專利名稱：：一種測(cè)定乳制品中乳鐵蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種測(cè)定乳制品中乳鐵蛋白的方法。
背景技術(shù)：
：乳鐵蛋白(LF)又稱"乳轉(zhuǎn)鐵蛋白"，它最早是由Sorensen等人于1939年從動(dòng)物乳汁中發(fā)現(xiàn)一種紅色糖蛋白，它廣泛存在于乳汁、唾液、淚液等外分泌或血漿中性粒細(xì)胞中。乳鐵蛋白具有多種生物學(xué)功能，它能夠參與鐵的運(yùn)轉(zhuǎn)，對(duì)腸中鐵離子具有增溶作用，并且具有廣譜抗菌、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能。乳鐵蛋白作為一種新興功能性食品配料，針對(duì)其提取純化工藝和應(yīng)用研究在不斷的增多，它主要在初乳、嬰幼兒配方奶粉及專用免疫奶粉等產(chǎn)品中。目前測(cè)定乳制品中乳鐵蛋白含量的方法有很多，如酶聯(lián)免疫法、凝膠色譜法和紫外分光光度法等幾種方法。酶聯(lián)免疫吸附觀!l定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,簡(jiǎn)稱ELISA)是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)上發(fā)展起來(lái)的一種新型免疫測(cè)定技術(shù)。ELISA是將抗原、抗體特異性反應(yīng)和酶的高效催化作用有機(jī)地結(jié)合起來(lái)的一種新穎、快速、實(shí)用的免疫學(xué)分析技術(shù)。ELISA是以待測(cè)抗原(或抗體)與酶標(biāo)抗體(或抗原)的特異結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)酶活力測(cè)定來(lái)確定抗原(或抗體)含量的。一般ELISA過(guò)程包括抗原吸附在固相載體上，這個(gè)過(guò)程稱為包被，加待測(cè)抗體，再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體，生成抗原——待測(cè)抗體——酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體的量。待測(cè)抗體的量與有色產(chǎn)物成正比。同理也可包被抗體，測(cè)定抗原含量。采用ELISA測(cè)定乳鐵蛋白含量具有靈敏度高、最小檢測(cè)限低、樣品無(wú)需純化等特點(diǎn)，因此該法應(yīng)用范圍最廣，適用于包括初乳和專用乳粉等一系列產(chǎn)品中的乳鐵蛋白含量的測(cè)定，但該法受環(huán)境和操作人員的影響較大，同一個(gè)樣品在兩次包被過(guò)程后測(cè)定的結(jié)果差異較大，因此，為了保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每測(cè)定一個(gè)樣品都需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線上所有的點(diǎn)進(jìn)行一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后再確定待測(cè)樣品的量，這大大的增加了實(shí)驗(yàn)工作量。并且實(shí)驗(yàn)所用試劑盒大多來(lái)源于進(jìn)口，費(fèi)用昂貴，也不適于長(zhǎng)期大量檢測(cè)乳鐵蛋白含量。紫外分光光度法是利用乳鐵蛋白在475nm處具有特征紫外吸收而測(cè)定的，該法具有快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但此法受體系內(nèi)其他物質(zhì)在475nm處的干擾明顯，其準(zhǔn)確性稍差，因而也不適合乳鐵蛋白的準(zhǔn)確定量。凝膠色譜法是一種HPLC方法，它具有測(cè)定準(zhǔn)確快速、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，適用于初步分離效果的監(jiān)控，但對(duì)純度較低的乳鐵蛋白檢測(cè)時(shí)，由于凝膠色譜分離是利用了凝膠的多孔性，根據(jù)溶劑分子的大小進(jìn)行分離的，當(dāng)乳鐵蛋白與其他雜蛋白分子大小相近時(shí)，在凝膠色譜上保留時(shí)間接近，很難達(dá)到基線分離，所以，凝膠色譜法僅適用于高純度的樣品測(cè)定。