專利名稱：：一種基于抗生素篩選轉(zhuǎn)基因水稻種子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于水稻轉(zhuǎn)基因
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體涉及一種基于抗生素篩選轉(zhuǎn)基因種子的方法，尤其適合于水稻種子篩選。技術(shù)背景-目前水稻轉(zhuǎn)基因種子篩選陽性植株，是用PCR的方法，進(jìn)一歩的鑒定是通過Southernblot。PCR的篩選方法其流程是1，用水稻種子發(fā)苗待長到有6片葉大小時(shí)，大約要40天；2，剪取0.2克左右的葉片。用CTAB方法提取基因組；3，PCR驗(yàn)證；4，電泳檢測。用這種方法篩選鑒定周期較長，因?yàn)橐鹊矫缱娱L到一定大小才可以取材，因?yàn)椴⒉恢肋@些苗子是陽性的還是陰性的，要栽種很多的苗子，所以要耗費(fèi)大量的精力，之后的提取DNA，PCR，電泳也是一系列繁瑣的工作，費(fèi)時(shí)，費(fèi)力，成本高！
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種利用抗生素篩選轉(zhuǎn)基因水稻種子的方法，方法簡便，篩選結(jié)果準(zhǔn)確，能獲得外源目的基因高效表達(dá)的植株，效率高，成本低廉，節(jié)約了資源。一種利用抗生素篩選轉(zhuǎn)基因水稻種子及其基因型判定的方法，其步驟是1，利用抗生素篩選轉(zhuǎn)基因水稻種子A)最佳篩選抗生素濃度確定設(shè)定抗生素選擇梯度(對(duì)于潮霉素0，100，200，400，600,800,lOOOul/1原始濃度2.5ug/ul;對(duì)于卡那霉素0，100，200，400，600，800，1000mg/l)，將未轉(zhuǎn)基因的受體種子在其中萌發(fā)，幼芽生長剛好完全被抑制的抗生素濃度即為最佳篩選抗生素濃度。B)篩選條件在2.5mm左右深的、適當(dāng)濃度〔根據(jù)A)確定的最適合濃度(濃度為卡那霉素400mg/l和潮霉素600ul/l)的抗生素溶液中鋪墊兩層大小適中的濾紙，在其上均勻鋪撒所需數(shù)量的(種子密度小于1個(gè)/平方厘米)飽滿的轉(zhuǎn)基因水稻種子；陰性對(duì)照是未進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的受體種子，陽性表型對(duì)照為未加抗生素的受體種子。C)培育條件保持培養(yǎng)體系密閉，密閉空間要有一定的高度(610cm)的條件下26—30度暗培養(yǎng)5天。D)結(jié)果判定結(jié)果將出現(xiàn)三種情況的種子①陽性表型芽體正常，根生長旺盛，根長超過2cm;②陰性表型芽體和根生長受到典型抑制，根長小于0.5cm;③萌發(fā)不正常的種子，沒有發(fā)芽，或者芽體不正常，此種表型是種子本身發(fā)芽能力不好所致，與轉(zhuǎn)基因陰性陽性沒有關(guān)系。2，轉(zhuǎn)基因植株的基因型純合雜合的判定方法該判定方法是建立在第一步上，以抗生素為基礎(chǔ)篩選轉(zhuǎn)基因陽性種子的方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。判斷方法l:A)設(shè)置對(duì)照:用未轉(zhuǎn)基因的受體種子做一個(gè)加入抗生素的陰性對(duì)照和一個(gè)未加入抗生素的陽性對(duì)照。B)按照《以抗生素為基礎(chǔ)篩選轉(zhuǎn)基因陽性種子的方法》所闡述的為基礎(chǔ)，如果想判定某一轉(zhuǎn)基因株系的基因型，只要在進(jìn)行此株系的種子篩選時(shí)設(shè)置一個(gè)不加抗生素的對(duì)照即可簡單的判斷出來。對(duì)照如表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>s為轉(zhuǎn)基因株系，c為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誄)判斷方法將加入抗生素的和沒有加抗生素的對(duì)照實(shí)驗(yàn)對(duì)比，如果S+和S-陽性表型率基本一致則此株系純合，其后代也都為純合；沒有加入抗生素的對(duì)照高于加入抗生素的發(fā)芽陽性率，此株系為轉(zhuǎn)基因雜合，(如果s-的陽性率明顯高于s+發(fā)芽陽性率，那么表明此株系為轉(zhuǎn)基因雜合，)其后代就有孟德爾分離。