專利名稱：量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙快速檢測(cè)膀胱癌方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)，具體地說(shuō)是一種量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙快 速檢測(cè)膀胱癌方法。
背景技術(shù)：
膀胱癌是一種惡性腫瘤疾病，死亡率高，全球每年約有幾十萬(wàn)個(gè)新膀胱 癌病例發(fā)生，患病率越來(lái)越高，已經(jīng)成為導(dǎo)致死亡的重要原因之一。早期發(fā) 現(xiàn)，及時(shí)診斷是挽救膀胱癌患者的有效手段?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)膀胱癌檢測(cè)最常用
的方法是膀胱鏡、超聲波、CT等。但是膀胱鏡檢測(cè)病人很痛苦，很多患者因 此不愿檢測(cè)，延誤了病情；而超聲波、CT檢測(cè)除了檢查費(fèi)高外，程序也較煩 瑣。所以發(fā)明一種能夠簡(jiǎn)便靈敏的檢測(cè)膀胱癌的方法，對(duì)于提早發(fā)現(xiàn)和診斷 膀胱癌疾病，減輕膀胱癌患者痛苦，挽救膀胱癌患者的生命是十分有意義的。
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明人的尿液中有一種纖維連接蛋白(即Fn),膀胱 癌患者排放的尿液中所含的纖維連接蛋白的量比正常人尿中Fn的量明顯升 高，而且隨著病理分級(jí)的增高而增高。檢測(cè)病人尿中纖維連接蛋白的濃度， 就可以確診和判斷膀胱癌，準(zhǔn)確率85%以上。
本發(fā)明是一種利用量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，快速檢測(cè)膀胱癌患者的尿 液中所含纖維連接蛋白量，確診和判斷膀胱癌的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供一種檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，病人痛苦少，膀胱癌診斷 準(zhǔn)確的醫(yī)學(xué)檢測(cè)方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙快速檢測(cè)膀胱癌方法，包括以下步驟\(1) 取0. 01M PBS緩沖液100 200uL與5 20uL表面連有羧基的 量子點(diǎn)，用l 20mg N-羥基硫代琥珀酸亞胺和 l 20mg 1_(3-二甲 基氨丙基)-3-乙基碳二胺鹽酸鹽作為偶聯(lián)試劑，加入單克隆抗人纖維 連接蛋白150 200uL搖床反應(yīng)1 4小時(shí)，層析柱過(guò)濾，離心化，1% 5%的牛血清白蛋白封閉，4。C保存；
(2) 將量子點(diǎn)標(biāo)記單克隆抗人纖維連接蛋白均勻噴覆于玻璃纖維 膜上，室溫干燥，4。C保存；用0. 05 0. 15M包被緩沖液稀釋纖維連接 蛋白多克隆抗體、兔抗鼠二抗分別噴覆于硝酸纖維素膜上，室溫晾干， 將膜放入PBS緩沖液中，37t:封閉，干燥后4"C保存；
(3) 在塑料板上粘貼玻璃纖維膜、量子點(diǎn)標(biāo)記單克隆抗人纖維連 接蛋白的玻璃纖維膜和分別包被纖維連接蛋白多克隆抗體、兔抗鼠二抗 的硝酸纖維素膜、吸水紙，將粘貼好的塑料板切成3 5皿的試紙條；
(4) 將量子點(diǎn)與單克隆抗人纖維連接蛋白混合，離心分離，得樣 品4。C保存；取50ul所制的樣品用PBS稀釋至3ml在熒光分光度計(jì)下
上述的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙快速檢測(cè)膀胱癌方法中PBS緩沖 液為含有牛血清白蛋白和蔗糖的磷酸鹽溶液，ra7.4;包被緩沖液為 0. 05 0. 15M的含有牛血清白蛋白和蔗糖的磷酸鹽溶液。
本發(fā)明的要點(diǎn)在于將水溶性的量子點(diǎn)與特異性的抗體通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)， 然后利用雙抗夾心原理結(jié)合量子點(diǎn)的熒光性質(zhì)檢測(cè)樣品中是否含有目標(biāo)物。 在紫外燈的照射下，通過(guò)觀察免疫層析試紙條上檢測(cè)帶和質(zhì)控帶的熒光線， 判斷檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明將免疫反應(yīng)的高特異性和量子點(diǎn)的熒光特性相結(jié)合， 利用量子點(diǎn)多波長(zhǎng)激發(fā)、高強(qiáng)度熒光發(fā)射、發(fā)射峰窄、峰形對(duì)稱、發(fā)光穩(wěn)定 性好的熒光特性，建立了快速、特異、簡(jiǎn)便、靈敏的免疫層析檢測(cè)方法。通過(guò)觀察熒光信號(hào)達(dá)到了定量檢測(cè)的目的。該方法的檢測(cè)靈敏度比目前常用的
一種快速檢測(cè)方法——膠體金的檢測(cè)靈敏度高約1000倍左右。由于金標(biāo)試