因而，探尋一種成本低廉、檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、適用于復(fù)雜體系乳制品中乳鐵蛋白含量的檢測(cè)方法是研究的首要問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服了現(xiàn)有測(cè)定乳制品中乳鐵蛋白含量方法的成本高、準(zhǔn)確性較差或樣品乳鐵蛋白含量低測(cè)定不準(zhǔn)確等的缺陷，提供了一種準(zhǔn)確度高，簡(jiǎn)便快速地測(cè)定乳制品中乳鐵蛋白的方法。本發(fā)明測(cè)定乳制品中乳鐵蛋白的方法包括如下步驟將乳制品按照本領(lǐng)域常規(guī)方法預(yù)提純富集乳鐵蛋白，再通過(guò)陽(yáng)離子交換色譜柱進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)測(cè)定含量。1、預(yù)提純富集乳制品中的乳鐵蛋白本發(fā)明中，所述的乳制品是指本領(lǐng)域常用的乳制品，如初乳、嬰幼兒奶粉、含有乳鐵蛋白的乳粉、還原乳或含乳飲料等。對(duì)乳制品中的乳鐵蛋白進(jìn)行預(yù)提純富集可按本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。本發(fā)明特別優(yōu)選如下方法①離心脫脂將乳制品溶解于水中得復(fù)原乳，離心脫脂；②去除酪蛋白將脫脂乳按本領(lǐng)域常規(guī)方法，較佳地用0.2mol/L0.5mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值；pH值較佳的為4.44.8，更佳的為4.6，離心去除酪蛋白，獲得乳清溶液；(D鹽析優(yōu)選硫酸銨分級(jí)沉淀法，具體步驟優(yōu)選如下將乳清溶液攪拌過(guò)程中緩慢加入硫酸銨，使溶液中硫酸銨濃度較佳的為30%50%，更佳的為40%;較佳的靜置時(shí)間為l3h，更佳的靜置時(shí)間為3h;離心并取其上清液；將上清液攪拌過(guò)程中再緩慢加入硫酸銨，使溶液中硫酸銨濃度較佳的為70%~90%，更佳的為80%;較佳的靜置時(shí)間為l3h，更佳的靜置時(shí)間為3h;離心取其沉淀部分即得到預(yù)純化富集的乳鐵蛋白，百分比為質(zhì)量百分比。其中，所述的離心條件中較佳的離心速度為30005000r/min，離心時(shí)間1530min，更佳的離心速度為5000r/min，離心時(shí)間為30min。2、陽(yáng)離子交換色譜柱進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)測(cè)定本發(fā)明中，所述的通過(guò)陽(yáng)離子交換色譜柱HPLC法的分離檢測(cè)乳鐵蛋白的基本原理是由于乳鐵蛋白的等電點(diǎn)為7.8-8.0之間，當(dāng)調(diào)整環(huán)境溶液的pH小于7.8時(shí)，乳鐵蛋白與其他部分蛋白所帶電荷極性不同。此時(shí)，乳鐵蛋白帶負(fù)電，而其他一些乳清蛋白，如a-乳清(白)蛋白、(3-乳球蛋白、免疫球蛋白等帶正電。在利用陽(yáng)離子交換色譜柱分離，當(dāng)待測(cè)樣品通過(guò)色譜柱時(shí)，乳鐵蛋白等帶負(fù)電的蛋白與柱填料上的陽(yáng)離子位點(diǎn)結(jié)合，其他帶正電的物質(zhì)被流動(dòng)相首先洗脫出來(lái)，隨著流動(dòng)相鹽濃度的不斷提高，乳鐵蛋白和其它部分帶負(fù)電的蛋白才被一一洗脫出來(lái)，進(jìn)而測(cè)量乳鐵蛋白的含量。本發(fā)明中，所述的高效液相色譜法的進(jìn)樣及進(jìn)樣前預(yù)處理可按照本領(lǐng)域7常規(guī)方法進(jìn)行，其優(yōu)選步驟如下①將預(yù)提純富集的乳鐵蛋白樣品溶于的磷酸鹽緩沖溶液中，pH值較佳的為6.8~7.2，更佳的為7.0，得到進(jìn)樣溶液；②去除雜質(zhì)為了去除進(jìn)樣溶液和流動(dòng)相中的顆粒雜質(zhì)，避免色譜柱阻塞，將進(jìn)樣溶液和流動(dòng)相溶液分別用濾膜過(guò)濾。