專利名稱：：乙型肝炎病毒e抗原檢測微粒、其制備及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及乙肝的診斷試劑，具體涉及基于光激化學發(fā)光原理的乙型肝炎病毒e抗原檢測顆粒、其制備及應用。
背景技術：
：免疫學檢測是基于抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種手段，由于其可以利用同位素、酶、化學發(fā)光物質等對被檢測信號進行放大和顯示，因此常被用于檢測蛋白質，激素等微量生物活性物質。我國免疫學檢測基本經(jīng)歷了放射免疫檢測(興起于20世紀70年代，現(xiàn)仍普遍使用于縣級以上醫(yī)院)；酶S^免疫檢測(興起于20世紀80年代，各臨床機構普遍使用)；以化學發(fā)光為代表的光生物學標記及免疫檢測技術(20世紀90年代開始推廣使用，產(chǎn)品步入成長期)三個階段。這一衍變過程主要是基于對檢測方法的敏感性、準確性、以及操作簡捷性的需求的不斷提高而決定的?；瘜W發(fā)光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay)是近十年來在世界范圍內發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析技術。檢測原理是以發(fā)光物質作為信號放大系統(tǒng)并籍助其發(fā)光強度直接測定免疫結合。由于其高靈敏度，檢測范圍寬等優(yōu)點，己成為放射性免疫分析與普通酶免疫分析的取代者，是免疫學檢測重要的發(fā)展方向。但目前國內自行研制的化學發(fā)光檢測試劑，大多為非均相反應，采用化學底物直接標記，通過化學反應激發(fā)。其分析過程與傳統(tǒng)酶標檢測類似，需反復清洗與分離，檢測耗時長，自動化程度不高。國外廠家檢測試劑隨發(fā)光基質與檢測形式而各不相同。以Abbott,Bayer與Chiron等公司為代表的化學激發(fā)，即以化學發(fā)光底物直接標記抗原或抗體進行免疫測定。最常用的為吖啶酯，在堿性環(huán)境中可被過氧化氫氧化而發(fā)光。BD則以AKP，金鋼脘為基質采用酶促化學發(fā)光。Roche為則采用電化學發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL，發(fā)光底物二價的三聯(lián)吡啶釕及反應參與物三丙胺在電極表面失去電子而被氧化。氧化的三丙胺失去一個H+而成為強還原劑，將氧化型的三價釕還原為激發(fā)態(tài)的二價釕，隨即釋放光子而恢復為基態(tài)的發(fā)光底物。這一過程在電極表面周而復始地進行，不斷地發(fā)出光子而常保持底物濃度的恒定。因反應過程中牽涉到分離清洗，自動化設計復雜，儀器相當昂貴。此外，發(fā)光基質的穩(wěn)定性也是一大問題。光激化學發(fā)光法通過引入激光技術與納米微球技術，成功的解決了上述不足。因反應在均相進行，既加快了反應速度，又避免了反復分離與清洗步驟，能有效降低檢測背景值，減少反應時間，并可實現(xiàn)自動化操作。目前，PE公司推出了針對生物研究用的光激化學發(fā)光試劑Alpha-screen。但在臨床檢測領域，還沒有面世的光激化學發(fā)光檢測試劑，尤其是用于腫瘤標志物與肝炎檢測項目。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種可用于定性或定量檢測乙型肝炎e抗原(HBeAg)的檢測微粒，其制備、檢測條件及應用。本發(fā)明的技術原理本發(fā)明的乙型肝炎e抗原(HBeAg)檢測試劑及試劑盒與光激化學發(fā)光檢測技術相關，光激化學發(fā)光免疫技術是一種利用化學發(fā)光物質發(fā)射的光波進行免疫測定的方法。該技術主要整合了高分子微粒技術，有機合成，蛋白質化學與臨床檢測相關領域的研究。本發(fā)明之所以能檢測乙型肝炎e抗原(HBeAg)，是由于在均相條件下，將內部帶有染料的感光微粒(納米級)以及包被有抗-HBe抗體并且內部帶有發(fā)光化合物的發(fā)光微粒(納米級)的混合物作為試劑和檢測樣品混合。此時納米感光微粒和包被有抗-HBe抗體的納米發(fā)光微?？裳杆儆行У夭蹲?HBeAg，在近距離內，三者形成免疫夾心復合物。激發(fā)光照射后，納米感光微粒屮的染料被誘導激活，并釋放高能態(tài)的活性氧離子(單線態(tài)氧)。該高能態(tài)的活性氧離子被近距離的納米發(fā)光微粒俘獲，從而傳遞能量以激活所述發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物。數(shù)微秒后，發(fā)光微粒中的發(fā)光化合'物將釋放出高能級紅光。用光子計數(shù)器測定這些高能級光子，并通過電腦將光子數(shù)換算為目標分子濃度，光子數(shù)的多少即精確地反映了目標分子的濃度。而當樣本不含HBeAg時，無法在近距離形成免疫夾心復合物，活性氧離子也無法傳遞至發(fā)光微粒表面?；钚匝蹼x子在液相中迅速衰減，檢測時則無光能級紅光產(chǎn)生。具體原理參見圖1及圖2。本發(fā)明第二方面提供了一種乙型肝炎e抗原(HBeAg)的檢測試劑盒，包括上述抗-HBe抗體包被的發(fā)光微粒、生物素標記的抗-HBe抗體和親和素包被的感光微粒。在試劑盒中，上述抗-HBe抗體包被的發(fā)光微粒、生物素標記的抗-HBe抗體和親和素包被的感光微粒分別以溶液的形式置于各自獨立的容器中。上述含有抗-HBe抗體包被的發(fā)光微粒、生物素標記的抗-HBe抗體或親和素包被的感光微粒的溶液的溶劑可以是常規(guī)的適合抗原抗體反應的溶劑體系，如HEPES緩沖體系、Tris緩沖體系?？?HBe抗體包被的發(fā)光微粒的溶劑優(yōu)選pH8.0的成分為HEPES、NaCl和EDTA-Na_2H20的HEPES緩沖液，生物素標記的抗-HBe抗體的溶劑優(yōu)選pH8.0的成分為Tris、NaCl,和EDTA-Na-2H20的Tris緩沖液，親和素包被的感光微粒的溶劑優(yōu)選HEPES、NaCl和EDTA-Na_2H20的HEPES緩沖液，上述各種溶劑中還可添加起封閉和蛋白保護作用的物質如BSA以及防止微粒聚集的穩(wěn)定試劑如Tween20，出于對試劑防腐以及長期儲存的考慮還可在溶劑中添加防腐劑，防腐劑優(yōu)選100U/ml慶大霉素和質量百分比為萬分之五的Proclin300作為防腐劑。