專利名稱：夾心免疫檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物分子檢測方法，特別是一種用已知抗體定量檢測相應抗 原的夾心免疫檢測方法。
背景技術：
傳統(tǒng)的免疫檢測方法是雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)。這類方法 是將抗待測抗原的多克隆或單克隆抗體作為捕獲抗體，用辣根過氧化物酶或 堿性磷酸酶標記的另一株單克隆抗體作為檢測抗體，最后加入酶的底物，通 過酶標儀檢測酶作用于底物引起的顏色變化計算出待測抗原的種類及濃度。 該法的靈敏度為0.2—lpg/L不等。
在上述的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析法中，所用的標記物是酶，測量的信 號是吸光度，因此導致其具有如下的缺點操作煩瑣、費時、檢測周期長、 顯色不穩(wěn)定、靈敏度低。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術存在的上述缺點，提出一種改進的夾心 免疫檢測方法，以實現(xiàn)多成分標記同時檢測同一樣品中的多種抗原成分。
本發(fā)明夾心免疫檢測方法，是將捕獲抗體直接或間接包被在聚苯乙烯板 的微孔，形成夾心發(fā)光免疫復合體，用熒光酶標儀激發(fā)并檢測所形成的捕獲 抗體一抗原一檢測抗體三層夾心發(fā)光免疫復合物的熒光強度，通過與標準溶 液對比求出待測抗原的濃度，其特點是所述的檢測抗體是用上轉換納米晶標 記的抗待測抗原的單克隆抗體，選用發(fā)射不同光的上轉換納米晶標記針對不 同抗原的抗體可同時檢測同一樣品中的多種抗原。
所說的包被是利用常規(guī)的方法(ELISA)將抗待測抗原的單克隆或多克 隆抗體作為捕獲抗體直接或通過親和素一生物素系統(tǒng)以及protein A或protein G間接固定在聚苯乙烯微孔上。
所說的三層夾心發(fā)光免疫復合體的形成是指加入待測樣品后，捕獲抗體 一抗原先反應形成二元免疫復合物，加入檢測抗體后，再通過抗原與檢測抗 體的特異性結合形成捕獲抗體一抗原一檢測抗體三層夾心的發(fā)光免疫復合 體。
所說的熒光強度的檢測是用熒光酶標儀激發(fā)并檢測所形成的捕獲抗體一 抗原一檢測抗體三層夾心發(fā)光免疫復合物的熒光強度，發(fā)不同光的抗體，選 用不同波長的光進行檢測，通常樣品中待測抗原的濃度越大，被捕獲抗體捕 獲的待測抗原的量越多，與之結合的檢測抗體越多，則測得的熒光強度值越 大。
上述的待測抗原可以是任何一種蛋白、肽類或其他小分子抗原，可以是 HbsAg、 TNT、 Ricin、 Ovalbumin等；相應的捕獲抗體和檢測抗體應為特異性 抗每種待測抗原的多克隆或單克隆抗體，使用不同的單克隆或多克隆抗體， 就可檢測不同的相應的待測抗原。
上轉換發(fā)光材料 (Up-converting phosphor,簡稱UCP)是一種可對能量 進行上轉的無機合成物，即UCP可吸收低能量的(長波長)紅外光，但卻發(fā) 射高能量的(短波長)可見光。UCP是由幾種稀土元素摻雜于某些晶體的晶 格中構成的。在這種材料中有兩種主要成分基質材料和稀土摻雜材料。
上轉換發(fā)光材料發(fā)出的磷光光子能量高于激發(fā)光，即發(fā)射波長短于激發(fā) 光。具有上轉換發(fā)光性能的材料是由稀土元素摻雜于晶體的晶格中而構成的 化合物，其發(fā)光機理是上轉換發(fā)光材料通過吸收兩個紅外光子發(fā)出一個可見 光子。將這種上轉換發(fā)光材料制備成納米級顆粒，標記于生物分子，在紅外 光激發(fā)下該顆粒將發(fā)出可見光。根據(jù)光的有無及其強弱，可判斷被檢測生物
分子的屬性及其含量。與傳統(tǒng)標記物相比，將上轉換發(fā)光材料作為標記物用 于生物分析中，具有無本底干擾、無淬滅?？蛇M行多重分析和定量分析等優(yōu)點。
本發(fā)明以UCP納米晶作為標記物，應用于抗原抗體特異性夾心反應的一 種新型夾心免疫檢測法。由于每種UCP納米晶具有狹窄的熒光譜峰，選用發(fā) 射不同光的UCP納米晶標記針對不同抗原的抗體可同時檢測同一樣品中的多
