專利名稱：那西肽制品生物效價(jià)含量的高效液相色譜(hplc)檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種飼料藥物添加劑那西肽及其各種制品的含量檢驗(yàn) 方法，具體涉及那西肽各種制品生物效價(jià)含量的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法。
在詞料中添加各種藥物添加劑，以防止疾病，促進(jìn)生長(zhǎng)，提高飼料利用率，已成為飼料 界廣泛采用和公認(rèn)有效的做法之一。半個(gè)世紀(jì)以來，人們不斷尋找更好更新型的添加成分， 以克服傳統(tǒng)成分存在的不足和缺陷。新獸藥那西肽(又名諾西肽，英文名Nosih印tide )是 生物工程的產(chǎn)物，由Str印Loraycesactuosus發(fā)酵產(chǎn)生，是一種新型非吸收型的詞用抗生素。 作為新型的含硫環(huán)狀多肽類抗生素屬的新成員，那西肽具有適用范圍廣，廣譜抗菌，促生長(zhǎng) 性優(yōu)良、添加量少、改善飼料利用率，消化道不吸收、機(jī)體無殘留和對(duì)環(huán)境影響小、服用安 全性高、基本無耐藥性及不與其他抗生素產(chǎn)生交叉等特點(diǎn)，尤其是極好的適應(yīng)性和極小的殘 留特性在飼料工業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用，是一種比較理想的飼用抗生素?fù)Q代品。
純品那西肽是一種黃色結(jié)晶，屬脂溶性物質(zhì)，其分子量為1222，分子式為C51H43N13012S6 ， 分子結(jié)構(gòu)(Merck index , fourth edition )，是由12種氨基酸及衍生物形成的的含硫多 膚類物質(zhì)，結(jié)構(gòu)參見下圖。<formula>formula see original document page 3</formula>
背景技術(shù)：
由于那西肽的生產(chǎn)是由微生物發(fā)酵產(chǎn)物提取純化而獲得的，而在其發(fā)酵粗物中存在大量 的與那西肽共生的，分子量及結(jié)構(gòu)式均與之較為近似的其它組分，這些組分也有一定的抗菌 作用，他們應(yīng)屬于與那西肽有相互關(guān)聯(lián)關(guān)系的共生組分。因此，在測(cè)定那西肽的含量時(shí)，其 中非那西肽部分的有效作用也不能被忽略。
抗生素的種類很多，化學(xué)性質(zhì)不同，因此具體檢測(cè)方法也千差萬別，但總歸起來可以歸 為兩類化學(xué)測(cè)定法和微生物檢定法(免疫測(cè)定法)。
微生物檢定法(免疫測(cè)定法)是抗生素國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的通用特效檢驗(yàn)方法，其結(jié)果能反映 抗菌素中抗菌物質(zhì)復(fù)合組分或稱多重組分的綜合效應(yīng)。那西肽生物效價(jià)含量現(xiàn)行規(guī)定也指定 為微生物檢定法來評(píng)估結(jié)果。
但由于諸多原因，造成目前規(guī)定測(cè)試方法的實(shí)用性差，費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且測(cè)定結(jié)果精密度難 達(dá)到要求。首先，其具體檢驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，單次樣品實(shí)驗(yàn)需用時(shí)平均為18個(gè)小時(shí)；其 次，單次實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)材料的利用率平均為60%—70%，實(shí)驗(yàn)材料消耗浪費(fèi)較大；再者，領(lǐng)啶 結(jié)果的方法可信限率出現(xiàn)>5%的概率平均為80%以上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，采用快速直觀的HPLC測(cè)定方法，通過 特殊處理，將那西肽制品含量結(jié)果能直接表達(dá)為生物效價(jià)含量。
