專利名稱：Ca27.29、tps、cyfra21-1乳腺癌膠體金三聯(lián)檢診斷試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種診斷腫瘤的試劑盒，尤其涉及一種乳腺癌膠體金三聯(lián)檢 診斷試劑盒，本發(fā)明還涉及該試劑盒的制備方法以及該試劑盒在診斷乳腺癌中 的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳腺癌是世界上最常見的上皮細(xì)胞腫瘤，對人類的健康和生存構(gòu)成重大 威脅，是世界各國面臨的最重要的社會問題之一。時至今日，乳腺癌占全身惡 性腫瘤的7%-10%，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，自1980年以來每年以3%的速度 增長，特別是北美、西歐等發(fā)達(dá)國家，表現(xiàn)的尤為明顯。全世界每年約有120 萬婦女發(fā)生乳腺癌，其中，有50萬婦女死于乳腺癌。2006美國癌癥協(xié)會，國 際癌癥學(xué)會和國際乳腺癌聯(lián)合體有關(guān)乳腺癌的統(tǒng)計資料顯示在女性人口中， 每8位就有1位將遭受乳腺癌的威脅。平均每2分半鐘就有1位女性被診斷為 乳腺癌患者。在2006年，平均每13分鐘就有1位女性死于乳腺癌。僅在2006 年，有212， 920位女性受到乳腺癌的侵襲，大約有40， 970位患者將面臨死亡。 在目前乳癌發(fā)病機理不清楚的情況下，最好辦法就是早期發(fā)現(xiàn)、早期診 斷與早期治療，這是提高乳腺癌療效的關(guān)鍵。腫瘤標(biāo)志物是由腫瘤組織和細(xì)胞產(chǎn)生的異常表達(dá)的生物活性物質(zhì)，根據(jù)其生化或免疫特性可以識別或診斷腫瘤。多數(shù)乳腺癌患者血清中都會出現(xiàn)針 對某些腫瘤標(biāo)志物的抗體，且與疾病的相關(guān)性已得到認(rèn)可，所以腫瘤標(biāo)志物 檢査對乳腺癌的診斷和療效評價方面都具有重要的意義。CA27.29是一種與腫瘤相關(guān)的粘蛋白抗原，其分子是O"連接的低聚糖 蛋白，分子量很大。目前，已知由人類MUC-l基因編碼的與乳腺癌相關(guān)的抗原 分別有MAM6、乳汁粘蛋白、CA27.29和CA15-3。用這些抗原制備的單克隆抗體，能夠不同程度地定量檢査患n期或m期乳腺癌婦女的癌癥復(fù)發(fā)情況。據(jù)有關(guān)資料報道，腫瘤相關(guān)抗原CA27.29對預(yù)測II期或III期乳腺癌病人復(fù)發(fā)情 況具有較高的特異性(達(dá)99%)和準(zhǔn)確率(88%)。美國食品和藥品管理局(FDA) 近期已批準(zhǔn)使用RIA CA27.29。臨床上，通常用40U/ml (RIA)作為正常值的 上限。對乳腺癌和卵巢癌轉(zhuǎn)移的病人，特別是經(jīng)治療后臨床上無疾病癥狀的 病人，在定期進(jìn)行血清CA27. 29檢查時發(fā)現(xiàn)，測定值大于40U/ml的病人比 測定值小于40U/ml或等于40U/ml的病人，其存活率要低得多。組織多肽特異抗原(TPS)是細(xì)胞角蛋白片段18上的M3抗原決定簇， 血清中組織多肽特異抗原含量的高低是衡量腫瘤細(xì)胞分裂和增殖活性的一個 較為特異的指標(biāo)。研究表明，組織多肽特異抗原在腫瘤的早期診斷、預(yù)測復(fù) 發(fā)和轉(zhuǎn)移、評價預(yù)后方面有獨特的價值。與傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物如甲胎蛋白、 癌胚抗原等不同的是，組織多肽特異抗原是"腫瘤活性依賴型"的，它在血 清中含量的高低與正在分裂、增殖的腫瘤細(xì)胞的數(shù)目有關(guān)，即與腫瘤的活性 有關(guān)；而甲胎蛋白、癌胚抗原等則是"腫瘤容量依賴型"的，與腫瘤的瘤體 負(fù)荷即腫瘤細(xì)胞的數(shù)目有關(guān)。因此，在腫瘤的早期，在出現(xiàn)肉眼復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移 之前，由于腫瘤細(xì)胞數(shù)目較少，那些反映腫瘤容量的標(biāo)志物的血清水平往往 是很低的，而此時腫瘤細(xì)胞分裂、增殖活躍，因而組織多肽特異抗原含量可以很高，從而有利于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和防治。