加入抗生素的表現(xiàn)為陰性，不加抗生素的為陽性表明此株系為非轉(zhuǎn)基因株系，如果s+完全表現(xiàn)為陰性，s-有較高的陽性率說明此株系為非轉(zhuǎn)基因株系(假陽性)。判斷方法2:直接統(tǒng)計(jì)篩選結(jié)果，如果陽性率為O,則為陰性純合株系，如果陽性種子與陰性種子的比率符合孟德爾分離規(guī)律則為雜合型，如果陽性率接近ioo則為陽性純合株系。判斷方法1比判斷方法2更準(zhǔn)確。說明陽性率=陽性種子/(陰性種子+陽性種子)，沒有發(fā)芽的種子或者發(fā)芽不正常的種子不計(jì)算在內(nèi)。本發(fā)明的效果是1)投入少、操作簡單，只要簡單的一個(gè)組織培養(yǎng)盒，少量的抗生素，建立好篩選體系后，5天內(nèi)就可以輕而易舉的得到陽性植株，而且還可以分析轉(zhuǎn)基因植株的基因型純合雜合狀態(tài)。2)可信度高，兩次次單獨(dú)的篩選實(shí)驗(yàn)中，陽性表型苗的PCR陽性率均為100%;陰性苗去除潮霉素后仍可以繼續(xù)生長，挑取生長良好的芽提取DNA進(jìn)行PCR分析，陰性率100%(每次實(shí)驗(yàn)PCR樣本量〉30個(gè))，表明本方法很可靠。3)鑒別明確、省時(shí)省力，本發(fā)明方法篩選出來的陽性苗應(yīng)該是已經(jīng)表達(dá)目的基因的植株，這與PCR篩選和Southernblot分析有所區(qū)別，用Southernblot分析和PCR鑒定的結(jié)果不一定就是能夠表達(dá)目的基因的植株，因?yàn)橥庠茨康幕虻牟迦胗形稽c(diǎn)效應(yīng)，Southernblot分析和PCR檢測只能鑒定出片斷是否插入到基因組中，不能說明目的基因已經(jīng)表達(dá)。而我們所需要的植株是目的基因高效表達(dá)的植株，本方法不僅鑒定了外源目的基因轉(zhuǎn)化的陽性植株，而且得到了外源目的基因穩(wěn)定表達(dá)的陽性植株，具有Northernblot分析的意義。所以本發(fā)明方法與以往的PCR檢測技術(shù)相比，具有簡單、高效、準(zhǔn)確、節(jié)約、省時(shí)省力，而且對(duì)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析驗(yàn)證也更有意義。圖1:一個(gè)篩選體系建立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖A)潮霉素濃度為0的篩選結(jié)果發(fā)芽生根正常；B)濃度為100ul/L的篩選結(jié)果大部分芽根抑制仍有少部分芽根長出；C)濃度為200ul/L的篩選結(jié)果大部分芽根抑制仍有少部分芽根長出；D)濃度為400ul/L的篩選結(jié)果大部分芽根抑制仍有極少量生根表現(xiàn)正常；E)濃度為600ul/L的篩選結(jié)果所有的種子生根得到了抑制，僅有較短的芽體產(chǎn)生；F)濃度為800ul/L的篩選結(jié)果所有的種子生根得到了抑制，僅有較短的芽體產(chǎn)生.(抗生素為潮霉素原始濃度為2.5ug/ul)圖2:轉(zhuǎn)基因wx25株系的篩選結(jié)果示意圖，表明此株系為陰性，即假陽性轉(zhuǎn)基因植株。圖3:所用的受體zhll在篩選條件下的陰性表型對(duì)照。此對(duì)照說明對(duì)于非轉(zhuǎn)基因種子，我們的篩選濃度得到了完全抑制。圖4:所用的受體zhll在無篩選條件下的陽性表型對(duì)照。說明圖3的結(jié)果(種子萌發(fā)不正常的結(jié)果)是抗生素壓力的結(jié)果，不是種子自身的原因。其表型為標(biāo)準(zhǔn)的陽性表型，可以作為轉(zhuǎn)基因種子篩選的表型參考。圖5:wxl8的篩選結(jié)果。出現(xiàn)了陽性表型和陰性表型以及其他不正常萌發(fā)的表型。圖6:WX18株系中的IO個(gè)陰性芽表型符合上文所說的陰性表型的標(biāo)準(zhǔn)，芽體可以萌發(fā)但是根長小于0.5cm。