專利名稱：乙型肝炎病毒表面抗體定量檢測診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
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本發(fā)明涉及一種用于定量檢測乙型肝炎病毒表面抗體的試劑盒。
背景技術(shù)：
眾所周知，乙肝病毒是嚴重威脅我國人民身體健康的病原體微生物之一，人
群普遍易感。我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，人群總感染率高達60%,全國乙型肝炎 表面抗原攜帶者至少有1.2億，其中約10%最終轉(zhuǎn)化為各種慢性肝病，包括慢性 肝炎、肝硬化和肝癌。成年人感染HBV后，90%~95%為自限性，5%~10%可成 為持續(xù)性感染或慢性化，輸血后乙型肝炎中的50。/。將慢性化。圍產(chǎn)期及新生兒被 HBV感染后，如果沒有進行疫苗阻斷，85。/。 90。/?？梢猿蔀闊o癥狀的HBsAg攜帶 者。
普遍認為乙型肝炎表面抗體是乙肝病毒的唯一保護性抗體，它的存在是 HBV感染被清除，身體產(chǎn)生對乙肝病毒免疫力的標(biāo)志。另外，隨著乙肝疫苗的 普遍使用，對于疫苗的使用效果也要由身體是否產(chǎn)生表面抗體來判斷。因此對于 乙型肝炎表面抗體的檢測，能夠提示乙肝病情的恢復(fù)和治療情況，判斷注射疫苗 后身體對病毒的免疫情況。
但長期以來，國產(chǎn)的HBV感染標(biāo)志物檢測試劑一直采用方法學(xué)上比較落后 的酶聯(lián)免疫(ELISA)和放射免疫(RIA)分析試劑，更先進的發(fā)光免疫檢測試 劑則主要依賴進口；盡管進口的發(fā)光免疫檢測方法在靈敏性、特異性、有效期和 測量范圍方面均有優(yōu)勢，但其昂貴的價格卻不易被國內(nèi)大多數(shù)用戶所承受。因而 市場上急需優(yōu)質(zhì)而價廉的國產(chǎn)診斷試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明中縮寫的含義
HBsAg:乙型肝炎表面抗原；抗-HBs:乙型肝炎表面抗體；DTTA-Eu: —種銪 離子螯合物N1-(P-異硫氰基芐基)-二乙三胺四乙酸銪鈉；P-NTA: 0-萘酰 三氟丙酮；S印hacryl S-200 : —種凝膠層析柱填料聚丙烯酰胺葡聚糖 S-200; Triton X-100:壬-(乙二醇)苯辛基醚；T0P0:三辛基氧化膦；Ag:
3抗原；Ab:抗體，Ab-Eu:銪標(biāo)記抗體。
本法發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、靈敏度高、特異性好、無污染的乙型 肝炎病毒表面抗體定量檢測診斷試劑盒。主要解決進口發(fā)光免疫檢測方法成本過 高的技術(shù)問題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下方案實施
乙型肝炎病毒表面抗體定量檢測診斷試劑盒，試劑盒由乙型肝炎表面抗體校
準(zhǔn)品、純化HBsAg包被反應(yīng)板、銪標(biāo)記純化HBsAg、銪標(biāo)記稀釋液、熒光增強液、 濃縮洗液組成。
所述純化HBsAg包被板的制備將純化HBsAg以磷酸鹽緩沖液稀釋適當(dāng)比例 (0. 75-6pg/ml)后加入微孔板內(nèi)，100pl每孔，過夜后洗滌、封閉、干燥， 而后將包被板條裝入鋁箔袋內(nèi)，冷藏備用。
所述純化HBsAg銪標(biāo)記物的制備將純化HBsAg對碳酸鹽緩沖液透析后與 DTTA-Eu以1 : 5的比例混合，靜置18小時后經(jīng)S印hacryl S-200分離柱分 離DTTA-Eu與Ag-Eu，獲得銪標(biāo)記過的純化HBsAg。
所述乙型肝炎表面抗體校準(zhǔn)品的制備以中國藥品生物制品檢定所國家標(biāo)準(zhǔn)品 2mlU/ml、 5mlU/ml、 10mlU/ml標(biāo)定抗-HBs羊血清，然后稀釋成含量分別為 5mlU/ml、 10mlU/tnl、 40mIU/ml、 160mIU/ml、 640mIU/ml的校準(zhǔn)品，以lml/ 瓶裝量分裝即可。
所述熒光增強液的配制，以無水乙醇溶解f3-NTA、 TOPO，再加鄰苯二甲酸氫鉀和 三蒸水，4(TC溶解后，加入乙酸、Triton X-100，調(diào)TO值至3. 2，并定容。 所述使用方法包括以下乙型肝炎病毒表面抗體測定步驟
1. 試劑的準(zhǔn)備
(1) 洗滌液將40mL濃縮洗液和960mL去離子水在干凈的洗液瓶中混合，作為工 作洗滌液備用。
