專利名稱：：一種準(zhǔn)確、快速檢測(cè)黃曲霉毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種準(zhǔn)確、快速檢測(cè)黃曲霉毒素的方法，屬于生物工程中免疫酶
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：黃曲霉毒素(簡(jiǎn)稱AFT)是一種真菌毒素，是由真菌黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的一種強(qiáng)毒性的次生代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已査明凡能孽生黃曲霉真菌的物質(zhì)，如糧食、油料作物的種子、水果、干果、蔬菜、調(diào)味品、煙草、黃麻、乳類、乳制品、肉類、魚奸類、發(fā)酵品類和飼料中均有AFT的污染。AFT理化性質(zhì)非常穩(wěn)定，在高溫20(TC及紫外線照射下，都不被破壞而且通過食物鏈的作用能從一種生物體轉(zhuǎn)移到另一種生物體內(nèi)，凡殘留在家禽、家畜的肉、內(nèi)臟、蛋、奶中毒素可隨食物進(jìn)入人體導(dǎo)致人類中毒或致癌，據(jù)世界衛(wèi)生組織及上海市腫瘤研究所等有關(guān)部門報(bào)導(dǎo)黃曲霉毒素是引起肝癌的首位致癌因素，因此世界上許多國(guó)家對(duì)食品中黃曲霉毒素允許量都做了嚴(yán)格的限制。我國(guó)規(guī)定詞料和食品中黃曲霉毒素的允許值分別小于50PPb和20PPb，這就要求測(cè)定方法要有很高靈敏度。目前測(cè)定方法大致有化學(xué)分析法、儀器分析法、生物鑒定法以及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。化學(xué)分析法中以薄層層析法最為常用，也作為我國(guó)對(duì)食品、詞料中黃曲霉毒素測(cè)定的國(guó)標(biāo)法，其檢測(cè)限為l-5PPb，但其檢測(cè)時(shí)必須要用己知黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，必要時(shí)通過用生物法作補(bǔ)充證實(shí)。儀器分析法一般用高效薄層層析掃描儀或高效液相色譜法，其自動(dòng)化程度高分辨率好，但儀器較昂貴，技術(shù)水平要求高，難以普及推廣應(yīng)用。生物鑒定法由于特異性較差，靈敏度低，一般只作化學(xué)分析法的補(bǔ)充驗(yàn)證。以上三種方法樣品前處理都較復(fù)雜，要提取與凈化，排除樣品中其它物質(zhì)干擾以致特異性不強(qiáng)。美國(guó)拉韋林(Lawellin)首先提出酶聯(lián)免疫吸附分析法來測(cè)定黃曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的結(jié)構(gòu)I^(羧甲基肟)來定性、定量黃曲霉毒素含量。目前國(guó)內(nèi)外都以黃曲霉中毒性最強(qiáng)的結(jié)構(gòu)B,做為檢控主要對(duì)象。由于此法特異性高，分析時(shí)間短，受到廣泛的重視，后來有人又研究出用酶聯(lián)免疫吸附分析法的"藥盒"，一盒試劑可測(cè)多個(gè)檢測(cè)樣品，"藥盒"在美國(guó)有購(gòu)買，但價(jià)格也比較昂貴。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種使用簡(jiǎn)易、價(jià)廉、一體化的準(zhǔn)確、快速檢測(cè)黃曲霉毒素的方法。為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種準(zhǔn)確、快速檢測(cè)黃曲霉毒素的方法，其特征在于，其方法為一.標(biāo)準(zhǔn)試樣制備第一步，制備黃曲霉毒素AFB,抗體包被反應(yīng)板將抗黃曲霉毒素AFBt多克隆抗體用50ramol/L—100mmol/L，Na2C03-NaHC03PH9.6緩沖液稀釋至3_5Pg/ml的包被液，加入到反應(yīng)板的48或96孔的試管中，每孔加100—110叱，3"C—5。C冰箱放置過夜，棄去包被液沖洗2次一4次，每孔中加200—250化含1%牛血清白蛋白BSA的100—110mmol/L、ffl7.4磷酸鹽PBS緩沖液封閉35。C一40。