進(jìn)樣液量小，較佳地選用針式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾；流動(dòng)相量大，較佳地選用水相濾膜過(guò)濾；兩者所用濾膜孔徑均為《0.45jim，更佳的為0.2pm;③進(jìn)樣，進(jìn)樣體積根據(jù)柱長(zhǎng)短來(lái)確定，較佳地，8mmx75mm的柱子進(jìn)樣體積為1020pL，更佳的為10pL。本發(fā)明中，所述的陽(yáng)離子交換色譜柱可選自本領(lǐng)域常規(guī)的陽(yáng)離子交換色譜柱，可以是強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱，也可以是弱陽(yáng)離子交換色譜柱，較佳的是弱陽(yáng)離子交換色譜柱。這主要是因?yàn)閺?qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱的結(jié)合位點(diǎn)與乳鐵蛋白的結(jié)合能力更強(qiáng)，在洗脫的過(guò)程中需要很高的離子強(qiáng)度才能把乳鐵蛋白洗脫出來(lái)，但是較高的離子強(qiáng)度對(duì)液相色譜儀器的損害較大，不利于儀器的日常維護(hù)，因此進(jìn)一步優(yōu)選使用弱陽(yáng)離子交換色譜柱對(duì)樣品進(jìn)行分析檢測(cè)。所述的陽(yáng)離子交換色譜柱優(yōu)選磺丙基(如ShodexIECSP-825)、磺酸基(如ProteomixSCX-NP)或羧甲基(如shodexIECCM-825)等陽(yáng)離子交換色譜柱，最佳的選擇羧甲基弱陽(yáng)離子交換色譜柱。所述的陽(yáng)離子交換色譜柱規(guī)格較佳的選用》8.0x7.5mm的常規(guī)型號(hào)的色譜分析柱。本發(fā)明中，高效液相色譜的流動(dòng)相溶液按照本領(lǐng)域常規(guī)方法，根據(jù)所用的陽(yáng)離子交換色譜柱的交換基團(tuán)而選擇。如，對(duì)本發(fā)明優(yōu)選的磺丙基、磺酸基或羧甲基陽(yáng)離子交換色譜柱，較佳的選用含有氯化鈉或氯化鉀的磷酸鹽緩沖溶液作為流動(dòng)相。磷酸鹽緩沖溶液的pH值較佳的為6.8~7.2，更佳的為7.0。在高效液相色譜梯度洗脫程序中，通過(guò)調(diào)節(jié)泵的輸入梯度，使流動(dòng)相氯化鈉或氯化鉀鹽濃度的不斷增加，從而分離乳鐵蛋白，具體過(guò)程如下流動(dòng)相中，隨著氯化鈉或氯化鉀的濃度的不斷增加，不與色譜柱陽(yáng)離子基團(tuán)結(jié)合的正電蛋白或結(jié)合力較弱的蛋白被率先洗脫出來(lái)，洗脫液中鹽濃度的不斷提高，當(dāng)洗脫液中氯化鈉或氯化鉀的濃度達(dá)到0.9mol/Llmol/L時(shí)，乳鐵蛋白開始洗脫出來(lái)，當(dāng)鹽濃度達(dá)到l.l~1.2mol/L時(shí)乳鐵蛋白基本被洗脫完全，此時(shí)繼續(xù)提高濃度直至1.41.5mol/L并持續(xù)一段時(shí)間，使其他結(jié)合力更強(qiáng)的雜質(zhì)被完全洗脫出來(lái)，從而有利于色譜柱的反復(fù)使用。本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)例中，高效液相色譜法的梯度洗脫程序如下-<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>上述優(yōu)選條件中，所述的磷酸鹽緩沖溶液中的共軛酸堿較佳的為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀；所述的磷酸鹽緩沖溶液的濃度較佳的為0.01~0.05mol/L，更佳為0.02mol/L;所述的濃度是指緩沖溶液中共軛酸堿的總濃度。本發(fā)明中，高效液相色譜法測(cè)定的其他色譜條件為本領(lǐng)域常規(guī)條件。優(yōu)選條件為流動(dòng)相流速較佳的為0.21.0mL/min，更佳的為0.5mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)較佳的為260~300nm，更佳的為280nm;柱溫較佳的為2530°C，更佳的為30。C。本發(fā)明中，乳鐵蛋白的含量可通過(guò)本領(lǐng)域常用的定量分析方法確定的，較佳地選用外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法計(jì)算峰面積，從而確定乳鐵蛋白的含量。