(2) 銪標(biāo)記物準(zhǔn)確吸取0.3ml去離子水充分溶解標(biāo)記物凍干品，并充分混勻， 使用前一小時內(nèi)用銪標(biāo)記稀釋液按l:50倍稀釋并一次用完(使用一次性的塑料 容器來配制)。
2. 將試劑及所需數(shù)量的微孔反應(yīng)條置室溫(室溫專指20-25。C范圍，下同)平3. 吸取lOOul抗-HBs校準(zhǔn)品及待檢樣本，按順序加入微孔反應(yīng)條小孔中并加貼 封片。
4. 微孔反應(yīng)條在室溫條件下，用振蕩儀緩慢振搖孵育40分鐘。
5. 在第一次孵育結(jié)束后，小心將微孔反應(yīng)條上的封片揭下并棄掉，將微孔反應(yīng) 條放入洗板機吸干各孔并每孔注入洗滌液400ul，再吸干各孔，重復(fù)以上洗滌4 次，最后一次將微孔反應(yīng)條拍干。
6. 每孔中加入100ul銪標(biāo)記物工作液，并加貼封片。
7. 微孔反應(yīng)條在室溫條件下，用振蕩儀緩慢振搖孵育40分鐘。
8. 第二次孵育結(jié)束后，小心將微孔反應(yīng)條上的封片揭下并棄掉，將微孔反應(yīng)條 放入洗板機吸干各孔并每孔注入洗滌液400ul，再吸干各孔，重復(fù)以上洗滌6次， 最后一次將微孔反應(yīng)條拍干。
9. 每一孔中加入增強液100ul (加樣過程中避免碰到小孔邊緣或其中的試劑， 盡量避免污染)，并加貼封片。
10. 微孔反應(yīng)條在室溫下，用振蕩儀輕搖5分鐘(在半小時內(nèi)完成測定)。
11. 使用乙肝表面抗體定量測定試劑盒時必須使用6個校準(zhǔn)品，或者使用兩點定 標(biāo)方法。每次更換批號時必須使用試劑盒所提供的6個校準(zhǔn)品作出曲線(雙對 數(shù))，校準(zhǔn)品復(fù)孔使用以保證準(zhǔn)確性。血樣中抗一HBs濃度通過標(biāo)定曲線得出。
與已有乙型肝炎病毒表面抗體檢測試劑盒相比，本發(fā)明試劑盒具有以下優(yōu)點
A. 以DTTA-Eu為標(biāo)記物，采用時間分辨熒光檢測的方式，使檢測靈敏度更高；
B. 定量測定血清中乙肝表面抗體的含量，更加準(zhǔn)確；
C. 以mlU/ml為單位，檢測結(jié)果與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌，便于推廣。


附圖為抗一HBs濃度標(biāo)定曲線
具體實施例方式
一種定量檢測乙型肝炎病毒表面抗體的試劑盒，試劑盒由乙型肝炎表面抗體校準(zhǔn) 品、純化HBsAg包被反應(yīng)板、銪標(biāo)記純化冊sAg、銪標(biāo)記稀釋液、熒光增強液、
濃縮洗液組成。
所述純化HBsAg包被板的制備將純化HBsAg以磷酸鹽緩沖液稀釋適當(dāng)比例(0. 75-6pg/ml)后加入微孔板內(nèi)，100nl每孔，過夜后洗滌、封閉、干燥， 而后將包被板條裝入鋁箔袋內(nèi)，冷藏備用。
所述純化HBsAg銪標(biāo)記物的制備將純化HBsAg對碳酸鹽緩沖液透析后與 DTTA-Eu以1 : 5的比例混合，靜置18小時后經(jīng)S印hacryl S-200分離柱分 離DTTA-Eu與Ag-Eu，獲得銪標(biāo)記過的純化HBsAg。
所述乙型肝炎表面抗體校準(zhǔn)品的制備以中國藥品生物制品檢定所國家標(biāo)準(zhǔn)品 2mlU/ml、 5ralU/ml、 10mIU/ml標(biāo)定抗-朋s羊血清，然后稀釋成含量分別為 5mlU/ral、 10mIU/ml、 40mIU/ml、 160mIU/ml、 640mIU/ml的校準(zhǔn)品，以lml/ 瓶裝量分裝即可。
所述熒光增強液的配制，以無水乙醇溶解e-NTA、 TOPO，再加鄰苯二甲酸氫鉀和 三蒸水，4(TC溶解后，加入乙酸、Triton X_100、，調(diào)PH值值至3.2，并定容。 所述使用方法包括以下乙型肝炎病毒表面抗體測定步驟
1. 試劑的準(zhǔn)備
(1) 洗滌液將40mL濃縮洗液和960raL去離子水在干凈的洗液瓶中混合，作為工 作洗滌液備用。
(2) 銪標(biāo)記物準(zhǔn)確吸取0.3ml去離子水充分溶解標(biāo)記物凍干品，并充分混勻， 使用前一小時內(nèi)用銪標(biāo)記稀釋液按l:50倍稀釋并一次用完(使用一次性的塑料 容器來配制)。
2. 將試劑及所需數(shù)量的微孔反應(yīng)條置室溫(室溫專指20-25'C范圍，下同)平 衡。
3. 吸取100ul抗-HBs校準(zhǔn)品及待檢樣本，按順序加入微孔反應(yīng)條小孔中并加貼 封片。
4. 微孔反應(yīng)條在室溫條件下，用振蕩儀緩慢振搖孵育40分鐘。
