專利名稱：甘蔗宿根矮化病菌的快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物保護(hù)領(lǐng)域，尤其是一種甘蔗宿根矮化病菌的快速檢測方法。
背景技術(shù)：
甘蔗宿根矮化病RSD是普遍存在于所有種植甘蔗地區(qū)的一種世界性的重要 病害。自1944 1945年在澳大利亞昆士蘭首次發(fā)現(xiàn)以來，已有美國、南非、毛 里求斯、印度、巴西等47個國家和地區(qū)報道了該病的發(fā)生，遍布世界各蔗區(qū)。 我國臺灣省于1945年最先報道此病的發(fā)生，在大陸1986確診存在甘蔗宿根矮 化病，之后廣東、福建、廣西、云南曾對全省蔗區(qū)進(jìn)行普查，結(jié)果表明均存在 此病。此病由一種棒桿菌屬細(xì)菌寄生于蔗株的維管束中引起，主要通過帶病蔗 種和收獲、砍種刀具等傳播蔓延，且傳播性極強(qiáng)。蔗株染病后變矮，蔗莖變細(xì)， 生長遲滯，宿根發(fā)株少，在干旱地區(qū)和種植感病品種的蔗區(qū)所造成的損失尤其 重要，病害造成損失的程度隨宿根年數(shù)的增加而增加， 一般減產(chǎn)10~30%，干旱 缺水時可達(dá)60%以上，還可導(dǎo)致品種退化。RSD無明顯的外部和內(nèi)部癥狀，病原 菌難以分離和培養(yǎng)，傳統(tǒng)診斷方法極其困難，因而迫切需要建立一種簡便、快 速、準(zhǔn)確、實用的檢測方法，以期為該病害的診斷和防治、脫毒種苗的生產(chǎn)、 對外甘蔗品種/材料交換檢疫檢測提供技術(shù)支撐。
目前，對甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法主要有剖莖檢測法、相差顯微鏡檢 測法和PCR法。但剖莖檢測法和相差顯微鏡檢測法準(zhǔn)確性差、操作繁瑣、檢測靈 敏度低，PCR法檢測體系不易穩(wěn)定，因此不適合田間大批量樣品的快速檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種甘蔗宿根矮化病菌的快速檢測方法，該方法克服 了現(xiàn)有檢測方法的不足，簡便、準(zhǔn)確、操作簡單、適合田間大批量樣品檢測。
本發(fā)明包括以下步驟1、用打氣泵吹氣法吹提樣品庶汁；2、離心法制備 樣液；3、 I-ELISA法檢測甘蔗宿根矮化病菌RSD。具體步驟如下
1、樣品蔗汁提取
每個待測甘蔗樣本取5 6條蔗莖，每條蔗莖截取中下部莖節(jié)，用砍刀切成 12 16cm長，每取一個樣品后均用70%的酒精消毒砍刀，再用打氣泵吹2 3ml 的甘蔗汁于2ml離心管內(nèi)，置于冰上，帶回室內(nèi)放于-18t冰箱保存?zhèn)溆茫?br> 2、 樣液制備
取待測蔗汁lOOOul于1. 5ml離心管旋渦混合器震蕩混勻后13000rpm離心 3min，棄上清；沉淀加1000ul包被緩沖液，旋渦混合器震蕩混勻后13000rpm 離心3min，棄上清；沉淀再加1000ul包被緩沖液，旋渦混合器震蕩混勻后 13000rpm離心3min，棄上清；沉淀加300ul包被緩沖液稀釋混勻；
3、 I-ELISA檢測
1) 上樣分別將上述制備好的包被緩沖液稀釋混勻的樣液加入ELISA酶標(biāo) 板反應(yīng)孔，每孔100ul，同時設(shè)陽性對照用包被緩沖液l: 50稀釋、陰性對照用 健康蔗汁制備和空白對照用PBST溶液，每個樣品重復(fù)，蓋上蓋子，37。C恒溫培 養(yǎng)過夜；用含0.05%吐溫的磷酸鹽緩沖液慢洗2次，每次5min，拍干；
2) 封閉每孔加200ul含5。/。脫脂奶粉的PBST溶液，室溫封閉30min， PBST
緩沖液同上慢洗l次，拍干；
3) 加抗體每孔加100ul含0. 1%RSD特異性抗血清和含2. 5%脫脂奶粉的 PBST緩沖液，室溫孵育1.5h， PBST緩沖液慢洗1次，拍干；
4) 加酶標(biāo)抗體每孔加100ul含0.01%堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔酶標(biāo)抗體、 含2.5y。脫脂奶粉的PBST緩沖液，室溫孵育1.5h， PBST緩沖液慢洗5次，拍干；