本發(fā)明中所述的硫酸銨、磷酸鹽、氯化鈉和氯化鉀的純度可用本領(lǐng)域常規(guī)使用純度，較佳的選用分析純。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于1.本發(fā)明將乳制品的常規(guī)預(yù)處理方法與陽(yáng)離子交換色譜柱兩者之間有機(jī)的結(jié)合，解決了復(fù)雜乳制品體系中乳鐵蛋白的快速富集和準(zhǔn)確定量分析的問(wèn)題，該法與目前常用的酶聯(lián)免疫法相比，具有檢測(cè)費(fèi)用低、準(zhǔn)確程度高、受環(huán)境變化影響小等優(yōu)點(diǎn)，有利于乳鐵蛋白在乳制品中的應(yīng)用，且該法也為其他功能性乳成分的快速定量分析提供了一定的理論依據(jù)。2.采用陽(yáng)離子交換色譜柱對(duì)樣品進(jìn)行分離分析乳鐵蛋白含量，與常規(guī)使用的凝膠色譜柱相比，除了依靠樣品之間分子大小的差異和分子間作用力的不同來(lái)進(jìn)行分離外，離子交換色譜還依靠樣品在不同pH條件下所帶電荷的多少來(lái)實(shí)現(xiàn)樣品間的分離，使樣品之間能夠很好的實(shí)現(xiàn)基線分離，從而達(dá)到準(zhǔn)確定量分析的目的。3.本發(fā)明優(yōu)選的預(yù)分離富集方法中，利用調(diào)節(jié)pH和硫酸銨分級(jí)沉淀來(lái)富集乳制品中的乳鐵蛋白，與常規(guī)使用的蛋白純化工藝超濾和柱層析相比，具有處理量小、快速、簡(jiǎn)單易行的特點(diǎn)。圖l為乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC曲線圖。圖2為實(shí)施例1試驗(yàn)1中初乳的乳鐵蛋白檢測(cè)的HPLC曲線圖。圖3為HPLC法測(cè)定乳鐵蛋白質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下述實(shí)施例中，緩沖溶液的濃度是指緩沖溶液中共軛酸堿的總濃度。實(shí)施例13的高效液相色譜法條件色譜柱IECCM—825羧甲基弱陽(yáng)離子交換色譜柱(8mmx75mm，Shodex公司，日本)；流動(dòng)相A溶液pH7.0的0.02mol/L的磷酸鹽緩沖溶液；B溶液pH7.0的含1.5mol/LNaCl的0.02mol/L磷酸鹽緩沖溶液；流速0.5mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)280nm;進(jìn)樣體積20pL;柱溫30°C。工作曲線的繪制(外標(biāo)法測(cè)定物質(zhì)含量)準(zhǔn)確稱取乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(江南大學(xué)測(cè)試中心提供，圖1)制成的乳鐵蛋白溶液濃度分別為0.054.0mg/mL;用高效液相色譜測(cè)定溶液在280nm處的吸收峰繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如下Y=494439X+25044(R2=0.9991，圖3)。實(shí)施例l初乳粉中乳鐵蛋白的含量測(cè)定準(zhǔn)確稱取5g初乳粉(由戴緯林國(guó)際貿(mào)易公司提供)樣品，使其完全溶解于200rnL水中，然后以5000r/min速度離心30min，去除上層漂浮的脂肪；再用0.2mol/L稀鹽酸將初乳溶液調(diào)節(jié)至pH值為4.6，去除初乳中的酪蛋白，得到乳鐵蛋白粗品，即乳清溶液。向攪拌的乳清溶液中緩慢加入硫酸銨至硫酸銨濃度為40%，靜置3h，離心取其上清液部分；然后再向上清液中緩慢添加硫酸銨至硫酸銨濃度為80%，靜置3h，離心取其沉淀部分即得到預(yù)純化富集的乳鐵蛋白，百分比為質(zhì)量百分比。將富集乳鐵蛋白樣品用pH7.0的0.02mol/L磷酸鹽緩沖溶液溶解于10mL容量瓶中，調(diào)整pH值至7.0，再用0.45jtim纖維素濾膜針式過(guò)濾器至樣品瓶?jī)?nèi)，搖勻后供高效液相色譜測(cè)定。