C放2—4小時(shí)，棄其封閉液，將包被板真空包裝后置-15T:—-25t:冷凍保存；第二步，制備酶標(biāo)抗原取0.5lmg黃曲霉毒素Bi—羧甲基肟AFB「omixe溶于20%乙醇溶液中，加入20-50mg乙二胺3.3-二甲胺丙基碳化二亞胺鹽酸鹽EDCHCL攪拌反應(yīng)30分鐘一60分鐘，再以磷酸鹽PBS0.01M、ffl7.4溶液透析2天一4天，得到酶標(biāo)抗原原液；第三步，制備黃曲霉毒素AFBi標(biāo)準(zhǔn)溶液將10%-20%甲醇的磷酸鹽PBSPH7.4溶液為溶劑，配制0.lng/ml—10ng/ml的AFB^示準(zhǔn)系列溶液；第四步，制備樣品稀釋液在磷酸鹽PBSPH7.4溶液中加入l(m—2(^甲醇；第五步，制備酶標(biāo)抗原稀釋液在磷酸鹽PBSPH7.4溶液中加入0.05—0.2%的牛血清白蛋白BSA;第六步，制備洗滌液在磷酸鹽PBSPH7.4溶液中加入0.03。/。一0.07%的吐溫-20TW-20;第七步，制備底物液a:在乙酸鈉——檸檬酸緩沖液PH=5.0中加入0.1%—0.4%四甲基聯(lián)苯胺TMB;第八步，制備底物液b:在乙酸鈉一檸檬酸緩沖液PH=5.0中加入0.Ol—O.03%過氧化氫H202;第九步，制備終止液即2mol/L硫酸液；第十步，提取液即甲醇水為h1;二，檢測(cè)第一步，待測(cè)液前處理，稱取5g粉碎過20目篩的樣品于磨口的50ml試管中，加入提取液20—30ml，加塞振蕩5分鐘一10分鐘，過濾即為待測(cè)樣液；第二步，試劑準(zhǔn)備在標(biāo)準(zhǔn)試樣制備第二步準(zhǔn)備的酶標(biāo)抗原原液中加l一2ml酶標(biāo)抗原稀釋溶液，充分溶解，配成酵標(biāo)抗原工作溶液；第三步，試管編號(hào)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將反應(yīng)板框架上的試管編號(hào)，設(shè)定1號(hào)試管為儀器凋零試管，2-7號(hào)試管為黃曲霉毒素AFBi標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照試管，其余試管為樣品試管；第四步，依次加入配置好的溶液及待測(cè)樣液(1)，在1號(hào)試管中加入40—6(mL樣品稀釋液，在2-7號(hào)試管中分別加入黃曲霉毒素AFBi標(biāo)準(zhǔn)溶液40—60化，在其余試管中分別加入待測(cè)樣液；(2)，在1號(hào)試管中加入40—60叱酶標(biāo)抗原稀釋液，其余試管中分別加入40一60化酶標(biāo)抗原工作溶液，輕輕地振蕩，使各試管中的反應(yīng)物混勻；(3)，然后將反應(yīng)板放入35X:—4(TC恒溫培養(yǎng)箱中孵育20分鐘一40分鐘；(4)，取出反應(yīng)板，甩掉反應(yīng)液，拍干，每試管加入200PL—300叱洗滌液，放置1分鐘一3分鐘后，甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，重復(fù)洗板3—5次;(5)，在每試管中分別加入底物液a和底物液b各50叱，搖勻，將反應(yīng)板放入35。C一4(TC恒溫培養(yǎng)箱中，顯色10分鐘一20分鐘；(6)，取出反應(yīng)板，在每個(gè)試管中分別加入終止液40—60PL，用黃曲霉毒素測(cè)定儀在360mm-450mm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度A值；(7)，將測(cè)得的吸光度A值，黃曲霉毒素測(cè)定儀內(nèi)自動(dòng)建立方程A二MC+N回歸計(jì)算，計(jì)算待測(cè)樣品孔A值與A。n^的比值，査標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到相應(yīng)待測(cè)樣液濃度C的常用對(duì)數(shù)值LgC，對(duì)其求反對(duì)數(shù)，可求得待測(cè)樣液的AFB1濃度C，按下列公式計(jì)算出樣品中AFB1的含量AFB!含量(~/紐)=-式中C--一從標(biāo)準(zhǔn)曲線上査得的AFBi的含量(ng/ml)F-—樣品提取液體積(ml);仏-一樣品稀釋倍數(shù)；^-一樣品的質(zhì)量(g)所述的黃曲霉毒素測(cè)定儀包括單片機(jī)和穩(wěn)壓電源，所述的單片機(jī)分別與只讀存儲(chǔ)器、鍵盤、顯示器、隨機(jī)存儲(chǔ)器、接口和數(shù)碼轉(zhuǎn)換器連接，數(shù)碼轉(zhuǎn)換器通過前置放大器與模數(shù)轉(zhuǎn)換器連接，模數(shù)轉(zhuǎn)換器通過接口和打印驅(qū)動(dòng)與打印機(jī)連接，穩(wěn)壓電源通過光源與干涉濾光片連接，干涉濾光片通過樣品池與硅光電池連接，硅光電池與前置放大器連接。