說明wxl8存在陽性表型的和陰性表型為雜合圖7:陰性芽和陽性芽的對(duì)比，差別明顯對(duì)于結(jié)果容易判斷。圖8:wxl8株系中的10個(gè)陰性表型芽經(jīng)過4天的恢復(fù)情況，除去抗生素后能夠恢復(fù)生長生根，說明這些陰性標(biāo)準(zhǔn)得到的陰性種子是可靠的，他們確實(shí)因?yàn)榭股貕毫Σ挪荒軌蛏L的，不是因?yàn)榉N子的其他原因引起的，因?yàn)楫?dāng)抗生素壓力除去后都仍能恢復(fù)生長。圖9:陰性表型種子恢復(fù)的表型對(duì)陰性表型種子恢復(fù)后的細(xì)節(jié)描述，除去抗生素壓力后根芽得到了健康生長。圖10:第一次篩選出的陽性苗PCR檢測驗(yàn)證結(jié)果，100%吻合，ZH11為未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照，3，4,18，25，27，32，34為不同株系編號(hào)，下面為每個(gè)編號(hào)對(duì)應(yīng)的不同后代苗。"+"為有目的基因的載體做模板，"一"為非轉(zhuǎn)基因DNA為模板，M為DL2000marker。圖11:第二次篩選的陽性苗PCR檢測驗(yàn)證結(jié)果，100%吻合，"M"DL2000marker,"—"非轉(zhuǎn)基因DNA陰性對(duì)照。3，34，32，27，18，4為不同株系的不同植株。圖12:陰性表型苗經(jīng)過恢復(fù)后進(jìn)行PCR驗(yàn)證，100%吻合；隨機(jī)的從9個(gè)株系的共108個(gè)可恢復(fù)的苗中隨機(jī)抽取30株進(jìn)行PCR檢測，最后一個(gè)樣"+"為轉(zhuǎn)基因陽性苗對(duì)照。具體實(shí)施方式實(shí)施例11.轉(zhuǎn)基因材料和抗生素轉(zhuǎn)基因種子和未轉(zhuǎn)基因種子，潮霉素(濃度2.5mg/ml)。轉(zhuǎn)基因材料說明中花11轉(zhuǎn)CA(碳酸酐酶基因)基因，所用載體為pCAMBIA1301(澳大利亞CAMBIA研究中心購買)，抗性篩選標(biāo)記為潮霉素，用農(nóng)桿菌EHA101(由takara公司購買)介導(dǎo)法。2.條件確定用6個(gè)9cm培養(yǎng)皿，每個(gè)皿中加入潮霉素溶液10ml,濃度依次是0.0,100，200,400,600,800ul/L(母液濃度為2.5ug/ul),平皿下鋪墊大小合適的濾紙兩層，每個(gè)培養(yǎng)皿放入中花11(未轉(zhuǎn)基)因種子30粒左右.均勻放置.28度暗培養(yǎng)3天.觀察結(jié)果.(如圖l)從結(jié)果可見潮霉素濃度為Oul/L,100ul/L,200ul/L,400ul/L的情況下不能完全抑制當(dāng)濃度達(dá)到600ul/L的時(shí)候就可以達(dá)到完全抑制，所以選用此濃度作為以后實(shí)驗(yàn)的篩選濃度。3.篩選流程一)組培盒(長X寬X高6cmX6cmX10cm，有蓋可以形成密閉的體系，透明塑料盒)加入10mL蒸餾水，pH6.0—7.0二)每盒加入6ul潮霉素，混合均勻三)鋪墊兩層大小合適的濾紙四)放入CA轉(zhuǎn)基因種子40粒左右，種子要飽滿干凈，有較好的發(fā)芽率。五)28度暗培養(yǎng)五天后觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果。4實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1五天后觀察結(jié)果(部分)結(jié)果如圖2:為轉(zhuǎn)基因wx25株系的篩選結(jié)果示意圖，表明此株系為陰性，即假陽性轉(zhuǎn)基因植株圖3:所用的受體Zhll在篩選條件下的陰性表型對(duì)照。此對(duì)照說明對(duì)于非轉(zhuǎn)基因種子，我們的篩選濃度得到了完全抑制，只能長出較短的芽以及小于0.5cm的不正常的根。圖4:所用的受體zhll在無篩選條件下的陽性表型對(duì)照。說明圖3的結(jié)果(種子萌發(fā)陰性表型的結(jié)果)是抗生素壓力的結(jié)果，不是種子自身的原因。