專利名稱：：檢測日本血吸蟲抗體的elisa試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，尤其涉及檢測日本血吸蟲抗體的ELISA試劑盒，及對應(yīng)的檢測方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：日本血吸蟲病是一種廣泛流行于亞洲的中國、菲律賓等國家的人畜共患寄生蟲病，目前針對日本血吸蟲病只有一種有效的治療藥物一吡喹酮。由于長期大規(guī)模使用這種藥物，有可能使血吸蟲產(chǎn)生抗藥性，血吸蟲病的診斷仍然是防治血吸蟲病的重要手段。血吸蟲的診斷技術(shù)是尋找并確定指示血吸蟲在機(jī)體存在的直接或間接的證據(jù)，為血吸蟲感染的臨床診斷提供依據(jù)。通過診斷結(jié)果還可以了解疾病的傳播情況，有可能在感染的初期及時發(fā)現(xiàn)，隨即采取相應(yīng)的措施有效地控制疾病的大規(guī)模傳播。雖然KatoKatz的糞檢方法仍然是日本血吸蟲病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法在中度或低度血吸蟲病流行區(qū)域的敏感性并不令人滿意，漏檢率較高。另外，在評估血吸蟲病流行情況尤其是連續(xù)收集同一個體的糞樣時，有些居民對于反復(fù)檢査顯得并不是十分配合。為了解決這一問題，至今逾半個世紀(jì)研究者們一直致力于免疫學(xué)診斷方法的研究，研制出來多種免疫學(xué)診斷方法并做了相關(guān)的優(yōu)化。據(jù)估計，中國血吸蟲病免疫學(xué)診斷方法的數(shù)量為全球之最。免疫學(xué)診斷因其良好的敏感性、特異性以及實用性等優(yōu)點，已經(jīng)成為當(dāng)前血吸蟲病的常用診斷方法。目前常用于日本血吸蟲病的免疫診斷方法主要包括間接血凝試驗(IHA)、免疫酶聯(lián)吸附試驗(ELISA)、膠體金標(biāo)記技術(shù)等。免疫酶聯(lián)吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)是以酶標(biāo)記的抗體或抗原為主要試劑的檢測方法，屬于一種標(biāo)記免疫技術(shù)，在各種診斷方法中，ELISA是人們研究的最為詳細(xì)的一種。1971年Engvall和Perlmann用ELISA對IgG進(jìn)行了定量的測定。嚴(yán)自助和呂再纓首先用ELISA檢測日本血吸蟲感染家兔的特異性抗體，取得較好的效果(嚴(yán)自助，呂再嬰.免疫酶標(biāo)記技術(shù)及應(yīng)用的初步研究.中華醫(yī)學(xué)雜志，1978,88:470-473)。由于循環(huán)抗體在患者接受有效治療后仍可以長期存在故不能區(qū)別現(xiàn)癥感染和既往感染，不宜作療效考核之用，而循環(huán)抗原常提示有活蟲存在，因此一般認(rèn)為可通過檢測循環(huán)抗原來判斷現(xiàn)癥患者和考核療效。隨著雜交瘤技術(shù)的引入，多用特異性較高的單抗檢測循環(huán)抗原。在我國多種單克隆抗體被用于研究檢測血吸蟲病患者體內(nèi)的循環(huán)抗原，但對低感染度的受檢者，檢測循環(huán)抗原的靈敏度是尚有待于解決的難題。曾報導(dǎo)的有:McAblIID10(婁文嫻，錢宗立，薛純良，等.抗日本血吸蟲單克隆抗體的制備及其在診斷中的應(yīng)用.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1991,9(4):254-257)、1B10A(嚴(yán)自助，呂再纓，王文，等.單克隆抗體Dot-ELISA檢測血吸蟲病循環(huán)抗原的研究II.中國血吸蟲病防治雜志，1990，2(2):39-41)、3D8A(嚴(yán)自助，王文，呂再纓，等.單克隆抗體Dot-ELISA檢測日本血吸蟲病循環(huán)抗原的研究I.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，19卯，8(3):161-163)、8SE4(裘麗姝，薛海籌，陸鍵，等.抗血吸蟲成蟲表膜抗原單克隆抗體檢測循環(huán)抗原及免疫復(fù)合物的實驗研究.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1990,8(3):177-179)、NP30(管曉紅，仇鎮(zhèn)寧，馬磊，等.日本血吸蟲單克隆抗獨特型抗體NP30的建株及初步鑒定.中國寄生蟲病與寄生蟲血雜志，1991,9(4):261-264)等，但這些單克隆抗體對于慢性血吸蟲病患者的敏感性仍然有待提高。