專利名稱：：葡萄球菌蛋白a定量檢測(cè)試劑盒及定量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)，涉及了一種葡萄球菌蛋白A定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：葡萄球菌蛋白A的發(fā)現(xiàn)從一開(kāi)始就與IgG(免疫球蛋白G)相關(guān)聯(lián)，早在1940年，Vevwey發(fā)現(xiàn)在某些金黃色葡萄球菌中，含有一種在雙向擴(kuò)散試驗(yàn)中能與正常人血清形成沉淀的物質(zhì)。Jensen(1959)也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，并將其命名為A抗原。直到1963年Lo&vist等分離了該抗原，并證明它是一種蛋白質(zhì)。為與糖相區(qū)別，Grov(1960)將其命名為葡萄球菌蛋白A，簡(jiǎn)稱葡萄球菌蛋白A或SPA。1978年，有研究者將加熱滅活并經(jīng)福爾馬林固定的金黃色葡萄球菌用于一種癌癥的治療，顯示出一定的療效，這是世界上第一次利用葡萄球菌蛋白A的抗體吸附性治療相關(guān)疾病的報(bào)道。UWen等在1984年闡明了葡萄球菌蛋白A的全基因序列和相應(yīng)的氨基酸序列。2003年，L.Yang等應(yīng)用表面張力探針證明每個(gè)葡萄球菌蛋白A分子可結(jié)合兩個(gè)IgG分子。葡萄球菌蛋白A的基因編碼序列由1464個(gè)堿基組成(若加上氨基端信號(hào)肽序列則為1572個(gè)堿基)，共編碼488個(gè)氨基酸，分子量約42KD。整個(gè)葡萄球菌蛋白A分子包含六個(gè)結(jié)構(gòu)域E、D、A、B、C和X(從氨基端至羧基端)，其中，E、D、A、B、C這五個(gè)結(jié)構(gòu)域均具備結(jié)合IgG的能力。X結(jié)構(gòu)域的作用是將葡萄球菌蛋白A嵌合入金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁。葡萄球菌蛋白A可與人類和哺乳動(dòng)物血清中的免疫球蛋白分子Fc段結(jié)合，特別是IgG和含IgG的免疫復(fù)合物，這是一種非免疫反應(yīng)性結(jié)合，具有高度的親和力。葡萄球菌蛋白A的應(yīng)用主要基于其抗體結(jié)合能力。將葡萄球菌蛋白A通過(guò)化學(xué)方法交聯(lián)至各種支架結(jié)構(gòu)上，如與瓊脂糖凝膠共價(jià)耦合，能耐受溫度、pH變化和變性劑的作用而不脫失。這種由葡萄球菌蛋白A和瓊脂糖凝膠合成的填料可用于抗體的分離純化。隨著免疫吸附血液凈化治療技術(shù)的快速發(fā)展，這種合成填料逐漸被應(yīng)用于自身免疫疾病、惡性腫瘤、移植排斥等疾病的治療，當(dāng)患者血漿通過(guò)時(shí)，基質(zhì)中葡萄球菌蛋白A可與血漿中致病性抗體，特別是IgG型抗體結(jié)合，這是一種可逆性、pH敏感的結(jié)合，將pH降至2.32.5時(shí)，葡萄球菌蛋白A與所結(jié)合抗體解離，抗體被洗脫清除，將pH恢復(fù)至7.0時(shí)，葡萄球菌蛋白A又恢復(fù)吸附能力，這樣可不斷重復(fù)循環(huán)吸附致病性抗體，從而達(dá)到治療疾病的目的，這種免疫吸附的方法稱為葡萄球菌蛋白A免疫吸附(ProteinAImmunoadsorption，PAIA)。在葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱的使用過(guò)程中，吸附柱內(nèi)結(jié)合不牢固的葡萄球菌蛋白A可能會(huì)隨著血槳的流動(dòng)從吸附柱上脫落，如果這些脫落的葡萄球菌蛋白A通過(guò)血液進(jìn)入人體并積累到一定量時(shí)很可能會(huì)對(duì)人體造成傷害并引發(fā)免疫系統(tǒng)的相關(guān)癥狀，因此對(duì)脫落葡萄球菌蛋白A含量的檢測(cè)是葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱產(chǎn)品的質(zhì)量保證和在臨床上使用的安全保證。本發(fā)明利用ELISA技術(shù)建立了可定量檢測(cè)微量葡萄球菌蛋白A的試劑盒，該試劑盒適用于葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱脫落的微量葡萄球菌蛋白A的檢測(cè)，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的目的是提供一種葡萄球菌蛋白A定量檢測(cè)試劑盒，該試劑盒通過(guò)使用人工重組的葡萄球菌蛋白A(SPA)作為標(biāo)準(zhǔn)品以及用人IgG作為包被ELISA板的抗體，使試劑盒的原料來(lái)源方便，制造成本和推廣成本更低。