離子交換色譜柱分離樣品梯度如下表l:表l采用離子交換色譜柱分離樣品的梯度洗脫表序號(hào)時(shí)間/min流速/mL/minA泵/%B泵/%150.510002100.540603250.540604500.520805600.520806700.501007800.51000通過(guò)上述分析方法對(duì)同一份初乳粉樣品進(jìn)行5次分析，試驗(yàn)1的HPLC測(cè)定如圖2所示，每次分析都能夠?qū)⑷殍F蛋白與其他雜蛋白的基線分離，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如下表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>上表2結(jié)果計(jì)算得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=2.70%。由上式可以看出，相對(duì)偏差為2.70%，表明其重現(xiàn)性良好。實(shí)施例2嬰幼兒奶粉中乳鐵蛋白的含量測(cè)定準(zhǔn)確稱取2030g嬰幼兒奶粉(市售，光明乳業(yè)股份有限公司生產(chǎn))樣品，使其完全溶解于200mL水中，然后以5000r/min速度離心30min，去除上層漂浮的脂肪；再用0.2mol/L稀鹽酸將乳粉溶液調(diào)節(jié)至pH值為4.6，離心去除奶粉中的酪蛋白，得到乳鐵蛋白粗品，即乳清溶液。向乳清溶液中緩慢添加硫酸銨至硫酸銨濃度為40%，靜置3h，離心取其上清液部分；然后再向上清液中緩慢添加硫酸銨至硫酸銨濃度為80%，靜置3h，離心取其沉淀部分即得到預(yù)純化富集的乳鐵蛋白，百分比為質(zhì)量百分比。將富集乳鐵蛋白樣品用pH7.0的0.02mol/L磷酸鹽緩沖溶液溶解于10mL容量瓶中，調(diào)整pH值至7.0，再用0.45pm纖維素膜針式過(guò)濾器過(guò)濾至樣品瓶?jī)?nèi)，搖勻后供高效液相色譜測(cè)定。離子交換色譜柱分離樣品梯度如下表3:表3采用離子交換色譜柱分離樣品的梯度洗脫表序號(hào)時(shí)間/min流速/mL/minA泵/%B泵/%10.510002100.54060250.540604500.52080600.520806700.501007800.51000通過(guò)上述分析方法對(duì)同一嬰幼兒奶粉樣品進(jìn)行5次分析，每次分析都能夠很好的實(shí)現(xiàn)乳鐵蛋白與其他雜蛋白的基線分離，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如下表4:表4同一份嬰幼兒奶粉中乳鐵蛋白含:量的測(cè)定序號(hào)峰面積保留時(shí)間/min樣品含量mg.g"128610838.2530.528229451338.3460.545330489638.4230.566429154638.7580.573529708439.0440.539上表4結(jié)果計(jì)算所得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=3.41%。由上式可以看出，相對(duì)偏差為3.41%，表明其重現(xiàn)性良好。實(shí)施例3乳飲料中乳鐵蛋白的含量測(cè)定取乳飲料樣品(光明乳業(yè)有限公司技術(shù)中心自制)500ml，以5000r/min速度離心30min，去除上層漂浮的脂肪；再用0.2mol/L稀鹽酸將乳飲料調(diào)節(jié)至pH值為4.6，離心去除酪蛋白，得到乳鐵蛋白粗品，即乳清溶液。向乳清溶液中緩慢添加硫酸銨至硫酸銨濃度為40%，靜置3h，離心取其上清液部分；然后再向上清液中緩慢添加硫酸銨至硫酸銨濃度為80%，靜置3h，離心取其沉淀部分即得到預(yù)純化富集的乳鐵蛋白，百分比為質(zhì)量百分比。將富集乳鐵蛋白樣品用pH7.0的0.02mol/L磷酸鹽緩沖溶液溶解于10mL容量瓶中，調(diào)整pH值至7.0，再用0.45pm纖維素針式過(guò)濾器過(guò)濾至樣品瓶?jī)?nèi)，搖勻后供高效液相色譜測(cè)定。離子交換色譜柱分離樣品梯度如下表5:表5采用離子交換色譜柱分離樣品的梯度洗脫表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>通過(guò)上述分析方法對(duì)同一種乳飲料樣品進(jìn)行5次分析，每次分析都能夠很好的實(shí)現(xiàn)乳鐵蛋白與其他雜蛋白的基線分離，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如下表6:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>上表6結(jié)果計(jì)算所得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=3.10%。