。
游離標(biāo)記物即 與血清結(jié)合后最大即
Rf=0.7 125 144
Rf=0.8 110 119
R產(chǎn)O. 9 142 363
實(shí)施例3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
硼酸鹽緩沖液(BB溶液)作為稀釋液用于所有樣品稀釋。將10 0 ^熒光標(biāo)記半抗原與20禮不同濃度的丁草胺標(biāo)準(zhǔn)品先后加入熒 光微孔板孔中，再加入IOO PL 400倍稀釋的丁草胺抗體，15 min后，
FP值通過(guò)Wallac VICTOR3 1420多標(biāo)記分析儀進(jìn)行測(cè)定。以mP值為 縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，應(yīng)用originPro7. 5軟件四參
數(shù)對(duì)數(shù)方程進(jìn)行曲線擬合，建立競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，見(jiàn)附圖l。附圖l為 利用已二胺化異硫氰酸熒光素(n二6)標(biāo)記丁草胺半抗原建立的丁草 胺極化熒光免疫檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其與本發(fā)明的實(shí)施方案一致，可用 于各種待分析樣品的檢測(cè)。未知濃度的待分析樣品中丁草胺的濃度即 可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。 四參數(shù)對(duì)數(shù)方程為
其中，A和D分別代表藥物濃度最小和最大時(shí)的FP， C為中點(diǎn)濃
度，當(dāng)藥物濃度等于C時(shí)的熒光偏振值為(A+D)/2，正處于曲線的拐
點(diǎn)處，濃度為IC50， B表示曲線的陡峭程度，稱(chēng)斜率因子；以IC10
為檢測(cè)限，以IC2o ICso為檢測(cè)范圍；A-D命名為SmP。 實(shí)施例4樣品前處理
對(duì)于水樣，如果混濁，用普通濾紙過(guò)濾或者離心后使用，澄清
水樣無(wú)需處理；對(duì)于土壤、大米等樣品，采用乙腈進(jìn)行提取，然后離 心，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫去溶劑，用含甲醇10%的硼酸緩沖液復(fù)溶，然后再測(cè) 定。
實(shí)施例5評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)
分別用緩沖液和五種實(shí)際水樣(泉水、蒸餾水、純凈水、自來(lái)水 和池塘水)來(lái)配制樣品作檢測(cè)曲線，觀察基質(zhì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響，見(jiàn) 附圖2，附圖2為用緩沖液和5種水樣配制樣品作的檢測(cè)曲線，水樣 包括泉水、蒸餾水、純凈水、自來(lái)水和池塘水，其中曲線1為自來(lái)水， 曲線2為純凈水，曲線3為池塘水，曲線4為泉水，曲線5為緩沖液， 曲線6為蒸餾水。與本發(fā)明的實(shí)施方案一致，表明所建立的方法沒(méi)有 明顯基質(zhì)干擾，從圖中可以看到六條曲線基本吻合，所以在這5種水 樣中不存在基質(zhì)干擾。 實(shí)施例6實(shí)際水樣檢測(cè)
通過(guò)在不同的實(shí)際水樣中添加標(biāo)準(zhǔn)品，配置成濃度為50、 100、 200、 500和1000ng/mL的添加樣。
將100 ML熒光標(biāo)記半抗原與20叱不同濃度的丁草胺添加樣先 后加入96孔熒光微孔板孔中，再加入100 ML 400倍稀釋的丁草胺抗
體，每個(gè)樣品平行做6個(gè)，溫育5 min后測(cè)讀極化熒光值(mp)，根 據(jù)前邊繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)測(cè)濃度，計(jì)算其回收率和變異系數(shù)，見(jiàn) 表2，回收率用來(lái)衡量方法準(zhǔn)確度，變異系數(shù)用來(lái)衡量方法穩(wěn)定性。
表2
水樣添加量實(shí)際測(cè)得量回收率平均回收CVCV mean
(ng/mL)(ng/mL)(%)率(％)(%)(%)
5037.8775.728.38
10095.4895.511.66
自來(lái)水200169.4584.789.510.3016.85
500395.237919.27
10001126.43112.614.65
5052.28104.58.5
簡(jiǎn)115.80115.811.54
泉水200161.8780.9105.5訓(xùn)l16.43
500451.1990.227.40
10001362.12136.223.91
5038.3376.718.13
腦100.7510014.64
純凈水200150.1275.188.214.0816.01
500393.8678.816.91
10001104.76110.516.22
5044883.9
10011511512
蒸餾水200172.4586.297.015.98.77
500408.1581.611.83