傳統(tǒng)制備單克隆的方法是通過雜交瘤技術(shù)獲得只分泌一種特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，ChenDX等人用構(gòu)建噬菌體展示抗體文庫的方法來制備單克隆抗體，為了獲得抗血吸蟲的一種單鏈可變片段抗體(sc-Fv)，所構(gòu)建的文庫用ELISA的方法以日本血吸蟲成蟲代謝抗原來檢測，結(jié)果顯示了sc-Fv在血吸蟲診斷中的潛在價值，同時也為大批量制備抗日本血吸蟲單克隆抗體提供了一種新的選擇。裘麗姝等用多抗和單抗夾心ELISA法檢測日本血吸蟲病患者血清循環(huán)抗原，在受檢的150例血吸蟲病患者中，敏感性平均為84.7%，40例正常人未出現(xiàn)假陽性反應(yīng)74例其他寄生蟲感染者中，有2例并殖吸蟲病患者陽性，其余均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，結(jié)果表明該法是一種較為理想的循環(huán)抗原檢測方法(裘麗姝，馮正，張永紅，等.多克隆抗體與單克隆抗體夾心ELISA法檢測日本血吸蟲病患者血清循環(huán)抗原[J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2000,18(2):92-93)。如今ELISA已經(jīng)發(fā)展成為了一種類型眾多的免疫學(xué)診斷方法。1.斑點畫ELISA(Dot畫ELISA)Dot-ELISA以硝酸纖維素膜作為載體，吸附微量抗原與受檢樣品反應(yīng)加入二抗顯色后用肉眼即可判斷結(jié)果，不需要特殊儀器，比較適合用于現(xiàn)場。中國寄生蟲病預(yù)防控制所(1986)首先用該法診斷日本血吸蟲病，在受檢的63名確診血吸蟲病人的陽性率為89%97%，65名健康人均為陰性。Janitschke等報道Dot-ELISA具有較高的特異性和敏感性。國內(nèi)研究者用抗CCA的單克隆抗體來檢測血吸蟲病人體內(nèi)的循環(huán)抗原，對急性和慢性血吸蟲病患者的敏感性分別為90.6%和83.2%,在非疫區(qū)人員檢測中沒有發(fā)現(xiàn)假陽性反應(yīng)，和其他寄生蟲病的交叉反映也很低，并且與絕大多數(shù)治愈后一年的患者都呈陰性反應(yīng)，表明這種方法可以用于療效期的考核，接下來研究人員進(jìn)行大量的研究工作和實驗，使得Dot-ELISA廣泛地應(yīng)用于現(xiàn)場。沈定文等利用Dot-ELISA檢測急性日本血吸蟲病患者血清特異性IgG抗體，并用常規(guī)ELISA作對照，Dot-ELISA和常規(guī)ELISA的陽性率分別為94.0%和97.4%，高于糞檢測的陽性率(92.3%)，兩法檢測結(jié)果的符合率為97.2%，結(jié)果表明兩法在檢測的敏感性和特異性方面相似，檢測結(jié)果無顯著差異，而Dot-ELISA操作簡便，診斷快速，具有一定的實用診斷價值(沈定文，陳嘉圭，等.Dot-ELISA快速檢測日本血吸蟲病的實驗研究.咸寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2001，15(1):36-38)。2.快速-ELISA(FAST-ELISA)在1986年，Hancock禾口Tsang首先將美國FalconAssayScreeningTest系統(tǒng)(簡稱FAST系統(tǒng))引用于動力學(xué)酶標(biāo)測定，用以檢測曼氏血吸蟲病患者血清中抗曼氏血吸蟲成蟲微?？乖@得滿意結(jié)果。王秀珍等(王秀珍,黎世濤.快速ELISA診斷血吸蟲病的研究及應(yīng)用.中國血吸蟲防治雜志,1990,2(4):31-35)對Fast-ELISA進(jìn)行了一系列的研究，并研制成為試劑盒，其敏感性為93.88%96.39%，特異性為94%99.22%，Youden指數(shù)為0.93，其重復(fù)性也達(dá)到了90%以上，與其他寄生蟲病的交叉反應(yīng)較低。另外，深圳康百得公司研制的Fast-ELISA試劑盒較為成熟，在全國各大疫區(qū)普遍使用。與傳統(tǒng)的ELISA相比，F(xiàn)ast-ELISA整個操作時間僅需20-30分鐘，無需攜帶專門儀器，但在療效考核期上稍有所欠缺。3.生物素一親和素ELISA(ABC-ELISA)生物素一親和素酶聯(lián)免疫吸附試驗(avidinbiotincomplexELISA,ABC-ELISA)是一種借助了親和素和生物素之間極強的親和力的免疫學(xué)診斷方法，既具有免疫反應(yīng)的特異性，又比常規(guī)標(biāo)記物的靈敏度提高數(shù)倍，有助于低抗體水平患者的診斷。