由上式可以看出，相對(duì)偏差為3.10%，表明其重現(xiàn)性良好。實(shí)施例4對(duì)嬰幼兒奶粉中乳鐵蛋白的含量測(cè)定準(zhǔn)確稱取2030g嬰幼兒奶粉(市售，光明乳業(yè)股份有限公司生產(chǎn))樣品，使其完全溶解于200mL水中，然后以3000r/min速度離心30min，去除上層漂浮的脂肪；再用0.5mol/L稀鹽酸將初乳溶液調(diào)節(jié)至pH值為4.4，去除初乳中的酪蛋白，得到乳鐵蛋白粗品，即乳清溶液。向攪拌的乳清溶液中緩慢加入硫酸銨至硫酸銨濃度為50%，靜置lh，離心取其上清液部分；然后再向上清液中緩慢添加硫酸銨至硫酸銨濃度為90%，靜置lh，離心取其沉淀部分即得預(yù)純化富集的乳鐵蛋白，百分比為質(zhì)量百分比。將富集乳鐵蛋白樣品用pH7.2的0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液溶解于10mL容量瓶中，調(diào)整pH值至7.2，再用0.45pm纖維素濾膜針式過(guò)濾器至樣品瓶?jī)?nèi)，搖勻后供高效液相色譜測(cè)定。高效液相色譜法條件色譜柱IECSP-825磺丙基弱陽(yáng)離子交換色譜柱(8mmx75mm，Shodex公司，日本)；流動(dòng)相A溶液:pH7.2的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖溶液；B溶液pH7.2的含1.5mol/LKCl的0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液；流速0.2mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)260nm;進(jìn)樣體積10pL;柱溫25。C。離子交換色譜柱分離樣品梯度如下表h表l采用離子交換色譜柱分離樣品的梯度洗脫表<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>蛋白的基線分離，結(jié)果樣品含量為0.535mg，g'1。實(shí)施例5初乳粉中乳鐵蛋白的含量測(cè)定準(zhǔn)確稱取5g初乳粉(由戴緯林國(guó)際貿(mào)易公司提供)樣品，使其完全溶解于200mL水中，然后以5000r/min速度離心15min，去除上層漂浮的脂肪；再用0.5mol/L稀鹽酸將初乳溶液調(diào)節(jié)至pH值為4.8，去除初乳中的酪蛋白，得到乳鐵蛋白粗品，即乳清溶液。向攪拌的乳清溶液中緩慢加入硫酸銨至硫酸銨濃度為30%，靜置3h，離心取其上清液部分；然后再向上清液中緩慢添加硫酸銨至硫酸銨濃度為70%，靜置3h，離心取其沉淀部分即得預(yù)純化富集的乳鐵蛋白，百分比為質(zhì)量百分比。將富集乳鐵蛋白樣品用pH6.8的0.05mol/L磷酸鹽緩沖溶液溶解于10mL容量瓶中，調(diào)整pH值至6.8，再用0.45pm纖維素濾膜針式過(guò)濾器至樣品瓶?jī)?nèi)，搖勻后供高效液相色譜測(cè)定。高效液相色譜法條件色譜柱SCX-NP磺酸基弱陽(yáng)離子交換色譜柱(8mmx75mm，Proteomix公司)；流動(dòng)相A溶液pH6.8的0.05mol/L的磷酸鹽緩沖溶液；B溶液pH6.8的含1.5mol/LNaCl的0.05mol/L磷酸鹽緩沖溶液；流速1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)300nm;進(jìn)樣體積20fxL;柱溫30°C。離子交換色譜柱分離樣品梯度如下表1:_表l采用離子交換色譜柱分離樣品的梯度洗脫表序號(hào)時(shí)間/min流速/mL/minA泵/%B泵/%1100.510002200.540603300.540604600.527735800.527736900.5010071000.51000通過(guò)上述分析初乳粉樣品，將乳鐵蛋白與其他雜蛋白的基線分離，結(jié)果樣品含量為1.825mg'g'1。權(quán)利要求1、一種測(cè)定乳制品中乳鐵蛋白含量的方法，其特征在于其步驟包括將乳制品按照現(xiàn)有方法預(yù)提純富集乳鐵蛋白，再通過(guò)陽(yáng)離子交換色譜柱進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定含量。