專利名稱：一種鑒別龍眼肉質(zhì)量的高效液相色譜檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)產(chǎn)品鑒別，特別是涉及一種鑒別龍眼肉真假的高效液相色譜檢測方法。
背景技術(shù)：
由文獻1 (中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中國藥典2000年版(一部)[M]. 北京.化學(xué)工業(yè)出版社.2000.)、文獻2 (謝世華.龍眼肉摻偽鑒別[J].時珍國醫(yī)國藥， 1999, 10 (5): 355.)和文獻3 (紀成茂，吳文海，張河貞.龍眼肉與龍荔肉的鑒別[J]. 海峽藥學(xué)，1996， 8 (2): 52)及文獻4 (孫法麗，徐凌川，馬萍.桂圓肉及其偽品的 鑒別[J].國藥鑒別，1998， 9 (4): 384)可知'龍眼("j'歷ocarp"s longan Lour)是 國家衛(wèi)生部第一批公布既是保健食品又是滋補藥品的特殊水果，享有南方人參的美 稱。龍眼肉俗稱桂圓，作為傳統(tǒng)的保健食品和滋補藥品，在國內(nèi)外市場上流通量很大， 并且假劣產(chǎn)品很多。有報道市場上有用同屬于無患子科的植物如有毒的龍荔肉、或 者荔枝肉來冒充桂圓出售，目前只有從外觀形態(tài)上的鑒別方法，來鑒別龍眼肉的真假。
由文獻5(肖維強，黃炳雄，王曉容，等.HPLC法測定龍眼肉中的幾種核苷類物質(zhì) [J].食品科學(xué)，2007年，28 (1): 234-237.)、文獻6 (肖維強，戴宏芬，黃炳雄， 等.龍眼肉中9種核苷類成分的HPLC分析[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007， 26(5): 722-726.)、文獻7(黃炳雄，李建光，王曉容，等.18種龍眼中多種核苷的HPLC定 量測定[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008， (3): 67-69)可知，龍眼肉中有高含量的核苷物質(zhì)， 以腺苷(adenosine)、鳥苷(guanosine)和尿苷(uridine )的含量最高。
但是，關(guān)于龍眼肉的真假的高效液相色譜檢測方法在國內(nèi)未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種鑒別龍眼肉質(zhì)量的高效液相色譜檢測方法， 以便為科學(xué)評價龍眼肉質(zhì)量提供鑒別的依據(jù)。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用以下的技術(shù)方案
本發(fā)明提供的鑒別龍眼肉質(zhì)量的高效液相色譜檢測方法，具體是先對供試樣品進行 剪碎研磨處理，供試樣品為新鮮龍眼果肉或制成的龍眼干，然后加水用超聲波提取，提取 物經(jīng)微孔膜過濾后，用已建立的高效液相色譜標準測定方法進行測定，得供試樣品色譜圖， 最后將供試樣品色譜圖與標準龍眼果肉色譜圖相比較，以此對供試樣品真假作出科學(xué)的評 價；標準龍眼肉色譜圖是按照IO種核苷標準品的分離方法建立的。
本發(fā)明提供的鑒別龍眼肉質(zhì)量的高效液相色譜檢測方法，其在鑒別龍眼果肉真?zhèn)沃械?應(yīng)用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下主要的優(yōu)點
l.具有明顯的特征性其腺苷、鳥苷和尿苷是樣品中較穩(wěn)定的核苷類特征性物質(zhì)。本
方法靈敏度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，經(jīng)幾種不同的分離方法試驗，上述三種核苷類物質(zhì)均 能得到良好地分離，且含量穩(wěn)定(本申請只選取其中一種分離方法)。