本發(fā)明包括如下內(nèi)容
那西肽制品生物效價(jià)含量的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法，包括待測(cè)樣品的預(yù)處理， 指定的色譜條件，測(cè)定圖譜的處理分析等-
(1) 用對(duì)那西肽有相當(dāng)脂溶性的有機(jī)溶劑和緩沖液的混合溶液對(duì)其制劑進(jìn)行提取，以便能 完全提取那西肽，從而獲得HPLC測(cè)定所需的待測(cè)液；
(2) 指定的色譜條件為帶紫外可見分光檢測(cè)器的高效液相色譜儀，乙氰水相=50 :
50的流動(dòng)相；0.5ml/min 2. Oml/mim的流速；反相碳十八大分子填充柱； 230nm-250nm的檢測(cè)波長(zhǎng)；
(3) 將測(cè)定圖譜的各個(gè)副峰的面積以面積折算系數(shù)(K)對(duì)其折算后，再用處理主峰的方法 處理結(jié)果，該面積折算系數(shù)(K)為1/2 3/4;
(4) 將HPLC測(cè)定結(jié)果通過含量矯正系數(shù)(P)的平均值換算獲得生物效價(jià)含量，含量矯正 系數(shù)(P)為0.970 1.050。
本發(fā)明所述的提取用的混合溶液中的有機(jī)溶劑是指N, N- 二甲基甲酰胺 (N, N-dimethylformaraide DMF)，緩沖液是指磷酸一磷酸鹽緩沖液。 以上(2)的所述水相為《0.50%重量百分比的磷酸水溶液。 綜上所述1、 本發(fā)明敘述了采用有機(jī)溶劑與緩沖液的混合溶液高效提取那西肽，以獲得待測(cè)樣提取 液的預(yù)處理方法。該處理液可用于那西肽制品含量測(cè)定或用于其它非測(cè)定目的。
2、 本發(fā)明詳細(xì)敘述了在指定的HPLC條件下測(cè)定那西肽制品主成分及相關(guān)其它成分含量 的方法，該方法快速實(shí)用、干擾少、測(cè)定結(jié)果重復(fù)性好，是一個(gè)有效可靠的新穎測(cè)定方法。
3、 本發(fā)明用HPLC測(cè)定結(jié)果在處理后可直接代表那西肽制品生物效價(jià)含量的方法，以及 在對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行處理時(shí)采用有效而可靠的計(jì)算方法。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及的檢測(cè)儀器、條件、方法步驟如下
① 、檢驗(yàn)設(shè)備條件
高效液相色譜儀(帶紫外可見分光檢測(cè)器)
流動(dòng)相乙氰水相(《0.50%重量百分比的磷酸水溶液)=50 : 50;
流速 0. 5ml/min - 2. 0ml/mim。
檢測(cè)柱反相碳十八大分子填充柱。
檢測(cè)波長(zhǎng)230nm-250咖。
② 、供試液預(yù)處理
標(biāo)準(zhǔn)貯備液
精密稱定已知那西肽制品含量(或已知相當(dāng)?shù)纳镄r(jià)的)的標(biāo)準(zhǔn)品于適宜的容量瓶中，
加入20ml的DMF液超聲至徹底溶解，用面F液稀釋到容量瓶滿刻度，將其制備成1000ppm的 貯備液。避光低溫保存，其有效期為三個(gè)月。 標(biāo)準(zhǔn)供試液
上述標(biāo)準(zhǔn)貯備液恢復(fù)至室溫后，準(zhǔn)確移取預(yù)先計(jì)算所需的體積數(shù)，并置于適宜的容量瓶 中，加入10ml的DMF，混均勻后用甲醇液稀釋到容量瓶滿刻度，將其制備成50ppm的供試液， 或配制成稀釋系列液。
用微過濾膜濾過，以備HPLC檢驗(yàn)測(cè)定用。該液應(yīng)臨用時(shí)配制，并盡可能避光。
待檢樣供試液
精密稱定預(yù)先計(jì)算制備50ppm濃度所需要的待檢樣品的相當(dāng)質(zhì)量，置于適宜體積的容量 瓶中，加入40ml的DMF液液，及10ml的磷酸磷酸鹽緩沖液，將樣品充分潤(rùn)濕。室溫下用超 聲或用振搖法提取，完成后用DMF液液稀釋到容量瓶滿刻度，而將其制備成約50ppm的待檢 樣供試液。用微過濾膜濾過，供HPLC檢驗(yàn)測(cè)定用。該液應(yīng)臨用時(shí)配制，并盡可能避光。為保 證置信度，同一批號(hào)樣應(yīng)進(jìn)行三個(gè)或以上的同等處理平行樣。