其表型為標(biāo)準(zhǔn)的陽性表型，可以作為轉(zhuǎn)基因種子篩選的參考表型。圖5:wxl8的篩選結(jié)果。出現(xiàn)了陽性表型和陰性表型以及其他不正常萌發(fā)的表型，表明此株系為雜合。圖6:WXl8株系中的IO個(gè)陰性芽表型符合上文所說的陰性表型的標(biāo)準(zhǔn)，芽體可以萌發(fā)但是根長小于0.5cm。說明wxl8存在陽性表型的和陰性表型為雜合。4.2統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表:l篩選統(tǒng)計(jì)情況.<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>說明:ZHll+，未加潮霉素的陽性表型對(duì)照；ZH11—為加入潮霉素的非轉(zhuǎn)基因陰性表型對(duì)照，WX18-:為WX18株系沒有加入潮霉素的對(duì)照。其他的為正常的篩選樣本。陰性表型發(fā)芽但是根系不發(fā)達(dá)(小于0.5cm)或沒有根系,陰性表型不一定就是陰性種子，因?yàn)橛锌赡苁潜旧戆l(fā)芽不正常的種子與抗生素壓力無關(guān)；陽性表型芽體茁壯,根系發(fā)達(dá)(大于2.0cm);沒有芽也沒有跟的種子是不能萌發(fā)的種子與本實(shí)驗(yàn)無關(guān)!本實(shí)驗(yàn)只計(jì)能正常萌發(fā)的種子，以消除干擾！結(jié)果表明根據(jù)判斷方法l，即針對(duì)WXl8進(jìn)行判斷，因?yàn)橹挥蠾Xl8設(shè)了正負(fù)對(duì)照，wxl8為轉(zhuǎn)基因雜合；根據(jù)判斷方法2，wx3,wxl8，wx27，wx32，wx34為轉(zhuǎn)基因雜合有，wx4為純合株系，wx25,wxll為非轉(zhuǎn)基因株系。4.3陰性苗的抑止解除實(shí)驗(yàn).將陰性表型的發(fā)芽種子用清水洗后放入無潮酶素的培養(yǎng)盒中繼續(xù)生長,然后統(tǒng)計(jì)表型并分析.結(jié)果能夠繼續(xù)生長的，并能長出根的種子被認(rèn)為是從抑止中解除的種子,能夠恢復(fù)生長的種芽應(yīng)該為陰性種芽,不能夠恢復(fù)生長的種芽可能與種芽本身的萌發(fā)有關(guān)(這樣的話有可能是陽性芽),或者和潮霉素毒性損傷有關(guān).陰性苗恢復(fù)生長4天后，如圖7，圖8.4.4PCR檢測結(jié)果CTAB法提取陽性表型苗基因組和陰性恢復(fù)苗基因組進(jìn)行PCR檢測以驗(yàn)證本發(fā)明的可靠性。PCR所用引物擴(kuò)增目的基因800bp，為轉(zhuǎn)的外源基因，水稻本身不含有。第一次檢測，對(duì)潮霉素篩選出來的陽性表型發(fā)芽種子，種植到溫室的水稻苗提取基因組進(jìn)行PCR的結(jié)果。如圖10;第二次檢測篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果2007-07-12如圖11和預(yù)期結(jié)果完全吻合。陰性表型苗消除潮霉素后，恢復(fù)生長后提取基因組進(jìn)行PCR結(jié)果2007-07-17如圖12和預(yù)期結(jié)果完全吻合。實(shí)施例2.l.轉(zhuǎn)基因材料和抗生素轉(zhuǎn)基因種子和未轉(zhuǎn)基因種子，卡那霉素轉(zhuǎn)基因材料說明中花U轉(zhuǎn)sbpase基因(1，7—2磷酸酶景天庚酮糖酶基因來源于藍(lán)藻)，所用載體為pBI121(genebank登錄號(hào)AY781296),抗性篩選標(biāo)記為卡那霉素，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，農(nóng)桿菌菌株EH/U01,由takara公司購買。2條件確定用6個(gè)9cm培養(yǎng)皿，每個(gè)皿中加入卡那霉素溶液10ml，濃度依次是0.0mg/L，100mg/L，200mgZL，400mg/L，600mg/L,800mg/L,平皿下鋪墊大小合適的濾紙兩層，每個(gè)培養(yǎng)皿放入受體(未轉(zhuǎn)基)種子30粒左右.均勻放置.28度暗培養(yǎng)3天.