2. 與傳統(tǒng)技術(shù)采用的從外觀、組織形態(tài)上鑒別相比，本方法是從龍眼肉內(nèi)含的、穩(wěn) 定的核苷物質(zhì)進行辨別，因此技術(shù)上具有穩(wěn)定性和整體性。
3. 本方法是一種綜合整體的鑒別手段，既避免了肉眼從外觀上判斷的差錯，又能準確 地、科學(xué)地判斷被檢測樣品的真假。結(jié)合標準品的標準曲線，還可以確定樣品中主要核苷 物質(zhì)的準確含量，從而判斷樣品的質(zhì)量。
4. 本方法還具有可操作性，能滿足上述測定條件的普通液相色譜儀均能滿足分離條 件(需要二元梯度洗脫和柱溫控制系統(tǒng))。
本發(fā)明利用高效液相色譜檢測方法所具有的靈敏度高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性和實用性強 的特點，以廣東的主栽龍眼品種石硤為分析材料，對石硤中水溶性物質(zhì)(包括多種核苷成 分)進行分離，擬建立石硤龍眼的高效液相色譜檢測方法，從而推而廣之為科學(xué)評價龍眼 果肉質(zhì)量提供鑒別的依據(jù)。


圖1是混合核苷標準品色譜圖。圖1中依保留時間先后為胞嘧啶、尿嘧啶、胞
苷、次黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、次黃嘌呤核苷、鳥苷、胸苷和腺苷(含量均為2 Pg/mL)。 圖2是石硤龍眼樣品(鮮樣)分離后得到的多種核苷及水溶性物質(zhì)高效液相色譜圖。
具體實施例方式
本發(fā)明提供的鑒別龍眼肉質(zhì)量的高效液相色譜檢測方法，具體是先對供試樣品進行 剪碎研磨處理，供試樣品為新鮮龍眼果肉或制成的龍眼干，然后加水用超聲波提取，提取 物經(jīng)微孔膜過濾后，再利用已建立的高效液相色譜測定方法進行分離，得供試樣品色譜圖， 最后用供試樣品色譜圖與標準龍眼果肉色譜圖相比較，以此作為供試樣品真假的科學(xué)評 價；標準龍眼肉色譜圖是按照IO種核苷標準品的分離方法建立的。
在利用高效液相色譜測定技術(shù)時，所采用的色譜條件為Nucleosil C18反相水性柱 5pm， 250mmX4mm;流動相為0.005mol/L的KH2P04和甲醇；二元梯度洗脫，流速 lmL/min;檢測波長260nm，柱溫35。C。
本發(fā)明鑒別龍眼肉質(zhì)量的高效液相色譜檢測方法，可采用包括以下步驟的方法
(1) 核苷類成分標準樣品的分離-
準確稱取各標準樣品2.5mg，精確至0.00001g,用水溶解并定容到5mL，混合標準樣 品溶液用水稀釋至50ng/mL，以后呈2倍稀釋，做標準曲線，該標準曲線可用于計算樣品 中各核苷的含量，以此量化地對供試樣品進行龍眼果肉的質(zhì)量評估；然后用色譜條件進 行IO種標準樣品的分離，得到IO種標準樣品色譜圖。
(2) 供試樣品的處理
A.將采集的新鮮龍眼果去皮和核，于—2(TC存放，備用；稱取備用龍眼果肉0.9 l.lg，
精確到0.001g;再經(jīng)剪碎研磨處理后移入25 mL容量瓶中，加入10 15mL的水，進行 兩次超聲波處理，其中，第一次超聲波處理為20分鐘，停止IO分鐘后再進行第二次超聲 波處理，時間為10分鐘；然后，用水定容至刻度，進樣前用0.5pm微孔過濾膜過濾。 或者，
B.將采集的新鮮龍眼果肉制成半干型龍眼干，龍眼干經(jīng)7(TC烘干至恒重后，稱取 0.32g精確到0.0001 g，龍眼肉的干濕為l: 5.8 6.5;再剪碎研磨處理后移入25mL容 量瓶中，加入14 16mL的水，浸泡3小時，超聲波處理30分鐘后定容至刻度，進樣前 用0.5nm微孔過濾膜過濾。
所述的新鮮龍眼肉取自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所果園，包括供試樣品和標準龍眼 果肉樣品，標準龍眼果肉樣品是經(jīng)該所專家鑒定廣東主栽品種石硤龍眼。
(3) 供試樣品色譜圖的建立 將處理后的供試樣品進行高效液相色譜分析，每個樣品重復(fù)3次；在所選定的色譜條