本發(fā)明所述的一種葡萄球菌蛋白A定量檢測(cè)試劑盒，包括包被有人IgG的ELISA板；葡萄球菌蛋白A標(biāo)準(zhǔn)品，包含人工重組的葡萄球菌蛋白A即SPA，該重組蛋白具有如序列表中SEQIDNO.l所述的氨基酸序列，分子量約27kd，純度95%以上；生物素標(biāo)記的抗SPA抗體；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素(Streptavidin/HRP);常規(guī)的樣品稀釋液，例如，稀釋液的組分為lxPBS，0.1%BSA，0.05%Tween-20，pH7.2土0.2;常規(guī)的洗滌液，例如，洗滌液的組分為lxPBS，0.05%Tween-20;常規(guī)的顯色液，例如TMB顯色液；常規(guī)的終止液，例如，終止液的組分為2mol/LH2S04。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述試劑盒的使用方法。本發(fā)明所述的一種定量檢測(cè)葡萄球菌蛋白A的方法，包括以下步驟1)將葡萄球菌蛋白A標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品用樣品稀釋液稀釋至適合濃度，加入包被有人IgG的ELISA板，IOOpL/孔，37°C60min;所述的葡萄球菌蛋白A標(biāo)準(zhǔn)品，包含人工重組的葡萄球菌蛋白A即SPA，該重組蛋白具有如序列表中SEQIDNO.l所述的氨基酸序列，分子量約27kd，純度95%以上；2)甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干，加入稀釋好的生物素標(biāo)記抗SPA抗體，100iiL/孔，37。C60min;3)甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干，加入稀釋好的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素，100nL/孔，37°C60min;4)甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干，加入顯色液，100ixL/孔，37°C孵育15-30min;5)加入終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD450值。本發(fā)明采用類似雙抗體夾心的方法建立了一種有效的定量檢測(cè)微量葡萄球菌蛋白A的ELISA試劑盒，具有以下有益效果1、采用人工重組的葡萄球菌蛋白A(SPA)作為標(biāo)準(zhǔn)品，使試劑盒的原料來(lái)源方便，制造成本和推廣成本更低。2、采用生物素-親和素系統(tǒng)，使所述試劑盒的靈敏度達(dá)到pg級(jí)，可檢測(cè)微量的葡萄球菌蛋白A。3、準(zhǔn)確性高。檢測(cè)結(jié)果便于由酶標(biāo)儀來(lái)進(jìn)行定量分析，檢測(cè)結(jié)果誤差在5%以內(nèi)。4、穩(wěn)定性好。檢測(cè)結(jié)果的批內(nèi)CV小于5，批間CV510。本發(fā)明所述的葡萄球菌蛋白A定量檢測(cè)試劑盒，可適用于葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱的葡萄球菌蛋白A脫落量的檢測(cè)，以及其他有關(guān)葡萄球菌蛋白A含量的定量檢測(cè)，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。圖1是本發(fā)明的原理示意圖。圖中1.酶聯(lián)反應(yīng)板2.包被人IgG3.SPA4.生物素標(biāo)記的抗SPA抗體5.辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素。圖2是利用葡萄球菌蛋白A定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱的脫落葡萄球菌蛋白A含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。難雄弒以下通過(guò)實(shí)施例結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，這并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例一葡萄球菌蛋白A標(biāo)準(zhǔn)品的制備1、重組葡萄球菌蛋白A基因單體的獲取設(shè)計(jì)三條單鏈DNA引物，其核苷酸序列分別為SEQIDN0.3、SEQIDN0.4禾口SEQIDN0.5(見(jiàn)序列表)，交由專業(yè)公司合成，通過(guò)PCR反應(yīng)進(jìn)行拼接獲得重組葡萄球菌蛋白A基因單體，在該單體5'端含有BamHI酶切位點(diǎn)，3'端含有HindIII酶切位點(diǎn)，再通過(guò)酶切連接將該基因單體連接入載體pQE一TriSystemHisStrepl中，獲得含重組葡萄球菌蛋白A基因單體的重組載體pQE-spa-b。