本發(fā)明先用含黃曲霉毒素特異抗體的免疫球蛋白附著于載體表面，含抗原溶液和酶標(biāo)記抗原溶液以不同比例混合，然后與致敏的載體表面保溫，再通過酶的特殊底物的水解量來確定未知液中是否有黃曲霉毒素及含量，酶底物水解量就由測(cè)定儀器進(jìn)行計(jì)數(shù)含量。物質(zhì)中的原子和分子所含能量以多種方法與相互作用而產(chǎn)生對(duì)光的吸收效應(yīng)，而物質(zhì)透光率變化與被測(cè)物質(zhì)濃度有一定的函數(shù)關(guān)系，在一定范圍內(nèi)它符合郎伯——比耳定律。因此在測(cè)定儀器內(nèi)計(jì)算機(jī)即可根據(jù)郎伯——比耳定律，設(shè)有一個(gè)線性回歸方程A=MC+N的計(jì)算程序，所以只要輸入標(biāo)準(zhǔn)試樣的濃度值或A二MC+N方程中M、N系數(shù)就可直接測(cè)定未知濃度試樣的濃度位置，測(cè)定波長(zhǎng)選擇范圍450mm360mm。本儀器微機(jī)采用8位機(jī)中最先進(jìn)的MCS—51系列單片機(jī)，操作者只要將自己要做的事通過鍵盤告訴單片機(jī)，單片機(jī)將各種處理結(jié)果通過顯示器或打印機(jī)告訴操作者。本發(fā)明的主要技術(shù)在于標(biāo)準(zhǔn)試樣的制備，這是黃曲霉毒素測(cè)定準(zhǔn)確性的關(guān)鍵，而標(biāo)準(zhǔn)試樣制備中關(guān)鍵技術(shù)為二個(gè)方面抗黃曲霉毒素I^抗體的制備和酶標(biāo)抗原的制備。1,抗黃曲霉毒素抗體的制備。此抗體必需具備高效應(yīng)、敏感、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，由于黃曲霉毒素是半抗原，不具有免疫原性，需首先制成復(fù)合抗原，然后利用抗原免疫家兔獲得含有抗體血清，經(jīng)過生化提純、分離含抗黃曲霉毒素AFB,抗體的免疫球蛋白，再將免疫球蛋白包被于載體上，并制成包被反應(yīng)板。2，酶標(biāo)記抗原的制備由于黃曲霉毒素(AFB》不能直接與酶結(jié)合，必須先將AFB,引入一個(gè)活性基團(tuán)，然后與酶反應(yīng)，使其具有酶的活性，能溶化底物的顯色反應(yīng)。辣根過氧化物酶(冊(cè)P)作為標(biāo)記抗原的酶，成功地合成了酶標(biāo)記抗原(AFB「0-HRP)滿足了酶聯(lián)免疫法(ELISA)中對(duì)酶標(biāo)記抗原中結(jié)合酶的要求。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.簡(jiǎn)便、快速本發(fā)明比化學(xué)分析法、儀器分析法、生物鑒定法前處理的提取和純化步驟簡(jiǎn)單，一次前處理僅花1020分鐘即可完成，樣品測(cè)定也僅需510分鐘可完成，比目前國(guó)標(biāo)法提高工作效率3040倍，而其結(jié)果與國(guó)標(biāo)法相吻合；2.準(zhǔn)確、靈敏度高本發(fā)明用儀器設(shè)備配套了試劑盒，其準(zhǔn)確性與靈敏度均比單試劑盒目測(cè)法要高、重復(fù)性也好，本發(fā)明限量檢測(cè)達(dá)5PPb、20PPb、50PPb，達(dá)到食品、詞料國(guó)家規(guī)定最小允許檢測(cè)量，最低限量為2.5Pg超過國(guó)標(biāo)法，其靈敏度是國(guó)標(biāo)法的160倍；3.價(jià)廉由于本發(fā)明是試劑與測(cè)定儀器一體化，其特異性、靈敏度、精確度均比國(guó)標(biāo)法高，而其成本卻大大低于國(guó)標(biāo)法，僅是國(guó)標(biāo)法的l/30;4、本發(fā)明比美國(guó)"試劑盒"的優(yōu)越性表現(xiàn)在①析速度更快、特異性增強(qiáng)、穩(wěn)定性有所提高。