紙是通過(guò)肉眼觀察，存在其自身的缺陷，而量子點(diǎn)標(biāo)記抗體復(fù)合物卻能夠彌 補(bǔ)這一缺陷，所以達(dá)到較高的靈敏度。半導(dǎo)體量子點(diǎn)是無(wú)機(jī)納米晶體，它的 出現(xiàn)，以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，例如具有光穩(wěn)定性好、較寬的激發(fā)光譜與較窄的發(fā) 射光譜、激發(fā)與發(fā)射光譜分離、可調(diào)諧發(fā)射光譜的波長(zhǎng)等光學(xué)特性，解決了 有機(jī)熒光基團(tuán)標(biāo)記物易被光漂白、發(fā)射光譜較寬、以及不同熒光基團(tuán)需不同
激發(fā)光源的諸多缺陷；隨著量子點(diǎn)生物兼容性的發(fā)展，使其成為生物科學(xué)和 醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中極具特色的熒光標(biāo)記探針。
本發(fā)明采用免疫層析原理的雙抗夾心方法，首先是基于將己修飾了羧基 的熒光納米量子點(diǎn)與生物分子上的氨基通過(guò)一系列交聯(lián)劑，使量子點(diǎn)上的羧 基與生物體上的氨基形成共價(jià)鍵(酰胺鍵)，從而達(dá)到將量子點(diǎn)穩(wěn)定結(jié)合在
抗體上的目的，并且除去未結(jié)合的抗體，使之成為標(biāo)記特異性抗體的前提保 證。本實(shí)驗(yàn)利用免疫層析法原理將一抗-量子點(diǎn)復(fù)合物先固定在待測(cè)樣品的 玻璃纖維膜上，當(dāng)干燥后的玻璃纖維膜一端浸入樣品尿液后，由于毛細(xì)管作 用，樣品沿著玻璃纖維膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有一抗-量子點(diǎn)復(fù)合物的 區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該一抗-量子點(diǎn)復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合，形 成了一個(gè)"量子點(diǎn)- 一抗-抗原"復(fù)合物，該復(fù)合物繼續(xù)移動(dòng)至硝酸纖維膜 上的固定有多抗的檢測(cè)線區(qū)域時(shí)，由于特異的抗原抗體免疫結(jié)合，多抗會(huì)通 過(guò)與抗原反應(yīng)固定、富集"量子點(diǎn)- 一抗-抗原"復(fù)合物，該區(qū)域在紫外照 射下會(huì)顯示熒光，從而達(dá)到檢測(cè)目的，實(shí)現(xiàn)免疫診斷。
本發(fā)明用共價(jià)偶聯(lián)方法連接量子點(diǎn)-抗體復(fù)合物效果明顯，并且用牛血 清白蛋白封閉消除了非特異性吸附的存在，利用雙抗夾心法檢測(cè)待測(cè)液樣品 達(dá)到檢測(cè)膀胱癌的目的，檢測(cè)限低，靈敏度高，具有比同類檢測(cè)手段更大的優(yōu)勢(shì)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、成本低；2、靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果 準(zhǔn)確；3、適用樣本多，適用于尿樣、也適用于血樣、唾液等樣本；4、應(yīng)用 廣，可應(yīng)用于激素、蛋白質(zhì)、病毒、毒品、細(xì)菌、環(huán)境污染等檢測(cè)；5、使 用范圍大，除了在醫(yī)院使用，也可在海關(guān)、機(jī)場(chǎng)、家庭等場(chǎng)所使用。


圖1為樣品和游離的量子點(diǎn)熒光圖。
紅線為樣品熒光圖，綠線為游離的量子點(diǎn)熒光圖，該量子點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng) 為650nm。圖1說(shuō)明了量子點(diǎn)已成功的連接到抗體上。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
一、樣品制備和試紙條的制作
1. 量子點(diǎn)標(biāo)記抗體
取PH 7.4的含有牛血清白蛋白和蔗糖的磷酸鹽溶液150uL與10uL 表面連有羧基的量子點(diǎn)，用10mg N-羥基硫代琥珀酸亞胺和10mg 1-(3_二 甲基氨丙基)-3-乙基碳二胺鹽酸鹽作為偶聯(lián)試劑，加入單克隆抗人纖維連接 蛋白150uL在搖床上反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)品通過(guò)s印hadex-G-100(lX35cm) 層析柱過(guò)濾，去除未參加反應(yīng)的抗體，離心純化，用4%的牛血清白蛋白封閉， 4'C保存?zhèn)溆谩?br> 2. 玻璃纖維膜和硝酸纖維素膜處理
將量子點(diǎn)標(biāo)記單克隆抗人纖維連接蛋白均勻噴覆于玻璃纖維膜上，室溫 干燥后封袋，4'C保存?zhèn)溆谩Ｓ?.05 0. 15M含有牛血清白蛋白和蔗糖的磷 酸鹽包被緩沖液稀釋到設(shè)定濃度0. 03 0. 05mg/ml，纖維連接蛋白多克隆抗 體、兔抗鼠二抗分別噴覆于硝酸纖維素膜上，形成T線和C線，室溫晾干，將硝酸纖維素膜放入含有牛血清白蛋白和蔗糖的磷酸鹽緩沖液中，37。C封 閉，干燥后封袋，4'C保存。