件下，供試樣品得到滿意的分離，得到多種水溶性物質(zhì)，其中有7種以上的核苷；并且所
建立的供試樣品色譜圖含有多個峰，較大的峰有6個，其中腺苷、鳥苷、尿苷峰較高(或 者峰面積較大)時，即表示這三種核苷的含量也較高；然后根據(jù)標準曲線和峰值，可計算 出這三種核苷的含量。
(4) 比較
將供試樣品色譜圖與按上述同樣步驟已建立的標準龍眼果肉色譜圖進行對比，利用試 腺苷、鳥苷和尿苷是標準龍眼果肉樣品中較穩(wěn)定的核苷類特征性物質(zhì)來鑒別供試樣品的真 偽。
本發(fā)明提供的鑒別龍眼肉質(zhì)量的高效液相色譜檢測方法，其在鑒別龍眼果肉真?zhèn)沃械?應(yīng)用。所述龍眼果肉為廣東主栽品種石硤龍眼果肉，同時適應(yīng)于廣東、廣西、云南、福建 等地的其它品種。
下面結(jié)合實例及附圖對本發(fā)明作進一步說明。
本實例采用高效液相色譜(HPLC)法，建立了標準石硤龍眼果肉的核苷類成分HPLC 定量分析方法。結(jié)果10種核苷類成分標準品能得到完全分離，在同樣條件下廣東主栽 品種石硤龍眼果肉水溶性提取物色譜圖共有30個峰左右，其中腺苷、鳥苷和尿苷含量較 高，以上的標準石硤龍眼果肉色譜圖和供試樣品中腺苷、鳥苷和尿苷含量可作為科學(xué)評價 石硤龍眼產(chǎn)品真假的檢測方法。具體如下
l.材料與方法
l丄核苷類成分標準樣品、儀器及試劑 l丄l.標準樣品
標準樣品有10種，分別是胞嘧啶(cytosine)，購于Fluka公司；尿嘧啶(uracil)、 胞苷(cytidine)、次黃嘌呤(hypoxanthine )、次黃嘌呤核苷(inosine)、胸苷 (thymidine)、胸腺噴啶(thymine)，它們購于上海源聚生物科技有限公司；尿苷、鳥
苷(adenine)，購于上海伯奧生物科技有限公司；腺苷，購于美國sigma公司。
1. 1. 2.主要儀器及試劑
1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)帶Agilent化學(xué)工作站和VWD檢 測器，手動進樣器，20uL定量管。
分離柱(德國MACHEREY — NAGEL公司)填料為Nucleosil C18，反相柱(水性柱， 5陶，250mmX4mm)卡套柱。
甲醇(色譜級，美國Fisher公司)實驗用水為蒸餾水經(jīng)Millipore純水器過 濾而得；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2. 核苷類成分標準樣品的分離-
IO種標準樣品的分離參照肖維強，黃炳雄等的方法加以改進(見文獻5 — 7)。 準確稱取各標準品2. 5mg，精確至O. 00001g，用水溶解并定容到5mL，混合標準
樣品溶液用水稀釋至50Pg/rnL，以后呈2倍稀釋，做標準曲線；然后用色譜條件進行10
種標準樣品的分離，得到IO種標準樣品色譜圖。
色譜條件Nucleosil C18反相水性柱5jim， 250mmX4mm;流動相為0. 005mol/L的
KH2P(^和甲醇；二元梯度洗脫，流速1 mL/min;檢測波長260nm，柱溫35。C。
1.3. 標準石硤龍眼樣品的采集和處理-
采集廣東省龍眼主栽品種成熟期的石硤龍眼果肉作為研究材料。樣品采集地點為 本申請人所在果園(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所果園，樣品是經(jīng)該所專家鑒定的廣東 主栽品種石硤龍眼)。然后采用以下的方法
方法一將新采的龍眼去皮和核，稱取lg左右(精確到O. OOlg)的龍眼肉，剪 碎研磨后放入25ml容量瓶中，加入10ml左右的水，超聲波提取20分鐘，停止10分 鐘后再超聲波處理IO分鐘，用水定容至刻度，進樣前用0. 5Wn的微孔膜過濾。
方法二將采集的新鮮龍眼果肉制成半干型龍眼干，龍眼干經(jīng)7(TC烘干至恒重后， 稱取0.32g精確到0.0001 g，龍眼肉的干濕為1: 5.8 6.5;再剪碎研磨處理后移入25mL 容量瓶中，加入14 16mL的水，浸泡3小時，超聲波處理30分鐘后定容至刻度，進樣 前用0.5lam微孔過濾膜過濾。