這里所采用的表達(dá)載體是pQE_TriSystemHisStrepl，該載體是德國(guó)Qiagen公司的商品化的pQE系列載體的一種，pQE系列載體屬于pDS載體家族成員(Bujard，H.，Gentz，R.，Lanzer，M.，Stiiber,D.Miiller,M.,Ibrahimi，I.H鄉(xiāng)tle，M.T.，andDobberstein,B.(1987)AT5promotorbasedtranscription-translationsystemfortheanalysisofproteinsinvivoandinvitro.MethodsEnzymol.155,416~433.),在載體pDS56/RBSII和pDS781/RBSII-DHFRS的基礎(chǔ)上構(gòu)建而成(Sttiber，D.,MatUe，H.,andGarotta,G(1990)Systemforhigh-levelproductioninEscherichiacoliandrapidpurificationofrecombinantproteins:applicationtoepitopemapping,preparationofantibodies,andstructure-functionanalysis.In:ImmunologicalMethods,Lefkovits,I.andPernis,B.,eds.,vol.IV,AcademicPress,NewYork,pp.121—152.)，其載體圖譜禾口序歹ll詳見(jiàn)http:〃wwwl.qiagen.com/literature/vectors_pqe.aspx。本發(fā)明也可采用其他表達(dá)載體，只需相應(yīng)地調(diào)整與表達(dá)載體相連的酶切位點(diǎn)即可。2、重組葡萄球菌蛋白A基因的獲取及含重組葡萄球菌蛋白A基因的表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)第一對(duì)引物CL1:5，-gggCCATGGG7Ucggataacaaattcaacaaag-3'CL2:5'-cccGTCGACttttggtgcttgCgcatc-3'設(shè)計(jì)第二對(duì)引物CL3:5，-cccGTCGACaacaaattcaacaaagaac-3，CL4:5，-gggCTCGAGttttggtgcttgCgc-3，用這兩對(duì)引物分別擴(kuò)增基因單體，擴(kuò)增產(chǎn)物CL1-2的5'端和3'端分別具有Ncol和Sail的識(shí)別位點(diǎn)，CL3-4的5'端和3'端分別具有Sail和Xhol的識(shí)別位點(diǎn)。CL1-2和CL3-4經(jīng)Sail酶切后進(jìn)行連接，獲得2個(gè)基因單體串聯(lián)而成的重組葡萄球菌蛋白A基因，命名為spa-b2。spa-b2經(jīng)Ncol禾口Xhol酶切并與載體pQE一TriSystemffisStr印l連接，獲得包含2個(gè)基因單體串聯(lián)而成的重組葡萄球菌蛋白A基因的重組載體pQE-spa-b2。經(jīng)Sail和Xhol酶切的CL3-4和經(jīng)Xhol酶切的載體pQE-spa-b2連接，獲得包含3個(gè)基因單體串聯(lián)而成的重組葡萄球菌蛋白A基因的重組載體pQE-spa-b3。以此類推，可獲得含4個(gè)基因單體串聯(lián)而成的重組葡萄球菌蛋白A基因的重組載體pQE-spa-b4。上述含spa-b4的大腸桿菌表達(dá)載體由本發(fā)明制備的重組葡萄球菌蛋白A基因(spa-b4)與大腸桿菌表達(dá)載體pQE—TriSystemHisStrepl構(gòu)建而成，命名為pQE-spa-b4。3、能高效表達(dá)重組葡萄球菌蛋白A的大腸桿菌重組株pQE-spa-b4-BL21(DE3)的構(gòu)建將重組載體pQE-spa-b4轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，按常規(guī)方法篩選具有氨芐青霉素抗性的重組菌株pQE-spa-b4-BL21(DE3)。4、利用大腸桿菌重組株pQE-spa-b4-BL21(DE3)生產(chǎn)重組葡萄球菌蛋白A1)將甘油保種的工程菌株pQE-spa-b4-BL21(DE3)按體積比1:100接入3mLLB培養(yǎng)基(Amp，100pg/mL)，37°C振搖12h。2)上述培養(yǎng)液按1:100接入100mLLB培養(yǎng)基(Amp，100ng/mL)，37°C振搖12h以進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。3)上述培養(yǎng)液按1:25接入2L加富培養(yǎng)基(Amp，100pg/mL)，37°C振搖3.5h至OD600=1.5。4)加入IPTG至終濃度為O.5mmol/L，37°C繼續(xù)振搖5h。