專利名稱：一種酶催化電導(dǎo)免疫傳感器及其檢測化學(xué)殘留與毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分析領(lǐng)域，具體涉及一種基于微間隙陣列電極的免疫傳 感器，以及利用該免疫傳感器檢測農(nóng)產(chǎn)品和食品中化學(xué)殘留與毒素方法。
技術(shù)背景在食品的生產(chǎn)、加工、貯存、流通過程中，由于受到農(nóng)藥、獸藥、生物毒素等化學(xué)有機物的污染而造成的潛在食源性危害已成為人們關(guān)注的焦點，是影響農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)和食品安全的主要問題。目前檢測食品中化學(xué)殘留與生物毒素的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、質(zhì)譜法、免疫親和柱熒光法和酶聯(lián)免疫吸附法等。這些檢測方法中，有的靈敏度不高，分析結(jié)果重復(fù)性較差，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，有的樣品處理煩瑣，操作復(fù)雜，需要精密貴重儀器，不能滿足現(xiàn)場快速篩查的需要。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)的化學(xué)殘留與生物毒素檢測技術(shù)靈敏 度低、需精密儀器定量檢測的不足，提出了一種酶催化電導(dǎo)免疫傳感器及其 檢測化學(xué)殘留與毒素的方法，具有高靈敏、快速、低成本的特點。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是，用于檢測化學(xué)殘留與毒素的所述酶催化電導(dǎo) 免疫傳感器采用以下歩驟制得1、 取常規(guī)光刻印刷法制作的微間隙陣列金電極做基片，它為叉指式雙電 極，正負電極均為兩個梳形金電極，彼此交叉組成微間隙陣列金電極。梳形齒D,寬為I,一IOO,，間隙D2為1,—100,(參見圖1);2、 將所述微間隙陣列金電極進行硅烷化處理，過程是-a.將所述微間隙陣列金電極用無水乙醇清洗三次，每次0.8min—1. 2min，b. 將該微間隙陣列金電極浸入1 M的NaOH溶液中28min—32min;然后 超純水清洗該微間隙陣列金電極三次，每次0.8min—1.2min，吹干；c. 將所述微間隙陣列金電極浸入含氨丙基三甲氧基硅烷5% (體積百分 數(shù))的乙醇溶液中，室溫下靜置23小時一25小時；再用超純水清洗三次后 吹干，即得硅烷化的微間隙陣列金電極；以上過程可在微間隙陣列金電極間的基片上形成一氨基硅烷自組裝單層。3、免疫傳感器的制備步驟a. 將所述硅烷化的微間隙陣列金電極浸入質(zhì)量分數(shù)為5%的戊二醛水溶 液中，室溫下靜置l小時；b. 取出，用超純水清洗三次；在所述電極上滴加30pL待測物與牛血清 白蛋白(或酪蛋白)交聯(lián)物溶液，室溫下靜置反應(yīng)l小時；所述交聯(lián)物濃度 為100嗎/mL，溶于磷酸緩沖溶液(Na3P04為0.01M, pH7.4);這樣使得交聯(lián) 物通過戊二醛交聯(lián)劑固定在微間隙陣列金電極的基片上；C.用超純水清洗三次，吹干，得到酶催化電導(dǎo)免疫傳感器；保存于4。C備用。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是，采用所述酶催化電導(dǎo)免疫傳感器檢測化學(xué)殘留與毒素的方法采用以下步驟實現(xiàn)1. 將分析物樣品或標樣溶液、待測物的單抗溶液各20 ^tL混合后滴加在 所述酶催化電導(dǎo)免疫傳感器上，室溫下靜置反應(yīng)0.4小時一0.6小時；所用 為磷酸緩沖溶液(Na3P04為0.01M, pH 7.4);由此使樣品中分析物與固定在傳感器上的交聯(lián)物競爭反應(yīng)溶液中一定 量的單抗，在傳感器表面上形成交聯(lián)物-單抗的免疫復(fù)合物；2. 在所述傳感器表面滴加2(VL堿性磷酸酶標記的第二抗體溶液(即堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG抗體溶液，亦即酶標二抗)，于室溫下靜置反應(yīng) 0.45小時一0.55小時；所述第二抗體溶液是將溶堿性磷酸酶標記的羊抗鼠