在用于定量檢測乙型肝炎e抗原時，上述試劑盒中還可包括含有多種確定濃度乙型肝炎e抗原的溶液。上述不同乙型肝炎e抗原濃度的溶液分別獨立包裝。用于定性檢測乙型肝炎e抗原時，上述試劑盒中還可包括陽性對照、陰性對照，以及參考樣品，上述參考樣品為含有確定濃度乙型肝炎e抗原的溶液。上述陽性對照、陰性對照，以及參考樣品分別獨立包裝。含有確定濃度乙型肝炎e抗原的溶液中乙型肝炎e抗原的濃度為乙型肝炎e抗原臨床cutoff點對應的濃度。.上述發(fā)光微粒是指填充有發(fā)光化合物和鑭系元素化合物的高分子微粒。發(fā)光化合物可以是Dioxene(二氧雜環(huán)己烯)或thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，鑭系元素化合物可以是Eu(TTA)3/T0P0或Eu(TTA)3/Phen等,該微?？捎墒袌錾腺彽谩Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)，由于最終的檢測反應是均相反應，發(fā)光微粒的粒徑(微粒的平均直徑)太大(>400nm)會自然沉降，影響檢測效果，微粒的粒徑太小(<50nm)，會使制備過程中的清洗工作比較困難，對抗體連接工作不利，因此發(fā)光微粒的粒徑范圍應在50-400nm之間，較好為100-300nm之間，優(yōu)選250nm。發(fā)光微粒的表面官能團可以是任何能聯(lián)接蛋白質的基團，如羧基，醛基，胺基，環(huán)氧乙基或鹵代烷基等各種已知的可連接蛋白質的官能團，最優(yōu)化的微粒表面官能團為羧基表面官能團的微?；蛉┗砻婀倌軋F的微粒。使用不同的徼粒表面官能團，連接抗體的反應方式和條件也不相同。A)羧基微粒和抗體連接方法羧基表面官能團的微粒親水性好，顆粒均勻穩(wěn)定。根據(jù)表面羧基含量的不同，一般可分為低，中和高羧基微粒。低羧基微粒一般采用物理吸附法連接抗體。但物理吸附的抗體會逐漸由微粒表面釋放，造成溶液中的游離抗體濃度增加，從而降低了檢測靈敏度。并且試劑保存的穩(wěn)定性也不夠。高羧基微粒一般采用化學方法連接抗體。化學法連接的微粒與抗體結合比較牢固，在檢測靈敏度及試劑的穩(wěn)定性方面要優(yōu)于物理吸附?；瘜W法連接微粒與抗體一般采用EDAC和NHS活化微粒，然后活化得微粒與抗體羧合的反應?？梢砸徊椒磻?活化和羧合同時進行)也可兩步反應(活化和羧合分步進行)。一步反應較兩步反應簡單，但反應的重現(xiàn)性不好，抗體容易失活。兩步法連接抗體雖然避免了抗體失活，但仍沒有完全解決抗體連接的重現(xiàn)性問題。B)醛基微粒和抗體連接方法醛基表面的微粒也有很好親水性，顆粒均勻穩(wěn)定，微粒表面容易修飾，并且與蛋白的反應比較容易。一般采用NaBH3CN進行還原胺化反應，反應生成的碳氮鍵很穩(wěn)定，抗體連接的效率也很高，重復性也很好。鑒于獲得更好的抗-HBe抗體連接效率，試劑穩(wěn)定性和連接重復性，經(jīng)試驗優(yōu)選醛基表面官能團的微粒，并應用了NaBH3CN的還原胺化反應作為抗體的連接方法。發(fā)光微粒的發(fā)光量會直接影響最終檢測的發(fā)光效果。市場提供的發(fā)光微粒發(fā)光量一般會在50，000——10，000，000光子數(shù)/100ug發(fā)光微粒范圍內，優(yōu)選150，000-350，000光子數(shù)/100ug)發(fā)光微粒。上述抗-HBe抗體包被的發(fā)光微粒中，發(fā)光微粒與抗-HBe抗體的質量比例較佳為10:(0.2-10)，優(yōu)選10:(1-4)。.上述生物素標記的抗-HBe抗體中，生物素與抗體的分子比例較佳為(5—50):1，優(yōu)選30:1。-上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒。在67(T690nm光激發(fā)下，可以產(chǎn)生單線態(tài)氧離子，當其與發(fā)光微粒距離足夠近的情況下，單線氧離子傳遞到發(fā)光微粒，與發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物反應，產(chǎn)生紫外光，紫外光再進一步激發(fā)鑭系元素化合物，產(chǎn)生52(T620nm波長光子。感光化合物可以是酞菁染料等，該微粒也可由市場上購得。上述親和素包被的感光微粒中，親和素與感光微粒的質量比例無特殊限制，較佳為l:(3—10)，優(yōu)選l:5。市售感光微粒均適用于本發(fā)明，微粒粒徑較佳為180—260nm，優(yōu)選220nm?？?HBe抗體包被的發(fā)光微粒采用NaBH3CN的還原胺化反應法制備，反應步驟如下1)混合將發(fā)光微粒與抗-HBe抗體按質量比例為10:(l—4)混合于緩沖液中；2)反應加入緩沖液配制的NaBH3CN洛液混合并反應；.3)封閉加入緩沖液配制的Gly及NaBH3CN溶液，混勻反應后，再加入BSA溶液封閉；4)清洗產(chǎn)物，獲得抗-HBe抗體包被的發(fā)光微粒。其中，混合步驟中，發(fā)光微粒與抗HBe抗體的質量比例為10:(l—4)優(yōu)選5:1。反應緩沖液可為MES緩沖液、磷酸緩沖液，優(yōu)選MES緩沖液，濃度優(yōu)選0.05M，反應步驟中，反應溶液中發(fā)光微粒的濃度可為10—40mg/ml，優(yōu)選25mg/ml。清洗的方式可以為離心法清洗或透析法清洗。透析法清洗步驟采用反應緩沖液透析，每次4-5小時，更換緩沖液4次。透析清洗操作時間較長，且微粒損失較多，造成收率降低。離心法清洗步驟包括離心去上清，加入反應緩沖液洗滌，超聲處理打開沉淀，如此反復3—5次。離心法清洗時離心力會使發(fā)光微粒暫時聚集在一起，但經(jīng)過超聲處理可以很容易再次分散打開，此法操作時間短，且收率較高。因此優(yōu)選采用此種清洗方式。生物素標記抗體的方法可釆用常規(guī)的方法進行。親和素包被的感光微?？刹捎肗aBH3CN的還原胺化反應法制備。'本發(fā)明第三方面，公開了一種利用光激化學發(fā)光原理，采用雙抗體夾心法，定性或定量檢測乙型肝炎e抗原的方法，包括將待測樣品與上述用于檢測乙型肝炎e抗原的檢測微粒、生物素標記的抗-HBe抗體和親和素包被的感光微粒混合反應，而后用激發(fā)光照射反應孔，測量每個反應孔發(fā)光光子量獲得光信號值。