專利名稱：從生物體液樣本中富集與檢測稀有細胞的整合方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及乂人生物體液才羊本中富集與才企測稀有細胞的整 合方法。
背景技術(shù)：
自/人美國國家食品藥品管理局于2004年審批通過美國 Immunicon/Veridex (Philadelphia, USAV^司的直4妄4乾獲人外周血中 循環(huán)胂瘤細胞的技術(shù)后,有關(guān)獲取及檢測循環(huán)肺瘤細胞，循環(huán)內(nèi)皮細 胞，腫瘤干細胞，以及某些免疫細胞的重要的科研及臨床意義已不 斷的4皮廣泛才艮道(Cristofanilli et al, 2004 7Vew丑wg / MeJ. 351:781; Braim and Marth, 2004臉w/ Med 351:824).
然而這種利用抗體偶聯(lián)磁珠直接捕獲循環(huán)胂瘤細胞的方法有 著盡人皆^口的擊夾,存、(Mocellin et al, 2006 7Ve"(is1 Mo/ecw/ar Afed/c/we 12:130):鑒于肺瘤細胞表面標志表達的異質(zhì)性，所以許多腫瘤細胞 不能被此種方法所捕獲，這已被許多臨床病例所證明；除此之外， 由于腫瘤細胞被抗體偶聯(lián)的磁珠"觸及"并被刺激，致使這些捕獲 的被大量免疫顆粒包被的腫瘤細胞已不再是處于自然狀態(tài)的細胞， 從而很難對其進行后續(xù)分析與研究。有鑒于此，人們開始尋求其它
的替代手段以獲取循環(huán)稀有細胞。與直接捕獲細胞技術(shù)相比，現(xiàn)已 公認通過去除紅細胞及白細胞從而達到富集循環(huán)稀有細胞的方法 是最為有效可行的替代手段。雖然某些去除或分離特定細胞群的單一實-瞼方法已經(jīng)有所才艮道，諸如密度離心法(U.S. Pat. No. 4,927,750): 免疫》茲性顆粒法(U.S. Pat. No. 4,177,145),紅細月包裂解法，以及必須 借助特殊細胞分離管的免疫磁性顆粒與密度離心的初步結(jié)合方法 (U.S. Pat. No. 5,840,502)，但所有這些方法已—皮證明耗時長，白細胞 及紅細胞除率低，靶細胞回收率低，以及因需要某些特殊器材而 帶來的操作不便?；谏鲜鲈?，本發(fā)明對現(xiàn)有的幾種互不關(guān)聯(lián)的 技術(shù)進行了優(yōu)化組合，從而提供了一套新穎獨特的整合方法，包括 去除血漿蛋白，力。紅細胞裂解，加抗體包被的免疫微球，力口基于獨 特的細胞分離介質(zhì)而成的密度離心分離方法。源于此一獨特的整合 試驗方法的不可預(yù)知的實驗結(jié)果已經(jīng)被證明能夠非?？焖俑咝Ъ?高特異性地地去除血漿蛋白，白細胞及紅細胞，/人而達到有效富集 循環(huán)稀有細胞的目的，而且可以始終維持很高的稀有細胞回收率。
迄今為止，人們所釆用的所有有關(guān)/人富集樣品中4企測循環(huán)稀有 細胞包括循環(huán)腫瘤細胞及剩余白細胞的方法都是基于免疫熒光染 色。然而，其不可避免的高非特異染色信號，昂貴的熒光顯微鏡， 以及必需但不便利的工作環(huán)境(例如暗室)極大地限制了基于免疫 熒光法進行循環(huán)腫瘤細胞及循環(huán)內(nèi)皮細胞檢測工作的開展。本發(fā)明 才是供了基于石成性^粦酸酶和過氧化物酶酶標抗體的特異組合進^f亍雙 色或多色染色，從而達到檢測富集的循環(huán)稀有細胞的目.的。經(jīng)此新 方法染色過的循環(huán)稀有細胞具有4艮好的細力包形態(tài)，并可借助普通光 學(xué)顯微鏡或掃描儀進行觀察與分析，從而能快速簡便地從剩余白細 月包中才企測出富集的循環(huán)稀有細月包。