IgG抗體溶于0. 01M、pH 7. 4磷酸緩沖溶液而得；溶液中抗體濃度為1(Vg/mL;
此過程中，酶標二抗通過與免疫復(fù)合物中的單抗發(fā)生反應(yīng)而被捕獲到傳 感器表面上；
3.將所述傳感器置于銀沉積溶液中，室溫下靜置反應(yīng)8min—12min;再 由該傳感器獲取與分析物濃度成負相關(guān)的電導(dǎo)或電阻信號；所述銀沉積溶液 為lmM抗壞血酸磷酸酯，2mMAgN03的0. 1M甘氨酸-NaOH緩沖溶液，pH9. 0; 所述分析物與待測物為赭曲霉毒素A或植物激素吲哚乙酸。 該步驟中，傳感器表面上堿性磷酸酶催化其底物抗壞血酸磷酸酯水解產(chǎn) 生還原劑抗壞血酸，后者將溶液中銀離子還原成銀金屬并沉積在微間隙陣列 金電極上，使微間隙陣列金電極正負電極部分導(dǎo)通，從而增大微間隙陣列金 電極的電導(dǎo)(或降低電阻)，獲得與分析物濃度成負相關(guān)的電導(dǎo)(或電阻) 信號。
上述步驟的技術(shù)原理是，采用分析物和固定化的交聯(lián)物競爭反應(yīng)一定量 單抗的間接競爭免疫分析步驟，形成抗原-單抗免疫復(fù)合物；再利用第二抗 體的酶標記催化沉積溶液中底物分解產(chǎn)生導(dǎo)電材料沉積在微間隙陣列金電 極間，改變微間隙陣列金電極正負電極的電導(dǎo)(或電阻)；通過電導(dǎo)或電阻 檢測測定化學(xué)殘留與生物毒素的濃度。
由以上可知，本發(fā)明為一種酶催化電導(dǎo)免疫傳感器及其檢測化學(xué)殘留與 毒素的方法，可望為農(nóng)產(chǎn)品和食品進出口檢驗與食品安全監(jiān)督提供快速、實 用、低成本、高靈敏、高通量的免疫檢測技術(shù)，其優(yōu)點有.-
1. 微間隙陣列電極制備簡單，可大批量、低成本生產(chǎn)；
2. 檢測步驟簡單，檢測時間在lh內(nèi)，檢測所需的儀器可用萬用電表或 自行研制的電阻量測裝置，便攜且價格低廉；
3. 本免疫傳感器靈敏度高，可實現(xiàn)0.1fg/mL小分子的檢測，且背景干擾很小。


圖l是微間隙陣列電極圖樣(黑色區(qū)域為金膜，白色區(qū)域為裸露的基片)。 掩膜圖樣與此相反(黑色區(qū)域為透明區(qū)，白色區(qū)域為不透明區(qū))。它為叉指 式雙電極，正負電極均為兩個梳形金電極，彼此通過微米級絕緣間隙交叉組
成陣列式金電極。正負電極的梳形齒數(shù)5至20個，寬為lnm—100n。電極
間隙為1iLim—100)am。
具體實施例方式
實施例l:基于微間隙陣列電極的免疫傳感器檢測赭曲霉毒素A (0A)。
1. 免疫傳感器的制備,-取常規(guī)光刻印刷法制作的微間隙陣列金電極做基片，它為叉指式雙電 極，正負電極均為兩個梳形金電極，彼此交叉組成微間隙陣列金電極。梳形
齒寬為1,一100拜，間隙為1ium—100i^m;
將微間隙陣列金電極用無水乙醇(100%)清洗三次(每次lmin)后， 將電極浸入lM的NaOH溶液中30min;再用超純水清洗電極三次(每次lmin)， 吹干；然后，將電極浸入含氨丙基三甲氧基硅烷5% (體積百分數(shù))的乙醇溶 液中，室溫下靜置24小時；用超純水清洗三次后吹干，獲得硅垸化的微間 隙陣列金電極；
將硅烷化的微間隙陣列金電極浸入戊二醛水溶液(質(zhì)量分數(shù)5%)，室溫 下靜置1小時；用超純水清洗三次后，在電極上滴加30 pL牛血清白蛋白與 赭曲霉毒素交聯(lián)物(BSA-OA)溶液(BSA-OA濃度為10(Vg/niL，溶于磷酸緩 沖溶液，其中N&P04為0.01M， pH 7.4)，室溫下靜置反應(yīng)l小時。用超純 水清洗三次后吹干備用。
2. 0A的檢測