結(jié)果發(fā)現(xiàn)卡那霉素濃度為0mg/L，100mg/L,200mg/L的情況下不能完全抑制當(dāng)濃度達(dá)到400mg/l的時(shí)候就可以達(dá)到完全抑制，所以選用此濃度作為以后實(shí)驗(yàn)的篩選濃度。3，篩選流程一)組培盒(長X寬X高6cmX6cmX10cm，有蓋可以形成密閉的體系，透明塑料盒)。二)每盒加入10ml濃度為400mg/l的潮霉素，三)鋪墊兩層大小合適的濾紙四)放入sbpase轉(zhuǎn)基因種子40粒左右，種子要飽滿干凈，有較好的發(fā)芽率。五)28度暗培養(yǎng)五天后即得到篩選結(jié)果。具體流程與實(shí)施例l相同。權(quán)利要求1、一種基于抗生素篩選轉(zhuǎn)基因水稻種子的方法，它包括下列步驟A、利用抗生素篩選轉(zhuǎn)基因水稻種子，首先是篩選抗生素濃度確定設(shè)定抗生素選擇梯度，梯度為0-1000mg/l，將未轉(zhuǎn)基因的受體種子在其中萌發(fā)，幼芽生長被抑制的抗生素濃度為篩選抗生素濃度；其次是篩選條件在2.5mm深，濃度的抗生素溶液中鋪墊兩層濾紙，濃度為卡那霉素400mg/l和潮霉素600ul/l，在其上均勻鋪撒種子密度小于1個(gè)/平方厘米轉(zhuǎn)基因水稻種子；陰性對(duì)照是未進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的受體種子，陽性表型對(duì)照為未加抗生素的受體種子；第三是培育條件，密閉空間條件下26-30度暗培養(yǎng)5天；第四是結(jié)果判定結(jié)果出現(xiàn)三種情況的種子①陽性表型芽體正常，根生長旺盛，根長超過2cm；②陰性表型芽體和根生長受到典型抑制，根長小于0.5cm；③萌發(fā)不正常的種子，沒有發(fā)芽或者芽體不正常；B、轉(zhuǎn)基因植株的基因型純合雜合的判定方法首先是設(shè)置對(duì)照用未轉(zhuǎn)基因的受體種子做一個(gè)加入抗生素的陰性表型對(duì)照和一個(gè)未加入抗生素的陽性表型對(duì)照；其次是按照以抗生素為基礎(chǔ)篩選轉(zhuǎn)基因陽性種子的方法為基礎(chǔ)，判定轉(zhuǎn)基因株系的基因型，在進(jìn)行此株系的種子篩選時(shí)設(shè)置一個(gè)不加抗生素的對(duì)照即判斷出來；第三是將加入抗生素的和沒有加抗生素的對(duì)照實(shí)驗(yàn)對(duì)比，陽性表型率一致則此株系純合，其后代也都為純合；沒有加入抗生素的對(duì)照高于加入抗生素的發(fā)芽陽性率，此株系為轉(zhuǎn)基因雜合，其后代就有孟德爾分離；加入抗生素的表現(xiàn)為陰性，不加抗生素的為陽性表明此株系為非轉(zhuǎn)基因株系；或直接統(tǒng)計(jì)篩選結(jié)果，陽性率為0，則為陰性純合株系，陽性種子與陰性種子的比率符合孟德爾分離規(guī)律則為雜合型，陽性率接近100則為陽性純合株系。全文摘要本發(fā)明公開了一種基于抗生素篩選轉(zhuǎn)基因水稻種子的方法，其內(nèi)容有A)利用抗生素篩選轉(zhuǎn)基因水稻種子，首先是確定篩選用的抗生素濃度，其次是建立篩選條件和培育條件，最后是判定篩選的結(jié)果；B)轉(zhuǎn)基因植株的基因型純合雜合的判定方法設(shè)目標(biāo)基因未轉(zhuǎn)化的受體親本加抗生素和不加抗生素對(duì)照，轉(zhuǎn)基因株系不加抗生素的對(duì)照，用抗生素篩選轉(zhuǎn)基因株系種子，比較分析轉(zhuǎn)基因株系加入抗生素的和兩個(gè)對(duì)照的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來判定轉(zhuǎn)基因株系的基因型。本發(fā)明方法簡便，可規(guī)模化分析，篩選結(jié)果準(zhǔn)確，能獲得外源目的基因高效表達(dá)的植株，效率高，成本低廉，可節(jié)約研究資源。文檔編號(hào)G01N33/48GK101241123SQ20081004708公開日2008年8月13日申請(qǐng)日期2008年3月18日優(yōu)先權(quán)日2008年3月18日發(fā)明者陽李,李陽生申請(qǐng)人:武漢大學(xué)