黃曲霉毒素B卜羧甲基肟最高產(chǎn)率達(dá)84%，AFB:抗體最高效價(jià)達(dá)1:800000，回收率在90%以上；②提高了標(biāo)記酶一辣根過氧化物酶與黃曲霉毒素交聯(lián)；由于選擇的交聯(lián)劑(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HC1))更有利于標(biāo)記酶一辣根過氧化物酶與黃曲霉毒素交聯(lián)使測(cè)定的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性加大、靈敏度提高，是國(guó)標(biāo)法靈敏度160倍；③保溫的時(shí)間與溫度控制更好，提高了檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性、精確度；④試劑與檢測(cè)儀器一體化生產(chǎn)，不但提高分析效率還降低了成本，適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。圖1為一種準(zhǔn)確、快速檢測(cè)黃曲霉毒素的方法程序流程圖；圖2為黃曲霉毒素測(cè)定儀結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為光路結(jié)構(gòu)圖4為黃曲霉毒素測(cè)定儀計(jì)算程序流程圖。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例如圖1所示，為一種準(zhǔn)確、快速檢測(cè)黃曲霉毒素的方法程序流程圖，一種準(zhǔn)確、快速檢測(cè)黃曲霉毒素的方法為一.標(biāo)準(zhǔn)試樣制備第一步，制備黃曲霉毒素AFBi抗體包被反應(yīng)板將抗黃曲霉毒素AFB!多克隆抗體用70mmol/L，Na2C03-NaHC03PH9.6緩沖液稀釋至4Pg/ml的包被液，加入到反應(yīng)板的48或96孔的試管中，每孔加100A，4T:冰箱放置過夜，棄去包被液沖洗3次，每孔中加200A含1%牛血清白蛋白BSA的100mraol/L、PH7.4磷酸鹽PBS緩沖液封閉37°C放3小時(shí)棄其封閉液將包被板真空包裝后置-2(TC冷凍保存；第二步，制備酶標(biāo)抗原取lmg黃曲霉毒素Bi——羧甲基肟AFB「omixe溶于20%乙醇溶液中加入30mg乙二胺3.3-二甲胺丙基碳化二亞胺鹽酸鹽EDCHCL攪拌反應(yīng)40分鐘，再以磷酸鹽PBSO.OIM、PH7.4溶液透析3天，得到酶標(biāo)抗原原液；第三步，制備黃曲霉毒素AFBd示準(zhǔn)溶液將20%甲醇的磷酸鹽PBSPH7.4溶液為溶劑配制0.lng/ml10ng/ml的AFB,標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；第四步，制備樣品稀釋液在磷酸鹽PBSPH7.4溶液中加入2(^甲醇；第五步，制備酶標(biāo)抗原稀釋液在磷酸鹽PBSPH7.4溶液中加入0.1%的牛血清白蛋白BSA;第六步，制備洗滌液在磷酸鹽PBSra7.4溶液中加入0.05%的吐溫-20TW-20;第七步，制備底物液a:在乙酸鈉——檸檬酸緩沖液PH=5.0中加入0.2%四甲基聯(lián)苯胺TMB;第八步，制備底物液b:在乙酸鈉——檸檬酸緩沖液PH=5.0中加入0.01%過氧化氫H202;第九步，制備終止液即2mol/L硫酸液；第十步，提取液即甲醇水為1:1;二，檢測(cè)第一步，待測(cè)液前處理，稱取5g粉碎過20目篩的樣品于磨口的50ml試管中，加入提取液20—30ml，加塞振蕩5分鐘一10分鐘，過濾即為待測(cè)樣液；第二步，試劑準(zhǔn)備在標(biāo)準(zhǔn)試樣制備第二步準(zhǔn)備的酶標(biāo)抗原原液中加1.5ml酶標(biāo)抗原稀釋溶液，充分溶解，配成酶標(biāo)抗原工作溶液；第三步，試管編號(hào)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將反應(yīng)板框架上的試管編號(hào)，設(shè)定1號(hào)試管為儀器凋零試管，2-7號(hào)試管為黃曲霉毒素AFBi標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照試管，其余試管為樣品試管；第四步，依次加入配置好的溶液及待測(cè)樣液(1)，在1號(hào)試管中加入50化樣品稀釋液，在2-7號(hào)試管中分別加入黃曲霉毒素AFBi標(biāo)準(zhǔn)溶液50禮，在其余試管中分別加入待測(cè)樣液；(2)，在1號(hào)試管中加入5(￥L酶標(biāo)抗原稀釋液，其余試管中分別加入酶標(biāo)抗原工作溶液，輕輕地振蕩，使各試管中的反應(yīng)物混勻；(3)，然后將反應(yīng)板放入37'C恒溫培養(yǎng)箱中孵育30分鐘；(4)，取出反應(yīng)板，甩掉反應(yīng)液，拍干，每試管加入25