將0A的標樣溶液、單抗溶液(各20nL，磷酸緩沖溶液，NaK)4為0. OIM， pH7.4)混合后滴加在免疫傳感器上，室溫下靜置反應(yīng)0.5小時。然后在傳感器表面滴加20pL堿性磷酸酶標記的二抗(堿性磷酸酶標記羊抗鼠IgG抗體)溶液(酶標抗體濃度為10昭/mL，磷酸緩沖溶液，N&P04為0. OIM， pH 7. 4)， 于室溫下靜置反應(yīng)0.5小時；將傳感器置于銀沉積溶液(lmM抗壞血酸磷酸 酯，2mM AgN"的0. 1M甘氨酸-NaOH緩沖溶液，pH9.0)中，室溫下靜置反 應(yīng)10min;然后，將免疫傳感器正負極分別與電化學(xué)工作站(CHI 760C)的 工作電極與對電極(參比電極與對電極復(fù)合)連接，采用線性掃描伏安法在 0 50mV電位范圍檢測，記錄傳感器電流隨電位變化的響應(yīng)曲線，并計算其 斜率(即電導(dǎo)值)。根據(jù)不同濃度OA標樣的電導(dǎo)值，獲得與濃度成負相關(guān)的 工作曲線。使用所研制的免疫傳感器如上法對10個可能含有OA的大豆、花生樣品 進行測定，根據(jù)樣品的電導(dǎo)響應(yīng)值與工作曲線，求得對應(yīng)的OA濃度。與ELISA 方法對照，所研制的免疫傳感器的結(jié)果與ELISA的測定值的相對誤差都在 6. 7%以內(nèi)。實施例2:基于微間隙陣列電極的免疫傳感器檢測植物激素n引哚乙酸 (IAA)。1.免疫傳感器的制備取常規(guī)光刻印刷法制作的微間隙陣列金電極做基片，它為叉指式雙電 極，正負電極均為兩個梳形金電極，彼此交叉組成微間隙陣列金電極。梳形齒寬為l拜一100iim，間隙為liini—lOO,;將微間隙陣列金電極用無水乙醇(100%)清洗三次(每次lmin)后， 將電極浸入1 M的NaOH溶液中30min。再用超純水清洗電極三次(每次lmin)， 吹千。然后，將電極浸入含氨丙基三甲氧基硅烷5% (體積百分數(shù))的乙醇溶 液中，室溫下靜置24小時；用超純水清洗三次后吹干，獲得硅垸化的微間 隙陣列金電極；將硅烷化的微間隙陣列金電極浸入戊二醛水溶液(質(zhì)量分數(shù)5%)，室溫 下靜置1小時；用超純水清洗三次后，在電極上滴加30pL牛血清白蛋白與吲哚乙酸交聯(lián)物(BSA-IAA) (BSA-IAA濃度為10(Vg/mL，溶于磷酸緩沖溶液，其中Na3P04為0.01M， pH 7.4)，室溫下靜置反應(yīng)1小時；用超純水清洗三次后吹干備用。2. IAA的檢測將IAA的標樣溶液、單抗溶液(各20pL，磷酸緩沖溶液，N出P04為0. OIM， pH 7. 4)混合后滴加在免疫傳感器上，室溫下靜置反應(yīng)0. 5小時；然后在傳 感器表面滴加20pL堿性磷酸酶標記的二抗(堿性磷酸酶標記羊抗鼠IgG抗 體)溶液(酶標抗體濃度為1(Vg/mL,溶于磷酸緩沖溶液，其中Na3P04為0. OIM， pH 7.4)，于室溫下靜置反應(yīng)0.5小時；將傳感器置于銀沉積溶液(lmM抗 壞血酸磷酸酯，2mM AgN03的0. 1M甘氨酸-NaOH緩沖溶液，pH9. 0)中，室 溫下靜置反應(yīng)10min;按照實施案例1的方法測定傳感器的電導(dǎo)，得到工作 曲線，傳感器的電導(dǎo)在0. lfg/mL 100pg/mL范圍內(nèi)與IAA濃度呈負線性相 關(guān)。使用所研制的免疫傳感器如上法對10個可能含有IAA的植物樣品進行 測定，根據(jù)樣品的電導(dǎo)響應(yīng)值與工作曲線，求得對應(yīng)的IAA濃度。與ELISA 方法對照，所研制的免疫傳感器的結(jié)果與ELISA的測定值的相對誤差都在 5.8%以內(nèi)。微間隙陣列金電極的制備采用傳統(tǒng)(常規(guī))的光刻印刷方法在清潔的 4X6mm的基片(石英、普通陶瓷或玻璃材料)上用甩膠機上涂上一層光刻膠 (正膠)，轉(zhuǎn)速3000r/min, 8(TC烘15min。在光刻機中將掩膜版與基片對 準，紫外曝光將掩膜版上的圖形轉(zhuǎn)移到基片上。顯影去掉曝光部分的光刻膠， 氮氣流吹干后，采用真空濺射在基片上依次噴涂30nm厚的Ti層和120nm厚 的Au層。然后用有機溶劑氯仿除去基片上的感光膠后，即可得到微間隙陣 列金電極。其中單個金帶寬度及相鄰兩根金帶之間的寬度可根據(jù)需要，在1 100 P m之間調(diào)整。9