研究者用單克隆抗體純化過的循環(huán)陰極抗原(CCA)建立的ABC-ELISA來檢測日本血吸蟲病患者血清中的特異性抗體，其特異性高達(dá)99.0%，在急性患者和慢性患者的敏感性分別可達(dá)96.2%和94.1%。其高度的特異性和敏感性是其它ELISA法不可比擬的，整個反應(yīng)時間僅需1.5h,并且該法可重復(fù)，在現(xiàn)場診斷中具有較大的應(yīng)用價值，國內(nèi)相關(guān)的報道較少(張悟澄，曾慶仁，周金春，等.應(yīng)用生物素-親和素系統(tǒng)診斷日本血吸蟲病.寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1986,4(1):8-11)。由于ABC-ELISA的標(biāo)記物昂貴，并且由于其高度靈敏，在提高陽性反應(yīng)的同時也有可能提高本底反應(yīng)，目前還沒有廣泛應(yīng)用。血吸蟲病免疫學(xué)診斷方法的靈敏度與特異性，除與選擇實驗的方法的不同有關(guān)外，主要與所用診斷抗原的特性有關(guān)。目前常用粗制的成蟲與蟲卵抗原用于血吸蟲病診斷的敏感性雖較高[MottKE，DixonN,CarterCE,etal.collaborativestudyonantigensforimmunodiagnosisofschistosomajaponicuminfection.BullWHO,1987，65(2):233-244]，但由于其?；煊兴拗骺乖昂衅渌纳x如肝吸蟲、肺吸蟲的共有抗原成分，易產(chǎn)生交叉應(yīng)，特異性較低[馮正，裘麗姝，陳名剛等.從平行檢測和監(jiān)測結(jié)果分析我國血吸蟲病診斷試劑的現(xiàn)狀.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志.1998;16(5):321-325]。此外由于傳統(tǒng)抗原多為蟲源性，來源較少，耗資大，難以適應(yīng)大規(guī)模査病的需要。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，用基因重組方法生產(chǎn)合成抗原用于診斷寄生蟲病已成為可能，國內(nèi)外也有研究證實，使用血吸蟲特異性的、純化的天然或重組的抗原不僅可以提高血吸蟲病診斷的敏感性和特異性，而且檢測抗某些特異抗原的短程抗體具有一定的療效考核價值。通過基因工程方法制備抗原，所獲抗原純度高，可以大量生產(chǎn)，易于質(zhì)量控制。不僅可以解決大量診斷抗原的來源，而且利于檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化。SJE16與曼氏血吸蟲的SME16基因具有較高的同源性。SME16被認(rèn)為是蟲卵階段特異的鈣結(jié)合蛋白，但其在蟲卵中的功能尚不清楚。1992年Moser在體外重組表達(dá)了曼氏血吸蟲蟲卵中的一種鈣結(jié)合蛋白Sml6(SME16)，該蛋白可為免疫兔血清識別，被認(rèn)為是一種具潛力的診斷抗原。其后Rao的研究發(fā)現(xiàn)Sml6具有抗感染的作用，是一種免疫調(diào)節(jié)蛋白在血吸蟲的免疫逃避中起著重要作用，重組表達(dá)的Sml6具有強烈的免疫活性可為多克隆的免疫兔血清所識別。值得注意的是，鈣結(jié)合蛋白是一類重要的參與調(diào)節(jié)細(xì)胞活動的蛋白家族，該類蛋白與耙蛋白結(jié)合后可使后者發(fā)生構(gòu)象改變，從而激發(fā)一系列生物學(xué)反應(yīng)，如肌肉收縮、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、酶激活和細(xì)胞生長等[SilvaAC,ReinachFC.Calciumbindinginducesconformationalchangesinmuscleregulatoryproteins.TrendsBiochemSci1991;16(2):53-7]。鑒于SME16在蟲卵中的高表達(dá)和f丐結(jié)合蛋白的重要生理功能，有理由認(rèn)為，SME16在調(diào)節(jié)蟲卵細(xì)胞活動過程中必然發(fā)揮著重要而獨特的作用。