種待測抗原，為解決一種疾病多致病因素同時需做多次檢測診斷問題提供可 能。
所說的檢測抗體是指用UCP納米晶標記的抗待測抗原的單克隆抗體，如
果捕獲抗體也是抗待測抗原的單克隆抗體，這兩株單抗應識別待測抗原分子
上不同的抗原表位，即具有互補性，能同時結合到同一抗原分子上；UCP納 米晶是指一種可對能量進行上轉的無機合成物，即上轉換納米晶可吸收低能 量的(長波長)紅外光，但卻發(fā)射高能量的(短波長)可見光。上轉換(UCP) 納米晶以氧化物、氟化物、氯化物和硫化物為基質材料，在基質材料上進行 稀土摻雜，實現(xiàn)上轉換發(fā)光，其發(fā)光顏色因摻雜離子不同而異。
本發(fā)明與傳統(tǒng)熒光染料標記的免疫熒光分析法相比，具有以下積極效果 具有狹窄的熒光譜峰；發(fā)射光譜可調；對化學物質和生理代謝的降解有很強 的抵抗力，光漂白域值高；熒光背景低。克服了以往的夾心免疫檢測法顯色 單一，在多種待測物同時檢測方面存在的局限性。
圖1是聚苯乙烯微孔中三層夾心結構的樣品及其形成過程示意圖； 圖2是聚苯乙烯微孔中protein A或protein G連接層及三層夾心結構的樣 品及其形成過程示意圖3是用UCP納米晶標記的夾心免疫法檢測HbsAg標準曲線。
具體實施例方式
本發(fā)明的三層夾心結構的樣品及其形成過程可以用圖1和圖2形象的表 述，所說的三層夾心結構就是捕獲抗體一抗原一檢測抗體的三層分子的夾心 結構。
圖1中，1為UCP納米晶標記的檢測抗體，2為待測抗原，3為捕獲抗體， 4為聚苯乙烯板的微孔，ll是三層夾心免疫復合物的形成。
圖2中，5為UCP納米晶標記的檢測抗體，6為待測抗原，7為捕獲抗體， 8為protein A， 9為聚苯乙烯板的微孔，10為三層夾心免疫復合物的形成。 三層夾心結構中，第一層為捕獲抗體，第二層為待測抗原，第三層為檢測抗 體。
實施例1
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的UCP納米晶標記的夾心免疫檢測 1 、 Yb， Er共摻的UCP納米晶標記抗HbsAg多克隆抗體，制備檢測抗體。 方法1:表面為羧基的Er,Yb共摻的納米晶標記抗HbsAg多克隆抗體， 制備檢測抗體；
取濃度為10—7M的UCP納米晶溶液2 mL，向UCP納米晶中分別加入 2(VL0.05M的NHS以及20pL的0.5M的EDC溶液，攪拌30—60分鐘；之 后向UCP納米晶溶液中加入10—5M的HbsAg多克隆抗體20|iL。
方法2:表面為氨基的Er,Yb共摻的納米晶標記抗HbsAg多克隆抗體， 制備檢測抗體；
取濃度為10—7M的UCP納米晶溶液2 mL,向UCP納米晶中加入20pL 0.05M的戊二醛溶液，攪拌30—60分鐘；之后向UCP納米晶溶液中加入加 入10—5M的HbsAg多克隆抗體20jiL。
2、捕獲抗體的包被。
方法l:直接將捕獲抗體吸附到聚苯乙烯微孔上；
用包被緩沖液將捕獲抗體稀釋至l一5(^g/mL,每孔10(VL，4'C冰箱過夜
或37。C2小時，用磷酸鹽緩沖液(PBS， 10mmol/L,pH7.2-7.4,含NaCl 8.5g/L) 洗3次，按20(^L/孔加3^BSA，封閉剩余的位點。
方法2:將protein A或protein G吸附到聚苯乙烯微孔上； 用包被緩沖液將protein A或protein G稀釋至1 一50昭/mL,孑L 100|iL， 4 。C冰箱過夜或37°C2小時，用磷酸鹽緩沖液(PBS， 10mmol/L, pH7.2-7.4,含 NaCl 8.5g/L)洗3次，按20(^17孔加3%BSA，封閉剩余的位點。依靠protein A或protein G與抗體的高度趨向型結合力將捕獲抗體一抗原一檢測抗體三元 發(fā)光免疫復合體結合到聚苯乙烯微孔上。
3、 捕獲抗體一抗原—檢測抗體夾心三元發(fā)光免疫復合他的形成。 檢測抗體是能與捕獲抗體同時結合到同一 HbsAg分子上的另一株單抗，
兩者結合HbsAg分子上的不同抗原表位。