(￥L洗滌液，放置2分鐘后，甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，重復(fù)洗板4次；(5)，在每試管中分別加入底物液a和底物液b各501^L，搖勻，將反應(yīng)板放入37'C恒溫培養(yǎng)箱中，顯色15分鐘；(6)，取出反應(yīng)板，在每個(gè)試管中分別加入終止液50叱，用黃曲霉毒素測(cè)定儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度A值；(7)，將測(cè)得的吸光度A值，黃曲霉毒素測(cè)定儀內(nèi)自動(dòng)建立方程A二MC+N回歸計(jì)算，計(jì)算待測(cè)樣品孔A值與A。^的比值，査標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到相應(yīng)待測(cè)樣液濃度C的常用對(duì)數(shù)值LgC，對(duì)其求反對(duì)數(shù)，可求得待測(cè)樣液的AFB1濃度C，按下列公式計(jì)算出樣品中AFB1的含量式中C-一-從標(biāo)準(zhǔn)曲線上査得的AFBL的含量(ng/ml)K----樣品提取液體積(ml);仏-一樣品稀釋倍數(shù)；^一-樣品的質(zhì)量(g)如圖2所示，為黃曲霉毒素測(cè)定儀結(jié)構(gòu)示意圖，所述的黃曲霉毒素測(cè)定儀包括單片機(jī)和穩(wěn)壓電源，所述的單片機(jī)分別與只讀存儲(chǔ)器、鍵盤、顯示器、隨機(jī)存儲(chǔ)器、接口和數(shù)碼轉(zhuǎn)換器連接，數(shù)碼轉(zhuǎn)換器通過前置放大器與模數(shù)轉(zhuǎn)換器連接，模數(shù)轉(zhuǎn)換器通過接口和打印驅(qū)動(dòng)與打印機(jī)連接，穩(wěn)壓電源通過光源與干涉濾光片連接，干涉濾光片通過樣品池與硅光電池連接，硅光電池與前置放大器連接。黃曲霉素酶標(biāo)測(cè)量?jī)x根據(jù)相對(duì)測(cè)量原理工作的，即選定某一溶劑(蒸餾水、空氣或試樣)作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，并設(shè)定它的透射比t(即透光率T)為100.0%，而被測(cè)試樣的透射比t(即透光率T)是相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)溶液而得到的，透射比t(即透光率T)的變化和被測(cè)物質(zhì)的濃度有一函數(shù)關(guān)系，在一定范圍內(nèi)，它符合郎伯—比耳定律。t(T)=I/I。A=KCL=—lgI/I0其中t_透射比A—吸光度C一濃度K—溶液的吸光系數(shù)L—液層在光路中的長(zhǎng)度I—光透過被測(cè)試樣后照射到光電轉(zhuǎn)換器上的強(qiáng)度I。一光透過標(biāo)準(zhǔn)試樣后照射到光電轉(zhuǎn)換器上的強(qiáng)度本儀器內(nèi)的計(jì)算機(jī)根據(jù)郎伯一比耳定律設(shè)有一個(gè)線性回歸方程A:MC+N的計(jì)算程序，采用C語言編制，如圖4所示，所以只要輸入標(biāo)準(zhǔn)試樣的濃度值或線性回歸方程中的系數(shù)M和N，就能直接測(cè)定未知濃度試樣的濃度位置，可廣泛用于黃曲霉素、免疫病理、微生物抗原及抗體檢測(cè)、寄生蟲病診斷、血液病診斷、植物病蟲研究等領(lǐng)域。其主要技術(shù)指標(biāo)1、波長(zhǎng)范圍330—900nM(本儀器只配450nM干涉濾光片在儀器中)，用戶也可以向廠方定購(gòu)340，380，405，492，510，546，578，650nM的干涉濾光片；2、干涉濾光片的半寬度為10nM;3、亮電流穩(wěn)定性《0.3t(T)/5分鐘；4、暗電流穩(wěn)定性《0.2%t(T)/5分鐘；5、透光比范圍0.0%t(T)一llO.0°/。t(T);6、吸光度范圍一0.041—1.999(A);7、濃度范圍0.000—99998、(T)轉(zhuǎn)換精度《士0.004A9、使用環(huán)境a、溫度5—35。Cb、濕度《85%10、工作電源220V土22V，頻率20HZ如圖3所示，為光路結(jié)構(gòu)圖，所述的樣品池中設(shè)有反射鏡3、聚光透鏡4和光欄5，本儀器采用溴鎢燈作為光源，穩(wěn)壓電源為光源提供高穩(wěn)定度的電壓，避免外界電壓的波動(dòng)影響光源的能量，光源1發(fā)出的連續(xù)輻射光束，經(jīng)濾光片2后射至反光鏡3，經(jīng)反光鏡3射至聚光透鏡4上，然后變成特定波長(zhǎng)的光射向樣品池中的反應(yīng)板，最后射至硅光電池7。