專利名稱：一種蠶豆根尖細(xì)胞微核制片方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞微核制片方法，特別是涉及一種蠶豆根尖細(xì)胞微 核制片方法。
背景技術(shù)：
植物蠶豆(Wc/a/a^L)根尖細(xì)胞的染色體大，數(shù)量少，DNA含量多， 對誘變劑反應(yīng)敏感。蠶草根尖細(xì)胞微核技術(shù)是1982年由Francesca和Ma Te-Hsiu建立的，目前己在環(huán)境污染監(jiān)測和致突變劑檢測方面被中國、美國、 聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署(UNEPA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)等眾多的國家、地 區(qū)及國際組織認(rèn)可。中國國家環(huán)境保護總局2002年頒布的《水和廢水監(jiān)測 分析方法》中，將蠶豆根尖微核試驗列為在環(huán)境監(jiān)測與執(zhí)法過程中使用的B 類方法，并在蠶豆根尖微核試驗中提供了具體的席夫試染色制片方法，該 方法的歩驟是取約1厘米根尖一加卡諾氏固定液固定24小時一用蒸餾水 浸洗兩次，每次5分鐘一吸凈蒸餾水一加入5摩爾/升鹽酸，放入28'C水浴 鍋中水解25分鐘一用蒸餾水洗兩次，每次5分鐘一用席夫試液遮光染色12 分鐘一用S02洗滌液浸洗兩次，每次5分鐘一用蒸餾水浸洗5分鐘一用解 剖針截下1毫米長的根尖一 滴上少許45%的乙酸溶液一用解剖針搗碎根尖 —壓片一觀察。這種微核制片方法的步驟多，試驗耗時長，藥品花費量大， 并且由于席夫試染液的配制、使用過程中都需要遮光，給試驗增加了一定 的難度；另外由于蠶豆根尖細(xì)胞用濃鹽配進(jìn)行離析的時間很難掌握，在試 驗過程中常造成根尖細(xì)胞時而離析不夠，細(xì)胞不能壓成單層；時而離析過 度，又影響細(xì)胞的著色；以及用席夫試染蠶豆根尖細(xì)胞時間較長，其試劑中含有的鹽酸往往使材料過于軟化，也影響到細(xì)胞核的著色情況，從而直 接造成蠶豆根尖細(xì)胞微核制片的質(zhì)量不佳。我們知道，細(xì)胞微核制片方法是確保細(xì)胞微核制片質(zhì)量的關(guān)鍵，直接 影響到蠶豆根尖微核技術(shù)監(jiān)測環(huán)境污染的可行性和準(zhǔn)確性。從當(dāng)前使用的 制片方法來看，確實存在上述不足，因此在一定程度上限制了我國蠶豆根 尖細(xì)胞微核技術(shù)在環(huán)境污染監(jiān)測和致突變劑檢測方面的廣泛運用。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種試驗步驟少、試驗 時間短、藥品耗費少、細(xì)胞微核制片質(zhì)量佳的蠶豆根尖細(xì)胞微核制片方法。 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的解決方案是先將蠶豆種子進(jìn)行催種催芽，然而切取約lcm長度的根尖，放入配制的固定離析液中處理4 6分 鐘，再將處理后的根尖取出，用蒸餾水清洗干凈后進(jìn)行染色壓片，所述固 定離析液由固定液和離析液按1:1的比例(體積比)現(xiàn)用現(xiàn)配，其中固定 液由無水乙醇和冰醋酸按，125:3的比例(體積比)配制，離析液選用濃鹽 酸，所述染液為Giemsa染液或改良苯酚品紅染夜，染色時間為4 7分鐘。 上述方案中根尖在固定離析液中進(jìn)行處理時的溫度為27 29°C。 本發(fā)明與現(xiàn)有席夫試染色制片方法相比具有如下優(yōu)點(1)由于將固 定、離析融合為一步完成，因此實驗步驟大大簡化，試驗時間明顯縮短， 由原來的需要25小時左右才能完成的試驗，縮短為僅需30分鐘左右就可 完成，藥品耗費也明顯減少。(2)由于采用的是Giemsa染液或改良苯酸品 紅染液，因此操作簡便，無需遮光；并且細(xì)胞核著色穩(wěn)定，細(xì)胞核、質(zhì)著 色對比度大，細(xì)胞輪廊清晰，能清楚地辨別出微核所屬的細(xì)胞，因而可準(zhǔn) 確地計算出監(jiān)測細(xì)胞中的微核數(shù)，使微核制片效果達(dá)到較佳，從而和放射性污染等的質(zhì)量檢測中。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