③ 、樣品HPLC測(cè)定
打開HPLC儀器，按照本發(fā)明①指定的檢驗(yàn)條件進(jìn)行設(shè)定，預(yù)運(yùn)行儀器以獲得平穩(wěn)的基線。用微量注射進(jìn)樣器對(duì)標(biāo)準(zhǔn)供試液和待檢樣供試液操作進(jìn)樣，每個(gè)樣液每次進(jìn)樣20ul，以獲得 相應(yīng)的色譜譜圖。
④ 、測(cè)定結(jié)果的計(jì)算方法
以峰面積外標(biāo)工作曲線法或以單點(diǎn)峰面積外標(biāo)法進(jìn)行處理計(jì)算。
⑤ 、不同時(shí)間出峰組分在測(cè)定結(jié)果計(jì)算中的處理原則
在處理主峰那西肽峰時(shí)，可直接用標(biāo)準(zhǔn)那西肽峰的峰面積外標(biāo)法(工作曲線法或以單點(diǎn) 計(jì)算法)進(jìn)行比對(duì)計(jì)算，以求得待檢樣中那西肽的含量。
在處理非那西肽的其它組分(與主峰有關(guān)聯(lián)性的其它組分峰，副峰)時(shí)，可以將各個(gè)副 峰的面積先用面積折算系數(shù)(K)進(jìn)行折算后，再用處理那西肽峰同等的計(jì)算方法來進(jìn)行處理。
在直接用標(biāo)準(zhǔn)品主峰計(jì)算獲得其它副峰的含量結(jié)果，已經(jīng)證明與用這些組分的純品分別 計(jì)算各自的結(jié)果之間存在一定的差異，但這種出入非常小，并且?guī)缀蹩梢院雎圆挥?jì)。
一般情況下，會(huì)出現(xiàn)兩到三個(gè)副峰，但只有一個(gè)最接近主峰的副峰才有計(jì)算意義。即該 副峰的結(jié)果會(huì)對(duì)最終結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，而其它副峰結(jié)果均可忽略不計(jì)。
在特殊的樣品中會(huì)出現(xiàn)多個(gè)較大副峰的情況，此時(shí)所有副峰對(duì)最終測(cè)定結(jié)果的影響應(yīng)該 被重新計(jì)算考慮。
◎、在得到那西肽的HPLC結(jié)果后，可以直接采用含量矯正系數(shù)(P)來計(jì)算得出其生物效價(jià)含量表達(dá)值。
對(duì)本發(fā)明方案的可行性分析如下-
1、待檢樣供試液對(duì)樣品中待測(cè)定成分的代表性研究
本發(fā)明中使用的用混合液高效提取處理待測(cè)樣的方法是通過以下研究獲得的。 研究理論表明不論采用什么方法進(jìn)行含量測(cè)定，樣品的前處理是十分重要的，要求是前處理獲得的待檢樣供試液必須能穩(wěn)定地代表樣品的待測(cè)成分的真實(shí)含量值。即處理液的回收率較大(》95%)且能保持一定的穩(wěn)定性(RSD， CV《2%)時(shí)，該方法才會(huì)是一個(gè)可靠的定量 檢驗(yàn)方法。
由于那西肽的大分子結(jié)構(gòu)決定了其對(duì)提取條件有相當(dāng)?shù)拿舾行?，影響那西肽高效穩(wěn)定地 被提取的因素有很多，如溫度、時(shí)間、pH、溶劑類型等，均會(huì)對(duì)其溶出度或者在溶出后的穩(wěn) 定性產(chǎn)生影響。前處理過程或條件控制得不好，極易造成提取不完全或形成降解。我們用不 同實(shí)際含量的預(yù)混劑，按不同條件進(jìn)行提取比較操作，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過影響因素的效率統(tǒng)計(jì)研究表明前處理?xiàng)l件的不同會(huì)導(dǎo)致完全不同的提取液濃度情況，從而導(dǎo)致最終的檢測(cè)結(jié)果不同。只有使用了適宜的處理?xiàng)l件，才能獲得較高的回收值。
實(shí)驗(yàn)證明
①、采用有機(jī)溶劑和緩沖溶液的混合溶液進(jìn)行處理，才能達(dá)到有效率地提取。② 、不同的有機(jī)溶劑對(duì)脂溶性那西肽進(jìn)行提取的效果不同。