10001142.18114.210.24
5067.27134.521.27
100143.1214310.4
池塘水200192.3496120.618.517.67
500456.569111.95
l冊(cè)1388.02138.626.23
平均值跳215.14從結(jié)果可以看出用熒光標(biāo)記半抗原BMPA-HDF建立的極化熒光免 疫檢測(cè)方法回收率較高，變異系數(shù)較小，準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性可以滿足檢 測(cè)需要。
本發(fā)明所建立的方法，室溫即可操作，整個(gè)反應(yīng)時(shí)間15 min或 者更短，96孔微孔板上可同時(shí)檢測(cè)96個(gè)樣品， 一步完成，不需洗滌， 配備機(jī)械手后可實(shí)現(xiàn)加樣、讀數(shù)自動(dòng)化，本發(fā)明方法可用于丁草胺殘 留的快速檢測(cè)。
權(quán)利要求
1.一種丁草胺極化熒光免疫檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟(1)將待分析樣品和熒光標(biāo)記半抗原混合；(2)往步驟(1)混合物中加入丁草胺抗體；(3)測(cè)量反應(yīng)體系的極化熒光信號(hào)；(4)根據(jù)丁草胺標(biāo)準(zhǔn)樣品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待分析樣品中丁草胺濃度。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述丁草胺極化熒光免疫檢測(cè)方法，其特征在于步驟(1)所述的熒光標(biāo)記半抗原是氨基熒光素或者異硫氰酸熒 光素與丁草胺半抗原的偶聯(lián)物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述丁草胺極化熒光免疫檢測(cè)方法，其特征在于所述的氨基熒光素與丁草胺半抗原的偶聯(lián)物氨基熒光素標(biāo)記半抗原的結(jié)構(gòu)如F:<formula>formula see original document page 2</formula>其中，n二0 6'
4、根據(jù)權(quán)利要求2所述丁草胺極化熒光免疫檢測(cè)方法，其特征 在于所述的異硫氰酸熒光素與丁草胺半抗原的偶聯(lián)物異硫氰酸熒光素標(biāo)記半抗原的結(jié)構(gòu)如下: <formula>formula see original document page 3</formula>其中，n二2 8。
5、 根據(jù)權(quán)利要求5所述丁草胺極化熒光免疫檢測(cè)方法，其特征 在于所述的n為6。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2、 3或4所述丁草胺極化熒光免疫檢測(cè)方法， 其特征在于所述的丁草胺半抗原結(jié)構(gòu)如下<formula>formula see original document page 3</formula>
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述丁草胺極化熒光免疫檢測(cè)方法，其特征 在于步驟(1)所述的待分析樣品包括水樣、土壤提取液、農(nóng)產(chǎn)品或食品提取液。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述丁草胺極化熒光免疫檢測(cè)方法，其特征 在于歩驟(2)所述的丁草胺抗體包括抗丁草胺的多克隆抗體、單克 隆抗體、重組抗體或抗體片段。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種丁草胺極化熒光免疫檢測(cè)方法，包括將待分析樣品和熒光標(biāo)記半抗原混合、加入丁草胺抗體、直接測(cè)量反應(yīng)體系的極化熒光信號(hào)、根據(jù)丁草胺標(biāo)準(zhǔn)樣品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待分析樣品中丁草胺濃度等步驟。本發(fā)明所建立的方法，室溫即可操作，整個(gè)反應(yīng)時(shí)間很短，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，一步完成，不需洗滌，配備機(jī)械手后可實(shí)現(xiàn)加樣、讀數(shù)自動(dòng)化，是一種高通量、自動(dòng)化免疫檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101368946SQ200810029088
公開(kāi)日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2008年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月27日
發(fā)明者青 吳, 孫遠(yuǎn)明, 徐小艷, 李美英, 柳春紅, 沈玉棟, 弘 王, 肖治理, 鋼 薛, 雷紅濤 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)