專利名稱：甘蔗黃葉病毒的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物保護領域，特別是一種快速、準確、操作簡單的甘蔗黃葉 病毒檢測方法。
背景技術：
甘蔗黃葉病是一種嚴重危害甘蔗生長的世界性甘蔗病害，自1989年在美國 夏威夷發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)陸續(xù)在全球30多個國家和地區(qū)出現(xiàn)并不斷蔓延擴大，我 國各蔗區(qū)也相當普遍和嚴重，發(fā)病率在10%-100%之間。該病的發(fā)生導致甘蔗產(chǎn) 量下降，品質變劣和種性退化，嚴重時甘蔗產(chǎn)量減產(chǎn)高達40%-60%。建立快速、 準確、可操作性強的病毒檢測方法是病害防治及甘蔗脫毒工作的關鍵。
目前，對甘蔗黃葉病毒的檢測方法主要有電鏡檢測、DAS-ELISA檢測和 RT-PCR檢測。但是，這些方法存在取樣復雜、操作繁瑣、檢測所需時間長，而 且需要特殊昂貴的儀器和條件，成本高的缺點和不足，不適合田間大批量樣品 的快速檢測。

發(fā)明內容
本發(fā)明克服了現(xiàn)有檢測方法中的缺點，提出一種快速、準確、操作簡單、 適合田間大批量樣品檢測的甘蔗黃葉病毒檢測方法。 本發(fā)明包括以下步驟
1、 將待測樣本組織斑印在硝酸纖維素膜上；
2、 把硝酸纖維素膜浸入含O. 01%甘蔗黃葉病毒特異性抗血清的封閉緩沖液 中孵育；
3、 把硝酸纖維素膜轉移至含O. 1%堿性磷酸酶標記抗體、19&脫脂奶粉的TBST 緩沖液中孵育；
4、 把硝酸纖維素膜轉入底物/緩沖液BCIP/NBT二片加20ml雙蒸水溶解中顯 色5 10min;
5、 結果判別硝酸纖維素膜顯色后組織斑上呈紫紅色即可確定檢測樣本中 有甘蔗黃葉病毒存在，組織斑不顯色則檢測樣本中沒有甘蔗黃葉病毒。
本發(fā)明的有益效果是能快速準確的檢測甘蔗黃葉病毒，檢測結果易于目測 判斷，且操作簡單，取樣少，節(jié)省勞力，結果可靠，不易受污染，不需特殊儀 器，也不需特殊條件，適合于大批量樣品檢測。
具體實施例方式
1、 制樣和組織印跡取甘蔗上部第一葉的下部中脈，用鋒利刀片將其橫切 成平面后，用力將切成平面在硝酸纖維素膜上垂直點壓，獲得印跡斑，把硝酸 纖維素膜放在一個小盒里風干；
2、 封閉將印跡斑風干后把硝酸纖維素膜浸入封閉緩沖液中，37i:下孵育 45min;
3、 TBST緩沖液快速洗膜1次倒去小盒里封閉緩沖液，把硝酸纖維素膜浸 入TBST緩沖液中，輕輕轉動幾下，再棄去TBST緩沖液；
4、 加抗體把硝酸纖維素膜浸入含0. 01%甘蔗黃葉病毒特異性抗血清、1% 脫脂奶粉的TBST緩沖液中，37。C孵育2h， TBST緩沖液洗膜3次，每次3min;
5、 加酶標抗體把硝酸纖維素膜浸入含0. 1%堿性磷酸酶標記抗體、1%脫 脂奶粉的TBST緩沖液中，37。C下孵育2h， TBST緩沖液洗膜4次，每次3min;
6、 加底物顯色把硝酸纖維素膜轉入底物/緩沖液BCIP/NBT 二片加20ml 雙蒸水溶解中顯色5 10min，取出后用蒸餾水^洗，自然干燥；
7、 結果判別肉眼觀察或顯微鏡觀察判別，感染甘蔗黃葉病毒的樣品組織 斑上呈紫紅色，不感染的組織斑上不顯色。
權利要求
1、一種甘蔗黃葉病毒的檢測方法，其特征在于步驟如下1)、取甘蔗上部第一葉的下部中脈，將其橫切成平面后，用力將切成平面在硝酸纖維素膜上垂直點壓，獲得印跡斑；2)、印跡斑風干后將硝酸纖維素膜浸入含0.01％甘蔗黃葉病毒特異性抗血清的封閉緩沖液中，37℃下孵育45min；3)、將硝酸纖維素膜浸入含0.1％堿性磷酸酶標記抗體、1％脫脂奶粉的TBST緩沖液中，37℃下孵育2h，TBST緩沖液洗膜3次，每次3min；4)、把硝酸纖維素膜轉入底物/緩沖液BCIP/NBT二片加20ml雙蒸水溶解中顯色5～10min，取出后用蒸餾水沖洗，自然干燥；5)、結果判別肉眼觀察或顯微鏡觀察判別，感染旨蔗黃葉病毒的樣品組織斑上呈紫色，不感染的組織斑上不顯色。
2、 根據(jù)權利要求1所述的甘蔗黃葉病毒的檢測方法，其特征在于TBST緩 沖液為按質量計P朋.0的Tris-HC16. 05g十NaCl 2. 92g十1000ml雙蒸水，再加 入0.5mlTween20。
3、 根據(jù)權利要求l所述的甘蔗黃葉病毒的檢測方法，其特征在于封閉緩沖 液為按質量計TBST中加入5%脫脂奶粉。
4、 根據(jù)權利要求l所述的甘蔗黃葉病毒的檢測方法，其特征在于所用的酶 標抗體為羊抗兔堿性磷酸酶標記抗體Goat Anti Robbit。
5、 根據(jù)權利要求1所述的甘蔗黃葉病毒檢測方法，其特征在于所用的底物 BCIP/ NBT是5_溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氮藍四唑。
全文摘要
一種甘蔗黃葉病毒的檢測方法，有以下步驟將待測樣本組織斑印在硝酸纖維素膜上；把硝酸纖維素膜浸入含0.01％甘蔗黃葉病毒特異性抗血清的封閉緩沖液中孵育；把硝酸纖維素膜轉移至含0.1％堿性磷酸酶標記抗體、1％脫脂奶粉的TBST緩沖液中孵育；把硝酸纖維素膜轉入底物/緩沖液BCIP/NBT二片加20ml雙蒸水溶解中顯色5～10min；硝酸纖維素膜顯色后組織斑上呈紫紅色即可確定檢測樣本中有甘蔗黃葉病毒存在，組織斑不顯色則檢測樣本中沒有甘蔗黃葉病毒，本發(fā)明能快速準確的檢測甘蔗黃葉病毒，檢測結果易于目測判斷，且操作簡單，取樣少，節(jié)省勞力，結果可靠，不易受污染，不需特殊儀器，適合于田間大批量樣品檢測。
文檔編號G01N21/77GK101363851SQ20081005899
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月27日 優(yōu)先權日2008年9月27日
發(fā)明者盧文潔, 李文鳳, 清 蔡, 陳學寬, 黃應昆 申請人:云南省農業(yè)科學院甘蔗研究所