專利名稱：一種牛乳中免疫球蛋白(IgG)含量的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種分析檢測乳中蛋白的方法，特別是一種檢測牛乳 中免疫球蛋白(IgG)含量的方法。屬于檢測技術領域。
背景技術：
牛乳是日常生活中不可或缺的營養(yǎng)品，它含有豐富的營養(yǎng)物質， 如酪蛋白、乳清蛋白、補體、脂肪和免疫球蛋白等。牛乳中含有的免 疫球蛋白主要為IgG, IgA和IgM。其中，IgG含量最高，約為免疫球 蛋白總量的80%。母牛分娩后第一天內分泌的初乳中免疫球蛋白含 量最高，研究表明，其IgG的平均濃度可達59~80mg/ml。然而， 第5—7天的初乳中IgG濃度已接近常乳水平，約為0. 7~1. Omg/ ml。免疫球蛋白具有多種生物活性功能，主要是識別和抵抗入侵的細 菌和病毒等病原體，在增強機體的免疫能力、防止細菌和病毒入侵、 活化補體、中和毒素、殺死腫瘤細胞等方面發(fā)揮著重要作用。
目前，國內尚未有乳免疫球蛋白(IgG)含量;f企測方法的國家標準 和行業(yè)標準。檢測乳免疫球蛋白(IgG)的方法有血清中和實驗、免疫 熒光抗體實驗、瓊脂擴散實驗、補體結合實驗、電鏡觀察、ELISA、 PCR等方法。由于考慮到人力、物力和效率，國內科研院所常用乳免疫球蛋白(IgG)的4企測方法是ELISA。 ELISA法靈敏度高，最小檢測限 低，適合于乳免疫球蛋白(IgG)的檢測，但是其檢測時間較長，不適 于適用于實際應用當中。鑒于該方法的優(yōu)缺點，本專利發(fā)明了將使用 毛細管電泳儀快速檢測乳免疫球蛋白(IgG)含量的方法。毛細管電泳 儀是一類包括電泳、色譜及其交叉內容的液相微分離技術。它能快速 精確檢測出牛奶中的摻假成分、抗生素、添加的功能性因子、乳清蛋 白、免疫球蛋白、酶、糖、添加劑和其他小分子的含量。該方法操作 簡便、準確，檢測到出結果時間僅為lh左右。
目前，毛細管電泳4義的應用前景非常廣泛。許多國際官方權威機 構，如FDA、 U. S. P、 CBER、 CDER等均已認可毛細管電泳方法。權威 機構歐洲藥典中認可勒沃卡-貝斯庭鹽酸鹽中雜質的CE測定；歐洲藥 典中還認可促紅細胞生成素(EP0)的毛細管電泳儀測定等。毛細管 電泳儀已成為化學、農業(yè)、醫(yī)學、生物工程、藥學等眾多領域的一個 常規(guī)科研工具。
目前，國內毛細管電泳儀檢測技術逐漸應用到乳品領域里，如產 品開發(fā)和控制質量問題等領域中。但毛細管電泳技術尚未開發(fā)檢測乳 免疫球蛋白(IgG)的方法。本發(fā)明成功彌補了乳品領域中的缺點，能 準確測定乳免疫球蛋白(IgG)的含量，從而有利于產品開發(fā)和質量控 制當中。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的 一種牛乳中乳免疫球蛋白(IgG)含量的檢測方法。本發(fā)明的一種檢測乳免疫球蛋白(IgG)含量的檢測方法，其中， 包括如下步驟1)將乳免疫球蛋白(IgG)溶于樣品緩沖液，制備得到 多個不同含量乳免疫球蛋白(IgG)的標準溶液，并對多個溶液分別檢 測后得到乳免疫球蛋白(IgG)含量與檢測結果之間的標準曲線；2 )對 樣品進行檢測，并得到檢測結果；3)將所述的4企測結果與所述的標 準曲線比對，得到樣品中乳免疫球蛋白(IgG)的含量；其中，檢測樣 品的設備是高壓毛細管電泳分析儀。
上述步驟l)中標準曲線的制定的方法優(yōu)選如下配制乳免疫球 蛋白(IgG)標準溶液，在樣品緩沖液中溶解乳免疫球蛋白(IgG)標準物 質配制成分別為lmg/ml 、 0. 5mg/ml 、 0. 25mg/ml 、 0. lmg/ml 、 0. 05mg/ml,制備得到標準溶液，搖勻后使用高壓毛細管電泳分析， 得到檢測結果，即得到乳免疫球蛋白(IgG)含量與平均校正因子的關 系曲線；其中，所述的檢測結果按照如下方法計算按峰面積計算出 平均校正因子。
上述的標準溶液或待;險測樣品的處理方法為4巴標準溶液或待4企 測樣品裝入離心管中，在2000-6000r/min離心條件下離心5-15min, 將樣品與緩沖液按照1: 4-20的比例加入凍存管(或其他容器)，并 搖勻，精確提取10-200ul處理樣品加入樣品管中，；改置于超聲波清 洗機1 ~ 10m i n, ^吏用毛細管電泳儀測定。
上述的樣品緩沖液為能夠使蛋白質*的緩沖液，優(yōu)選如下緩 沖液