有意思的是SME16與童蟲、成蟲特異的鈣結(jié)合蛋白sm20[AvercroftJC,HugginsMC,DunneDW,etal.CharacterisationofSm20，a20-kilodaltoncalcium-bindingproteinofSchistosomamanoni.MolBiochemParasitol1990;38(2):211-9]以及尾呦特異的8-KDaf丐結(jié)合蛋白[AmD，GrossmanZ,MarkovicsA，etal.RapidchangesintheexpressionofageneencodingacalciumbindingproteininSchistosomama謂ni.MolBiochemParasitol1989;34(2):167-75]除了具有相似的鈣結(jié)合位點外，相互之間并不具有明顯的同源性。免疫素(Immunophilin)是免疫抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)的受體，屬FK506結(jié)合蛋白(FKBP)超家族，與熱休克結(jié)合免疫素p59等結(jié)構(gòu)相似。其具有肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPIase)活性，是蛋白折疊中重要的伴侶分子，并可與多種胞內(nèi)受體蛋白結(jié)合。存在于血吸蟲體內(nèi)的免疫素可與人體內(nèi)FKBP12相互作用，在血吸蟲感染中起重要作用。由于SJP50和Smp50在核苷酸水平氨基酸水平上的一致性達(dá)到了71%，可認(rèn)為他們很可能也具有相似的功能。Smp50的研究顯示P50屬FK506結(jié)合蛋白(免疫素)超家族，與熱休克結(jié)合免疫素P59等結(jié)構(gòu)相似，具有PPIase活性，可幫助血吸蟲體內(nèi)的蛋白組裝和蛋白折疊，而且能夠與熱休克蛋白90相互作用，一起構(gòu)成類固醇激素受體復(fù)合物的成分。已知宿主的激素對血吸蟲的生長發(fā)育有調(diào)節(jié)作用，但到目前為止，人們尚未直接證據(jù)表明血吸蟲體內(nèi)有類固醇激素受體存在。而SJP50和Smp50的存在可能對驗證類固醇受體提供一些支持。以前的研究顯示，P50可以被曼氏血吸蟲可溶性抽提物以及表皮抽提物所識別，說明Smp50可能存在于表皮，且抗P50的抗血清不能識別Hda細(xì)胞和大腸桿菌的抽提物，說明來源于不同物種的FKBP雖然在一般結(jié)構(gòu)上有許多相似性，但在全部結(jié)構(gòu)以及序列上的差異足以產(chǎn)生不同的抗體反應(yīng)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種具有高敏感性和特異性的快速檢驗日本血吸蟲病的試劑盒，以及對應(yīng)的檢測方法和應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供一種檢測日本血吸蟲抗體的ELISA試劑盒，包括己包被日本血吸蟲抗原的固相載體、酶標(biāo)記的日本血吸蟲抗原、酶的底物、陰性對照品和陽性對照品、包被液、洗滌液以及酶反應(yīng)終止液，所述固相載體上包被的日本血吸蟲抗原來源于重組的抗原蛋白SJE16或SjP50，所述的重組的抗原蛋白SJE16具有SEQIDNO:l所示的氨基酸序列，所述的抗原蛋白SJP50具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。所述的包被液采用碳酸鈉和氫氧化鈉的混合溶液。優(yōu)選地，所述的包被液通過1.5g的碳酸鈉和2.9g的氫氧化鈉混合定容至1000ml時制得。所述的酶標(biāo)記抗原分為兩種，包括1號酶結(jié)合物，采用生物素標(biāo)記的抗人IgG(H+L)(BiotinylatedAnti-HumanIgG(H+L));1號酶結(jié)合物的工作溶液配置用樣本稀釋液按1:10000比例稀釋，充分混勻，即配置成1號酶結(jié)合物工作溶液，此處需要即用即配；2號酶結(jié)合物，采用辣根過氧化物酶鏈(霉)親和素(HorseradishPeroxidaseStreptavidin);2號酶結(jié)合物的工作溶液配置用樣本稀釋液按1:5000比例稀釋，充分混勻，即配置成2號酶結(jié)合物工作溶液，此處亦需要即用即配。所述的酶反應(yīng)終止液采用硫酸溶液。