③ 、采用合適的有機(jī)溶劑(DMF)與適宜的緩沖液混合提取那西肽，才可以獲得最高的提 取值和最穩(wěn)定的提取效率。
數(shù)據(jù)研究表明該提取方法獲得的待檢樣供試液的平均回收率值達(dá)到102. 6%，滿足90% — 110%的方法要求；此平均回收率的CV (%)為0.6%，明顯小于2%的方法理論規(guī)定。 2、本發(fā)明測(cè)試方法可靠性研究
本發(fā)明中使用的方法條件組合是通過以下研究獲得的。
方法研究理論表明檢測(cè)方法的可行性和可靠性是決定檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵。因此需要對(duì)其進(jìn) 行科學(xué)的評(píng)價(jià)，下面通過方法精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍對(duì)液相色譜測(cè)定方法進(jìn)行驗(yàn)證
① 、精密度-
方法精密度是指分析結(jié)果的重復(fù)性或重現(xiàn)性。對(duì)于一個(gè)實(shí)用的定量方法，其重復(fù)性的精 密度(既變異系數(shù)CVn/。， RSD%)必須控制在盡可能小的范圍內(nèi)，考慮到方法本身和操作因
素外精密度大小還與待測(cè)物濃度有關(guān)，而一般指標(biāo)是若濃度在^100mg/kg時(shí)，CV(。/。)應(yīng)蕓 5%。
我們用理論含量為0. 5%的某批號(hào)制劑樣品進(jìn)行平行性實(shí)驗(yàn)，共檢測(cè)40個(gè)平行樣。測(cè)試研 究數(shù)據(jù)證明表明在本發(fā)明條件下檢測(cè)獲得的樣品測(cè)試結(jié)果的CV (%) =0.539%，明顯小于5% 的要求，說明該方法的重復(fù)測(cè)試精密度完全達(dá)到方法理論規(guī)定。
② 、準(zhǔn)確度
方法的準(zhǔn)確度是指測(cè)定值與真實(shí)值的接近程度，通常采用添加回收率來表示。作為一個(gè)可 用的定量方法，回收率一般應(yīng)在80%~110%的范圍內(nèi)。而作為一個(gè)高效的定量方法，回收率 應(yīng)在控制在95%~105%的范圍內(nèi)，且其回收率的精密度應(yīng)保持在2%以下。
通過對(duì)同一濃度樣品的多次重復(fù)測(cè)試及對(duì)不同真實(shí)濃度的測(cè)試數(shù)據(jù)研究表明，本方法在那 西肽濃度從0.1%到96.0%范圍內(nèi)，其樣品平行測(cè)定結(jié)果精密度最差為0.30%，滿足《2%的要 求；不同濃度的制劑回收率保持在102% —104%的范圍內(nèi)，而各個(gè)濃度的回收率精密度最差 為1.24%，滿足方法理論規(guī)定。
③ 、線性范圍-
方法的線性范圍表示了該方法可以應(yīng)用樣品測(cè)試的廣泛性，在此線性范圍內(nèi)的樣品使用本 方法進(jìn)行測(cè)試，有線性保障。 一個(gè)有效的定量分析方法的有效線性范圍，應(yīng)至少保證5個(gè)濃 度的統(tǒng)計(jì)線性相關(guān)系數(shù)r ^ 0.995，并且應(yīng)保證不同濃度回收率的精密度RSDS59L
通過對(duì)那西肽濃度從0.1%到96. 0%的范圍內(nèi)近15個(gè)不同真實(shí)濃度的那西肽樣品的測(cè)試數(shù) 據(jù)研究表明，回收率及回收率CV保持符合方法規(guī)定要求外，其線性相關(guān)系數(shù)r=0. 999984%， 滿足方法理論規(guī)定。因此認(rèn)為本方法在此范圍內(nèi)的那西肽制品生物效價(jià)含量的測(cè)定均適用。3、 測(cè)定中其它相關(guān)組分峰(副峰)的處理 本發(fā)明中測(cè)定結(jié)果的處理原則是通過以下研究獲得的。
由于那西肽是通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)后再經(jīng)過某種方法而提純獲得的，因此那西肽中存在著 其它組分。
