專利名稱::超聲/微波協(xié)同萃取-hplc檢測(cè)食品中的罌粟殼生物堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及一種超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測(cè)食品中的罌粟殼生物堿的方法,屬于液相色譜分析
技術(shù)領(lǐng)域:
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背景技術(shù):
:罌粟殼,為罌粟科植物罌粟(Pa。aversomnlferumL)的干燥果殼,含有罌粟堿、嗎啡、可待因、地巴因、那可汀等多種生物堿。罌粟殼具有斂肺、澀腸、止痛功效。吸食罌粟果殼及制品.可造成吸食者在心理、生理上產(chǎn)生很強(qiáng)的依賴性。罌粟殼的對(duì)機(jī)體作用似嗎啡,長(zhǎng)期食用危害與吸食海洛因相似。因此國(guó)家將其列入麻醉藥品予以管制,禁止非法供應(yīng)、運(yùn)輸和使用。但社會(huì)上存在一些非法經(jīng)營(yíng)者,為了招欖顧客,在調(diào)味料中添加罌粟殼,消費(fèi)者食用后有異香之感,在不知不覺中上癮、中毒。這種異常感覺正是罌粟殼中的嗎啡等生物堿刺激神經(jīng)的一種反應(yīng),并非食物的味道。因此,加強(qiáng)相關(guān)食品的監(jiān)督檢測(cè)非常必要。文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)食品中罌粟殼生物堿有薄層法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、免疫測(cè)定法(IMA)等。薄層法靈敏度lMg,高效液相色譜法(HPLC)炅敏度l.lng但兩種方法檢測(cè)干擾嚴(yán)重;免疫測(cè)定法靈敏度高,但特異性差。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種炅敏度高、精密度并且操作簡(jiǎn)單的超聲-微波協(xié)同萃取—高效液相法,檢測(cè)目標(biāo)為罌粟殼中含有的嗎啡、可待因和罌粟堿,以確定被檢測(cè)食品中是否含有罌粟殼生物堿。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的這種超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測(cè)食品中的罌粟殼生物堿的方法,其特征在于包括如下步驟A、萃取取2mL待測(cè)樣品,加75%乙醇,酒石酸調(diào)pH至4,放進(jìn)超聲一微波協(xié)同萃取儀70。C,萃取15分鐘;B、過(guò)濾萃取后的樣品過(guò)濾,殘?jiān)肞H4.0的75冗酸性乙醇洗滌2-3次,冷卻后用脫脂棉過(guò)濾,再用75%酸性乙醇洗滌1次,水浴揮發(fā)乙醇成糖漿狀,自然冷卻后用脫脂棉過(guò)濾,殘?jiān)?0%的酒石酸溶液洗滌3-4次;C、分離合并濾液于分液漏斗中,用30nl和20mL石油醚脫脂兩次,水層用氨水調(diào)。H至9.0-9.5,再用比例為3:l的三氯甲烷異丙醇混合液30ml、30ml和20ml萃取3次,每次靜置15m1n,合并萃取液,用無(wú)水硫酸鈉脫水后水浴揮發(fā)有機(jī)溶剤,加甲醇定容至5ml離心管中,進(jìn)液相前用0.45"m的濾膜過(guò)濾,供色譜分析;D、液相色譜分析檢測(cè)目標(biāo)為罌粟殼中含有的嗎啡、可待因和罌粟堿,液相色譜條件為柱溫30。C,流速lml/m1n;最大吸收波長(zhǎng):嗎啡210nm,可待因213nm,罌粟堿253nm;流動(dòng)相水相:0.005mol/L磷酸二氫鈉和0.00005mol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液;有機(jī)相乙腈;D-1、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備分別以嗎啡、磷酸可待因和鹽酸罌粟堿為對(duì)照品在上述色譜條件下稀釋進(jìn)樣,得出嗎啡,可待因,罌粟堿的特征峰,以峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;D-2、樣品檢測(cè)取步驟C處理好的樣品分別與嗎啡、磷酸可待因和鹽酸罌粟堿對(duì)照品相同的條件進(jìn)樣,得出檢測(cè)樣品的譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而確定樣品中是否含有罌粟殼生物堿及含量。所述超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測(cè)食品中的罌粟殼生物堿的方法,步驟D-1中嗎啡標(biāo)準(zhǔn)曲線制備包括對(duì)嗎啡的色譜圖峰形進(jìn)行優(yōu)化,在標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.5-10vg/mL梯度為:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>將嗎啡標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0.5、1、2、4、6、8、10〃g/mL,在上述色譜條件下,平行測(cè)定每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品3次,繪制標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度與峰面積的關(guān)系曲線,得回歸方程y:42.92x-3.9387,相關(guān)系數(shù)R2=0.999934。所述超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測(cè)食品中的罌粟殼生物堿的方法,其特征在于步驟D-1中磷酸可待因標(biāo)準(zhǔn)曲線制備包括對(duì)磷酸可待因的色譜圖峰形進(jìn)行優(yōu)化,在濃度為0.2-10ug/rrl梯度為<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>將可待因標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0.2、0.4、0.6、0.8、2、4、6、8、10〃g/nt,在上述色譜條件下,平行測(cè)定每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品3次,繪制標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度與峰面積的關(guān)系曲線,得回歸方程y=31.606x-1.6496,相關(guān)系數(shù)R2=0.999940。