在本發(fā)明的另一個方面，提供一種檢測日本血吸蟲抗體檢測方法，包含如下步驟1、樣本稀釋用樣本稀釋液將待檢血清按1:100稀釋；2、加樣反應(yīng)(1)、樣本檢測孔每孔分別加已稀釋樣本血清100ul，每個樣本平行檢測2孔，同時設(shè)陰性、陽性及空白對照各2孑L，取陰性、陽性對照品各100ul分別加入反應(yīng)孔內(nèi)，空白對照孔僅加入100ul樣本稀釋液；(2)、37"C避光反應(yīng)60分鐘后甩去孔內(nèi)液體，每孔用樣本稀釋液或洗滌液注滿，立即甩去，再注滿樣本稀釋液或洗滌液，靜置2分鐘，鬼去液體，重復(fù)洗滌3次，每次均需靜置2分鐘，最后一次甩去拍干；3、加酶反應(yīng)(1)、每孔加1號酶結(jié)合物的工作溶液100ul，37。C避光反應(yīng)60分鐘后甩去孔內(nèi)液體，如上洗滌，拍干；(2)、每孔加2號酶結(jié)合物的工作溶液100ul，37。C避光反應(yīng)30分鐘后甩去孔內(nèi)液體，如上重復(fù)5次洗滌，拍干；4、顯色反應(yīng)每孔加配好的底物顯色液100ul，室溫反應(yīng)1分30秒，加終止液50ul，混勻，終止反應(yīng)，立即用酶標(biāo)儀測讀；5、酶標(biāo)儀測讀數(shù)將已終止反應(yīng)的酶標(biāo)板立即測讀，以空白對照調(diào)零于490nm讀取OD值。在本發(fā)明的另一個方面，提供上述ELISA試劑盒在檢測血吸蟲病中的應(yīng)用。本發(fā)明的檢測日本血吸蟲抗體的ELISA試劑盒及檢測方法在防治和治療日本血吸蟲病中有著重要的作用。具體實施例方式以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1日本血吸蟲病酶聯(lián)診斷試劑盒的制備1.包被抗原的固相載體固相載體可以選用聚苯乙烯或聚氯乙烯，采用微量滴定板或小試管的形式。將抗原蛋白SJE16或SJP50包被于聚苯乙烯或聚氯乙烯反應(yīng)孔中。1.溶液配制3.1包被緩沖液的制備將1.5gNaC03和2.9gNaHC03加蒸餾水定容至1000ml。3.2制備酶結(jié)合物(酶標(biāo)記抗原)這里酶標(biāo)記抗原分為兩種，包括1號酶結(jié)合物，采用生物素標(biāo)記的抗人IgG(H+L)BiotinylatedAnti-HumanIgG(H+L)。(VectorLaboratories,CAT:BA-3000)1號酶結(jié)合物的工作溶液配置用樣本稀釋液按l:10000比例稀釋，充分混勻，即配置成1號酶結(jié)合物工作溶液，此處需要即用即配。2號酶結(jié)合物，采用辣根過氧化物酶鏈(霉)親和素HorseradishPeroxidaseStreptavidin。(VectorLaboratories,CAT:SA-5004)2號酶結(jié)合物的工作溶液配置用樣本稀釋液按l:5000比例稀釋，充分混勻，即配置成2號酶結(jié)合物工作溶液，此處亦需要即用即配。3.3酶的底物液(顯色液)a.OPD儲存液的配置將C6H807'H20(檸檬酸)2.1g，OPD(鄰苯二胺)混合，稀釋到100ml的蒸餾水定容，并小分量分裝，于-20。C環(huán)境下凍存。b.將0.1M的Na2HP0442H20重量為7.2g，稀釋到200ml蒸餾水定容。在使用時，將a溶液取出融解，并將a、b于a:b^:2的配比混合，再加入3%的過氧水&02G0ul/10ml)即配置成酶的底物液。3.4樣本稀釋液或洗滌液配置選用如下樣品及重量1)Na2HP04*12H2011.6g2)NaH2P04*2H201.2g3)NaCl18g4)Tween-202ml5)Water2000ml配置成為樣本稀釋液。3.5終止液配置選用100ml蒸餾水，并將12.4ml112804加入蒸餾水中，混合過程需緩慢進(jìn)行，配置成2M的H2S04終止液。實施例2檢測方法及操作程序1.樣本稀釋用樣本稀釋液將待檢血清按l:100稀釋，如將5ul血清中加入500ul稀釋液，充分混勻。陰、陽對照品不用稀釋。2.加樣反應(yīng)2.1樣本檢測孔每孔分別加已稀釋樣本血清100ul，建議每個樣本平行檢測2孔。同時設(shè)陰性、陽性及空白對照各2孔，取陰性、陽性對照品各100ul分別加入反應(yīng)孔內(nèi)，空白對照孔僅加入100ul樣本稀釋液。2.237"C避光反應(yīng)60分鐘后甩去孔內(nèi)液體，每孔用樣本稀釋液或洗滌液注滿，立即甩去，再注滿樣本稀釋液或洗滌液，靜置2分鐘，甩去液體，重復(fù)洗滌3次，每次均需靜置2分鐘，最后一次甩去拍干。3.加酶反應(yīng)3.1每孔加1號酶結(jié)合物的工作溶液(即用即配)100ul，37X:避光反應(yīng)60分鐘后甩去孔內(nèi)液體，如上洗滌，拍干。3.2每孔加2號酶結(jié)合物的工作溶液(即用即配)100ul，37。C避光反應(yīng)30分鐘后甩去孔內(nèi)液體，如上重復(fù)5次洗滌，拍干。4.