在正確表達(dá)那西肽的生物效價(jià)含量時(shí)，應(yīng)該考慮到那西肽是一種生物抗菌素，其共生或共 存的相關(guān)組分的作用不應(yīng)被忽視，應(yīng)充分考慮那西肽及其它各組分在抗菌中共同表現(xiàn)的綜合 效果。而在用免疫測(cè)定法(微生物檢定法)測(cè)定那西肽的生物效價(jià)含量時(shí)獲得的結(jié)果， 一定 是那西肽與其共生組分的共同作用結(jié)果。這些組分在性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)或分子量與那西肽不同， 但它們與那西肽存在著相互關(guān)聯(lián)性，或類似或很接近。并且這些組分也表現(xiàn)出一定的抗菌作 用，但比起那西肽的作用效率要低一些。
在用HPLC方法測(cè)定那西肽峰(主峰)的時(shí)候，這些組分也會(huì)出峰，在此籠統(tǒng)地稱之為副峰。
理論上，應(yīng)該分別用這些組分的純品來分別定量計(jì)算這些組分的其含量結(jié)果，但這些組 分純品的獲得是十分困難，甚至是幾乎不可能的。因此有采用那西肽主峰來直接定量它們， 是一種比較簡(jiǎn)便的方法，關(guān)鍵是由此會(huì)造成多大的測(cè)定誤差。通過研究表明，采用本簡(jiǎn)化方 法進(jìn)行處理后的結(jié)果，與實(shí)際值的出入非常小，甚至幾乎可以忽略。
因此，我們?cè)谔幚磉@些副峰時(shí)，可以采用如下原則來進(jìn)行計(jì)算
① 、可直接用西肽標(biāo)準(zhǔn)品的主峰直接來定量計(jì)算副峰而獲得其結(jié)果。可以將各個(gè)副峰的 面積先以某個(gè)面積折算系數(shù)(K)對(duì)其面積進(jìn)行折算后，再用主峰處理的同等處理方法法處理。
而這個(gè)面積折算系數(shù)(K)的具體數(shù)值是由比較同一濃度樣品的HPLC結(jié)果與微生物檢定法結(jié) 果而獲得的。通過研究，我們得到該面積折算系數(shù)(K) 一般在1/2 - 3/4的范圍內(nèi)。
② 、 一般情況下會(huì)出現(xiàn)兩到三個(gè)副峰，但只有一個(gè)最接近主峰的副峰才比較有計(jì)算意義， 其它峰極小，即該副峰的結(jié)果對(duì)最終結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定的影響，而其它副峰結(jié)果均可忽略不計(jì)。
③ 、在特殊情況下，會(huì)出現(xiàn)多個(gè)較大副峰的情況，此時(shí)應(yīng)該重新考慮如何折算所有副峰 對(duì)最終測(cè)定結(jié)果的影響。
4、 那西肽HPLC含量與生物效價(jià)含量的轉(zhuǎn)換
本發(fā)明中那西肽的生物效價(jià)含量用HPLC含量來轉(zhuǎn)換表達(dá)的方法是通過以下研究獲得的。
由于生物效價(jià)能更為準(zhǔn)確地反映抗菌素的綜合效果，抗生素的測(cè)定結(jié)果一般要求用生物 效價(jià)含量來表達(dá)，含硫多肽類抗生素那西肽的最終結(jié)果可以用生物檢定法測(cè)得其生物效價(jià)含
那西肽的HPLC測(cè)定結(jié)果表達(dá)了制劑中那西肽和其它成分的質(zhì)量百分率。由于那西肽制劑抗菌效果是由制劑中那西肽和其它組分表達(dá)出來的能力，當(dāng)制劑中那西肽百分率增高時(shí)， 其抗菌效果會(huì)增強(qiáng)，同時(shí)，其它組分百分率增高也會(huì)部分地增強(qiáng)其抗菌效果。
如果這重百分含量與其生物效價(jià)含量間存在固定的關(guān)聯(lián)性，即兩者的比值保持固定值， 則可以通過HPLC的結(jié)果直接換算成其生物效價(jià)含量。這種關(guān)聯(lián)可以通過考察兩者的比值是 否保持為一個(gè)相對(duì)固定的系數(shù)，并且此系數(shù)有高精密度而加以證明。