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一套新穎獨特的整合方法包括去除血漿蛋白，紅 細胞裂解，加入免疫微球或免疫材料以去除白細胞，加入基于獨特 的細胞分離介質(zhì)而成的密度離心以從生物體液標本中分離循環(huán)稀 有細力包。由濃縮與富集構(gòu)成的本方法能夠快速i也乂人生物體液標本，如外周血中，富集循環(huán)稀有細胞，且回收率高。富集的細胞具有可 用于影像學(xué)分析的很好的細胞形態(tài)。同時，病人標本中的大部分白 細胞亦可被高效回收以應(yīng)用于其它研究分析，例如基因譜的研究。 在本項發(fā)明中，任何特殊器材如細胞分離管或磁鐵均不需要。
本發(fā)明中，從人或動物收集的所述生物體液標本包括但并不局
限于以下來源外周循環(huán)血，臍帶血，尿液，精液，骨髓，羊水， 脊髓及胸腔積液，腹水，痰液，處理過并/或勻漿化的人或動物組織， i咅養(yǎng)的人或動物細月包。
所述免疫孩i球由特異性識別白細胞標示物的抗體與微5求表面 進行共價或^一共價偶聯(lián)而形成，所述微球的表面可經(jīng)過或沒有經(jīng)過 化學(xué)處理以適于與蛋白質(zhì)相偶聯(lián)，所述樣i球的直徑介于10納米-100 孩史米，即lOnm-100 pm，所述孩史3求包含或部分包含寸壬何一種下列成 份二氧化硅(silica), 右旋糖普 (dextran)， 瓊月旨糖(sepharose， agarose),或交聯(lián)葡聚糖(sephadex)。用于制備所述免疫微球的微球 為》茲'1"生或非》茲寸生。
在本發(fā)明中，用于制備免疫樣"求的抗體特異性地識別下述4旦不 局限于這些白細胞表面標示物CD3, CD31, CD34, CD45, CD50， CD69， CD84，或CD102等。制備免疫微^求過程中，或是識別這些 CD分子中的任意一種的抗體，或是識別這些CD分子中任意兩種 或兩種以上的抗體的組合與任何適宜偶聯(lián)的固體表面進行共^介或 非共《介偶耳關(guān)，例如直徑介于IO纟內(nèi)米到100樣吏米(10nm-100 jim)的》茲 性或非磁性微球。
本發(fā)明中，所述免疫吸附劑是將任何經(jīng)過或沒有經(jīng)過化學(xué)處理 的適宜結(jié)合蛋白的固體表面如石圭^皮璃片(silicon glass slide)與配體 (ligand)或特異的單克隆或多克隆抗體包括抗白細胞表面標示物如 CD45的抗體進行共價或非共價偶聯(lián)而制備而成。本發(fā)明中，所述獨特的細月包分離介質(zhì)在20°C溫度下比重范圍 介于1.07256-1.07638克/毫升(gr/ml or gr/cm3)，這一特定范圍內(nèi)
述細胞分離介質(zhì)包含下列任何一種或任意兩種或兩種以上的試劑 成 <分聚乙烯p比p各火克包凈皮的月交質(zhì)二氧4匕石圭(polyvinylpyrrolidine coated colloidal silica); 多聚外唐 (polysucrose)力口；乏影酉交4內(nèi)(sodium diatrizoate)或其衍生物；由蔗4唐和表氯醇《且成的非離子聚->物 (nonionic polymer consisting of sucrose and epichlorohydrin); 或任何 一種含^f唐的溶液，如右旋糖苷或蔗^f唐(sucrose);石典化小分子4匕合物
(如甲泛影酰胺(metrizamide));或4壬意蛋白溶液，所述細月包分 離介質(zhì)的比重可用4壬4可滲透壓介于280-320mOsm/kg H20， pH 6.8-7.8的緩沖液在20。C溫度下調(diào)制在1.07256-1.07638克/毫升