CYFRA21-1是細(xì)胞角蛋白19片段抗原21-l(cytokeratin 19 fragment antigen 21-1)的英文縮寫，1992年BODENMULER等采用雜交瘤技術(shù)制備出 BM19. 21和KS19. 1兩株單克隆抗體，經(jīng)配對組成免疫測定方法，可特異性的 識別細(xì)胞角蛋白19的片段抗原。在正常情況下細(xì)胞角蛋白19在外周血、骨 髓、淋巴結(jié)中無表達(dá)或低表達(dá)，而在惡性上皮癌中，激活的蛋白酶加速了細(xì) 胞的降解，使得大量可溶性的CYFRA21-1被釋放，造成血液中CYFRA21-1濃 度升高。CYFRA21-1作為一種新的上皮來源性質(zhì)的腫瘤標(biāo)志物，近幾年來在腫 瘤臨床的應(yīng)用越來越廣泛，在許多上皮性癌如肺癌、鼻咽癌等都有不同程度 的檢出率；文獻(xiàn)報道乳腺癌患者血清CYFRA21-1水平與臨床分期有關(guān)，但其 陽性率不高，僅為21.2%，但與良性腫瘤組差異有顯著性，CYFRA21-1陽性率 隨臨床分期及有無轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的程度增加而上升。由于相關(guān)上皮起源的腫瘤 都可能表達(dá)CK19，因此CYFRA21-1的檢測亦可出現(xiàn)假陽性，這需要結(jié)合臨床 資料及通過追蹤觀察加以排除。單獨檢測上述某一腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)，并不能提供更多的信息，檢測靈敏 度和特異性都比較低，很難檢測出早期或復(fù)發(fā)乳腺癌患者，容易出現(xiàn)誤診或 漏診。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種新的乳腺癌診斷試劑盒，相比于現(xiàn)有的乳腺癌 診斷試劑盒，本發(fā)明乳腺癌診斷試劑盒具有更高的靈敏度高和更強的特異性 強。針對CA27. 29對乳腺癌診斷具有特異性高的特點，TPS在腫瘤的早期診斷、預(yù)測復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、評價預(yù)后方面有獨特的優(yōu)勢，CYFRA21-1在乳腺癌臨床 分期有關(guān)及區(qū)分惡性與良性腫瘤方面的特性，本發(fā)明應(yīng)用免疫層析法將以上 三種抗原聯(lián)合使用，從而大大提高了乳腺癌臨床檢測的靈敏度及特異性，相 對于單檢試劑具有靈敏度高及特異性強等特點，同時，每種腫瘤標(biāo)志物的顯 色顏色不同，結(jié)果判斷更加直觀。具體的，本發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種乳腺癌膠體金三聯(lián)檢診斷試劑盒，包括反應(yīng)卡、吸滴管、血清加樣 杯和一次性注射器，其中，所述的反應(yīng)卡自下而上依次由樣品墊、膠體金標(biāo) 記的結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊(各自的邊緣)連接在一起后固定于背 襯上而組成；其中，所述的膠體金標(biāo)記的結(jié)合墊按照以下方法制備得到將CA27.29 單克隆抗體、TPS單克隆抗體和CYFRA21-1單克隆抗體分別用金溶膠粒標(biāo)記后， 將其混合，包被于玻璃纖維上，即得；更優(yōu)選的，所述的膠體金標(biāo)記的結(jié)合墊按照以下方法制備得到將 CA27. 29單抗用粒徑為24. 5 nm的金溶膠粒標(biāo)記，TPS單抗用粒徑為41 nm的 金溶膠粒標(biāo)記，CYFRA21-lCA12-5單抗用粒徑為71nm的金溶膠粒標(biāo)記，將金 溶膠粒標(biāo)記的3種單抗混合后(優(yōu)選為等比例混合)，包被于玻璃纖維上，即 得。所述的硝酸纖維素膜上含有由抗CA27. 29單克隆抗體、抗TPS單克隆抗 體和抗CYFRA21-1單克隆抗體分別包被而成的3條檢測線和1條由羊抗鼠IgG 包被而成的對照線；更優(yōu)選的，所述的硝酸纖維素膜上的3條檢測線和1條 對照線按照以下次序排列而成從靠近吸水紙一端到靠近膠體金結(jié)合墊一端 依次為為羊抗鼠IgG對照線、抗CA27. 