本儀器的單片機(jī)外購(gòu)采用8位機(jī)中最先進(jìn)的MCS—51系列單片機(jī)，隨機(jī)存儲(chǔ)器(RAM)和接口PIO0采用8155，模數(shù)轉(zhuǎn)換器(A/D)為14433，數(shù)碼轉(zhuǎn)換器(D/A)為7520，只讀存儲(chǔ)器(ROM)為2764，前置放大器為7650，打印機(jī)為16列打印機(jī)。光電池將光信號(hào)轉(zhuǎn)為電信號(hào)，經(jīng)前置放大器的放大，信號(hào)進(jìn)入模數(shù)轉(zhuǎn)換器，模數(shù)轉(zhuǎn)換器將模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)送往單片機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。單片機(jī)根據(jù)不同的基準(zhǔn)信號(hào)，向模數(shù)轉(zhuǎn)換器發(fā)出命令，從而改變前置放大器的放大倍數(shù)，即自動(dòng)調(diào)零、調(diào)滿度，操作者只要將自己要做的事通過鍵盤告訴單片機(jī)，單片機(jī)將各種處理結(jié)果通過顯示器或打印機(jī)告訴操作者。儀器可以按照兩種方法建立計(jì)算方程A:MC+N，這是一個(gè)線性回歸方程，一旦儀器內(nèi)建立了這個(gè)方程，操作者就可以直接得到試樣的濃度值。第一種方法操作者配置l一n個(gè)不同農(nóng)奴的標(biāo)準(zhǔn)試樣，把它們一一轉(zhuǎn)入光路，同時(shí)一一通過鍵盤輸入對(duì)應(yīng)試樣的濃度值，只要將(l_n)個(gè)試樣的濃度值輸入，儀器內(nèi)就自動(dòng)建立方程A:MC+N，然后把未知推入光路就能直讀濃度。第二種方法是己知待測(cè)試樣的方程A=MC+N中的系數(shù)M和N，只要通過鍵盤將M和N輸入儀器內(nèi)，儀器也可以立即建立該試樣的濃度計(jì)算方程A=MC+N。1、通過培植標(biāo)準(zhǔn)試樣建立方程a)濃度值輸入范圍O.000—9999b)標(biāo)準(zhǔn)試樣最多為99個(gè)。2、通過輸入系數(shù)M和建立方程a)必須先輸入M，然后再輸入N;b)輸入的M、N值，相關(guān)系數(shù)R反映濃度C和吸光度A之間的線性關(guān)系，R越接近于l，濃度值C和吸光度A之間線性關(guān)系越好，反之越差。第一種凡是輸入標(biāo)樣，自動(dòng)建立A4C+N線性回歸方程，如果僅輸入一點(diǎn)標(biāo)樣它的濃度曲線就是O點(diǎn)與這點(diǎn)標(biāo)樣建立曲線，稱之為一點(diǎn)法，輸入二點(diǎn)標(biāo)樣我們就稱之為二點(diǎn)法。以此類推，根據(jù)用戶的需要可以培植l一n個(gè)不同的標(biāo)準(zhǔn)試樣，測(cè)量要求不高，配的標(biāo)樣可以少一些，測(cè)量要求愈高配的樣品數(shù)也愈多。本發(fā)明通過檢測(cè)1.中國(guó)疾控中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所，在2007年10月21日對(duì)測(cè)試盒與檢測(cè)儀器進(jìn)行技術(shù)性能指標(biāo)質(zhì)檢，質(zhì)檢分析報(bào)告(編號(hào)20070705)表明用該方法測(cè)定其結(jié)果與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)薄層分析法(TLC)無差異，其測(cè)定結(jié)果為有效、可靠。黃曲霉毒素Bi酶聯(lián)免疫測(cè)試盒質(zhì)檢結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>B:lng/mlAFB！標(biāo)準(zhǔn)孔(2-4號(hào)孔)的OD值均值B0:Ong/mlAFBi標(biāo)準(zhǔn)孔(5-12號(hào)孔)的OD值均值(以下空白)因此在日常檢測(cè)中可代替煩瑣的國(guó)標(biāo)法進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，方便推廣使用。2.