顯色反應(yīng)每孔加配好的底物顯色液100ul，室溫反應(yīng)1分30秒。加終止液50ul，混勻，終止反應(yīng)。立即用酶標(biāo)儀測讀。5.酶標(biāo)儀測讀數(shù)將已終止反應(yīng)的酶標(biāo)板立即測讀，以空白對照調(diào)零于490nm讀取OD值。這里需要注意的是，本體系顯色反應(yīng)快，在顯色、終止及測取讀數(shù)時，必須每塊逐次進(jìn)行，否則極易造成誤差。6.結(jié)果判斷儀器判斷待檢孔OD值大于或等于陰性對照2.1倍者為陽性。當(dāng)陰性對照OD值低于0.05時按0.05計算。7.注意事項(1)在使用排槍加樣時，必須避免槍頭觸及ELISA板孔內(nèi)壁；(2)試劑盒在2-8"C下保存，其中1號酶結(jié)合物(1號液)、底物(3號液)、陰性對照品、陽性對照品需保存于-2(TC，每次取出時先平衡至室溫后使用；(3)洗滌時將稀釋液或洗滌液注滿孔內(nèi)，每次停放2分鐘后甩去孔內(nèi)液體。禁用自來水等其它水源。實施例3進(jìn)一步將人體血清作為陰性對照和陽性對照品對本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢驗，并與常用的試劑盒進(jìn)行對比，以得出本試劑盒的檢驗效果及臨床上的應(yīng)用前景。1.評價重組抗原SjP50和SjE16用于治療前后疫區(qū)人群ELISA診斷的敏感性和療效采血方法以江西、四川、安徽、湖北四省的疫區(qū)人群為采血對象江西、四川、安徽(用于療效考核的現(xiàn)場評估)(1)選擇一定數(shù)量的糞檢陽性者(A組)和孵化法確認(rèn)的糞檢陰性者(B組)；在治療前采集第一次血樣，同時治療A組。(2)化療后3、4(江西、四川)、5(安徽)個月用集卵孵化法復(fù)檢A組和B組，采集A組孵化陰性者和B組孵化陰性者的第二次血樣。湖北(日本血吸蟲病診斷試劑盒現(xiàn)場考核)在疫區(qū)采集562人份血樣，對這562人用改良加藤法進(jìn)行蟲卵計數(shù)(二送三檢)，對糞檢陰性者進(jìn)行集卵孵化。全部血樣重新編號，達(dá)到單盲法(湖北)、雙盲法(江西、四川、安徽)的要求。2.ELISA檢測2.1血吸蟲病檢測試劑盒采用深圳康百得試劑公司出品的檢測試劑合2.2實驗室檢測診斷抗原SjP50、SjE162個蛋白等比例聯(lián)合包被ELISA:生物素/親和素陽性標(biāo)準(zhǔn)以非疫區(qū)(北京)正常人的血清為參照。3.統(tǒng)計結(jié)果對四個現(xiàn)場采集的血樣分別采用單盲法、雙盲法進(jìn)行了ELISA的檢測，檢測的總樣本數(shù)為1506例，其中江西424例、四川409例、安徽111例、湖北562例，同時，選用經(jīng)考核評選后，被推薦用于每年血吸蟲病流行區(qū)疫情監(jiān)測的ELISA試劑盒進(jìn)行同步檢測。結(jié)果表明，以對重組抗原用于日本血吸蟲病診斷試劑盒現(xiàn)場考核為目的(湖北)的血清組ELISA結(jié)果聯(lián)合抗原的敏感性達(dá)到97.3%，接近商品試劑盒的敏感性(98.6%)高于單個抗原的敏感性，而SjP50特異性達(dá)到31.1%，高于聯(lián)合抗原(27.4%)和試劑盒(27.2°/。)。以評價重組抗原用于疫區(qū)療效考核為目的的血清(江西組、四川組、安徽組)的檢測結(jié)果治療后3個月的轉(zhuǎn)陰率江西組SjE為20.3%、SjP50為15.3。/。、聯(lián)合抗原為10.9%、試劑盒為0，四川組SjE的為23.5。/。、SjP50為22.4。/。、聯(lián)合抗原為12%、試劑盒為1.6%;治療后4個月的轉(zhuǎn)陰率江西組SjE為11.4%、SJP50為18.1%、聯(lián)合抗原為7.6%、試劑盒為3.8%，四川組SjE為22.9。/。、SjP50為50。/。、聯(lián)合抗原為3.4%、試劑盒為1.5%;治療后5個月的轉(zhuǎn)陰率安徽組SjE為3.7%、SJP50為29.2%、聯(lián)合抗原為39.2%、試劑盒為9.7%。具體統(tǒng)計結(jié)果如下表1-4所示。表1.SJE16和SJP50ELISA診斷法在江西疫區(qū)療效考核的盲法評估結(jié)果診斷抗原糞檢EL1SANo.No.No.陽掛陽性率％化療后轉(zhuǎn)陰化療后轉(zhuǎn)陰受檢陽性糞陽性(非疫區(qū)(非疫區(qū)正常率％(非疫區(qū)正率％(疫區(qū)Kato正常人為對照)人為對照)常人為對照)陰性者為對照)3M4M3M4MSjE16412510382.420.311.427.143.2SjP5016412511088.015.318.151.561.4SjE+SjP5016412511692.810.97.623.438.5商品試劑盒(深圳康16412511692.803.803.8百得)_*表示以同時采集的疫區(qū)Kato陰性者為陰參對照，**表示以同時采集的疫區(qū)Kato陰性者為陰參照表2SjE和SJP50ELISA診斷法在四川疫區(qū)療效考核的盲法評估結(jié)果的評估結(jié)果診斷抗原糞檢EL1SA!No-No.陽No.No.陽誠檢陽性率》/。陰性符合化療后5M轉(zhuǎn)化療后5M轉(zhuǎn)受檢性陰性陽性(非疫區(qū)(非疫區(qū)正常率*/*(與陰率％(非疫陰率％(疫區(qū)正常人為對人為對照>糞檢)區(qū)正常人為Kato陰性者為照對照)對照)SjE1611140403587542.53.77.4SJP50111404032肌057.529.258.3SjE16+SjP50m404036卯.O47.539.275.0商品試劑盒m40404010022.59.7(深圳康百得)安敏省血防所iii40403895.017.50提供診斷試劑盒(IHA)18<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>康百得)*表示以非疫區(qū)正常人為對照，**表示以商品試劑盒提供的陰參為對照，無外源性陰參對照，表示以疫區(qū)糞檢陰性為對照，其中假陽性率ELISA假陽性數(shù)/糞檢陰性總數(shù)xl00%。4.結(jié)果分析目前血吸蟲病現(xiàn)場檢測通常采用尼龍絹集卵孵化法和改良加藤法(簡稱糞孵和加藤法)來確診病人，由于方法敏感性和其他干擾因素的影響，這兩種方法的檢測結(jié)果都不能如實的反映實際的患病人數(shù)。而病人在治愈后的很長時間，其抗體滴度仍維持在一個高水平。因此，一種操作簡便、敏感性和特異性較高的診斷試劑盒的開發(fā)對血吸蟲病的防治尤為重要。本發(fā)明通過對日木血吸蟲功能基因的研究發(fā)掘可能的診斷靶分子，利用分子生物學(xué)實驗室技術(shù)，獲得了2個具有診斷價值的重組蛋白，并通過對疫區(qū)人群的血清學(xué)檢測，結(jié)果表明，重組抗原可作為診斷試劑盒用于現(xiàn)場檢測，其敏感性接近成熟試劑盒，特異性略高于試劑盒。而作為療效考核的診斷檢測，其治療后3、4、5個月的轉(zhuǎn)陰率均高于試劑盒，因此，這2個重組抗原均有進(jìn)一步開發(fā)為診斷試劑盒的前景。序列表〈110〉中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所上海人類基因組研究中心<120〉檢測日本血吸蟲抗體的ELISA試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用<130〉NP-08-12557〈160〉2〈210〉1〈211〉145<212〉PRT〈213〉日本血吸蟲(6b/i"os謹(jǐn)力p。m'c，)<400>1MSDENRWIAVFNSLDKDGNKLLTRDEIEQCLKSLGVSESFAEKIIKETDL50NKDGKISLDEYLKALRKIPPRDKCSSVERWKEVFQSIDKDNSGKVSAKEL100DEFLKSTGND頂KSCLE匪ATND認(rèn)KDGELDYAEFLAYVRQTYE145〈210〉2〈211〉425<212〉PRT〈213〉日本血吸蟲(5b力j'W。扁a力/o/i，)<400〉2MSETPKQSEEEYLKDFIDLSPSGDRGILKKVVREGYSDIKPCDGDTVIVH50YVGTNFGGEKHGEVFDSSRA認(rèn)EKFEFTIGKGSVIKAWDIGVAT服LGEV100CELIASPEYAYMDGKSLKFEVELFETMGSDVSRNKDGSIRKSIIKKGRDI150HNPVAGAEATIVFRNLLNLTEETEVTYCVGDPPSNVPDELDQSVRH麗TG200EVSRIVVYKDGHSLTSGDSDKDRIVYELTLKSFEKTKHLSGITSFPERIA250YANTLKEKANNFLKDSKFDSAIELYKRLDDELQYVVANGPTRQRNCLGFT300VAVQLNLALVYLKLCKPRQCIEFCKKVLDNFSDNEKALFRIGQAHLLRKD350HEEAVVYFKGLYPKILTMHLLYNRFKSVRKRLEEPKDIERKKFRHIFERC400KDTGIKLDAQNHEDGVVVNDEKSAL4252權(quán)利要求1、一種檢測