步驟3的光激化學發(fā)光法檢測的激發(fā)光光源波長范圍為600-700nm，優(yōu)選640-680nm;反應孔發(fā)光的發(fā)射光光源波長范圍為600-680nm，優(yōu)選610-620nni;發(fā)射光延遲時間范圍為100ms-1000ms;激發(fā)光光源的功率范圍為5-100mw，優(yōu)選40-60w。定量檢測乙型肝炎e抗原的方法，包括下列步驟1)在反應孔中加入待測樣品、上述抗-朋e抗體包被的發(fā)光微粒和生物素標記的抗-朋e.抗體獲得初始反應溶液，混合反應；2)再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應溶液進行反應；3)激發(fā)光照射反應孔，測量每個反應孔發(fā)光光子量獲得光信號值；4)根據(jù)標準曲線計算待測樣品HBeAg含量。本發(fā)明第四方面，公開了一種定性檢測乙型肝炎e抗原的方法，包括下列步驟1)在反應孔中加入待測樣品或參考樣品，以及上述抗-HBe抗體包被的發(fā)光微粒和生物素標記的抗-HBe抗體獲得初始反應溶液，混合反應；2)再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應溶液進行反應；3)激發(fā)光照射反應孔，測量每個反應孔發(fā)光光子量獲得光信號值；4)計算待測樣品光信號值與HBeAg參考樣品光信號的比值，即S/C0值，當S/C0>1時待測樣品被判定為陽性，當S/C(X1時待測樣品被判定為陰性。上述參考樣品中，HBeAg的濃度與乙型肝炎e抗原臨床cutoff點對應。在定性或定量檢測乙型肝炎e抗原的方法中步驟1)的反應條件為37。C溫育10-120分鐘，較佳為10—30分鐘，優(yōu)選20分鐘，步驟2的反應條件也為37'C溫育10—30分鐘，優(yōu)選15分鐘。初始反應溶液中，抗-HBe抗體包被的發(fā)光微粒的濃度無特殊限制，可以為50—300ug/ral，優(yōu)選50ug/m1-150ug/ml，最佳50ug/ml。初始反應溶液中，生物素標記的抗-HBe抗體的濃度無特殊限制，可以為2—12ug/ml，較佳為2ug/ml-6ug/ml，優(yōu)選4ug/ml。在最終反應溶液中，親和素包被的感光微粒的濃度一般控制在30-100ug/ml，可以為30-100ug/ml，優(yōu)選60ug/ml。上述方法中，初始反應溶液的體積無特殊限制，可以為30—75ul，優(yōu)選75ul;最終反應溶液的體積也無特殊限制，可以為100—250ul，優(yōu)選250ul。上述樣品包括血清、血漿和全血。本發(fā)明是采用光激化學發(fā)光檢測技術，測定人血清樣品中乙型肝炎e抗原(HBeAg)的定量及定性體外診斷試劑盒，可以與其它血清和臨床信息聯(lián)合用于診斷個體發(fā)生急性或慢性乙型肝炎感染的情況，也可用于對圍產(chǎn)期女性乙型肝炎的篩選，.以判斷新生兒感染乙型肝炎的危險性。本發(fā)明與檢測對象相近的乙型肝炎e抗原(HBeAg)酶免法試劑盒在方法學上比較，酶免法以OD值體現(xiàn)樣本檢測值，OD值可檢測范圍窄，僅可做定性檢測，且靈敏度低。本發(fā)明的試劑盒采用光激化學發(fā)光法測定標本中的HBeAg，具有靈敏度高、檢測范圍寬等特點，在方法學上較酶免法能達到更高的靈敏度和更優(yōu)的檢測范圍。圖l:光激化學發(fā)光免疫技術原理圖微粒結合形成二聚體，產(chǎn)生光子信號圖2:光激化學發(fā)光免疫技術原理圖未結合微粒，無光子信號產(chǎn)生圖3:單線態(tài)氧隨微粒間距離衰減，在大概600nm的距離，基本沒有單線氧的存在，因此也不發(fā)光附圖標記FGBEAD:發(fā)光微粒，內含發(fā)光分子；GGBEAD:感光微粒，內含感光分子；SingletOxygen:單線態(tài)氧，活性氧離子；A/B:兩者可直接或間接特異結合的活性分子。如在雙抗夾心檢測中，A，B為針對靶分子C不同的表位的單克隆抗體具體實施方式下面結合實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。實驗中儀器原料來源及試劑配方原料及試劑廠家Biotin-X-X-NHSSigmaTLX》95%BSAEquitech/proteasefreeGlySigma>95%HEPES華美TrisSigmaNaBH3CNAcrosAvidinPierGe抗-HBe廈門波生生物有限責任公司感光微粒發(fā)光微粒美國PentaTek公司美國PentaTek公司儀器粒徑儀酶標儀紫外可見分光光度計熒光分光光度計'光激化學發(fā)光分析系統(tǒng)型號Model370MultiS薩MK3752PF95廠家Nicomplabsystem上海光譜有限公司上海棱光技術有限公司博陽生物/上海北濱光子實施例1抗-HBe抗體包被的發(fā)光微粒的制備制備方法-1)發(fā)光微?；鞈乙禾幚砦∫欢康陌l(fā)光微粒于高速冷凍離心機中離心，棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲破碎至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調節(jié)發(fā)光微粒濃度至100mg/ml。2)抗體處理抗一HBe于0.05MpH6.0的MES緩沖液(以下簡稱MES緩沖液)透析，透析完成后測定濃度，并調節(jié)濃度至8mg/ml。3)MES緩沖液、100mg/ml的發(fā)光微?；鞈乙?MES緩沖液)和8mg/ml的抗一HBe(MES緩沖液)以及，以l:2:5的體積比進行混合，迅速混勻，得到反應液。4)用MES緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應液1:25的體積比加入，迅速混勻，37'C旋轉反應48小時。5)MES緩沖液配制75mg/ml的Gly溶液'以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應液2:1:IO的體積比加入上述溶液中，混勻，37。C旋轉反應2小時。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應液體積比為5:8，迅速混勻，37'C旋轉反應16小時。6)用MES緩沖液離心清洗三次，最后用發(fā)光試劑緩沖液進行懸浮，測定粒徑和固含量，調節(jié)濃度至10mg/ml。參照前述1)的制備方法制備抗-HBe抗體包被的發(fā)光微粒，并通過各項性能測試比較從以下幾方面進行了具體工藝條件的選擇研究研究中涉及的各個參數(shù)的檢測方法如下1.