29單克隆抗體檢測線、抗TPS單克隆抗體檢測線和抗、CYFRA21-1單克隆抗體檢測線。其中，所述的硝酸纖維素膜可以由尼龍膜等代替。所述的背襯可以是各種硬質(zhì)的支持物，只要具有一定的硬度具有附載或 支持的功能都可用于本發(fā)明，例如可以是塑料板(PVC)、硬紙板等，優(yōu)選為 PVC。本發(fā)明首先制備抗CA27.29、 TPS、 CYFRA21-1的單克隆抗體(所述3 種單克隆抗體的制備方法可參考實施例所公開的方法)；再用不同大小的金顆 粒分別標(biāo)記抗CA27.29、 TPS、 CYFRA21-1單克隆抗體，按一定比例混合，制 備成金結(jié)合物墊；通過試驗發(fā)現(xiàn)，抗CA27. 29、 TPS、 CYFRA21-1單克隆抗體 在試紙條上的不同分布關(guān)系到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性，本發(fā)明通過一系 列的試驗，最終確定了抗CA27.29、 TPS、 CYFRA21-1單克隆抗體在硝酸纖維 素膜上的最佳排列位置，從而顯著提高了對乳腺癌診斷的檢出率、靈敏度及 特異性。本發(fā)明試劑盒的使用方法及評測標(biāo)準(zhǔn)用吸滴管將待檢樣品(血清)收集在血清加樣杯中，將反應(yīng)卡的下端 (吸水紙一端)浸入血清中，等候約1分鐘，將樣品完全被吸收之后，取出 反應(yīng)卡進(jìn)行鑒定。根據(jù)膠體金標(biāo)記的物種抗體的顏色變化進(jìn)行鑒定，自吸水 紙至樣品墊分別為檢測CA27. 29、 TPS、 CYFRA21-1的條帶，相對應(yīng)的顏色分 別為橙紅色、紅色和紫紅色。本發(fā)明在同一條檢測試紙上聯(lián)合檢測了乳腺癌診斷的CA27.29、 TPS、 CYFRA21-1等三種腫瘤標(biāo)志物，利用免疫層析技術(shù)，將已純化的抗CA27.29、 TPS、 CYFRA21-1的單克隆抗體利用自動微量噴點設(shè)備，固定在已預(yù)處理合格 的硝酸纖維素膜上；同時，用不同大小的金顆粒標(biāo)記抗CA27.29、 TPS、CYFRA21-1單克隆抗體，將上述金標(biāo)抗體按一定比例混合，制備成金結(jié)合物墊; 再輔以樣品墊，組合成為反應(yīng)卡。本發(fā)明試劑盒采用雙抗體夾心法原理，能夠快速檢測人全血或血清、 血漿中的CA27.29、 TPS、 CYFRA21-1抗原，克服了以前分開檢測方法的很多 弊端， 一滴血就可以檢測三種腫瘤標(biāo)志物，其次，根據(jù)上述三種腫瘤標(biāo)志物 與乳腺癌診斷的相關(guān)程度，確定此三種腫瘤標(biāo)志物的金標(biāo)抗體分別用不同大 小的金顆粒標(biāo)記，使每種腫瘤標(biāo)志物的顯色顏色不同，結(jié)果判斷更加直觀， 同時也提高了乳腺癌檢測的靈敏度及特異性。臨床應(yīng)用結(jié)果表明，本發(fā)明膠體金三聯(lián)檢診斷試劑盒可以準(zhǔn)確的檢測出 早期或復(fù)發(fā)乳腺癌患者，靈敏度和特異性都比較高，檢測過程非常快速(全 部檢測過程僅需3-20分鐘)、具有簡便、價格低廉、人為操作誤差小、穩(wěn)定 性好等優(yōu)點。


圖1本發(fā)明試劑盒中的反應(yīng)卡示意圖；從左至右依次由樣品墊、膠體金 標(biāo)記的結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊連接在一起后固定于背襯之上，其中， 在硝酸纖維素膜的膠體金標(biāo)記抗體由右到左依次為羊抗鼠IgG、 CA27. 29單克 隆抗體、TPS單克隆抗體、CYFRA21-1單克隆抗體。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成 任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均 落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實施例1本發(fā)明膠體金三聯(lián)檢診斷試劑盒的制備1、 制備抗CA27.29、 TPS、 CYFRA21-1的單克隆抗體分別用CA27. 29、TPS、CYFRA21-1(CA27. 