所述的超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測(cè)食品中的罌粟殼生物堿的方法,步驟D-1中鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)曲線制備包括對(duì)罌粟堿的色譜圖峰形進(jìn)行優(yōu)化,在濃度為0.2-10ug/mL梯度為<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>將罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0.2、0.4、0.6、0.8、2、4、6、8、10〃g/mL,在上述色譜條件下,平行測(cè)定每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品3次,繪制標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度與峰面積的關(guān)系曲線,得回歸方程y=19.903x-1.1284,相關(guān)系數(shù)R2=0.999954。所述超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測(cè)食品中的罌粟殼生物堿的方法,步驟D-2樣品檢測(cè)包括取步驟c處理好的樣品分別與嗎啡、磷酸可待因和鹽酸罌粟堿對(duì)照品相同的條件進(jìn)樣,得出檢測(cè)樣品的譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線,每次進(jìn)樣量10^L。本發(fā)明與現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)相比,其優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在由于超聲-微波協(xié)同萃取充分利用了超聲波振動(dòng)的空化作用(同吋具有萃取和機(jī)械攪拌作用)以及微波的高能作用,使樣品介質(zhì)內(nèi)各點(diǎn)受到的作用一致,降低目標(biāo)物與樣品基體的結(jié)合力,加速目標(biāo)物從固相進(jìn)入溶剤的過(guò)程,使樣品中罌粟成分提取徹底。本發(fā)明用超聲-微波協(xié)同萃取一高效液相法檢測(cè)食品中的罌粟殼生物堿其炅敏度能達(dá)到0.1ng/L,實(shí)驗(yàn)干擾小。并且操作簡(jiǎn)單,耗吋短,具有回收率高、精密度高等優(yōu)點(diǎn),在食品中罌粟殼生物堿的檢測(cè)方面有很好的應(yīng)用前景。圖1是嗎啡、磷酸可待因、鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)曲線圖圖2是嗎啡標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖圖3是磷酸可待因標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖圖4是鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖圖5是測(cè)試樣品中嗎啡的色譜圖圖6是測(cè)試樣品中可待因的色譜圖圖7是測(cè)試樣品中罌粟堿的色譜圖具體實(shí)施例方式1、樣品處理,模擬樣品為添加罌粟殼的牛肉湯1-1、萃取取2mL待測(cè)樣品,加75%乙醇,酒石酸調(diào)pH至4,放進(jìn)超聲一微波協(xié)同萃取儀70。C,萃取15分鐘;l-2、過(guò)濾萃取后的樣品過(guò)濾,殘?jiān)弥?.0的75%酸性乙醇洗滌2-3次,冷卻后用脫脂棉過(guò)濾,再用75%酸性乙醇洗滌1次,水浴揮發(fā)乙醇成糖漿狀,自然冷卻后用脫脂棉過(guò)濾,殘?jiān)?0%的酒石酸溶液洗滌3-4次;1-3、分離合并濾液于分液漏斗中,用30mL和20mL石油醚脫脂兩次,水層用氨水調(diào)PH至9.0-9.5,再用比例為3:l的三氯甲烷異丙醇混合液30m]、30m,和20ml萃取3次,每次靜置15m1n,合并萃取液,用無(wú)水硫酸鈉脫水后水浴揮發(fā)有機(jī)溶剤,加甲醇定容至5ml離心管中,進(jìn)液相前用0.45/^m的濾膜過(guò)濾,供色譜分析;2、液相色譜分析檢測(cè)目標(biāo)為罌粟殼中含有的嗎啡、可待因和罌粟堿,液相色譜條件:柱溫30。C'流速lml/m1n;最大吸收波長(zhǎng):嗎啡210nm,可待因213nm,罌粟堿253nm;流動(dòng)相水相0.005mol/L磷酸二氳鈉和0.00005mol/L磷酸氳二鈉緩沖溶液;有機(jī)相乙腈;2-1、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備分別以嗎啡、磷酸可待因和鹽酸罌粟堿為對(duì)照品在上述色譜條件下稀釋進(jìn)樣,得出嗎啡,可待因和罌粟堿的特征峰,以峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;2-1-1、嗎啡標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)嗎啡的色譜圖峰形進(jìn)行優(yōu)化,在標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.5-10/^g/mL梯度為<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>將可待因標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0.2、0.4、0.6、0.8、2、4、6、8、10"g/nt,在上述色譜條件下,平行測(cè)定每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品3次,繪制標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度與峰面積的關(guān)系曲線,得回歸方程y:31.606x-1.6496,相關(guān)系數(shù)R2=0.999940。