5)lOOOOg、10min離心收集細(xì)菌沉淀，細(xì)菌沉淀可放置于-20。C一-80。C冰箱保存?zhèn)溆谩?)將上述細(xì)菌沉淀的重新混勻于100mLPBS溶液中，超聲破碎細(xì)胞(相關(guān)參數(shù)為超聲時(shí)間4s，間隔時(shí)間4s，功率200W，總時(shí)間100min)。7)10000g，15min離心，收集上清。8)在緩慢攪拌的同時(shí)將硫酸銨固體粉末緩慢加入上清溶液至飽和度為70%，4。C放置lh，10000g，15min離心收集沉淀并重新溶于PBS溶液。9)取NiNTAAgarose(Qiagen公司生產(chǎn))約7.5mL填裝柱子，先后用5~10個(gè)柱床體積的雙蒸水和PBS沖洗填料并平衡，將蛋白樣品流經(jīng)填料以吸附目標(biāo)蛋白。10)先以含20mmol/L咪唑的PBS沖洗填料至OD280不再下降，用含100mmol/L咪唑的PBS洗脫目標(biāo)蛋白并收集，最后再用含200mmol/L咪唑的PBS洗脫一遍。11)含100mmol/L咪唑的PBS洗脫液經(jīng)硫酸銨沉淀后可獲得純度在95%以上的SPA-B4蛋白。經(jīng)測(cè)序，該基因由732個(gè)脫氧核苷酸組成，編碼244個(gè)氨基酸。該基因序列見(jiàn)序列表SEQIDNa2，其編碼的氨基酸序列為SEQIDNO.l。5、重組葡萄球菌蛋白A的活性測(cè)定1)分別將本發(fā)明的重組葡萄球菌蛋白A(SPA-B4)、本元正陽(yáng)基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的重組葡萄球菌蛋白A(國(guó)產(chǎn)SPA)和美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的天然葡萄球菌蛋白A(進(jìn)口SPA)用包被液(0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，pH9.6)配成濃度依次為100ng/mL，50ng/mL，25ng/mL，12.5ng/mL，6.25ng/mL，3.125ng/mL的溶液。2)各取上述溶液100pL加入96孔板，陰性對(duì)照以包被液代替樣品，空白對(duì)照除底物外，其余反應(yīng)成分均不加入，每個(gè)濃度做2個(gè)重復(fù)。置于37^1h。3)甩掉板孔中溶液，每孔加入洗滌液(含0.02%Tween-20的PBS溶液)200nL，振蕩3min，甩干，重復(fù)洗滌4次，最后一次徹底甩干液體。4)每孔加入封閉液(含1%BSA和10%蔗糖的PBS溶液)100pL，置于370Clh。5)洗滌，步驟同3)。6)每孔加入人IgG溶液(20pg/mL)100pL，置于37GClh。7)洗滌，步驟同3)。8)每孔加入羊抗人IgG-HRP溶液(稀釋20000倍)100pL，置于37GClh。9)洗滌，步驟同3)。10)每孔加入TMB顯色液(武漢博士德公司生產(chǎn))100pL，置于37QC15min。11)每孔加入終止液(2mol/LH2S04)lOOpL，終止反應(yīng)。12)于酶標(biāo)儀中測(cè)定A45d。檢測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明的重組葡萄球菌蛋白A對(duì)人IgG具有強(qiáng)吸附能力，其活性高于本元正陽(yáng)基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的重組葡萄球菌蛋白A，略低于美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的天然葡萄球菌蛋白A。實(shí)施例二葡萄球菌蛋白A定量檢測(cè)試劑盒的制備本發(fā)明所述的一種葡萄球菌蛋白A定量檢測(cè)試劑盒，其原理見(jiàn)圖l，該試劑盒包括包被有人IgG的ELISA板；葡萄球菌蛋白A標(biāo)準(zhǔn)品，包含人工重組的葡萄球菌蛋白A即SPA，該重組蛋白的制備方法見(jiàn)實(shí)施例一；生物素標(biāo)記的抗SPA抗體；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素；常規(guī)的樣品稀釋液；常規(guī)的洗滌液；常規(guī)的顯色液；和常規(guī)的終止液。1)制備葡萄球菌蛋白A標(biāo)準(zhǔn)品葡萄球菌蛋白A標(biāo)準(zhǔn)品的分子量約27kd，純度在95%以上。經(jīng)試驗(yàn)證明，定量檢測(cè)葡萄球菌蛋白A時(shí)，葡萄球菌蛋白A標(biāo)準(zhǔn)品的濃度在01000pg/mL的范圍內(nèi)，OD45。與相應(yīng)的濃度成正比關(guān)系。