29和TPS購自CanAg Diagnostics AB 、 CYFRA21-1購自Medix Biochemica)對BALB/c純系小鼠免疫，小鼠血 清產(chǎn)生相應(yīng)的抗體時，即可將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞融合。利用HAT選擇雜交 瘤細(xì)胞，并用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)對McAb進(jìn)行檢測。對于檢測抗體 陽性的雜交瘤應(yīng)用有限稀釋法進(jìn)行克隆，同時保存陽性細(xì)胞株，禾U用BALB/c 純系小鼠制備大量的單克隆抗體。2、 含有3條檢測線和1條對照線的硝酸纖維素膜的制備 2. 1檢測線和對照線包被三種單抗在硝酸纖維素膜上的位置，自樣品墊到吸水紙的方向，分別為 CYFRA21-1單克隆抗體、抗TPS單克隆抗體及抗CA27. 29單克隆抗體。檢測線劃線分別將抗CYFM21-1單克隆抗體、抗TPS單克隆抗體及抗 CA27.29單克隆抗體裝入BioDot噴膜機中(蛋白微量噴膜系統(tǒng))，在硝酸纖維 素膜上按0. 1W/mm的量劃上(膜規(guī)格為25mmX310mm)。對照線劃線羊抗鼠抗體包被液裝入BioDot噴膜機中(蛋白微量噴膜 系統(tǒng))，在硝酸纖維素膜上按O. l!4/mm的量劃上。(膜規(guī)格為25mmX310mm)包被37"C包被2小時；封閉37'C封閉30分鐘；干燥將包被后的硝酸纖維素膜放入真空干燥器內(nèi)干燥20小時，真空度0.1。2. 2膠體金標(biāo)記的結(jié)合墊制備膠體金標(biāo)記分別對CA27.29、 TPS、 CYFRA21-1單抗溶液透析除鹽(4°C 過夜)，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度至lmg/ml;在電磁攪拌下，CA27.29單抗用粒徑為 24.5 nm的金溶膠粒標(biāo)記，TPS單抗用粒徑為41 nm的金溶膠粒標(biāo)記， CYFRA21-1CA12-5單抗用粒徑為71 nm的金溶膠粒標(biāo)記，最終檢測CA27. 29、 TPS、 CYFRA21-1的條帶相對應(yīng)顏色為橙紅、紅、紫紅。然后等比例將3種免 疫金混合，得到混合免疫金； .包被膠體金稀釋液稀釋至0D=6.0， lOmmX 310mm玻璃纖維在溶液中浸 泡5-10分鐘；干燥將標(biāo)記后玻璃纖維放入真空干燥器內(nèi)干燥20小時，取出密閉保存 待用。2. 3組裝備料樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和P VC背襯等按生產(chǎn) 工藝要求裁成一定的規(guī)格和尺寸。黏貼按生產(chǎn)工藝要求將各組分黏貼在白色塑料板上。 裁切用切條機將組裝好的反應(yīng)板切成3mm寬的試劑條。 裝袋裝入鋁箔袋內(nèi)，外加干燥劑防潮。機器封口。試驗例l本發(fā)明試劑盒臨床檢測乳腺癌試驗取500例乳腺癌患者，均為病理確診的乳腺癌患者(乳癌組)，年齡20-81 歲，平均年齡47.5歲；另選500例正常對照(對照組)。標(biāo)本收集受檢者均于早晨空腹抽靜脈血3ml;分離血清，置一2(TC冰箱保存。采用本發(fā)明試劑盒(實施例l所制備)檢測CA27.29、 TPS、 CYFRA21-1。 嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。臨界值CA27.29定為40 U/ml， TPS為100U/L， CYFRA21-l為45 ng/ml， 高于臨界值的反應(yīng)為陽性。統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分 析。采用單因素方差分析和q檢驗；率的比較用x2檢驗。