5. 在第一次孵育結(jié)束后，小心將微孔反應(yīng)條上的封片揭下并棄掉，將微孔反應(yīng) 條放入洗板機吸干各孔并每孔注入洗滌液400ul，再吸干各孔，重復(fù)以上洗滌4 次，最后一次將微孔反應(yīng)條拍干。
6. 每孔中加入100ul銪標(biāo)記物工作液，并加貼封片。
7. 微孔反應(yīng)條在室溫條件下，用振蕩儀緩慢振搖孵育40分鐘。
8. 第二次孵育結(jié)束后，小心將微孔反應(yīng)條上的封片揭下并棄掉，將微孔反應(yīng)條
6放入洗板機吸干各孔并每孔注入洗滌液400ul，再吸干各孔，重復(fù)以上洗滌6次， 最后一次將微孔反應(yīng)條拍干。
9. 每一孔中加入增強液lOOul (加樣過程中避免碰到小孔邊緣或其中的試劑， 盡量避免污染)，并加貼封片。
10. 微孔反應(yīng)條在室溫下，用振蕩儀輕搖5分鐘(在半小時內(nèi)完成測定)。
11. 使用乙肝表面抗體定量測定試劑盒時必須使用6個校準(zhǔn)品，或者使用兩點定 標(biāo)方法。每次更換批號時必須使用試劑盒所提供的6個校準(zhǔn)品作出曲線(雙對 數(shù))，校準(zhǔn)品復(fù)孔使用以保證準(zhǔn)確性。血樣中抗一HBs濃度通過標(biāo)定曲線得出， 參照附圖。
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒表面抗體定量檢測診斷試劑盒，其特征是試劑盒由乙型肝炎表面抗體校準(zhǔn)品、純化乙型肝炎表面抗原包被反應(yīng)板、銪標(biāo)記純化乙型肝炎表面抗原、銪標(biāo)記稀釋液、熒光增強液、濃縮洗液組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗體定量測定診斷試劑盒，其特征 是所述純化乙型肝炎表面抗原包被板的獲得將純化乙型肝炎表面抗原以磷酸鹽緩沖液稀釋至濃度為0. 75-6pg/ml后加入微孔板內(nèi)，100pl每孔， 過夜后洗滌、封閉、干燥，而后將包被板條裝入鋁箔袋內(nèi)，冷藏備用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗體定量測定診斷試劑盒，其特征是所述純化乙型肝炎表面抗原銪標(biāo)記物的獲得將純化乙型肝炎表面抗原對碳酸鹽緩沖液透析后與Nl-(P-異硫氰基芐基)-二乙三胺四乙酸銪鈉以 1 : 5的比例混合，靜置18小時后經(jīng)聚丙烯酰胺葡聚糖S-200分離柱分 離Nl-(P-異硫氰基芐基)-二乙三胺四乙酸銪鈉與銪標(biāo)記抗體，獲得銪 標(biāo)記過的純化乙型肝炎表面抗原。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗體定量測定診斷試劑盒，其特征 是所述乙型肝炎表面抗體校準(zhǔn)品的獲得以中國藥品生物制品檢定所國家標(biāo) 準(zhǔn)品2mlU/ml、 5mlU/ml、 10mIU/ml標(biāo)定乙型肝炎表面抗體羊血清，然后稀釋 成含量分別為5mlU/ml、 10mlU/ml、 40mIU/ml、 160raIU/ml、 640mIU/ml 的校準(zhǔn)品，以lml/瓶裝量分裝即可。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗體定量測定診斷試劑盒，其特征是所述熒光增強液的獲得以無水乙醇溶解e -萘酰三氟丙酮、三辛基氧化膦，再加鄰苯二甲酸氫鉀和三蒸水，4CTC溶解后，加入乙酸、壬_ (乙二醇)苯辛 基醚，調(diào)PH值至3.2，并定容。
全文摘要
本發(fā)明目的在于提供一種定量檢測乙型肝炎病毒表面抗體的試劑盒，主要解決進口發(fā)光免疫檢測方法成本過高的技術(shù)問題。試劑盒由乙型肝炎表面抗體校準(zhǔn)品、純化HBsAg包被反應(yīng)板、銪標(biāo)記純化HBsAg、銪標(biāo)記稀釋液、熒光增強液、濃縮洗液組成，應(yīng)用銪標(biāo)記與時間分辨免疫熒光定量檢測技術(shù)，結(jié)合時間分辨熒光檢測儀，定量檢測血清中的乙型肝炎病毒表面抗體。應(yīng)用時間分辨免疫熒光技術(shù)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有操作簡單、靈敏度高、特異性好、無污染等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/576GK101614738SQ200810043550
公開日2009年12月30日 申請日期2008年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日
發(fā)明者吳馮波, 唐曉燕, 陳煌輝 申請人:上海新波生物技術(shù)有限公司