(gr/ml or gr/cm3)范圍內(nèi)。所述免疫微球的比重高于所述細胞分離 介質(zhì)的比重。基于所述細胞分離介質(zhì)的離心在普通商品化的離心管 內(nèi)進行。
本發(fā)明的用于從生物體液中富集稀有纟田月包的方法還包括，將通 過基于所述細胞分離介質(zhì)的離心得到的沉積細胞以上的所有上清 液全部收集。
本發(fā)明的用于從生物體液中富集稀有細胞的方法，其中，所述 裂解紅細月包以去除紅細胞的步4聚在所述加入免疫孩U求或免疫吸附 劑進4亍孵育的步驟之前、之后或者同時進行。如果本發(fā)明的方法不 包括加入紅細胞裂解液進行紅細胞裂解的步驟，則可以通過長時間 的離心來分離去除紅細月包。
本發(fā)明方法富集的循環(huán)3希有細力包可以應(yīng)用于以下方面通過免 疫熒光或免疫組化加普通光學(xué)顯樣i鏡或可見光掃描儀對所述富集 的循環(huán)稀有細胞的計數(shù)；PCR;流式細胞儀4企測；基因表達譜分析； 蛋白表達譜分析；酶學(xué)測定；腫瘤病人體外化療藥物的篩選；有關(guān)腫瘤病人化療方案的制定與指導(dǎo)化療的進行；對腫瘤病人體內(nèi)的腫 瘤細胞使用化療藥物及/或一種或多種治療腫瘤抗體效果的評估；體 內(nèi)或體外培養(yǎng)富集的稀有細胞；在富集的稀有細胞上鑒定及確認現(xiàn) 有的或新發(fā)現(xiàn)的腫瘤細胞表面或細胞內(nèi)的標示物；富集的稀有細胞 應(yīng)用于臨床治療；監(jiān)測腫瘤病人的腫瘤復(fù)發(fā)；開發(fā)新的治療肺瘤的 藥物；作為腫瘤i貪斷的輔助手l殳；健康人群體才全；以及基于循環(huán)內(nèi) 皮細力包的有關(guān)心臟病的it斷與治療。
但來源于熒光染料自身負電荷引起的與靶細胞的非特異結(jié)合這一 主要缺點卻無可避免。此一缺點給人們在區(qū)分真假陽性染色信號的 過程中帶來了極大的困擾。本發(fā)明提供了 一整套優(yōu)化過的新穎的基 于免疫組化的多色染色方法，從而能夠克服免疫熒光帶來的非特異
下或者基于顯微鏡原理的掃描儀下進行。此方法已被證明為一種高 特異性，快速，簡單，低成本的技術(shù)手段，而且不再需要任何熒光 染料及昂貴的熒光顯微鏡。
本發(fā)明對富集的稀有細胞進行檢測的方法還可以包括染色體 熒光原位雜交。
所述雙色染色是指對所述稀有細胞的標示物如一種或多種角 蛋白，以及白細月包的標示物如CD45分別進4亍染色，所述稀有細月包 和所述白細胞被染成不同的顏色；所述三色染色是指在所述雙色染 色的基礎(chǔ)上對所述稀有纟田月包的細胞核進行另外一種顏色的染色，或 對所述稀有細力包的其他標示物進4于第三種顏色的染色，所述染色包 括將特異性識別所述稀有細胞標示物的一抗單克隆或多克隆抗體
以及特異性識別所述白細胞的一抗單克隆或多克隆抗體與所述富 集的稀有細胞進行孵育。所述特異性識別所述稀有細月包標示物的 一 抗單克隆或多克隆 抗體以及所述特異性識別所述白細月包標示物的 一抗單克隆或多克 隆抗體分別與不同的小分子相共價偶聯(lián)，所述小分子選自包括以下
物質(zhì)的《且羅丹明(rhodamine),生物素(biotin ),異羥基洋i也黃 戒(digoxigenin ) , Alexa Fluor系歹0分子，F(xiàn)ITC,及Texas Red, <旦 不限于這些物質(zhì)。
在本發(fā)明的某些具體實施方式