表l三種標(biāo)志物對500疑似乳腺癌血清檢測的顯色結(jié)果CA27.29 TPS CYFRA21-1陽性 322 255 161陰性 198 245 339表2 血清CA27.29、 TPS、 CYFRA21-1對乳腺癌檢出率(0/0)檢出數(shù)值顯色組合陽性陽性檢出率(％)CA27.298164.4TPS6251CYFRA21-12232.2CA27.29+ TPS11880CA27.29+ CYFRA21-16472TPS + CYFRA21-11668.2CA27.29+ TPS+ CYFRA21-15984.4不顯色78表3三種標(biāo)志物對500陰性血清檢測的顯色結(jié)果CA27.29 TPS CYFRA21-1陽性 8 34 21陰性 492 467 479表4血清CA27.29、 TPS、 CYFRA21-1對500陰性血清檢測的顯色結(jié)果變色組合顯色不顯色CA27.29493TPS31469CYFRA21-119481CA27.29+ TPS1499CA27.29+CYFRA21-10500TPS + CYFRA21-12498CA27.29+ TPS+ CYFRA21-10500試驗結(jié)果表明，本發(fā)明膠體金三聯(lián)檢診斷試劑盒可以準(zhǔn)確的檢測出早期 或復(fù)發(fā)乳腺癌患者，靈敏度高、特異性強，且檢測過程非?？焖?全部檢測過程僅需3-20分鐘)。
權(quán)利要求
1. 一種乳腺癌診斷試劑盒，包括反應(yīng)卡，吸滴管、血清加樣杯和一次性注射器，其特征在于所述的反應(yīng)卡自下而上依次由樣品墊、膠體金標(biāo)記的結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊各自的邊緣連接在一起后固定于背襯上而組成；其中，所述的硝酸纖維素膜上含有由抗CA27.29單克隆抗體、抗TPS單克隆抗體、抗CYFRA21-1單克隆抗體所分別包被而成的3條檢測線和1條由羊抗鼠IgG包被而成的對照線。
2、 按照權(quán)利要求1所述的乳腺癌診斷試劑盒，其特征在于所述的膠 體金標(biāo)記的結(jié)合墊按照以下方法制備得到將抗CA27. 29單克隆抗體、抗TPS 單克隆抗體和抗CYFRA21-1單克隆抗體分別用金溶膠粒標(biāo)記后，將其混合， 包被于玻璃纖維上，即得。
3、 按照權(quán)利要求2所述的乳腺癌診斷試劑盒，其特征在于所述的膠 體金標(biāo)記的結(jié)合墊按照以下方法制備得到抗CA27. 29單克隆抗體用粒徑為 24. 5 nm的金溶膠粒標(biāo)記，抗TPS單克隆抗體用粒徑為41 nm的金溶膠粒標(biāo)記， 抗CYFRA21-1CA12-5單克隆抗體用粒徑為71 nm的金溶膠粒標(biāo)記，將金溶膠 粒標(biāo)記的3種單抗混合后，包被于玻璃纖維上，即得。
4、 按權(quán)利要求3所述的乳腺癌診斷試劑盒，其特征在于將金溶膠粒 標(biāo)記的3種單抗按照1:1:1的重量比例混合后包被于玻璃纖維上。
5、 按照權(quán)利要求1所述的乳腺癌診斷試劑盒，其特征在于所述的硝 酸纖維素膜上的3條檢測線和1條對照線按照以下次序排列而成從靠近吸 水紙一端到靠近膠體金結(jié)合墊一端依次為羊抗鼠IgG對照線、抗CA27. 29單 克隆抗體檢測線、抗TPS單克隆抗體檢測線和抗CYFRA21-1單克隆抗體檢測 線。
6、 按照權(quán)利要求1所述的乳腺癌診斷試劑盒，其特征在于所述的硝 酸纖維素膜可以由尼龍膜代替。
7、 按照權(quán)利要求1所述的乳腺癌診斷試劑盒，其特征在于所述的背 襯是各種硬質(zhì)的支持物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乳腺癌診斷試劑盒及其制備方法。本發(fā)明試劑盒包括反應(yīng)卡，吸滴管、血清加樣杯和一次性注射器；所述的反應(yīng)卡依次由樣品墊、膠體金標(biāo)記的結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊連接組成。本發(fā)明分別將抗CA27.29、TPS、CYFRA21-1的3種單克隆抗體固定在硝酸纖維素膜的不同位置上；同時，用不同大小的金顆粒標(biāo)記上述三種單克隆抗體，將上述金標(biāo)抗體混合后制備成金結(jié)合物墊，再加上樣品墊和吸水墊，組合成為反應(yīng)卡。本發(fā)明試劑盒可以快速、準(zhǔn)確的檢測出早期或復(fù)發(fā)乳腺癌患者，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，僅需3-20分鐘即可完成全部檢測過程。
文檔編號G01N33/574GK101281198SQ20081008185
公開日2008年10月8日 申請日期2008年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月8日
發(fā)明者路 戴, 鑫 金 申請人:黑龍江美康匯融生物技術(shù)股份有限公司