5) 顯色每孔加100ul底物/緩沖液，lmg/ml稀釋，加入酶標(biāo)板，室溫下 充分顯色。
4、 結(jié)果判別
在BIO—RAD Model 550型酶標(biāo)儀405nm波長下分別讀取每個樣品0小時和 充分顯色后的OD值。每個樣品充分顯色后的OD值減去0小時OD值的差大于0. 15 為陽性，小于0.05為陰性，在0.05 0. 15之間為可疑。
本發(fā)明的有益效果是克服了傳統(tǒng)的剖莖檢測法和相差顯微鏡檢測法準(zhǔn)確性 差、操作繁瑣、靈敏度低，PCR檢測法體系難于穩(wěn)定等不足，能簡便、快速、準(zhǔn) 確、有效的檢測出病蔗樣品中的宿根矮化病菌RSD，適合田間大批量樣品的快速 檢測，為甘蔗宿根矮化病的診斷和防治、脫毒種苗的生產(chǎn)、對外甘蔗品種/材料 交換檢疫檢測提供了技術(shù)支撐。
具體實施例方式
1、樣品蔗汁提取
每個待測甘蔗樣本取5 6條蔗莖，每條蔗莖截取中下部莖節(jié)，用砍刀切成 15cm左右長，再用打氣泵吹2ml左右的甘蔗汁于2ml離心管內(nèi)，置于冰上，帶
回室內(nèi)放于-18。C冰箱保存?zhèn)溆?；每取一個樣品后刀和打氣泵均要用清水沖洗后
再用70%的酒精液消毒。
2、 樣液制備
取待測蔗汁1000ul于1. 5ml離心管旋渦混合器震蕩混勻后13000卬m離心 3min，棄上清；沉淀加1000ul包被緩沖液，旋渦混合器震蕩混勻后13000rpm 離心3min，棄上清；沉淀再加1000ul包被緩沖液，旋渦混合器震蕩混勻后 13000rpm離心3min，棄上清；沉淀加300ul包被緩沖液稀釋混勻；
3、 I-ELISA檢測
1) 上樣分別將上述制備好的包被緩沖液稀釋混勻的樣液加入ELISA酶標(biāo) 板反應(yīng)孔，每孔100ul，同時設(shè)陽性對照用包被緩沖液l: 50稀釋、陰性對照用 健康蔗汁制備和空白對照用PBST溶液，每個樣品2重復(fù)，蓋上蓋子，37匸恒溫 培養(yǎng)過夜；用含0.05%吐溫的磷酸鹽緩沖液慢洗2次，每次5min，拍干；
2) 封閉每孔加200ul含5%脫脂奶粉的PBST溶液，室溫封閉30min， PBST 緩沖液同上慢洗l次，拍干；
3) 加抗體每孔加100ul含0. 1%RSD特異性抗血清和含2. 5%脫脂奶粉的 PBST緩沖液，室溫孵育1.5h， PBST緩沖液慢洗1次，拍干；
4) 加酶標(biāo)抗體每孔加100ul含0. 01%堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔酶標(biāo)抗體、 含2. 5%脫脂奶粉的PBST緩沖液，室溫孵育1.5h， PBST緩沖液慢洗5次，拍干；
5) 顯色每孔加100ul底物/緩沖液，lmg/ml稀釋，加入酶標(biāo)板，室溫下 充分顯色。
4、 結(jié)果判別
在BIO—RAD Model 550型酶標(biāo)儀405nm波長下分別讀取每個樣品0小時和 充分顯色后的OD值。每個樣品充分顯色后的OD值減去0小時OD值的差大于0. 15 為陽性，小于0.05為陰性，在0.05 0. 15之間為可疑。
上述的包被緩沖液配制方法為Na2C03 1.59g和NaHC03 2.93g溶解于 1000ml雙蒸水后調(diào)pH值為9.6。
PBST緩沖液配制方法為NaC18.0g、 KH2P04 0.2g、 Na2HPO4.2H20 2.9g和 KC1 0.2g溶解于1000ml雙蒸水中，再按重量計加入0. 5mlTween20。
封閉緩沖液配制方法為PBST中按重量計加入5%脫脂奶粉。
所用的底物是硝基苯磷酸鹽，底物緩沖液是10%乙二醇胺，配制濃度為lmg 硝基苯磷酸鹽用1ml 10%乙二醇胺溶解。
權(quán)利要求