2、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的陽(yáng)離子交換色譜柱為弱陽(yáng)離子交換色譜柱。3、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的陽(yáng)離子交換色譜柱為磺丙基、磺酸基或羧甲基陽(yáng)離子交換色譜柱；所述的陽(yáng)離子交換色譜柱規(guī)格為》8.0x7.5mm。4、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的高效液相色譜法測(cè)定的流動(dòng)相溶液為pH值為6.8~7.2的含有氯化鈉或氯化鉀的磷酸鹽緩沖溶液；所述的高效液相色譜法的梯度洗脫程序?yàn)?<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>5、如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的高效液相色譜法的梯度洗脫程序?yàn)?lt;table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>6、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的高效液相色譜法測(cè)定的色譜條件為流動(dòng)相流速為0.2-1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為260300nm;柱溫為25~30°C。7、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的高效液相色譜法測(cè)定的進(jìn)樣及預(yù)處理步驟為-①將預(yù)提純富集的乳鐵蛋白樣品溶于pH值為6.87.2的磷酸鹽緩沖溶液中，得進(jìn)樣溶液；②去除雜質(zhì)將進(jìn)樣溶液用針式過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，流動(dòng)相溶液用水相濾膜過(guò)濾，濾膜孔徑為《0.45iam;(D進(jìn)樣進(jìn)樣體積為1020pL。8、如權(quán)利要求4或7所述的方法，其特征在于所述的磷酸鹽緩沖溶液中的共軛酸堿為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀；所述的磷酸鹽緩沖溶液的濃度為0.010.05mol/L，所述的濃度是指緩沖溶液中共軛酸堿的總濃度。9、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的現(xiàn)有方法預(yù)提純富集乳鐵蛋白的步驟如下-①離心脫脂將乳制品溶解于水中得復(fù)原乳，離心脫脂；②去除酪蛋白將脫脂乳用0.2mol/L0.5mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為4.44.8，離心去除酪蛋白，獲得乳清溶液；③鹽析硫酸銨分級(jí)沉淀法步驟如下將乳清溶液攪拌加入硫酸銨至硫酸銨濃度為30%50%，靜置l~3h;離心并取上清液；將上清液攪拌加入硫酸銨至硫酸銨濃度為70%90%，靜置l~3h;離心取沉淀即得預(yù)提純富集的乳鐵蛋白，百分比為質(zhì)量百分比；上述步驟中所述的離心的條件為離心速度為3000~5000r/min，離心時(shí)間1530min。10、如權(quán)利要求1或9所述的方法，其特征在于所述的乳制品為初乳、嬰幼兒奶粉、含有乳鐵蛋白的乳粉、還原乳或含乳飲料。全文摘要本發(fā)明公開了一種測(cè)定乳制品中乳鐵蛋白的方法。通過(guò)將乳制品的常規(guī)預(yù)處理方法與陽(yáng)離子交換色譜柱兩者之間有機(jī)的結(jié)合，解決了復(fù)雜乳制品體系中乳鐵蛋白的快速富集和準(zhǔn)確定量分析的問(wèn)題，具有檢測(cè)費(fèi)用低、準(zhǔn)確程度高、受環(huán)境變化影響小等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N30/96GK101672835SQ200810042678公開日2010年3月17日申請(qǐng)日期2008年9月9日優(yōu)先權(quán)日2008年9月9日發(fā)明者璐任,孟令潔,云張,鵬張,張鋒華,鋒杭,王蔭榆,郭本恒,龔廣予申請(qǐng)人:光明乳業(yè)股份有限公司