光信號檢測方法在反應孔中分別加入樣品，再依次加入發(fā)光試劑(50ug/ml)和25W生物素化抗體試劑(按實施例4的方法制備，4ug/ml)。然后放入儀器(光激化學發(fā)光分析系統(tǒng))，由儀器自動按以下步驟操作振動，37'C溫育20.分鐘，再自動加入175W親和素包被的感光微粒試劑(按實施例4的方法制備，60ug/ml)后37'C溫育15分鐘。儀器自動產(chǎn)生激光照射微孔計算每孔發(fā)光光子量。2.靈敏度檢測方法檢測靈敏度參考品(編號L1-13、L2-l3、L3-l3)光信號，均需檢出所要求的企業(yè)靈敏度參考品(需檢出Ll-2;L2-2;L3-2)。Ll-l3、L2-13、L3-l3配方選取了3份不同來源的血清標本，經(jīng)檢測HCV、HIV均為陰性，HBeAg經(jīng)ABBOTT公司試劑盒檢測確認為陽性，分別按照比例稀釋后得到3個標本系列<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>結果表明按上述比例稀釋后組成的3個標本系列為弱陽性標本，可用于試劑盒靈敏度的考核。以l財示本的l:1024-1:256、2財示本的1:512-1:128、3財示本的1:512-1:128組成的3個標本系列作為公司內部靈敏度參考品(編號L1-13、L2-l3、L3-l3)。3.特異性檢測方法檢測20份特異性參考品光信號，不得檢出假陽性，無假陽性則記為20/20。特異性參考品配方:從收集的HBeAg陰性標本中選取20份，組成特異性參考品，編號N_01N-20。標本選擇時既包括了健康人標本，也包括了.的較易引起假陽性的特殊人群標本。其具體組成如下<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>4.Hook檢測檢測HBeAg濃度分別為1400PEIU/ml、2800PEIU/ml、5600PEIU/ml、11200PEIU/ml的樣本光信號，結果應大于60.0PEIU/ml。5.精密性檢測方法-檢測HBeAg濃度分別為0.5PEIU/ml和5.0PEIU/ml的質控品光信號，每個濃度做10孔重復測定，代入公式，計算CV值。低濃度的精密性測定表示為QCL，高濃度的精密性測定表示為QCH。工藝條件選擇-a.反應pH值其它反應條件25mg/ml的發(fā)光微粒反應濃度，10:2的FG-bead與抗-HBe質量比，離心法清洗pH5.0:0.05MMES緩沖反應體系中有明顯的微粒聚集現(xiàn)象，故不采用此反應條件。pH7.0:0.1MPB緩沖體系的HBeAg檢測比p服.0的MES緩沖體系稍差。pH6.0:0.05MMES.緩沖體系反應正常，HBeAg檢測比其它pH的MES緩沖體系稍好，故選擇0.05Mp服.0的MESbuffer作為反應緩沖液。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>b.發(fā)光微粒在反應液中的濃度其它反應條件0.05MpH6.0的MESbuffer作為反應緩沖液，10:2的FG-bead與抗-HBe的質量比，離心法清洗<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>10mg/ml反應濃度時，靈敏度不佳。選擇25mg/ml的發(fā)光微粒反應濃度為宜。c.發(fā)光微粒與抗體的反應比例<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>綜合考慮靈敏度和QC結果、檢測結果及成本問題，選擇10mgFG-bead與2mg抗-HBe反應條件。d.清洗方式其它反應條件，0.05MpH6.0的MESbuffer作為反應緩沖液，25mg/ml的發(fā)光微粒反應濃度，5:l的FG-bead與抗-HBe比例。透析法清洗步驟IOO倍體積透析，每次4-5小時，更換緩沖液4次。透析清洗操作時間較長，透析過程中微粒損失較多。離心法清洗步驟12000rpm離心30分鐘，清洗4次。離心法清洗的離心力會使發(fā)光微粒暫時聚集，但經(jīng)過超聲處理很容易可再次分散打開。且操作時間短，收率較高?？紤]到生產(chǎn)周期以及生產(chǎn)成本，決定采用此種清洗方式。最終選擇250nm的粒徑，發(fā)光量為》250，000光子數(shù)/100ug的發(fā)光微粒，0.05Mp服.0的MESbuffer作為反應緩沖液，25mg/ml的發(fā)光微粒反應濃度，5:l的FG-bead與抗-HBe比例，離心法清洗作為最優(yōu)制備條件。實施例2生物素標記抗體的制備制備方法1)抗體處理將抗-HBe透析于0.1MNaHCO3溶液，測定抗體濃度并調節(jié)至lmg/ml。2)用DMSO配制16.17mg/ml的Biotin溶液。3)標記取處理好的hng/ml抗-HBe標記抗體與配制好的Biotin溶液，二者按照10000:54的體積比進行混合，迅速混勻。28'C靜置反應12^16小時。4)透析將反應好的生物素標記抗體透析于生物素標記透析緩沖液(pH8.00)。5)將透析好的生物素化抗體吸出轉移至干凈離心管中，取樣測定抗體濃度。將質檢合格的生物素標記抗體濃度調節(jié)至0.5mg/ml。將抗體與Biotin按照不同比例進行反應并進行檢測光信號檢測方法在反應孔中分別加入25W樣品，再依次加入25W發(fā)光試劑(按實施例1的方法制備，100ug/ml濃度)和生物素化抗體試劑(6ug/ml濃度)。然后放入儀器(光激化學發(fā)光分析系統(tǒng))，由儀器自動按以下步驟操作振動，37'C溫育15分鐘，再自動加入175W親和素包被的感光微粒試劑(按實施例3的方法制備，60ug/ml濃度)后37。C溫育15分鐘。儀器自動產(chǎn)生激光照射微孔計算每孔發(fā)光光子量。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>'標記比例越高，與實際測定比例之間的偏差越大。從靈敏度及Hookeffect等方面進行考慮，認為優(yōu)選30:l的比例。實施例3親和素包被的感光微粒的制備感光微粒采用粒徑為220土40nm的感光微粒(美國PentaTek公司)制備方法a、感光微?