標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖3,其中可待因特征峰為6.17,峰面枳19.9。實(shí)驗(yàn)中按信噪比略大于3來(lái)廿算,得最低檢測(cè)限為:0.1vg/mL。2-1-3、鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)罌粟堿的色譜圖峰形進(jìn)行優(yōu)化,在濃度為0.2-10ug/mL梯度為<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>將罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0,2、0.4、0.6、0.8、2、4、6、8、10〃g/mL,在上述色譜條件下,平行測(cè)定每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品3次,繪制標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度與峰面積的關(guān)系曲線,得回歸方程y:19.903x-1.1284,相關(guān)系數(shù)R2=0.999954。標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖4,其中罌粟堿特征峰為5.205,峰面積1.98。實(shí)驗(yàn)中按信噪比略大于3來(lái)廿算,得最低檢測(cè)限為0.1v2—2、樣品沖僉測(cè):2-2-1、樣品中嗎啡的檢測(cè);取1-3處理好的樣品分別與2-1-1對(duì)照品相同的條件進(jìn)樣,進(jìn)樣量10"L,得出檢測(cè)樣品的色譜圖如圖5,與標(biāo)準(zhǔn)圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線比較,其中嗎啡特征峰5.495,從而確定樣品中含有罌粟殼生物堿及含量。2-2-2、樣品中可待因的檢測(cè);取1-3處理好的樣品分別與2-1-2對(duì)照品相同的條件進(jìn)樣,進(jìn)樣量10"L,得出檢測(cè)樣品的色譜圖如圖6,與標(biāo)準(zhǔn)圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線比較,其中可待因特征峰6.179,從而確定樣品中含有罌粟殼生物堿及含量。2-2-3、樣品中罌粟堿的檢測(cè);取1-3處理好的樣品分別與2-1-3對(duì)照品相同的條件迸樣,進(jìn)樣量10/zL,得出檢測(cè)樣品的色譜圖如圖7,與標(biāo)準(zhǔn)圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線比較,其中罌粟堿特征峰5.225,從而確定樣品中含有罌粟殼生物堿及含量。所述超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測(cè)食品中的罌粟殼生物堿的方法,步驟D-1中嗎啡標(biāo)準(zhǔn)曲線制備包括3、方法精密度考察精密吸取嗎啡、磷酸可待因、鹽酸罌粟堿的標(biāo)準(zhǔn)品1C^L進(jìn)行HPLC檢測(cè),連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)得RSD值分別為:0.070%、0.037%、0.029%。表l超聲一微波協(xié)同萃取測(cè)定生物堿含量的精密度<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4、方法的準(zhǔn)確度考察加標(biāo)回收率向已加入罌粟殼的肉湯加入嗎啡、磷酸可待因、鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品各25;ug,經(jīng)提取后定容至5mL,進(jìn)樣,計(jì)算器回收率。結(jié)果嗎啡的平均回收率為97.87%,磷酸可待因的平均回收率為96.80%,鹽酸罌粟堿的平均回收率為94.47%。重現(xiàn)性對(duì)6份同樣的樣品各取2mL用同樣的方法進(jìn)行提取,用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。RSD值分別為:0.040%、0.209%、0.665%。表2超聲一微波協(xié)同萃取測(cè)定生物堿含量的準(zhǔn)確度<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>5、最低檢測(cè)限考察嗎啡、可待因、罌粟堿的最低檢測(cè)限分別為0.1ng/L、0.08ng/L、0.1ng/L。本發(fā)明列舉的實(shí)施例旨在更進(jìn)一步地闡明超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測(cè)食品中的罌粟殼生物堿的方法和應(yīng)用方向,而不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。