所以，進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，用樣品稀釋液將葡萄球菌蛋白A標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度依次為1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL和31.25pg/mL的溶液，使用量為100/iL/孔。2)制備包被有人IgG的ELISA板，其制作過(guò)程是用本發(fā)明單位制備的葡萄球菌蛋白A瓊脂糖凝膠吸附填料從人血漿中分離純化人IgG，純度在90%以上。用包被緩沖液(35mmol/LNaHC03，15mmmol/LNa2C03，PH9.6)將人IgG配成濃度為5g/mL溶液，在ELISA板中每孔加入100L，4口放置過(guò)；取出，置于37口30min;甩去液體，洗滌液洗滌4次，拍干；加入封閉液(lxPBS，1%BSA)，200L/孔，37口2hr;甩去液體，洗滌液洗滌4次；干，放于4口，備用o3)制備生物素標(biāo)記的抗SPA抗體，制備方法是先制備抗SPA抗體，用本發(fā)明單位研發(fā)生產(chǎn)的重組葡萄球菌蛋白A免疫，分離細(xì)胞并制備交瘤細(xì)胞，篩選能產(chǎn)生高特性和強(qiáng)結(jié)合力的葡萄球菌蛋白A單抗體的交瘤細(xì)胞株，再通過(guò)體外培養(yǎng)篩選出的交瘤細(xì)胞株，產(chǎn)生并純化獲得高純度的單抗體，即抗SPA抗體。葡萄球菌蛋白A不能識(shí)別來(lái)源于的抗體的Fc段。將生物素與一基二在二的作用下進(jìn)行禾n，生成生物素—基二(biotiny-N-hydroxy-succinimide，BNHS)。BNHS分子中的《=0基與抗SPA抗體分子中氨酸的氨基形成肽，從而制備生物素標(biāo)記的抗SPA抗體。4)制備下述溶液樣品稀釋液lxPBS，0.1%BSA，0.05%Tween-20，PH7.2±0.2洗滌液lxPBS，0.05%Tween-20終止液2mol/LH2S045)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素和TMB顯色液分別自博生物技術(shù)有限公司和武漢博士德生物工程有限公司。葡萄球菌蛋白A定量檢測(cè)試劑盒由上述試劑組成。實(shí)施例三利用葡萄球菌蛋白A定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱的脫落葡萄球菌蛋白A的含量1)將重組葡萄球菌蛋白A與瓊脂糖凝膠交聯(lián)，制成葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱。用一定量的人血漿流經(jīng)吸附柱，收集從柱子中流出的血漿，水10min(葡萄球菌蛋白A不會(huì)變性)，離心后取上清溶液作為待測(cè)樣品1。然后，用洗脫液(pHl-3的酸-化溶液)洗脫吸附在柱子上的抗體，收集洗脫下來(lái)的溶液，同樣經(jīng)、離心后作為待測(cè)樣品2。另外，在人血漿中加入量的葡萄球菌蛋白A，經(jīng)同樣理后制成葡萄球菌蛋白A濃度的待測(cè)樣品3(2ng/mL)和待測(cè)樣品4(10ng/mL)。2)用樣品稀釋液將SPA標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度依次為1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL和31.25pg/mL的溶液，用樣品稀釋液將待測(cè)樣品分別稀釋10倍、20倍和100倍。各取上述溶液以100L/孔的體積加入包被有人IgG的ELISA板，陰性對(duì)照以包被液代替樣品，空白對(duì)照除底物外，其余反應(yīng)成分均不加入，每個(gè)濃度做2個(gè)重復(fù)。置于37叱lh。3)甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干。4)用樣品稀釋液將生物素標(biāo)記的抗SPA抗體溶解至濃度為1~3g/mL，100L/孔，37°C60min。5)甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干。6)加入稀釋好的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素，100L/L，37'C60min;7)甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干。8)加入TMB顯色液，100L/孔，37。C孵育15-30min;9)加入終止液中止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD450。通過(guò)不同濃度SPA標(biāo)準(zhǔn)品的OD值制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。