；鞈乙禾幚砦∫欢康母泄馕⒘Ｓ诟咚倮鋬鲭x心機中離心，棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲細胞破碎儀上超聲至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調節(jié)感光微粒濃度至100mg/ml。b、親和素溶液配制稱量一定量Avidin，加MES緩沖液溶解至8mg/ml。c、混合將處理好的感光微?；鞈乙?、8mg/ml的Avidin以及MES緩沖液，以2:5:1的體積比進行混合，迅速混勻，得到反應液。d、反應MES緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應液1:25的體積比加入，迅速混勻。37'C旋轉反應48小時。e、封閉MES緩沖液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應液2:1:10的體積比加入上述溶液中，混勻，37t:旋轉反應2小時'。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應液體積比為5:8，迅速混勻，37"C旋轉反應16小時。f、清洗向反應好的溶液中加入MES緩沖液，高速冷凍離心機離心，棄上清，加入新鮮MES緩沖液超聲法重新懸浮，再次離心，如此清洗3次，最后用少量的感光試劑緩沖液進行懸浮，測定固含量，用感光試劑緩沖液調節(jié)濃度至10mg/ml。-實施例4臨床cutoff點確定試劑配制1.發(fā)光抗體緩沖液pH8.0成分為HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H20的HEPES緩沖液，添加BSA及100U/ml慶大霉素和質量百分比為萬分之五Proclin300。2.生物素標記抗體緩沖液pH8.0的成分為Tris、NaCl和EDTA-Na-2H20的Tris緩沖液，添加BSA及l(fā)OOU/ml慶大霉素和質量百分比為萬分之五Proclin300。'3.抗-HBe抗體包被的發(fā)光微粒試劑采用實施例l的方法，選擇250nm的粒徑，發(fā)光量為》250,000光子數(shù)/100ug的發(fā)光微粒，0.05Mp服.0的MESbuffer作為反應緩沖液，25mg/ml的發(fā)光微粒反應濃度，5:1的FG-bead與抗-HBe比例，離心法清洗制得抗-HBe抗體包被的發(fā)光微粒。將抗體包被的發(fā)光微粒用發(fā)光抗體緩沖液調節(jié)濃度至10mg/ml。4.生物素標記抗體試劑采用實施例2的方法，抗體與Biotin按照30:1的比例制得生物素標記抗體。將生物素標記抗體用生物素標記抗體緩沖液調節(jié)濃度至0.5mg/ml。5.親和素包被的感光微粒試劑由實施例3的方法制得親和素包被的感光微粒，將親和素包被的感光微粒用感光試劑緩沖液調節(jié)濃度至10mg/ml。光信號檢測方法在反應孔中分別加入25W樣品，再依次加入254發(fā)光試劑和25W生物素化抗體試劑。然后放入儀器(光激化學發(fā)光分析系統(tǒng))，由儀器自動按以下步驟操作振動，37'C溫育20分鐘，再自動加入175W親和素包被的感光微粒試劑后37'C溫育15分鐘。儀器自動產(chǎn)生激光照射微孔計算每孔發(fā)光光子量。根據(jù)對1042個正常非乙型肝炎患者的血樣進行檢測的結果，99%的樣品HBeAg水平小于0.1PEIU/ml，所以我們可以認為0.1PEIU/ml是本試劑的臨床cutoff點。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例5陰性、陽性對照、參考樣及定標品的制備1.HBeAg陰性對照新生牛血清。2.HBeAg陽性對照使用Paul-Ehrlich-Institute(Virologicalstandards10/2001)出品的乙型肝炎e抗原定量參考品以新生牛血清為稀釋液配制濃度為6PEIU/ml的溶液作為陽性對照。3.參考樣品根據(jù)實施例4對臨床cutoff點的研究，使用Paul-Ehrlich-Institute(Virologicalstandards10/2001)出品的乙型肝炎e抗原定量參考品以新生牛血清為稀釋液配制濃度為0.10PEIU/ml的樣品作為參考樣。4.定標品使用Paul-Ehrlich-Institute(Virologicalstandards10/2001)出品的乙型肝炎e抗原定量參考品以新生牛血清為稀釋液，按照濃度0PEIU/ml，0.3PEIU/ml，.2.0PEIU/ml，8.OPEIU/ml,20.0PEIU/ml，60.0PEIU/ml配制6個定標品。實施例6乙型肝炎e抗原定性及定量檢測1.基本檢測模式首先向反應孔中分別加入樣品，再依次加入發(fā)光試劑(抗體包被的發(fā)光微粒)和生物素標記抗體。然后放入儀器(光激化學發(fā)光分析系統(tǒng))，由儀器自動按以下步驟操作振動，37D溫育。再自動加入親和素包被的感光微粒后37'C再次溫育。溫育結束后儀器自動產(chǎn)生激光照射微孔計算每孔發(fā)光光子量。2.標準曲線的獲得'按上述方法檢測各個定標品的發(fā)光光子量，將測得的光信號值與相應的定標品濃度采用cubicspline擬和作圖即得，標準曲線呈線性。3.定量檢測在定量測定中，根據(jù)標準曲線，按樣本實測光信號值計算每一個樣本的HBeAg含量，單位是PEIU/ml。4.定性檢測在定性測定中，檢測參考樣品的光信號值計，計算每一個樣本的S/C0(即待測樣品光信號值與HBeAg參考樣品光信號的比值)，當S/C0^1時待測樣品被判定為陽性，當S/C0<1時待測樣品被判定為陰性。檢測陰陽對照的光信號，如檢測結果出錯，則檢測無效，需重新檢測。5.檢測條件的優(yōu)化試驗5.l溫育時間的確定試驗材料采用實施例4的方法制備抗體包被的100ug/ml的發(fā)光微粒試劑(下簡稱發(fā)光抗體試劑)和6ug/ml的生物素標記抗體試劑，及100ug/ml的親和素包被的感光微粒試劑檢驗樣本靈敏度參考品和質控品QcL，QcH。初始反應條件加樣量為樣品10ul，發(fā)光微粒試劑10ul，生物素標記抗體試劑10ul，親和蘇包被的感光微粒試劑為75ul，兩步溫浴。5.1.1第一步溫育時間的確定第一步溫育時間分別為10min、30min、60min、120min，第二步溫育時間為20min對檢驗樣本進行檢測，分別考察靈敏度、特異性、準確性、精密度等指標。