具體實施方式
實施例1(1) 浸種催芽選擇無病蟲害的蠶豆種子用25。C溫水浸泡，待種子吸脹后，剝?nèi)ヅ吒浇姆N皮，放入鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入少量蒸餾水，在3(TC恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽培養(yǎng)，在培養(yǎng)期間要勤換水，待根長 到l 2cm時，選出根生長良好、長度一致的種子進(jìn)行試驗；(2) 配制固定離析液先按125:3的體積比取無水乙醇和冰醋酸，并將 其混合制成固定液，離析液選用濃鹽酸，再按l:l的體積比將固定液和離析 液混合配制成固定離析液；(3) 固定離析取長約lcm的根尖放入28r固定離析液中處理5min， 隨即取出根尖用蒸餾水清洗2 3次，每次2 3min，直至將根尖上的固定 離析液清洗干凈；(4) 染色壓片將洗凈后的根尖置于載玻片上，吸干水分，用解剖針 取根尖liran左右，并用解剖針仔細(xì)搗碎，然后在根尖細(xì)胞上滴加Giemsa染 液染色6min后，蓋上蓋玻片進(jìn)行壓片并在顯微鏡下觀察。根據(jù)試驗觀察， 用Giemsa染液染色，微核制片效果最好。實施例2(1) 浸種催芽選擇無病蟲害的蠶豆種子用25X:溫水浸泡，待種子吸 月長后，剝?nèi)ヅ吒浇姆N皮，放入鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入少量蒸 餾水，在28"C恒溫箱中進(jìn)行催芽培養(yǎng)，在培養(yǎng)期間要勤換水，待根長到1 2cm時，選出根生長良好、長度一致的種子進(jìn)行實驗；(2) 配制固定離析液先按125:3的體積比取無水乙醇和冰醋酸，并 將其混合制成固定液，離析液選用濃鹽配，再按1:1的體積比將固定液和離析液混合配制成固定離析液；.(3) 取約lcm的根尖放入29t:的固定離析液中處理6min，隨即取出根 尖用蒸餾水清洗2 3次，每次2 3min，直至將根尖上的固定離析液清洗 干凈；(4) 染色壓片將洗凈后的根尖置于載玻片上，吸干水分，用解剖針 取根尖lmm左右，并用解剖針仔細(xì)搗碎，然后在根尖細(xì)胞上滴血改良苯酚 品紅染液染色7min后，蓋上蓋玻片進(jìn)行壓片并在顯微鏡下觀察。根據(jù)試驗 觀察，用改良苯酚品紅染液染色，微核制片效果稍次于Giemsa染液。
權(quán)利要求
1.一種蠶豆根尖細(xì)胞微核制片方法，其特征在于先將蠶豆種子進(jìn)行催種催芽，然后切取約1cm長度的根尖，放入配制的固定離析液中處理4～6分鐘，再將處理后的根尖取出，用蒸餾水清洗干凈后進(jìn)行染色壓片，所述固定離析液由固定液和離析液按1∶1的比例配制，其中固定液由無水乙醇和冰醋酸按125∶3的比例配制，離析液選用濃鹽酸，所述染液為Giemsa染液或改良苯酚品紅染夜，染色時間為4～7分鐘。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蠶豆根尖細(xì)胞微核制片方法，其特征在 于根尖在固定離析液中處理時的溫度為27 29"C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蠶豆根尖細(xì)胞微核制片方法，該方法包括蠶豆種子的浸種催芽、根尖的固定離析和染色壓片等步驟。該方法通過采用一種固定離析液將固定和離析融合為一步完成，使原來需要25小時左右才能完成的試驗，縮短為僅需30分鐘左右就可完成，極大地節(jié)省了試驗時間、減少了藥品消耗；并通過使用操作簡便、染色效果好的細(xì)胞核染液，達(dá)到了使細(xì)胞核著色明顯、核質(zhì)對比度大、細(xì)胞輪廓清晰的最佳微核制片效果，從而確保了用蠶豆根尖微核技術(shù)監(jiān)測環(huán)境的可行性和準(zhǔn)確性。
文檔編號G01N1/30GK101246098SQ20081004498
公開日2008年8月20日 申請日期2008年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月14日
發(fā)明者劉碧崇, 艷 孫, 孫雁霞, 徐文俊, 王躍華, 鄔曉勇, 奕 鄭, 馬丹煒 申請人:成都大學(xué)