1、一種甘蔗宿根矮化病菌的快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)、樣品蔗汁提取每個待測甘蔗樣品取5～6條蔗莖，每條蔗莖截取中下部莖節(jié)，用刀切成12～16cm長，用打氣泵吹2～3ml的甘蔗汁于離心管內(nèi)，置于冰上，帶回室內(nèi)放于-18℃冰箱保存?zhèn)溆茫?)、樣液制備取上一步驟提取的待測蔗汁1000ul于離心管旋渦混合器中震蕩混勻后13000rpm離心3min，棄上清，沉淀加1000ul包被緩沖液，旋渦混合器震蕩混勻后13000rpm離心3min，棄上清，沉淀再加1000ul包被緩沖液，旋渦混合器震蕩混勻后13000rpm離心3min，棄上清，沉淀加300ul包被緩沖液稀釋混勻得到樣液；3)、I-ELISA檢測(1)上樣分別將上述制備好的樣液加入ELISA酶標(biāo)板反應(yīng)孔，每孔100ul，同時設(shè)置陽性對照用包被緩沖液按重量份150稀釋、陰性對照用健康蔗汁制備和空白對照用PBST溶液，每個樣品重復(fù)，蓋上蓋子，37℃恒溫培養(yǎng)過夜；用含0.05％吐溫的磷酸鹽緩沖液慢洗2次，每次5min，拍干；(2)封閉每孔加200ul含5％脫脂奶粉的PBST溶液，室溫封閉30min，PBST緩沖液同上慢洗1次，拍干；(3)加抗體每孔加100ul含0.1％RSD特異性抗血清和含2.5％脫脂奶粉的PBST緩沖液，室溫孵育1.5h，PBST緩沖液慢洗1次，拍干；(4)加酶標(biāo)抗體每孔加100ul含0.01％堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔酶標(biāo)抗體、含2.5％脫脂奶粉的PBST緩沖液，室溫孵育1.5h，PBST緩沖液慢洗5次，拍干；(5)顯色每孔加100ul底物／緩沖液，1mg/ml稀釋，加入酶標(biāo)板，室溫下充分顯色；4)、結(jié)果判別在BIO—RAD Model 550型酶標(biāo)儀405nm波長下分別讀取每個樣品0小時和充分顯色后的OD值，每個樣品充分顯色后的OD值減去0小時OD值的差大于0.15為陽性，小于0.05為陰性，在0.05～0.15之間為可疑。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌的快速檢測方法，其特征在于每取一個樣品后刀和打氣泵均要用清水沖洗后再用70%的酒精液消毒。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌的快速檢測方法，其特征在于 包被緩沖液配制為Na2C03 1.59g和NaHC03 2.93g溶解于lOOOml雙蒸水后調(diào) pH值為9.6。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌的快速檢測方法，其特征在于 PBST緩沖液配制為NaCl 8.0g、 KH2P04 0.2g、 Na2HPO4.2H20 2.9g和KCl 0.2g 溶解于lOOOml雙蒸水中，再按重量計加入O. 5mlTween20。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌的快速檢測方法，其特征在于 封閉緩沖液配制為PBST中按重量計加入5%脫脂奶粉。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌的快速檢測方法，其特征在于 所用的底物是硝基苯磷酸鹽，底物緩沖液是10%乙二醇胺，配制濃度為lmg硝 基苯磷酸鹽用1ml 10%乙二醇胺溶解。
全文摘要
一種甘蔗宿根矮化病菌的快速檢測方法，包括以下步驟1.用打氣泵吹氣法吹提樣品蔗汁；2.離心法制備樣液；3.I-ELISA法檢測甘蔗宿根矮化病菌RSD；該方法克服了傳統(tǒng)的剖莖檢測法和相差顯微鏡檢測法準(zhǔn)確性差、操作繁瑣、靈敏度低，PCR檢測法體系難于穩(wěn)定等不足，能簡便、快速、準(zhǔn)確、有效的檢測出甘蔗宿根矮化病菌RSD，適合田間大批量樣品的快速檢測，為甘蔗宿根矮化病的診斷和防治、脫毒種苗的生產(chǎn)、對外甘蔗品種/材料交換檢疫檢測提供了技術(shù)支撐。
文檔編號G01N21/78GK101363847SQ20081005899
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月27日
發(fā)明者盧文潔, 吳才文, 李文鳳, 范源洪, 黃應(yīng)昆 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所