權(quán)利要求1、超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測(cè)食品中的罌粟殼生物堿的方法,其特征在于包括如下步驟A、萃取:取2mL待測(cè)樣品,加75%乙醇,酒石酸調(diào)pH至4,放進(jìn)超聲—微波協(xié)同萃取儀70℃,萃取15分鐘;B、過(guò)濾:萃取后的樣品過(guò)濾,殘?jiān)胮H4.0的75%酸性乙醇洗滌2-3次,冷卻后用脫脂棉過(guò)濾,再用75%酸性乙醇洗滌1次,水浴揮發(fā)乙醇成糖漿狀,自然冷卻后用脫脂棉過(guò)濾,殘?jiān)?0%的酒石酸溶液洗滌3-4次;C、分離:合并濾液于分液漏斗中,用30mL和20mL石油醚脫脂兩次,水層用氨水調(diào)pH至9.0-9.5,再用比例為3∶1的三氯甲烷∶異丙醇混合液30ml、30ml和20ml萃取3次,每次靜置15min,合并萃取液,用無(wú)水硫酸鈉脫水后水浴揮發(fā)有機(jī)溶劑,加甲醇定容至5ml離心管中,進(jìn)液相前用0.45μm的濾膜過(guò)濾,供色譜分析;D、液相色譜分析:檢測(cè)目標(biāo)為罌粟殼中含有的嗎啡、可待因和罌粟堿,液相色譜條件:柱溫30℃,流速1ml/min;最大吸收波長(zhǎng):嗎啡210nm,可待因213nm,罌粟堿253nm;流動(dòng)相:水相:0.005mol/L磷酸二氫鈉和0.00005mol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液;有機(jī)相:乙腈;D-1、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:分別以嗎啡、磷酸可待因和鹽酸罌粟堿為對(duì)照品在上述色譜條件下稀釋進(jìn)樣,得出嗎啡,可待因和罌粟堿的特征峰,以峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;D-2、樣品檢測(cè):取步驟C處理好的樣品分別與嗎啡、磷酸可待因和鹽酸罌粟堿對(duì)照品相同的條件進(jìn)樣,得出檢測(cè)樣品的譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而確定樣品中是否含有罌粟殼生物堿及含量。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測(cè)食品中的罌粟殼生物堿的方法,其特征在于步驟D-1中嗎啡標(biāo)準(zhǔn)曲線制備包括對(duì)嗎啡的色譜圖峰形進(jìn)行優(yōu)化,在標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.5-10;ug/mL梯度為<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>將嗎啡標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0.5、1、2、4、6、8、10〃g/mL,在上述色譜條件下,平行測(cè)定每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品3次,繪制標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度與峰面枳的關(guān)系曲線,得回歸方程y二42.92x-3.9387,相關(guān)系數(shù)R2=0.999934。3、根據(jù)杈利要求1所述超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測(cè)食品中的罌粟殼生物堿的方法,其特征在于步驟D-1中磷酸可待因標(biāo)準(zhǔn)曲線制備包括對(duì)磷酸可待因的色譜圖峰形進(jìn)行優(yōu)化,在濃度為0.2-10ug/mL梯度為<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測(cè)食品中的罌粟殼生物堿的方法,其特征在于D-1中鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)曲線制備包括:對(duì)罌粟堿的色譜圖峰形進(jìn)行優(yōu)化,在濃度為0.2-10ug/mL梯度為:<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>將罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0.2、0.4、0.6、0.8、2、4、6、8、10//g/mL,在上述色譜條件下,平行測(cè)定每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品3次,繪制標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度與峰面積的關(guān)系曲線,得回歸方程y:19.903x-1.1284,相關(guān)系數(shù)R2=0.999954。5、根據(jù)權(quán)利要求l、2、3和4所述超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測(cè)食品中的罌粟殼生物堿的方法,其特征在于步驟D-2樣品檢測(cè)包括取步驟C處理好的樣品分別與嗎啡、磷酸可待因和鹽酸罌粟堿對(duì)照品相同的條件進(jìn)樣,得出檢測(cè)樣品的譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線,每次進(jìn)樣量10;uL。全文摘要本發(fā)明提供一種超聲/微波協(xié)同萃取-HPLC檢測(cè)食品中的罌粟殼生物堿的方法,待測(cè)樣品經(jīng)過(guò)超聲—微波協(xié)同萃??;過(guò)濾;分離;液相色譜分析;分別以嗎啡、磷酸可待因和鹽酸罌粟堿為對(duì)照品,得出嗎啡,可待因,罌粟堿的特征峰,以峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;取處理好的樣品分別與嗎啡、磷酸可待因、鹽酸罌粟堿對(duì)照品相同的條件進(jìn)樣,得出檢測(cè)樣品的譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而確定樣品中是否含有罌粟殼生物堿及含量。由于超聲-微波協(xié)同萃取充分利用了超聲波振動(dòng)的空化作用,降低目標(biāo)物與樣品基體的結(jié)合力,使樣品中罌粟成分提取徹底。本發(fā)明的靈敏度能達(dá)到0.1ng/L,實(shí)驗(yàn)干擾小并且操作簡(jiǎn)單,耗時(shí)短,具有回收率高、精密度高等優(yōu)點(diǎn),在食品中罌粟殼生物堿的檢測(cè)方面有很好的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)G01N30/02GK101393176SQ200810079608公開日2009年3月25日申請(qǐng)日期2008年10月23日優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日發(fā)明者馮麗娟,劉崢顥,吳廣臣,夏立婭,龐艷蘋,李小亭,王庭欣,趙志磊申請(qǐng)人:河北大學(xué)