結果見下表-<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>對上述結果進行分析比較，在初始條件下，第一步溫育時間為10-120min均可，根據(jù)結果當?shù)谝粶卦r間大于30min后，結果己經(jīng)趨于穩(wěn)定。第一步溫育時間分別為10min、15min、20rain、30min，第二步溫育時間為20min對檢驗樣本進行檢測，分別考察靈敏度、特異性、準確性、精密度等指標。結果見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>根據(jù)上述結果，當?shù)谝徊綔卦r間為20min時，反應已經(jīng)完全，結果趨于穩(wěn)定，因此確定第一溫浴時間為20min。5.1.2第二步溫育時間的確定第一步溫育時間為20min，第二步溫育時間分別為10min、30min、60min、120min對檢寧樣本進行檢測，分別考察靈敏度、特異性、準確性、精密度等指標。結果見下表'<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>對上述結果進行分析比較，在初始條件下，第一溫浴時間為20min，當?shù)诙綔赜龝r間可以為10-120min，其中當?shù)诙卦r間大于30min后，結果趨于穩(wěn)定。第一步溫育時間為20min，第二步溫育時間分別為10min、15min、20min、30min對檢'驗樣本進行檢測，分別考察靈敏度、特異性、準確性、精密度等指標。結果見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>根據(jù)上述結果，當?shù)诙綔卦r間為20min時，反應巳經(jīng)完全，結果趨于穩(wěn)定，因此.確定第二溫浴時間為如min。5.2加樣模式的考察試驗材料采用實施例4的方法制備抗體包被的100ug/ml的發(fā)光微粒試劑(下簡稱發(fā)光抗體試劑)和6ug/mlde生物素標記抗體試劑，及100ug/ml的親和素包被的感光微粒試劑檢驗樣本靈敏度參考品和質控品QcL，QcH。初始反應條件依次添加樣品、發(fā)光微粒試劑、生物素標記抗體試劑、親和素包被的感光微粒，兩步溫浴，其中第一溫浴時間為20min,第二溫浴時間為15min。設計了三種加樣模式進行考察。模式l:10ul樣品+10ul發(fā)光抗體試劑+10ul生物素化抗體試劑+70ul親和素包被的感光微粒試劑；模式2:15ul樣品+15ul發(fā)光抗體試劑+15ul生物素化抗體試劑+105ul親和素包被的感光微粒試劑；模式3:25ul樣品+25ul發(fā)光抗體試劑+25ul生物素化抗體試劑+175ul親和素包被的感光微粒試劑。在初始條件下相同的情況下，按照以上三種加樣模式對企業(yè)內控品進行檢測，分別考察靈敏度、特異性、準確性、精密度等指標。結果見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>對上述結果進行分析比較，在其余條件相同的情況下，并考慮到手工加樣樣品量過小會造成不便于操作的'影響以及更容易產(chǎn)生誤差，所以優(yōu)選模式3。5.3發(fā)光抗體、生物素化抗體、親和素包被的感光微粒濃度的篩選試驗材料采用實施例4的方法制備抗體包被的發(fā)光微粒試劑(下簡稱發(fā)光抗體試劑)和生物素標記抗體試劑，及親和素包被的感光微粒試劑檢驗樣本靈敏度參考品和質控品QcL，QcH。初始反應條件依次添加25ul樣品、25ul發(fā)光微粒試劑、25ul生物素標記抗體試劑、175ul親和素包被的感光微粒，兩步溫浴，其中第一溫浴時間為20min，第二溫浴時間為15min。5.3.1發(fā)光抗體和生物素化抗體濃度的初篩親和素包被的感光微粒采用100ug/ml的濃度，分別配制濃度為50ug/ml、150ug/ml、300ug/ml的發(fā)光抗體以及濃度為2ug/ml、6ug/ml、12ug/ml的生物素化抗體交叉配對進行檢測，在初始條件下結果分別如下-50ug/ml發(fā)光抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>150ug/ml發(fā)光抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>300ug/ml發(fā)光抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>對上述結果進行分析比較，發(fā)光抗體的濃度在50ug/m1-150ug/ral之間，生物素化抗體的濃度在2ug/ml-6ug/ml之間結果較為理想。5.3.2發(fā)光抗體和生物素化抗體濃度的精篩根據(jù)初篩的結果分別配制濃度為50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml的發(fā)光抗體以及濃度為2ug/ml、4ug/ml、6ug/ml的生物素化抗體交叉配對迸行檢測，結果分別如下50ug/ml發(fā)光抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>對上述結果進行分析比較，發(fā)光抗體的濃度在50ug/ml，生物素化抗體的濃度在4ug/ml時結果最為理想。5.3.3親和素包被感光微粒濃度的篩選發(fā)光抗體濃度選用50ug/ml，生物素化抗體的濃度選用4ug/ml，親和素包被的感光微粒濃度分別配制為30ug/ml，60ug/ml，1Q0ug/ml，在初始反應條件<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>根據(jù)靈敏度比較，QcL和QcH的測定濃度及CV分析，親和素包被的感光微粒濃度在60ug/ml時結果最為理想。綜上所述，發(fā)光微粒濃度采用50ug/ml，生物素標記的抗體濃度采用4ug/ml，親和素包被的感光微粒濃度在60ug/ml時的結果最為理想。實施例7評價試驗.試劑采用實施例4的方法制備發(fā)光抗體試劑(濃度50ug/ml)、生物素標記抗體試劑(濃度為4ug/ml)及親和素包被的感光微粒試劑(濃度為60ug/ml)。檢測方法在反應孔中分別加入25W樣品，再依次加入發(fā)光試劑和25W生物素化抗體試劑。然后放入儀器，由儀器自動按以下步驟操作振動，37'C溫育20分鐘，再自動加入親和素包被的感光微粒試劑后37'C溫育15分鐘。