160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩沖液中加40 m mol/L 3-嗎啉代丙烷石黃酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，7 mol/L尿素，處理樣品時 添加5ul/ml的巰基乙醇，甲基羥乙基纖維素0. 05%, pH值為8. 5 上述的搖勻步驟采用旋渦混合器。
上述高壓毛細管電泳分析的使用檢測參數如下毛細管電泳檢測 檢測的溫度控制在15 40。C之間，毛細管柱直徑25~75um、長度 20~ 600 mm, DAD (或紫外光)檢測器，壓力進樣(或電動進樣)，壓 力為0 lpsi，進樣時間為ls 20s,分離溫度為15~40°C,工作電 壓為10~ 30 kV。
上述的毛細管柱為石英毛細管柱，包括涂層和未涂層。 上述的高壓毛細管電泳分析的檢測時電泳模式為區(qū)帶電泳，其電 泳緩沖液為pH2. 0~9. 0,主要成分為無機鹽緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽、 硼酸或檸檬酸。
上述的檢測結果的處理方法如下檢測結果為樣品分離的圖鐠， 運用毛細管電泳儀所帶的分析軟件，積分各峰的面積，計算出試樣濃 度，再乘稀釋倍數，即得實際濃度。
常乳里乳免疫球蛋白(IgG)的含量20mg ~ 350mg/L，其分子量為 12000。毛細管電泳^f義檢測最低濃度能達到l(T5-10—8mol/L。所以毛 細管電泳儀能檢測出其含量。使用毛細管電泳儀開發(fā)檢測乳免疫球蛋 白(IgG)含量的方法包括樣品性質的了解、分離模式、建立緩沖體系、 優(yōu)化緩沖體系和換分離模式等步驟。開發(fā)出的方法能應用于產品開 發(fā)、質量控制和分析檢測領域中。
本發(fā)明主要使用毛細管電泳儀能準確測定乳免疫球蛋白(IgG)的含量，從而應用于產品開發(fā)、質量控制和分析檢測領域中。
本發(fā)明在在傳統的電泳和色譜的原理的基礎上，使用高壓毛細管
電泳儀檢測乳免疫球蛋白(IgG)的含量，達到準確檢測出乳制品中乳 免疫球蛋白(IgG)的含量。通過試驗，最終確定檢測方法的最佳參數 條件。具體如下
檢測乳免疫球蛋白(IgG)含量的檢測方法，包括樣品前處理、上 樣檢測，還包括校準讀數等步驟。毛細管電泳檢測檢測的溫度控制 在15 ~ 40。C之間，毛細管柱直徑50 ~ 75 u m、長度20 ~ 600隱的石 英毛細管柱，DAD (或紫外光)檢測器，壓力進樣，壓力為0.5psi, 進樣時間為5s 20s,分離溫度為20~40°C，工作電壓為15-25 kV。 校準曲線的制定配制乳免疫球蛋白(IgG)標準溶液濃度分別為 lmg/ml、 Q. 5mg/ml、 0.25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 051mg/ml。搖勻后 使用高壓毛細管電泳分析，按峰高計算出平均校正因子。 檢測步驟為
把原料奶樣品裝入15ml的離心管中，在5000r/min離心條件下 離心5min。準確提取樣品100ul置入凍存管。提取400ul樣品緩沖 液加入凍存管(或其他容器)，并使用漩渦混合器混勻。精確提取 40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清洗機3min,使用毛細 管電泳儀測定。
樣品定量讀數:才艮據樣品分離的圖譜,運用毛細管電泳儀所帶的 分析軟件，積分各峰高(或峰面積)，計算出試樣濃度，再乘稀釋倍 數，即得實際濃度。有益效果
本發(fā)明方法現行回歸方程相關系數〉0.98，其線性范圍在 0. Olmg/ml ~ 2mg/ml ，最低檢出線為0. 15ng,最低4全出濃度為 0. 005mg/ml。精確度達90%以上，柱子回收率達到90%以上，樣品回 收率達70°/。以上。能有效檢測出樣品中的乳免疫球蛋白(IgG)的含量。
具體實施例方式
實施例1 一種牛乳中免疫球蛋白(IgG)含量的檢測方法
毛細管電泳溫度控制在25°C,使用直徑為50um、長度為20腿 的石英毛細管柱，DAD^r測器，進樣壓力為0. 5psi，進樣時間為10s, 工作電壓為15 kV。