天津市、上海市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所分別于2006年12月23日、2006年2月15日其質(zhì)檢分析報(bào)告也都符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與TLC測(cè)定結(jié)果無差巳升o<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3.江西、江蘇、四川獸藥飼料監(jiān)察所分別在2006年4月29日、2006年10月8日、2006年10月27日檢測(cè)報(bào)告。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>權(quán)利要求1.一種準(zhǔn)確、快速檢測(cè)黃曲霉毒素的方法，其特征在于，其方法為一.標(biāo)準(zhǔn)試樣制備第一步，制備黃曲霉毒素AFB1抗體包被反應(yīng)板將抗黃曲霉毒素AFB1多克隆抗體用50mmol/L-100mmol/L，Na2CO3-NaHCO3PH9.6緩沖液稀釋至3-5μg/ml的包被液，加入到反應(yīng)板的48或96孔的試管中，每孔加100-110μL，3℃-5℃冰箱放置過夜，棄去包被液沖洗2次-4次，每孔中加200-250μL含1％牛血清白蛋白BSA的100-110mmol/L、PH7.4磷酸鹽PBS緩沖液封閉35℃-40℃放2-4小時(shí)棄其封閉液將包被板真空包裝后置-15℃--25℃冷凍保存；第二步，制備酶標(biāo)抗原取0.5～1mg黃曲霉毒素B1-羧甲基肟AFB1-omixe溶于20％乙醇溶液中加入20-50mg乙二胺3.3-二甲胺丙基碳化二亞胺鹽酸鹽EDC·HCL攪拌反應(yīng)30分鐘-60分鐘，再以磷酸鹽PBS0.01M、PH7.4溶液透析2天-4天，得到酶標(biāo)抗原原液；第三步，制備黃曲霉毒素AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液將10％-20％甲醇的磷酸鹽PBSPH7.4溶液為溶劑配制0.1ng/ml-10ng/ml的AFB1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；第四步，制備樣品稀釋液在磷酸鹽PBSPH7.4溶液中加入10％-20％甲醇；第五步，制備酶標(biāo)抗原稀釋液在磷酸鹽PBSPH7.4溶液中加入0.05-0.2％的牛血清白蛋白BSA；第六步，制備洗滌液在磷酸鹽PBSPH7.4溶液中加入0.03％-0.07％的吐溫-20TW-20；第七步，制備底物液a在乙酸鈉——檸檬酸緩沖液PH＝5.0中加入0.1％-0.4％四甲基聯(lián)苯胺TMB；第八步，制備底物液b在乙酸鈉-檸檬酸緩沖液PH＝5.0中加入0.01-0.03％過氧化氫H2O2；第九步，制備終止液即2mol/L硫酸液；第十步，提取液即甲醇∶水為1∶1；二，檢測(cè)第一步，待測(cè)液前處理，稱取5g粉碎過20目篩的樣品于磨口的50ml試管中，加入提取液20-30ml，加塞振蕩5分鐘-10分鐘，過濾即為待測(cè)樣液；第二步，試劑準(zhǔn)備在標(biāo)準(zhǔn)試樣制備第二步準(zhǔn)備的酶標(biāo)抗原原液中加1-2ml酶標(biāo)抗原稀釋溶液，充分溶解，配成酶標(biāo)抗原工作溶液；第三步，試管編號(hào)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將反應(yīng)板框架上的試管編號(hào)，設(shè)定1號(hào)試管為儀器凋零試管，2-7號(hào)試管為黃曲霉毒素AFB1標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照試管，其余試管為樣品試管；第四步，依次加入配置好的溶液及待測(cè)樣液(1)，在1號(hào)試管中加入40-60μL樣品稀釋液，在2-7號(hào)試管中分別加入黃曲霉毒素AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液40-60μL，在其余試管中分別加入待測(cè)樣液；(2)，在1號(hào)試管中加入40-60μL酶標(biāo)抗原稀釋液，其余試管中分別加入40-60μL酶標(biāo)抗原工作溶液，輕輕地振蕩，使各試管中的反應(yīng)物混勻；(3)，然后將反應(yīng)板放入35℃-40℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