3. 免疫層析試紙條的制備
在塑料板上依次粘貼上玻璃纖維膜、量子點(diǎn)標(biāo)記單克隆抗人纖維連接蛋 白的玻璃纖維膜和分別包被纖維連接蛋白多克隆抗體、兔抗鼠二抗的硝酸纖 維素膜、吸水紙，將粘貼好的塑料板切成3 5mm寬的試紙條，裝袋待用。
4. 按上述樣品制備的方法，將量子點(diǎn)與單克隆抗人纖維連接蛋白混合反 應(yīng)，最后反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)離心分離，除去未反應(yīng)的量子點(diǎn)，得樣品保存在4。C 備用。取50ul所制的樣品用PBS稀釋至3ml在熒光分光度計(jì)下觀測(cè)。結(jié)果 見(jiàn)圖1。
二、病例檢測(cè)
5. 將準(zhǔn)備好的免疫試紙條插入待測(cè)樣品尿液中，全部試驗(yàn)過(guò)程10分鐘， 取出試紙條在紫外燈下觀察結(jié)果。膜上的檢測(cè)線和質(zhì)控線處都有紅色的熒 光，說(shuō)明患者尿液樣品中含有纖維連接蛋白的量達(dá)到檢測(cè)限并得到定量的結(jié)
果。檢驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。
6. 將準(zhǔn)備好的免疫試紙條插入待測(cè)樣品尿液中，全部試驗(yàn)過(guò)程10分鐘， 取出試紙條在紫外燈下觀察結(jié)果。膜上只有質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色的熒光，說(shuō)明 患者尿液中所含纖維連接蛋白的量在檢測(cè)限以下并得到定量的結(jié)果。檢測(cè)結(jié)
果陰性。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本 領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則 之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之 內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙快速檢測(cè)膀胱癌方法，包括以下步驟(1)取0.01M PBS緩沖液100～200uL與5～20uL表面連有羧基的量子點(diǎn)，用1～20mgN-羥基硫代琥珀酸亞胺和1～20mg1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二胺鹽酸鹽作為偶聯(lián)試劑，加入單克隆抗人纖維連接蛋白150～200uL搖床反應(yīng)1～4小時(shí)，層析柱過(guò)濾，離心純化，1％～5％的牛血清白蛋白封閉，4℃保存；(2)將量子點(diǎn)標(biāo)記單克隆抗人纖維連接蛋白均勻噴覆于玻璃纖維膜上，室溫干燥，4℃保存；用0.05～0.15M的包被緩沖液稀釋纖維連接蛋白多克隆抗體、兔抗鼠二抗分別噴覆于硝酸纖維素膜上，室溫晾干，將膜放入PBS緩沖液中，37℃封閉，干燥后4℃保存；(3)在塑料板上粘貼玻璃纖維膜、量子點(diǎn)標(biāo)記單克隆抗人纖維連接蛋白的玻璃纖維膜和分別包被纖維連接蛋白多克隆抗體、兔抗鼠二抗的硝酸纖維素膜、吸水紙，將粘貼好的塑料板切成3～5mm的試紙條；(4)將量子點(diǎn)與單克隆抗人纖維連接蛋白混合，離心分離，得樣品4℃保存；取50ul所制的樣品用PBS稀釋至3ml在熒光分光度計(jì)下觀測(cè)到定量的結(jié)果。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙快速檢測(cè)膀 胱癌方法PBS緩沖液為含有牛血清白蛋白和蔗糖的磷酸鹽溶液， PH7. 4。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙快速檢測(cè)膀胱癌方法?，F(xiàn)在膀胱癌檢測(cè)的方法是膀胱鏡、超聲波、CT等，但是這些方法檢測(cè)程序煩瑣、病人痛苦。本發(fā)明利用量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙，快速檢測(cè)膀胱癌患者的尿液中所含纖維連接蛋白量，確診和判斷膀胱癌。本發(fā)明檢測(cè)方法成本低、方法簡(jiǎn)單；適用于血樣、尿樣、唾液等樣本；可應(yīng)用于激素、蛋白質(zhì)、病毒、毒品、細(xì)菌、環(huán)境污染等檢測(cè)；可在醫(yī)院、海關(guān)、機(jī)場(chǎng)、家庭等場(chǎng)所使用。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101339196SQ20081004113
公開(kāi)日2009年1月7日 申請(qǐng)日期2008年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月29日
發(fā)明者菲 方, 沈鶴柏 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)