在上述的包被方式中，加入待測樣品后，37°C1小時，包被在聚苯乙烯 微孔上的捕獲抗體與HbsAg抗原特異性結合，在聚苯乙烯微孔表面形成捕獲 抗體一抗原二元免疫復合物，用磷酸鹽緩沖液(PBS， 10mmol/L, pH7.2隱7.4, 含NaC18.5g/L)洗3次，去掉非特異性吸附；加入檢測抗體，37°C1小時， 后者通過與HbsAg抗原特異性結合在聚苯乙烯微孔表面形成捕獲抗體一抗原 一檢測抗體三元免疫熒光復合物，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS， lOmmol/L, pH7,2-7.4，含NaC18.5g/L)洗3次，去掉非特異性吸附。
4、 熒光檢測
UCP納米晶標記的夾心免疫檢測法是通過檢測結合到聚苯乙烯微孔上的 捕獲抗體一抗原一檢測抗體夾心的三元免疫復合物的熒光強度來實現(xiàn)對待測 物質的檢測的?？芍苯语@示或與標準曲線對比求出樣品中HbsAg抗原的濃度。 結合到聚苯乙烯微孔上的UCP納米晶標記的檢測抗體的數(shù)量不同，產(chǎn)生的熒 光強度不同。通常捕獲抗體捕獲的待測抗原的量越多，與之結合的檢測抗體 越多，則測得的濃度或熒光強度值越多。幾乎所有的熒光酶標儀都能直接顯
示濃度值，如不能顯示，則需繪制標準曲線將已知HbsAg含量的標準溶液 配制成有底至高5種不同濃度(1.6,1.9,2.2,2.4,和2.7ng/mL)，用與待測標 本相同的方法，即重復2、 3步驟的操作，測定每種濃度的標準溶液對應的熒 光強度，以HbsAg濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標，繪制標準曲線，見圖 3。
實施例2
HbsAg的UCP納米晶標記的夾心免疫檢測法的特異性。 為了說明該夾心免疫檢測結果的特異性，用BSA代替HbsAg作為待測 抗原進行免疫檢測，重復實施例1的全過程。在實施例2中，所用的抗HbsAg 單克隆抗體與BSA是非配對抗原抗體或非相關抗體，不具有選擇性的識別作 用，因此不能特異性結合，也不能形成三層夾心的免疫復合體，即不能測到 熒光，說明待測樣品中不含有HbsAg，實驗結果表明，樣品中的非相關蛋白 不會引起非特異性反應，該夾心免疫檢測法具有高度特異性。 實施例3
AFP的UCP納米晶標記的夾心免疫檢測。
如圖實施例1的各步操作，不同的是捕獲抗體和檢測抗體為抗AFP的單 克隆或多克隆抗體，待測抗原只能是AFP。通過檢測熒光強度，直接顯示或 與標準曲線對比求出樣品中AFP的濃度。
權利要求
1. 一種夾心免疫檢測方法，是將捕獲抗體直接或間接包被在聚苯乙烯板的微孔，形成夾心發(fā)光免疫復合體，用熒光酶標儀激發(fā)并檢測所形成的捕獲抗體—抗原—檢測抗體三層夾心發(fā)光免疫復合物的熒光強度，通過與標準溶液對比求出待測抗原的濃度，其特征在于所述的檢測抗體是用上轉換納米晶標記的抗待測抗原的單克隆抗體，選用發(fā)射不同光的上轉換納米晶標記針對不同抗原的抗體可同時檢測同一樣品中的多種抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物分子檢測方法，特別是一種用已知抗體定量檢測相應抗原的夾心免疫檢測方法，是將捕獲抗體直接或間接包被在聚苯乙烯板的微孔，形成夾心發(fā)光免疫復合體，用熒光酶標儀激發(fā)并檢測所形成的捕獲抗體—抗原—檢測抗體三層夾心發(fā)光免疫復合物的熒光強度，通過與標準溶液對比求出待測抗原的濃度，所述的檢測抗體是用上轉換納米晶標記的抗待測抗原的單克隆抗體，選用發(fā)射不同光的上轉換納米晶標記針對不同抗原的抗體可同時檢測同一樣品中的多種抗原。具有狹窄的熒光譜峰，發(fā)射光譜可調，對化學物質和生理代謝的降解有很強的抵抗力，光漂白域值高、熒光背景低?？朔艘酝膴A心免疫檢測法顯色單一，在多種待測物同時檢測方面存在的局限性。
文檔編號G01N33/544GK101387645SQ20081005130
公開日2009年3月18日 申請日期2008年10月22日 優(yōu)先權日2008年10月22日
發(fā)明者劉曉敏, 孔祥貴, 孫雅娟, 張友林, 曾慶輝 申請人:中國科學院長春光學精密機械與物理研究所