育20分鐘-40分鐘；(4)，取出反應(yīng)板，甩掉反應(yīng)液，拍干，每試管加入200μL-300μL洗滌液，放置1分鐘-3分鐘后，甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，重復(fù)洗板3-5次；(5)，在每試管中分別加入底物液a和底物液b各50μL，搖勻，將反應(yīng)板放入35℃-40℃恒溫培養(yǎng)箱中，顯色10分鐘-20分鐘；(6)，取出反應(yīng)板，在每個(gè)試管中分別加入終止液40-60μL，用黃曲霉毒素測(cè)定儀在360mm-450mm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度A值；(7)，將測(cè)得的吸光度A值，黃曲霉毒素測(cè)定儀內(nèi)自動(dòng)建立方程A＝MC+N回歸計(jì)算，計(jì)算待測(cè)樣品孔A值與AOng/ml的比值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到相應(yīng)待測(cè)樣液濃度C的常用對(duì)數(shù)值LgC，對(duì)其求反對(duì)數(shù)，可求得待測(cè)樣液的AFB1濃度C，按下列公式計(jì)算出樣品中AFB1的含量id="icf0001"file="S2008100384190C00031.gif"wi="83"he="11"top="46"left="41"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>式中C----從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的AFB1的含量(ng/ml)V----樣品提取液體積(ml)；D----樣品稀釋倍數(shù)；m----樣品的質(zhì)量(g)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種準(zhǔn)確、快速檢測(cè)黃曲霉毒素的方法，其特征在于，所述的黃曲霉毒素測(cè)定儀包括單片機(jī)和穩(wěn)壓電源，所述的單片機(jī)分別與只讀存儲(chǔ)器、鍵盤、顯示器、隨機(jī)存儲(chǔ)器、接口和數(shù)碼轉(zhuǎn)換器連接，數(shù)碼轉(zhuǎn)換器通過前置放大器與模數(shù)轉(zhuǎn)換器連接，模數(shù)轉(zhuǎn)換器通過接口和打印驅(qū)動(dòng)與打印機(jī)連接，穩(wěn)壓電源通過光源與干涉濾光片連接，干涉濾光片通過樣品池與硅光電池連接，硅光電池與前置放大器連接。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種準(zhǔn)確、快速檢測(cè)黃曲霉毒素的方法，其特征在于，所述的樣品池中設(shè)有反射鏡(3)、聚光透鏡(4)和光欄(5)，穩(wěn)壓電源(1)發(fā)出的連續(xù)輻射光束，經(jīng)濾光片(2)后射至反光鏡(3)，經(jīng)反光鏡(3)射至聚光透鏡(4)上，然后射向樣品池中的反應(yīng)板(6)，最后射至硅光電池(7)。全文摘要本發(fā)明涉及一種準(zhǔn)確、快速檢測(cè)黃曲霉毒素的方法，其特征在于，其方法為第一步，制備酶標(biāo)抗原、黃曲霉毒素AFB₁標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品稀釋液、酶標(biāo)抗原稀釋液、洗滌液制備底物液a、底物液b、終止液即2mol/L硫酸液和提取液，第二步，進(jìn)行待測(cè)液前處理、試劑準(zhǔn)備、反應(yīng)板試管編號(hào)、依次加入配置好的溶液、待測(cè)樣液和終止液，反應(yīng)板裝入用黃曲霉毒素測(cè)定儀測(cè)定各孔的吸光度A值；將測(cè)得的吸光度A值，黃曲霉毒素測(cè)定儀內(nèi)自動(dòng)建立方程A＝MC+N回歸計(jì)算，計(jì)算出樣品中AFB₁的含量。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高。文檔編號(hào)G01N21/25GK101285834SQ200810038419公開日2008年10月15日申請(qǐng)日期2008年6月2日優(yōu)先權(quán)日2008年6月2日發(fā)明者成恒嵩,潘中華,葛其德,趙曉聯(lián)申請(qǐng)人:上海纖檢儀器有限公司