1.4. 精密度、精確度及樣品穩(wěn)定性試驗
2. 結(jié)果與分析
2.1. IO種核苷類成分標準品分離條件 色譜條件
流動相A:為0.005mol/L的KH2P04，流動相B:為甲醇，流速1 mL/min，檢測波 長260nra。 二元梯度洗脫100M的A5min， 3X的B5min， 10%的B 2mim (0.8mL/min)， 20%的B 4mim(0,6mL/min)' 32%的B 3mim(0,7mL/min)， 48%的B 3mim(0.8mL/min), 100X的B5min， 100^的B5min， 100^的A5min，柱溫35。C， 20iliL定量管。
按所選定的色譜條件，混合核苷類成分標準品的分離結(jié)果如圖1所示。據(jù)圖l，
IO種標準品在所選定的色譜條件下，標準品得到了完全的分離。
圖1中依保留時間先后為胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、 次黃嘌呤核苷、鳥苷、胸苷和腺苷(均為2txg/mL)。
2.2. 標準石硤龍眼樣品分離結(jié)果
按1.3和2. 1的樣品處理方法和分離條件，將取樣的龍眼肉進行HPLC分析，重 復(fù)3次。標準石硤龍眼肉樣品分離結(jié)果見圖2。
如圖2所示在所選定的色譜條件下，樣品能得到滿意的分離，含有30種左右 的水溶性物質(zhì)(包括7種以上的核苷)，與標準品對照圖譜相比，樣品中腺苷、鳥苷 和尿苷含量較高。
2.3. 精密度、精確度及樣品穩(wěn)定性測定結(jié)果
據(jù)以往的研究結(jié)果，9種混合標準核苷在48h內(nèi)保留時間和峰面積的相對標準偏 差分別在0. 133 1. 156%和1. 153—3. 023%之間，說明混合標準品在48h內(nèi)穩(wěn)定， 供試儀器穩(wěn)定且精密度高。標準品回收率在91.00 107.29%之間，回收率相對標準 偏差在1. 411 4. 587%之間(見文獻4一5)。樣品經(jīng)超聲波處理后不穩(wěn)定，在冰浴保 存條件下，8小時內(nèi)測定，不宜放置過夜。
權(quán)利要求
1.一種鑒別龍眼肉質(zhì)量的高效液相色譜檢測方法，其特征是先對供試樣品進行剪碎研磨處理，供試樣品為新鮮龍眼果肉或制成的龍眼干，然后加水用超聲波提取，提取物經(jīng)微孔膜過濾后，用已建立的高效液相色譜標準測定方法進行測定，得供試樣品色譜圖，將供試樣品色譜圖與標準龍眼肉色譜圖相比較，以此對供試樣品真假作出科學(xué)的評價；標準龍眼肉色譜圖是按照10種核苷標準品的分離方法建立的。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效液相色譜檢測方法，其特征是在利用高效液相色譜測 定技術(shù)時，所采用的色譜條件為Nucleosil C18反相水性柱5nm， 250mmX4mm;流動 相為0.005mol/L的KH2P04和甲醇；二元梯度洗脫，流速lmL/min;檢測波長260nm，柱溫35℃。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高效液相色譜檢測方法，其特征是所述的高效液相色譜檢測方法，具體是采用包括以下步驟的方法(1) 核苷類成分標準樣品的分離準確稱取各標準樣品2.5mg，精確至0.00001g，用水溶解并定容到5mL，混合標準樣品溶液用水稀釋至50μg/mL，以后呈2倍稀釋，做標準曲線；然后用色譜條件進行10種 標準樣品的分離，得到1O種標準樣品色譜圖；1O種標準樣品分別是胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、次黃嘌呤核苷、鳥苷、胸苷和腺苷；(2) 供試樣品的處理A. 