中，可識別角蛋白8， 18, 19或 廣"i普角蛋白中4壬意一種或任意兩種或兩種以上的一抗單克隆或多 克隆抗體被用于識別從具有上皮來源的任何實體腫瘤脫落入血的 循環(huán)腫瘤細胞。另外一林可識別白細胞表面標志CD45的單克隆或 多克隆抗體用于白細胞染色以區(qū)分假陽性。
所述染色包括加入可特異性識別所述小分子的與不同的酶相 偶聯(lián)的二抗單克隆或多克隆抗體。所述偶聯(lián)的酶是過氧化物酶，或 石咸性磷酸酶，所述石威性磷酸酶被用于4企測所富集的稀有細胞。
可以在載玻片上或在溶液中對用本發(fā)明的方法富集的稀有細 胞進行染色。
在本發(fā)明的一些具體實施方式
中，將抗所述稀有細胞的標示物 與抗白細力包的標示物的 一抗抗體4安任意順序與所述富集的稀有細 胞一起進行孵育，或?qū)煞N抗體制備成混合液同時與所述富集的稀 有細胞進4于孵育。
本發(fā)明中，所述稀有細胞或其它細胞既可直接—皮共價或非共價 偶耳關(guān)于任意適宜固體表面的抗體所捕獲，也可通過本發(fā)明的富集方 法所富集。組化的染色及可見光下的觀察，所述免疫熒光用于4全測富集的循環(huán) 稀有細胞，而所述基于免疫組化的染色則用于白細胞染色。
在本發(fā)明的某個具體實施方式
中，識別角蛋白的一抗抗體被標
記上熒光分子，而抗CD45的一抗則被標記上小分子以用于過氧化 物酶催化的基于免疫組化的可見光顏色反應(yīng)。
本發(fā)明獨特的富集與染色兩種方法的結(jié)合可以才及大地促進才企 測血中稀有細胞如循環(huán)肺瘤細胞的普及應(yīng)用。該新穎獨特的富集與 染色方法已凈皮i正明成本^f氐，且能快速高效及高特異性地富集并定量 才企測血中的稀有細月包。
本發(fā)明還涉及一種對富集的稀有細胞進行檢測的方法，包括進 行染色體熒光原位雜交，以及利用熒光或普通光學(xué)顯微鏡或基于顯 樣史鏡原理的掃描儀進行觀察鑒定。
本發(fā)明的目的還在于一種用于乂人生物體液中富集稀有細力包的 試劑盒，包括紅細胞裂解液，免疫微球或者免疫吸附劑，獨特的細 胞分離介質(zhì)。該試劑盒還包括說明書，用于說明試劑盒的使用。
本發(fā)明還涉及一種用于檢測富集的稀有細胞的試劑盒，包括特 異性識別所述稀有細力包標示物的共^f介偶4關(guān)了小分子的一抗單克隆 或多克隆抗體，可識別所述小分子的偶聯(lián)了酶的二抗單克隆或多克 隆4元體以及所述酶的相應(yīng)底物。該試劑盒還可以包4舌免疫焚光染剩-標記的抗體。該試劑盒還可以包括用于染色體熒光原位雜交的探針 及試劑。該試劑盒還包括說明書，用于說明試劑盒的使用。
本發(fā)明還涉及 一 種用于從生物體液樣本中富集循環(huán)稀有細胞 的自動化系統(tǒng)，包括用于自動去除血漿蛋白的離心^L,用于自動加入紅細胞裂解液的裝置，用于自動加入免疫孩i球或免疫吸附劑的裝 置，用于自動加入一種細胞分離介質(zhì)的裝置，密度離心裝置以及自 動收集上清的裝置。
本發(fā)明還涉及一種對富集的稀有細胞進行檢測的自動化系統(tǒng)， 包括基于免疫組化的雙色或多色染色的裝置，普通光學(xué)顯微鏡或基
于顯孩i鏡原理的自動掃描裝置。所述染色裝置包括自動加樣器，孵 育器和自動清洗裝置。
名詞解釋
稀有細胞:其在采集的體液樣本內(nèi)的所有有核細胞中的占有比 例小于0.1%。它們包括循環(huán)肺瘤細胞，循環(huán)內(nèi)皮細胞，肺瘤干細胞， 千細力包，及某些免疫細"包等。
循環(huán)稀有細胞循環(huán)稀有細胞是指存在于體液中的稀有細胞。
生物體'液4示本:其為從人或動物體中收集的液體，它們包括4旦 并不局限于以下來源外周循環(huán)血，臍帶血，尿液，精液，骨髓， 羊水，脊髓及胸腔積液，腹水，痰液，處理過的人或動物組織，培 養(yǎng)的人或動物細月包。
紅細胞裂解(hemolysis):在低滲條件下裂解紅細胞。