校準曲線的制定利用乳免疫球蛋白(IgG)標準品配制濃度分別 為2mg/ml、 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml的標準溶液。 搖勻后使用高壓毛細管電泳分析，積分后的峰面積分別為189614、 87015、 44216、 20897、 13210,利用軟件得出標準曲線，線性回歸 相關系數為0.9973，最低檢出線為0. 009ug，最低檢出含量為 0. OlmgAnl，標準樣品回收率達90%。
處理樣品緩沖液配置方法160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩沖 液中加40 m mol/L 3-嗎啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二 鈉，6mol/L尿素，處理樣品時添加5ul/ml的P-巰基乙醇，曱基羥 乙基纖維素0. 05%,使用氫氧化鈉溶液把pH值調至8. 5。
電泳緩沖液的配置方法0. 32 mol/L檸檬酸，20 m mol/L檸檬 酸三鈉，7 mol/L尿素，羥丙基曱基纖維素0. 05%。才企測步驟為4巴奶樣品加入15ml的離心管中，在5000r/min 離心條件下離心10min。準確提取樣品lOOul置入凍存管(或其他 容器)。提取400ul樣品緩沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用 漩渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超 聲波清洗機3min，之后使用毛細管電泳儀測定。
樣品定量讀數:根據樣品分離的圖語，運用毛細管電泳儀所帶的 分析軟件，積分乳免疫球蛋白(IgG)的峰面積為9851，利用分析軟件 自動套入標準曲線方程內計算出試樣濃度為0. 1435mg/ml，再乘稀 釋倍數5，即得實際濃度為0. 72mg/ml，所以該奶樣含有的乳免疫球 蛋白(IgG)濃度為0. 72g/L。 實施例2 —種牛乳中乳免疫球蛋白(IgG)含量的檢測方法
毛細管電泳溫度控制在30。C,使用直徑為75y m、長度為600 mm 的石英毛細管柱，DAD檢測器，進樣壓力為0. 5psi，進樣時間為5s， 工作電壓為25 kV。
校準曲線的制定利用乳免疫球蛋白(IgG)標準品配制濃度分別 為2 mg/ml 、 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml的標準溶 液。搖勻后使用高壓毛細管電泳分析，積分后的峰面積分別為， 153413、 76214、 37502、 18305、 8923利用軟件得出標準曲線，線 性回歸相關系數為0. 999，最低檢出線為0. Olug，最低檢出含量為 0. 01mg/ml,標準樣品回收率達92%。
處理樣品緩沖液配置方法160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩沖 液中加40 m mol/L 3-嗎啉代丙烷碌酸，60mmol/L乙二胺四乙酸，6mol/L尿素，處理樣品時添加5ul/ml的巰基乙醇，曱基羥乙基纖 維素0. 4%。使用0. 1M氫氧化鈉調至pH值為8. 5。
電泳緩沖液的配置方法0. 32 mol/L種檬酸，20 m mol/L檸檬 酸三鈉，6 mol/L尿素，羥丙基曱基纖維素0. 4%。
才企測步驟為把奶樣品加入15ml的離心管中，在5000r/min 離心條件下離心5min。準確提取樣品100ul置入凍存管(或其他容 器)。提取400ul樣品緩沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用漩 渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲 波清洗機3min,之后使用毛細管電泳儀測定。
樣品定量讀數:根據樣品分離的圖譜，運用毛細管電泳儀所帶的 分析軟件，積分乳免疫球蛋白(IgG)的峰面積為4738，利用分析軟件 自動套入標準曲線方程內計算出試樣濃度為0. 0614mg/ml,再乘稀 釋倍數5，即得實際濃度為0. 307mg/ml，所以該奶樣含有的乳免疫 球蛋白(IgG)濃度為0. 307g/L。
權利要求
1.一種檢測乳免疫球蛋白(IgG)含量的檢測方法，其特征在于包括如下步驟1)將乳免疫球蛋白(IgG)溶于樣品緩沖液，制備得到多個不同含量乳免疫球蛋白(IgG)的標準溶液，并對多個溶液分別檢測后得到乳免疫球蛋白(IgG)含量與檢測結果之間的標準曲線；2)對樣品進行檢測，并得到檢測結果；3)將所述的檢測結果與所述的標準曲線比對，得到樣品中乳免疫球蛋白(IgG)的含量；其中，檢測樣品的設備是高壓毛細管電泳分析儀。
2. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述步驟l)中 標準曲線的制定的方法優(yōu)選如下配制乳免疫球蛋白(IgG)標準 溶液，在樣品緩沖液中溶解乳免疫球蛋白(IgG)標準物質配制成 分另寸為lmg/ml 、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 05mg/ml, 制備得到標準溶液，搖勻后使用高壓毛細管電泳分析，得到檢測 結果，即得到乳免疫球蛋白(IgG)含量與平均校正因子的關系曲 線；其中，所述的檢測結果按照如下方法計算按峰面積計算出 平均校正因子。
3. 如權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于把標準溶液或 待檢測樣品裝入離心管中，在2000-6000r/min離心條件下離心 5-15min，將樣品與緩沖液按照1: 4-20的比例加入凍存管(或 其他容器)，并搖勻，精確提取10-200ul處理樣品加入樣品管中， 放置于超聲波清洗機1 ~ 10min,使用毛細管電泳儀測定。
4. 如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述的樣品緩沖液 為能夠使蛋白質分歉的緩沖液，優(yōu)選如下緩沖液160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩沖液中加40 m mol/L 3-嗎啉代 丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，7mol/L尿素，處理樣 品時添加5ul/ml的P-巰基乙醇，曱基羥乙基纖維素0. 05%， pH值為8. 5。
5. 如權利要求2所述的檢測方法，其特征在于所述的搖勻步驟采 用旋渦混合器。
6. 如權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于所述高壓毛細 管電泳分析的使用檢測參數如下毛細管電泳檢測檢測的溫度控 制在15 ~ 40。C之間，毛細管柱直徑25 ~ 75 y m、長度20 ~ 600 mm, DAD (或紫外光)檢測器，壓力進樣(或電動進樣)，壓力為0~ lpsi，進樣時間為ls 20s，分離溫度為15~40°C，工作電壓為 7~ 30 kV。
7. 如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于所述的毛細管柱為 石英毛細管柱，包括涂層和未涂層。
8. 如權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于所述的高壓毛 細管電泳分析的檢測時電泳模式為區(qū)帶電泳，其電泳緩沖液為 pH2. 0~9. 0,主要成分為無機鹽緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽、硼酸或 檸檬酸。
9. 根據權利要求2中所述的檢測方法，其特征在于所述的檢測結 果的處理方法如下；險測結果為樣品分離的圖譜，運用毛細管電泳儀所帶的分析軟件，積分各峰的面積，計算出試樣濃度,再乘稀 釋倍數，即得實際濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測乳中成分的方法，特別是一種檢測乳免疫球蛋白(IgG)含量的檢測方法。屬于檢測技術領域。本發(fā)明毛細管電泳儀檢測乳免疫球蛋白(IgG)含量的檢測方法，包括樣品前處理、上樣檢測，還包括校準讀數，編輯報告等步驟。本發(fā)明是樣品在毛細管電泳儀上跑電泳，從而毛細管色譜系統檢測出樣品的吸光值，以圖譜的形式表達出來，從而能準確檢測出乳免疫球蛋白(IgG)的含量，為產品研發(fā)、質量控制和分析成分提供技術支持。
文檔編號G01N33/68GK101315384SQ200810081900
公開日2008年12月3日 申請日期2008年5月20日 優(yōu)先權日2008年5月20日
發(fā)明者劉衛(wèi)星, 孫國慶, 康小紅, 胡新宇 申請人:內蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司