日本血吸蟲抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，包括已包被日本血吸蟲抗原的固相載體、酶標(biāo)記的抗原、酶的底物、陰性對照品和陽性對照品、包被液、洗滌液以及酶反應(yīng)終止液，所述的固相載體上包被的日本血吸蟲抗原來源于重組的抗原蛋白SjE16或SjP50，所述的重組的抗原蛋白SjE16具有SEQIDNO1所示的氨基酸序列，所述的抗原蛋白SjP50具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測日本血吸蟲抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述的包被液采用碳酸鈉和氫氧化鈉的混合溶液。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測日本血吸蟲抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述的包被液通過1.5g的碳酸鈉和2.9g的氫氧化鈉混合定容至1000ml時制得。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測日本血吸蟲抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述的酶標(biāo)記抗原分為兩種，包括1號酶結(jié)合物，采用生物素標(biāo)記的抗人IgG(H+L);1號酶結(jié)合物的工作溶液配置用樣本稀釋液按l:10000比例稀釋，充分混勻，即配置成1號酶結(jié)合物工作溶液，此處需要即用即配；2號酶結(jié)合物，采用辣根過氧化物酶鏈(霉)親和素；2號酶結(jié)合物的工作溶液配置用樣本稀釋液按l:5000比例稀釋，充分混勻，即配置成2號酶結(jié)合物工作溶液，此處亦需要即用即配。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測日本血吸蟲抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述的酶反應(yīng)終止液采用硫酸溶液。6、一種日本血吸蟲抗體的檢測方法，包含如下步驟步驟l、樣本稀釋用樣本稀釋液將待檢血清按l:100稀釋；步驟2、加樣反應(yīng)(1)樣本檢測孔每孔分別加已稀釋樣本血清100ul，每個樣本平行檢測2L同時設(shè)陰性、陽性及空白對照各2孔，取陰性、陽性對照品各100ul分別加入反應(yīng)孔內(nèi)，空白對照孔僅加入100ul樣本稀釋液；(2)37'C避光反應(yīng)60分鐘后甩去孔內(nèi)液體，每孔用樣本稀釋液或洗滌液注滿，立即甩去，再注滿樣本稀釋液或洗漆液，靜置2分鐘，甩去液體，重復(fù)洗滌3次，每次均需靜置2分鐘，最后一次甩去拍干；步驟3、加酶反應(yīng)(1)每孔加1號酶結(jié)合物的工作溶液lOOul,37。C避光反應(yīng)60分鐘后鬼去孔內(nèi)液體，如上洗滌，拍干；(2)每孔加2號酶結(jié)合物的工作溶液100ul，37"C避光反應(yīng)30分鐘后甩去孔內(nèi)液體，如上重復(fù)5次洗滌，拍干；步驟4、顯色反應(yīng)每孔加配好的底物顯色液100ul，室溫反應(yīng)1分30秒，加終止液50ul，混勻，終止反應(yīng)，立即用酶標(biāo)儀測讀；步驟5、酶標(biāo)儀測讀數(shù)將已終止反應(yīng)的酶標(biāo)板立即測讀，以空白對照調(diào)零于490nm讀取OD值。7、一種如權(quán)利要求1所述的ELISA試劑盒在檢測血吸蟲病中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測日本血吸蟲抗體的ELISA試劑盒，及對應(yīng)的檢測方法和應(yīng)用。本發(fā)明的ELISA試劑盒的抗原采用重組的日本血吸蟲抗原SjE16或抗原SjP50。本發(fā)明的檢測方法具有高敏感性和特異性，并能快速檢驗出日本血吸蟲病，本發(fā)明的ELISA試劑盒在血吸蟲病防治和診斷中擁有廣闊的應(yīng)用前景。文檔編號G01N33/535GK101685097SQ200810043808公開日2010年3月31日申請日期2008年9月26日優(yōu)先權(quán)日2008年9月26日發(fā)明者正馮,斌徐,王志勤,薇胡,韓澤廣申請人:中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所;上海人類基因組研究中心