免疫組化(IHC):通過偶聯(lián)于抗體上的酶與底物的反應(yīng)顯現(xiàn)光 學(xué)顯微鏡下可觀察到的顏色。
免疫焚光:將抗體標i己熒光分子


圖1是將乳腺癌病人外周血中的循環(huán)腫瘤細胞經(jīng)本發(fā)明方法富集后， 再經(jīng)本發(fā)明的基于免疫組化的方法進行三色染色后獲得的圖像。
圖2是用染色體熒光原位雜交方法檢測循環(huán)腫瘤細胞得到的圖像。
具體實施例方式
本發(fā)明首次將四種互不關(guān)聯(lián)的單一實驗手段(即去除血漿蛋 白，裂解紅細胞，抗體包被的免疫微球及基于特殊細胞分離介質(zhì)的 密度離心)進行了改進與優(yōu)化組合從而提供了一套新穎獨特的可快 速高效地從外周血或其它體液樣本中富集循環(huán)稀有細胞的方法。富 集后的循環(huán)稀有細胞不需經(jīng)免疫熒光染色，而是用本發(fā)明中由免疫 組化優(yōu)化衍生而成的技術(shù)進行雙色或多色染色，并可借助普通光學(xué) 顯微鏡或掃描儀完成對染色的稀有細胞的觀察，圖像采集與分析處 理。其中稀有細胞包括循環(huán)肺瘤細胞，循環(huán)內(nèi)皮細胞，肺瘤干細胞，
干細胞，及某些免疫細胞，其中所述循環(huán)腫瘤細胞來自于具有或不 具有上皮來源的任何實體瘤，如黑色素瘤。
1.用于富集血中循環(huán)稀有細胞包括循環(huán)腫瘤細胞及循環(huán)內(nèi)皮 細胞的方法與試劑
分離任意所需的稀有細胞。體液標本包括但并不局限于以下來源 外周循環(huán)血，臍帶學(xué)，尿液，精液，骨髓，羊水，脊髓及胸腔積液， 腹水，痰液，處理過的人或動物組織，培養(yǎng)的人或動物細月包。
在本發(fā)明的某些具體實施方式
中，血液#^欠集于4壬意一種商品 4匕的采血管中(如BD, New Jersey, USA; Cyto-Chex, Iowa， USA)。這些采血管含有任何一種下述抗凝劑枸櫞酸葡萄糖(ACD),乙二 胺四乙酸(EDTA)，肝素(heparin)等。標本應(yīng)在72小時之內(nèi)進 行處理。
在本發(fā)明的其它某些具體實施方式
中，本方法將去除血漿蛋 白，裂解紅細胞，加入抗體包被的免疫磁珠，及基于特殊細月包分離 介質(zhì)的密度離心進行了組合優(yōu)化從而可有效地去除血漿蛋白，紅細 胞和白細胞。作為替代手段，富集手段也可簡化為由兩個步驟組成， 即免疫微球加紅細胞裂解；或免疫微球加基于特殊細胞分離介質(zhì)的 密度離心。不同于其它常規(guī)的用密度離心法分離細胞后只能費時費 力且非精確地收集不同比重的分界相溶液，本發(fā)明中沉積細胞以上 的所有上清液全部纟皮4欠集。
在本發(fā)明的實施方式中，免疫微球的制備是將單克隆或多克隆 抗體與任何經(jīng)過或沒有經(jīng)過化學(xué)處理的適宜結(jié)合蛋白的固體表面
(例如直徑介于10 nm-lOO iLim的孩O求)進^f亍共《介或非共《介偶耳關(guān)。 這些樣0求包含或部分包含任4可一種下列成<分二氧4匕石圭(silica)，右 i走津唐香(dextran)，瓊月旨jf唐(sepharose， agarose),或交聯(lián)葡聚并唐 (sephadex)。這些樣U求可以是》茲性的，也可為非》茲性的。
在本發(fā)明的某些實施方式中，免疫微球可由免疫吸附劑所替 代。免疫吸附劑的制備是將特異的單克隆或多克隆抗體與任何經(jīng)過 或沒有經(jīng)過化學(xué)處理的適宜結(jié)合蛋白的固體表面進4亍共^f介或非共 價偶聯(lián)，如硅玻璃片(silicon glass slide).