將采集的新鮮龍眼去皮和核，于-20℃存放，備用；稱取備用龍眼果肉0.9 1.1g， 精確到0.001 g;再經(jīng)剪碎研磨處理后移入25 mL容量瓶中，加入10 15 mL的水，進行兩次超聲波處理；然后，用水定容至刻度，進樣前用微孔過濾膜過濾，或者，B. 將采集的新鮮龍眼果肉制成半干型龍眼干，龍眼干經(jīng)70℃烘干至恒重后，稱取 0.32g精確到0.0001 g，龍眼肉的干濕為l: 5.8 6.5;再剪碎研磨處理后移入25mL容量瓶中，加入14 16mL的水，浸泡3小時，超聲波處理30分鐘后定容至刻度，進樣前用微孔過濾膜過濾；(3) 供試樣品色譜圖的建立 將處理后的供試樣品進行高效液相色譜分析，每個樣品重復(fù)3次；在所選定的色譜條件下，供試樣品得到滿意的分離，得到多種水溶性物質(zhì)，其中有7種以上的核苷；并且所建立的供試樣品色譜圖含有多個峰，較大的峰有6個，其中腺苷、鳥苷、尿苷的峰較高或者峰面積較大時，即表示這三種核苷的含量也較高；然后根據(jù)標準曲線和峰值，計算出這三種核苷的含量；(4) 比較將供試樣品色譜圖與按上述同樣步驟已建立的標準龍眼肉色譜圖進行對比，利用腺苷、鳥苷和尿苷是標準龍眼果肉樣品中較穩(wěn)定的核苷類特征性物質(zhì)來鑒別供試樣品的真 偽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效液相色譜檢測方法，其特征是步驟(2)所述的兩次 超聲波處理，其中，第一次超聲波處理為20分鐘，停止IO分鐘后再進行第二次超聲波處 理，時間為IO分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效液相色譜檢測方法，其特征是步驟(2)所述的微孔 過濾膜為0.5pm微孔過濾膜。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效液相色譜檢測方法，其特征是步驟(2)所述的新鮮 龍眼肉取自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所果園，包括供試樣品和標準龍眼果肉樣品。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效液相色譜檢測方法，其特征是根據(jù)步驟(1)所述的 標準曲線計算樣品中各核苷的含量，以此量化地對供試樣品進行龍眼果肉的質(zhì)量評估。
8. —種根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一權(quán)利要求所述高效液相色譜檢測方法的用途，其 特征是在鑒別龍服果肉真?zhèn)沃械膽?yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供的鑒別龍眼肉質(zhì)量的高效液相色譜檢測方法，具體是對供試樣品(新鮮龍眼果肉或制成的龍眼干)進行剪碎研磨處理，加水用超聲波提取，提取物經(jīng)微孔膜過濾后，用高效液相色譜儀測定，得供試樣品色譜圖；將供試樣品色譜圖與標準龍眼果肉色譜圖相比較，以此對供試樣品真假作出科學(xué)的評價；標準龍眼肉色譜圖是按照10種核苷標準品的分離方法建立的；通過標準曲線，能計算出標準龍眼肉中多種核苷成分的含量；因此供試樣品的測定方法，按照核苷標準品和標準龍眼肉的測定方法進行測定，可鑒別其樣品的真?zhèn)巍１景l(fā)明可以準確地、科學(xué)地判斷被檢測樣品的真假和質(zhì)量，并且靈敏度高，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，還具有可操作性。
文檔編號G01N30/00GK101344507SQ20081004897
公開日2009年1月14日 申請日期2008年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月26日
發(fā)明者劉傳和, 戴宏芬, 李建光, 王曉容, 肖維強, 黃炳雄 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所