通過對(duì)不同濃度樣品的兩種測(cè)試方法的結(jié)果研究表明，此比值P (含量矯正系數(shù))確實(shí)存 在。當(dāng)制劑濃度在0.1% - 96.0%的范圍內(nèi)變化時(shí)，研究結(jié)果表明含量矯正系數(shù)(P)波動(dòng)很 小，且含量矯正系數(shù)(P)的離散系數(shù)CV為0.954%,明顯小于5%的方法理論要求，這說明那 西肽生物效價(jià)含量可以直接用HPLC測(cè)定結(jié)果通過含量矯正系數(shù)(P)的平均值換算獲得。一 般含量矯正系數(shù)(P)保持在0.970 - 1.050的范圍內(nèi)。
本發(fā)明采用快速直觀的HPLC測(cè)定方法，通過特殊處理，將那西肽制品含量結(jié)果能直接 表達(dá)為生物效價(jià)含量，這就大大地縮短了時(shí)間，減輕了勞動(dòng)強(qiáng)度，減少了實(shí)驗(yàn)材料的消耗， 因此有較大的實(shí)用性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
權(quán)利要求
1、那西肽制品生物效價(jià)含量的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法，包括待測(cè)樣品的預(yù)處理，指定的色譜條件，測(cè)定圖譜的處理分析，其特征在于(1)用對(duì)那西肽有相當(dāng)脂溶性的有機(jī)溶劑和緩沖液的混合溶液對(duì)其制劑進(jìn)行提取，獲得那西肽HPLC待測(cè)液；(2)指定的色譜條件為帶紫外可見分光檢測(cè)器的高效液相色譜儀，乙氰∶水相＝50∶50的流動(dòng)相；0.5ml/min～2.0ml/mim的流速；反相碳十八大分子填充柱；230nm-250nm的檢測(cè)波長(zhǎng)；(3)將測(cè)定圖譜各個(gè)副峰的面積以面積折算系數(shù)(K)對(duì)其折算后，再用處理主峰的方法處理結(jié)果，該面積折算系數(shù)(K)為1/2～3/4；(4)將HPLC測(cè)定結(jié)果通過含量矯正系數(shù)(P)的平均值換算獲得生物效價(jià)含量，含量矯正系數(shù)(P)為0.970～1.050。(5)該發(fā)明方法可同等用于那西肽的發(fā)酵原液或其各種制劑。
2、 如權(quán)利要求l所述那西肽制品生物效價(jià)含量的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法，所述對(duì)那西肽有相當(dāng)脂溶性的有機(jī)溶劑是指N，N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide DMF)， 混合的緩沖液是指磷酸一磷酸鹽緩沖液。
3、 如權(quán)利要求1所述那西肽制品生物效價(jià)含量的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法，其(2) 的所述水相為《0. 50%重量百分比的磷酸水溶液。
全文摘要
本發(fā)明屬生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及那西肽制劑生物效價(jià)含量的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法。在那西肽制劑稀釋處理前，預(yù)先加入有機(jī)溶劑和緩沖液的混合溶液進(jìn)行提??；采用帶紫外可見分光檢測(cè)器的高效液相色譜儀，乙氰∶水相＝50∶50的流動(dòng)相；0.5ml/min～2.0ml/mim的流速；反相碳十八大分子填充柱；230nm-250nm的檢測(cè)波長(zhǎng)；將各個(gè)副峰的面積以面積折算系數(shù)(K)對(duì)其折算后，再用處理主峰的方法處理結(jié)果，將HPLC測(cè)定結(jié)果通過含量矯正系數(shù)(P)的平均值換算獲得生物效價(jià)含量。
文檔編號(hào)G01N30/89GK101303334SQ20081006241
公開日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月6日
發(fā)明者瑜 丁, 曹春華, 胡玉霞, 陳貴才 申請(qǐng)人:浙江匯能動(dòng)物藥品有限公司