在本發(fā)明的一些實施方式中，用于密度離心的特殊細胞分離介 質(zhì)具有特定范圍的比重，即1.07256-1.07638克/毫升(gr/ml or gr/cm3)，在此比重范圍內(nèi)的細胞分離介質(zhì)可用于分離所需的細胞。 本項發(fā)明中的細胞分離介質(zhì)包含下列任何一種或任意兩種以上的 i式劑成^f分聚乙火希p比p各》克包凈皮的月交質(zhì)二氧4匕石圭(polyvinylpyrrolidinecoated colloidal silica); 多聚才唐(polysucrose)力口泛"f》酸4內(nèi)或其書f生 4勿；由嚴并唐和表氯醇纟且成的非離子聚合物(nonionic polymer consisting of sucrose and epichlorohydrin); ^f壬"f可一種含4唐的〉容液,i口 右旋糖普或蔗糖(sucrose);碘化小分子化合物(如曱泛影酰胺 (metrizamide));和/或任意蛋白溶液。細月包分離介質(zhì)的比重可用 4壬4可滲透壓介于280-320 mOsm/kg H20, pH 6.8-7.8的鄉(xiāng)爰沖液調(diào)制而 成。
免疫微球的比重高于細胞分離介質(zhì)的比重。 在本發(fā)明的實施方法中，血漿蛋白可用離心方法去除。
密度離心相結(jié)合以快速高效地去除紅細胞。
本發(fā)明中首次使用免疫微球與基于特殊細胞分離介質(zhì)的密度 離心相結(jié)合以快速高效地去除白細胞。作為替代手l殳，本發(fā)明中的 去除白細胞亦可簡化為只 <吏用免疫樣"求或免疫吸附劑。
在本發(fā)明的具體實施方式
中，用于制備免疫微球或免疫吸附劑 的抗體既可以是特異'l"生地識別4壬意下述白細胞表面標示物的 一 種 抗體，或是識別任意兩種或兩種以上下述白細胞表面標示物的抗 體CD3， CD31， CD34， CD45, CD50， CD69, CD84，或CD102等。
在本發(fā)明的具體實施方式
中，紅細胞與白細胞的去除可以以任 意適宜的順序進行。它們既可同時去除，亦可紅細胞或白細胞先被 去除。富集的循環(huán)稀有細胞可用于 一 系列后續(xù)分析，包括免疫熒光分
析，基于免疫組化的染色分析，PCR，體外或體內(nèi)i咅養(yǎng)富集的循環(huán) 稀有細胞等。
2.檢測富集的循環(huán)稀有細胞包括循環(huán)腫瘤細胞
目前所有發(fā)表的有關(guān)檢測循環(huán)腫瘤細胞的方法都基于免疫熒 光染色。然而免疫熒光染色不可避免的主要缺點，即人們熟之為"鬼 影，，的非特異性染色卻給人們在判斷真假陽性細胞的過程中帶來了 極大的困擾。本發(fā)明提供了一整套優(yōu)化后的基于免疫組化的多色染
色方法。通過本發(fā)明試 -驗手>a富集的循環(huán)《希有細月包經(jīng)此方法染色 后，可極大地消除非特異染色。此染色方法與普通光學(xué)顯微鏡相結(jié)
在本發(fā)明的某一具體實施方式
中，經(jīng)本方法富集的^盾環(huán)^希有細
月包用2%多聚甲醛(paraformaldehyde)固定。
在本發(fā)明的其它具體實施方式