權(quán)利要求
1.一種用于檢測化學(xué)殘留與毒素的酶催化電導(dǎo)免疫傳感器，其特征是，它采用以下步驟制得(1)取常規(guī)光刻印刷法制作的微間隙陣列金電極做基片，它為叉指式雙電極，正負電極均為兩個梳形金電極，彼此交叉組成微間隙陣列金電極。梳形齒寬為1μm-100μm，間隙為1μm-100μm；；(2)將所述微間隙陣列金電極進行硅烷化處理，過程是a.將所述微間隙陣列金電極用無水乙醇清洗三次，每次0.8min-1.2min，b.將該微間隙陣列金電極浸入1M的NaOH溶液中28min-32min；然后超純水清洗該微間隙陣列金電極三次，每次0.8min-1.2min，吹干；c.將所述微間隙陣列金電極浸入含氨丙基三甲氧基硅烷5％(體積百分數(shù))的乙醇溶液中，室溫下靜置23小時-25小時；再用超純水清洗三次后吹干，即得硅烷化的微間隙陣列金電極；(3)免疫傳感器的制備步驟a.將所述硅烷化的微間隙陣列金電極浸入質(zhì)量分數(shù)為5％的戊二醛水溶液中，室溫下靜置1小時；b.取出，用超純水清洗三次；在所述電極上滴加30μL待測物與牛血清白蛋白或酪蛋白交聯(lián)物溶液，室溫下靜置反應(yīng)1小時；所述交聯(lián)物濃度為100μg/mL，該交聯(lián)物溶液是將牛血清白蛋白或酪蛋白交聯(lián)物溶于0.01M、pH7.4磷酸緩沖溶液而得；c.用超純水清洗三次，吹干，得到酶催化電導(dǎo)免疫傳感器。
2、 一種采用權(quán)利要求1所述酶催化電導(dǎo)免疫傳感器檢測化學(xué)殘留與毒 素的方法，其特征是，該方法采用以下步驟實現(xiàn)(1)將分析物樣品或標樣溶液、待測物的單抗溶液各20pL混合后滴加在所述酶催化電導(dǎo)免疫傳感器上，室溫下靜置反應(yīng)0.4小時一0.6小時；所用為0.01M、 pH 7.4磷酸緩沖溶液；(2) 在所述傳感器表面滴加2(^L堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG抗體溶 液，抗體濃度為1(Vg/mL，于室溫下靜置反應(yīng)0.45小時一0.55小時；所述 抗體溶液是將溶堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG抗體溶于0. OIM、 pH 7. 4磷酸 緩沖溶液而得；(3) 將所述傳感器置于銀沉積溶液中，室溫下靜置反應(yīng)8min—12min; 再由該傳感器獲取與分析物濃度成負相關(guān)的電導(dǎo)或電阻信號；所述銀沉積溶 液為lmM抗壞血酸磷酸酯，2mMAgN03的0. 1M甘氨酸-NaOH緩沖溶液，pH9. 0。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測化學(xué)殘留與毒素的方法，其特征是，所述 分析物與待測物為赭曲霉毒素A或植物生長調(diào)節(jié)劑吲哚乙酸等化學(xué)毒素與殘 留物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測化學(xué)殘留與生物毒素的微間隙電極陣列免疫傳感器，包括微間隙陣列電極、硅烷化處理的電極基片、具有良好導(dǎo)電性的酶沉積物及基于電導(dǎo)檢測的酶聯(lián)免疫傳感器及檢測方法。本發(fā)明利用微間隙電極陣列免疫傳感器，對赭曲霉毒素A和植物生長調(diào)節(jié)劑吲哚乙酸進行檢測，該方法靈敏度高，操作簡單，儀器便攜且價格低廉，可望為農(nóng)產(chǎn)品和食品進出口檢驗與食品安全監(jiān)督提供快速、實用、低成本、高靈敏、高通量的化學(xué)殘留與生物毒素免疫檢測技術(shù)。
文檔編號G01N33/53GK101275946SQ20081003132
公開日2008年10月1日 申請日期2008年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月16日
發(fā)明者俞汝勤, 霞 楚, 沈國勵, 蔣建暉, 勇 黃 申請人:湖南大學(xué)