各待測(cè)樣品不同稀釋度的測(cè)定值及其平均值見(jiàn)下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>經(jīng)計(jì)得出，待測(cè)樣品3和待測(cè)樣品4的SPA濃度分別是2.051ng/mL和9.867ng/mL，誤差分別為2.55%和1.33%。待測(cè)樣品1的SPA濃度為4.353ng/mL，待測(cè)樣品2的SPA濃度為54.910ng/mL，結(jié)果與相。上述實(shí)驗(yàn)作與結(jié)果表明，本發(fā)明的葡萄球菌蛋白A定量檢測(cè)試劑盒的靈敏度達(dá)到pg級(jí)，準(zhǔn)確度高(誤差在5%以內(nèi))，所需儀(主要是酶標(biāo)儀等)簡(jiǎn)單，于作和推廣。實(shí)施例葡萄球菌蛋白A定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)葡萄球菌蛋白A濃度的結(jié)果穩(wěn)定性測(cè)定1)制備低、中、高三個(gè)濃度的葡萄球菌蛋白A樣品，按照上述方法分別在同一次檢測(cè)中次(n=10)測(cè)定其濃度，其測(cè)定值及差系數(shù)(批內(nèi)CV)如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2)制備低、中、高三個(gè)濃度的葡萄球菌蛋白A樣品，按照上述方法分別在次(n=5)檢測(cè)中測(cè)定其濃度，其測(cè)定值及差系數(shù)(批間CV)如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>上述結(jié)果表明，用本發(fā)明的葡萄球菌蛋白A定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)葡萄球菌蛋白A濃度的結(jié)果的批內(nèi)CV低于5，批間CV在510間，顯示出高的穩(wěn)定性。SEQUENCELISTING(序列表)〈110〉廣州康盛生物科技有限公司<120>葡萄球菌蛋白A定量檢測(cè)試劑盒及定量檢測(cè)方法〈130〉<160〉5<170>Patentlnversion3.5〈210〉1<211>244〈212〉PRT<213〉人:l:序列<400〉1MetGlyAlaAspAsnLysPheAsnLysGluGinGinAsnAlaPheTyr151015GlulieLeuHisLeuProAsnLeuAsnGluGluGinArgAsnGlyPhe202530lieGinSerLeuLysAspAspProSerGinSerAlaAsnLeuLeuAla354045GluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGinAlaProLysValAspAsnLys505560PheAsnLysGluGinGinAsnAlaPheTyrGlulieLeuHisLeuPro65707580AsnLeuAsnGluGluGinArgAsnGlyPhelieGinSerLeuLysAsp859095AspProSerGin100SerAlaAsnLeuLeu105AlaGluAlaLysLysLeuAsn110AspAlaGinAlaProLysLeuAspAsnLysPheAsnLysGluGinGin115120125AsnAlaPheTyr130GlulieLeuHisLeu135ProAsnLeuAsnGluGluGin140ArgAsnGlyPhelieGinSerLeuLysAspAspProSerGinSerAla145150155160AsnI>euLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGinAlaProLys165170175LeuAspAsnLysPheAsnLysGluGinGinAsnAlaPheTyrGlulie180185190LeuHisLeuPro195AsnLeuAsnGluGlu200GinArgAsnGlyPhelieGin205SerLeuLysAspAspProSerGinSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAla210215220LysLysLeuAsnAspAlaGinAlaProLysLeuGluHisHisHisHis225230235240HisHisHisHis〈210〉2〈211〉732<212〉DNA<213〉人工序列〈400〉2atgggtgcggataacaaattcaacaaagaacaacaa犯tgctttctatgaaatcttacat60ttacctaacttaaacgaagaacaacgcaatggtttcatccaaagcctgaaagatgaccca120agccaaagcgctaaccttttagcagaagctaaaaagct肌atgatgcgcaagcacc肌aa180gtcgacaacaaattcaacaaagaacaacaaaatgctttctatgaaatcttacatttacct240aactt肌acgaagaacaacgcaatggtttcaitccaaagcctg肌agatgaccc犯gcc犯300agcgctaaccttttagcagaagctaaaaagctaaatgatgcgcaagcaccaaaactcgac360犯caaMtcaacaaagaacaacaaaatgctttctatgaeiatcttacatttacctaactta420aacgaagaacaacgcaatggtttcatccaaagcctgaaagatgacccaagccaaagcgct480aaccttttagcagaagctaaaaagctaaatgatgcgcaagcaccaaaactcgacaacaaa540ttcaacaaagaacaacaaaatgctttctatgaaatcttacatttacctaacttaaacgaa600gaacaacgcaatggtttcertccaaagcctgaaagatgacccaagccaaagcgctaacctt660ttagcagaagctaaaaagctaaatgatgcgcaagcaccaaaactcgagcaccaccatcac720catcaccatcac732<210〉3<211〉70<212>DNA<213〉人工合成<400>3g'cggataacaaattcaacaaagaacaacaaaatgctttctatgaaatcttacatttacct60aacttaaacg70<210>4<211>70<212〉DNA<213>人工合成<400>4ctttggcttgggtcatctttcaggctttggatgaaaccattgcgttgttcttcgtttaag60tt8ggtaaal70<210〉5<211>70〈212〉DNA<213>人工合成〈400>5ttttggtgcttgcgcatcatttagctttttagcttctgctaaaaggttagcgctttggct60tgggtcatct70權(quán)利要求1.一種葡萄球菌蛋白A定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括包被有人IgG的ELISA板；葡萄球菌蛋白A標(biāo)準(zhǔn)品，包含人工重組的葡萄球菌蛋白A即SPA，該重組蛋白具有如序列表中SEQIDNO.1所述的氨基酸序列，分子量約27kd，純度95％以上；生物素標(biāo)記的抗SPA抗體；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素；常規(guī)的樣品稀釋液；常規(guī)的洗滌液；常規(guī)的顯色液；和常規(guī)的終止液。2.—種定量檢測(cè)葡萄球菌蛋白A的方法，包括以下步驟1)將葡萄球菌蛋白A標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品用樣品稀釋液稀釋至適合濃度，加入包被有人IgG的ELISA板，100yL/孔，37°C60min;所述的葡萄球菌蛋白A標(biāo)準(zhǔn)品，包含人工重組的葡萄球菌蛋白A即SPA，該重組蛋白具有如序列表中SEQIDNO.l所述的氨基酸序列，分子量約27kd，純度95%以上；2)甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干，加入稀釋好的生物素標(biāo)記抗SPA抗體，100uL/孔，37°C60min;3)甩去液體，用洗漆液洗滌4次，拍干，加入稀釋好的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素，100yL/孔，37°C60min;4)甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干，加入顯色液，100uL/L，37r孵育15-30min;5)加入終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD45Q值。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種葡萄球菌蛋白A定量檢測(cè)試劑盒。該試劑盒采用類似雙抗體夾心的ELISA方法定量檢測(cè)微量葡萄球菌蛋白A，并通過(guò)采用生物素-親和素系統(tǒng)，使其靈敏度達(dá)到pg級(jí)。該葡萄球菌蛋白A定量檢測(cè)試劑盒可適用于葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱在使用過(guò)程中脫落的微量葡萄球菌蛋白A的定量檢測(cè)，以及其他有關(guān)葡萄球菌蛋白A含量的定量檢測(cè)，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N33/543GK101339197SQ20081002989公開(kāi)日2009年1月7日申請(qǐng)日期2008年7月30日優(yōu)先權(quán)日2008年7月30日發(fā)明者余波光,張旭鋒,楊東升,苗趙,陳校園申請(qǐng)人:廣州康盛生物科技有限公司