儀器自動產(chǎn)生激光照射微孔計算每孔發(fā)光光子量，根據(jù)標準曲線可以推算樣品HBeAg濃度，單位是PEIU/ml，也可以根據(jù)S/CO值判斷樣品的陰陽性，最后打印試驗報告。1.定量模式性能評價1.1檢測范圍在3個臨床試驗點對1042個正常非乙型肝炎患者的血樣進行檢測，99%的樣品HBeAg水平小于0.10PEIU/ml。而高濃度HBeAg水平的病人樣品可導致RLU(相對光子單位)的反常性下降(即高滴度的鉤帶效應)。在本測定方法中，HBeAg水平高達5600PEIU/ml的病人樣品的檢測結果將大于60PEIU/ml。因此確定檢測范圍為0.卜60.OPEIU/ml。1.2靈敏度的檢測對靈敏度參考品(編號L1-13、L2-13、'L3-13)，均需檢出所要求的靈敏度參考品(要求檢出L1-2;L2-2;L3-2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>1.3特異性的檢測檢測20份特異性參考品，不得檢出假陽性。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>2.3線性的檢測對除0值外其他5點定標品(實施例5制備)做線性分析，計算線性相關系數(shù)r(r應大于0.99)，r=0.9998。2.4精密性的檢測分別采用2個批號的試劑對高、低2個水平的乙肝e抗原質控品進行檢測，重復10次，將結果數(shù)值代入公式，計算CV值<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>2.5Hook試驗檢測濃度1400PEIU/ml.2800PEIU/ml5600PEIU/ml11200PEIU/ml測定值(PEIU/ml)81.9576.7669.9265.78由上述結果確定雖然本產(chǎn)品在HBeAg濃度11200PEIU/ml時測定結果依然大于60.0PEIU/ml，但結果己經(jīng)與60.0PEIU/ml比較接近，在HBeAg濃度5600PEIU/ml時，檢測結果將大于60.0PEIU/ml。'2.6干擾性試驗在一份己知濃度的臨床標本中添加血紅蛋白、甘油三酯及膽紅素制成250mg/dL血紅蛋白的溶血標本、500mg/dL甘油三酯的脂血標本及10mg/dL膽紅素的黃疸標本進行檢測，測定值與原濃度的偏差不得超過10%。領u定值理論值偏差率(％)溶血標本24.4226.06-6.3脂血標本27.1326.064.1黃疸標本'28.0026.067.42.定性模式檢測使用靈敏度參考品、特異性參考品以及陰陽性對照對定性模式下的試劑進行檢測靈敏度(s/co)Ll-2+L2-2+L3-2+特異性符合率20/20陰性對照(s/co)均值0.57cv(%)-4.51陽性對照(s/co)均值2.37cv(%)3.69由上述結果確定本產(chǎn)品在定性模式下靈敏度、特異性、精密性等指標均能達到要求。.實施例8比較試驗試劑采用賣施例4的方法制備發(fā)光抗體試劑(50ug/ml)、生物素標記抗體試劑(4ug/ml)及親和素包被的感光微粒試劑(60ug/ml)。以美國Abbott公司HBeAg試劑盒(磁性微粒發(fā)光系統(tǒng))為參照進行了質量水平比較，所用標本為前述靈敏度參考品，結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>根據(jù)以上結果,本公司試劑盒的最低檢出率與特異性己和Abbott公司的產(chǎn)品基本相當。實施例9試劑盒的組配將實施例l一3中按照各種方法制備的三種試劑分別獨立包裝，組配后獲得基本試劑盒?？捎糜跈z測待測樣本的光激化學反應光信號。在上述試劑盒中加入分別獨立包裝的實施例5配制的陰性、陽性對照及參考樣后獲得定性檢測試劑盒。可用于定性檢測乙型肝炎e抗原。在上述試劑盒中加入獨立包裝的實施例5配制的定標品后獲得定量檢測試劑盒?？捎糜诙繖z測乙型肝炎e抗原。權利要求1.一種用于檢測乙型肝炎e抗原的檢測微粒，為抗-HBe抗體包被的發(fā)光微粒。2.如權利要求l所述用于檢測乙型肝炎e抗原的檢測微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒粒徑為50nm到400nm。3.如權利要求2所述用于檢測乙型肝炎e抗原的檢測微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒粒徑為150-300nm。4.如權利要求l所述用于檢測乙型肝炎e抗原的檢測微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒表面官能團選自羧基、醛基、胺基、環(huán)氧乙基或鹵代垸基。5.如權利要求4所述用于檢測乙型肝炎e抗原的檢測微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒表面官能團選自羧基或醛基。6.如權利要求l一5中任一權利要求所述用于檢測乙型肝炎e抗原的檢測微粒，其特征在于，所述抗-HBe抗體包被的發(fā)光微粒中，發(fā)光微粒與抗-HBe抗體的質量比例為10:0.2到10:10。7.如權利要求6所述用于檢測乙型肝炎e抗原的檢測微粒，其特征在于，所述抗-HBe抗體包被的發(fā)光微粒中，發(fā)光微粒與抗-HBe抗體的質量比例為10:1到10:4。8.—種定性或定量檢測乙型肝炎e抗原的方法，為采用雙抗體夾心法檢測乙型肝炎e抗原，包括將待測樣品和權利要求l一7中任一權利要求所述用于檢測乙型肝炎e抗原的檢測微粒，生物素標記的抗-HBe抗體，以及親和素包被的感光微?；旌线M行反應，而后用激發(fā)光照射反應孔，測量每個反應孔發(fā)光光子量獲得光信號值。9.如權利要求8所述定性或定量檢測乙型肝炎e抗原的方法，其特征在于，包括下列步驟1)在反應孔中加入待測樣品、權利要求l一7中任一權利要求所述用于檢測乙型肝炎e抗原的檢測微粒和生物素標記的抗-HBe抗體，獲得初始反應溶液，混合反應；2)再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應溶液進行反應；3)激發(fā)光照射反應孔，測量每個反應孔發(fā)光光子量獲得光信號值。10.如權利要求9所述定性或定量檢測乙型肝炎e抗原的方法，其特征在于，所述步驟l)和2)的反應條件為37t:溫育10—120分鐘。11.如權利要求10所述定性或定量檢測乙型肝炎e抗原的方法，其特征在于，所述步驟1)和2)的反應條件為37。C溫育10-30分鐘。12.如權利要求9所述定性或定量檢測乙型肝炎e抗原的方法，其特征在于，初始反應溶液中，所述檢測微粒的濃度為50—300ug/ml，生物素標記的抗-HBe抗體的濃度為2—12ug/ml，最終反應溶液中，所述親和素包被的感光微粒的濃度為30-100ug/ml。13.如權利要求12所述定性或定量檢測乙型肝炎e抗原的方法，其特征在于，初始反應溶液中，所述檢測微粒的濃度為50ug/ml-150ug/ml，生物素標記的抗-HBe抗體的濃度為2ug/ml_6ug/ml。14.如權利要求13所述定性或定量檢測乙型肝炎e抗原的方法，其特征在于，初始反應溶液中，所述檢測微粒的濃度為50ug/ml，生物素標記的抗-HBe抗體的濃度為4ug/ml，親和素包被的感光微粒的濃度為60ug/ml。15.如權利要求9所述定性或定量檢測乙型肝炎e抗原的方法，其特征在于，所述初始反應溶液的總體積為30—75ul，最終反應溶液的體積為].00—250ul。16.如權利要求、15所述定性或定量檢測乙型肝炎e抗原的方法，其特征在于，所述初始反應溶液的總體積為75ul，最終反應溶液的體積為250ul。17.如權利要求9一16中任一權利要求所述定性或定量檢測乙型肝炎e抗原的方法，其特征在于，當定量檢測乙型肝炎e抗原時，步驟3后還包括根據(jù)標準曲線計算待測樣品HBeAg含量。18.如權利要求9一16中任一權利要求所述定性或定量檢測乙型肝炎e抗原的方法，其特征在于，當定性檢測乙型肝炎e抗原時，所述步驟1中，反應孔中加入的為待測樣品或HBeAg參考樣，步驟3后還包括計算待測樣品光信號值與HBeAg參考樣光信號的比值，即S/CO值，當S/C0》1時待測樣品被判定為陽性，當S/C(X1時待測樣品被判定為陰性。19.如權利要求18所述定性檢測乙型肝炎e抗原的方法，其特征在于，所述HBeAg參考樣品為含有確定濃度乙型肝炎e抗原的溶液，確定濃度為乙型肝炎e抗原臨床cutoff點對應的乙型肝炎e抗原濃度。20.如權利要求l一7中任一權利要求所述用于檢測乙型肝炎e抗原的檢測微粒的制備方法，包括下列步驟1)將發(fā)光微粒與抗-HBe抗體按質量比例為10:(l—4)混合于緩沖液中獲得混合液；2)加入緩沖液配制的NaBH3CN溶液，混合并反應；3)加入緩沖液配制的Gly及NaBH3CN溶液，混勻反應后，再加入牛血清白蛋白溶液.封閉；4)清洗產(chǎn)物，獲得抗-HBe抗體包被的發(fā)光微粒。21.如權利要求20所述用于檢測乙型肝炎e抗原的檢測微粒的制備方法，其特征在于，在步驟l)中，發(fā)光微粒與抗HBe抗體的質量比例為5:1。22.如權利要求20所述用于檢測乙型肝炎e抗原的檢測微粒的制備方法，其特征在于，在'步驟l)中，發(fā)光微粒在混合液中的濃度為25mg/ml。23.如權利要求20所述用于檢測乙型肝炎e抗原的檢測微粒的制備方法，其特征在于，在步驟4)中，清洗方法為離心法。24.—種乙型肝炎e抗原的檢測試劑盒，包括權利要求l一7中任一權利要求所述用于檢測乙型肝炎e抗原的檢測微粒，生物素標記的抗-HBe抗體，以及親和素包被的感光微粒。25.如權利要求24所述乙型肝炎e抗原的檢測試劑盒，其特征在于，所述生物素標記的抗-HBe抗體中，生物素與抗體的分子比例為(5—50):1。26.如權利要求25所述乙型肝炎e抗原的檢測試劑盒，其特征在于，所述生物素標記的抗-HBe抗體中，生物素與抗體的分子比例為30:1。27.如權利要求24所述乙型肝炎e抗原的檢測試劑盒，其特征在于，所述親和素包被的感光微粒中，親和素與感光微粒的質量比例為1:5。28.如權利要求24—27中任一權利要求所述乙型肝炎e抗原的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測微粒、生物素標記的抗-HBe抗體和親和素包被的感光微粒分別獨立包裝。29.如權利要求28所述乙型肝炎e抗原的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測微粒、生物素標記的抗-HBe抗體和親和素包被的感光微粒均為混懸液。30.如權利要求29所述乙型肝炎e抗原的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測微?；鞈乙旱娜軇镠EPES緩沖液。31.如權利要求29所述乙型肝炎e抗原的檢測試劑盒，其特征在于，所述生物素標記的抗-HBe抗體混懸液的溶劑為Tris緩沖液。32.如權利要求29所述乙型肝炎e抗原的檢測試劑盒，其特征在于，所述親和素包被的感光微?；鞈乙旱娜軇镠EPES緩沖液。33.如權利要求29所述乙型肝炎e抗原的檢測試劑盒，其特征在于，所述混懸液的溶劑中還含有蛋白保護劑、防止微粒聚集的穩(wěn)定試劑或防腐劑中的一種或多種。34.如權利要求33所述乙型肝炎e抗原的檢測試劑盒，其特征在于，所述蛋白保護劑為BSA，防止微粒聚集的穩(wěn)定試劑為Tween20，防腐劑為慶大霉素和Proclin300。35.如權利要求28—34中任一權利要求所述乙型肝炎e抗原的檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中還包括獨立包裝的定標品，所述定標品為含有不同濃度的乙型肝炎e抗原的溶液。36.如權利要求28—34中任一權利要求所述乙型肝炎e抗原的檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中還包括獨立包裝的參考樣品，所述參考樣品為含有確定濃度乙型肝炎e抗原的溶液，確定濃度為乙型肝炎e抗原臨床cutoff點對應的乙型肝炎e抗原濃度。全文摘要本發(fā)明涉及乙肝的診斷試劑，公開了一種乙型肝炎病毒e抗原檢測微粒，為抗-HBe抗體包被的發(fā)光微粒。本發(fā)明還公開了上述乙型肝炎病毒e抗原檢測微粒的制備及應用。此外，本發(fā)明又進一步公開了一種測定人血清樣品中乙型肝炎e抗原(HBeAg)的體外診斷試劑盒，同時公開了利用光激化學發(fā)光原理定量及定性檢測乙型肝炎病毒e抗原的方法。本發(fā)明的試劑盒，可以與其它血清和臨床信息聯(lián)合用于診斷個體發(fā)生急性或慢性乙型肝炎感染的情況，也可用于對圍產(chǎn)期女性乙型肝炎的篩選，以判斷新生兒感染乙型肝炎的危險性。文檔編號G01N33/544GK101251540SQ20081003519公開日2008年8月27日申請日期2008年3月26日優(yōu)先權日2008年3月26日發(fā)明者張向輝,王海蛟,趙衛(wèi)國申請人:博陽生物科技(上海)有限公司