中，可識別角蛋白8, 18, 19或 廣i普角蛋白中4壬意一種或4壬意兩種或兩種以上的一#元單克隆或多 克隆抗體^皮用于識別循環(huán)腫瘤細胞，這些血中的循環(huán)腫瘤細月包脫落 于具有上皮來源的任何實體瘤。另外一4朱可識別白細月包表面標志 CD45的單克隆或多克隆抗體凈皮用于區(qū)分作i陽性。
在本發(fā)明的其它一些具體實施方式
中，抗角蛋白或CD45的一 抗單克隆或多克隆抗體分別與下述任意一種小分子進4于共〗介偶耳關(guān)， 它們包括但不局限于羅丹明(rhodamine),生物素(biotin),異 羥基洋;也黃戒(digoxigenin ) ， Alexa Fluor系列分子，F(xiàn)ITC,及Texas Red等。在本發(fā)明的其它具體實施方式
中，可特異識別標記在一抗抗體 上的小分子的二抗單克隆或多克隆抗體分別與石威性磷酸酶，過氧化 物酶或其它酶相共價偶聯(lián)。
在本發(fā)明的某個具體實施方式
中，作為另外一種選^^的^^4戈方 法，免疫熒光可與經(jīng)可見光識別的免疫組化法相結(jié)合。在此方法中， 識別角蛋白的一抗單克隆或多克隆抗體被標記上<壬<可顏色的熒光
分子，長口 Alexa Fluor系列，Quantum dot, FITC等，而4元CD45的一 抗^皮標記上上述小分子以用于過氧化物酶催化的免疫組化可見光
示物CD45的非特異染色。
自動染色裝置包括自動加樣裝置，孵育裝置和自動清洗裝置。 實施例
實施例l.從乳腺癌病AJf周血中富集循環(huán)腫瘤細胞
采集5 ml人外周血于含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑的采 血管中(BD, New Jersey, USA)。離心血樣(700 x g, 10分4中)后， 可以4吏用吸液管或者自動吸液裝置來吸除上清以去掉血漿蛋白。將 離心后得到的沉淀物重懸于30毫升紅細胞裂解液(BD Pharmingen, California, USA)后，孵育20分鐘。進行標本離心(700 x g， 10分鐘) 以便分離出在上清液中的被裂解的紅細胞碎片。去掉上清后，將沉 淀物(即沉積細胞)重懸于5毫升磷酸鹽緩沖液(pH7.4)。向其中 加入0.5毫升包^皮有抗白細月包表面抗原例如CD45的單克隆4元體的 ^茲i朱后(Invitrogen， California, USA),室溫孵育30分4中。將所有反應(yīng) 液加到普通50毫升離心管內(nèi)的5毫升細胞分離介質(zhì)的頂層，離心 400 xg, 10分4中。jR集所有上清液。上清液離心900xg， 10分4中。 離心后得到的沉積細胞重懸于磷酸鹽緩沖液后可做進一步分4斤。該實施例中的細胞分離介質(zhì)是這樣制備的5.7%多聚糖 (polysucrose)與9%泛影酸鈉(Sigma, Missouri, UDA)的混合物在高 ^T度凄t字密度4義(型號DMA 4500， Anton-Paar, Virginia, USA)于 20。C監(jiān)測下，用PBS將其密度調(diào)至成1.07256-1.07638克/毫升 (gr/ml or gr/cm3)。
實施例2.三色法染色從乳腺癌病"卜周血中富集的循環(huán)腫瘤
細胞
富集的循環(huán)肺瘤細胞置于載玻片上，用由磷酸鹽緩沖液配制而 成的2%多聚甲醛(paraformaldehyde)室溫固定2小時后，用石粦酸 鹽IC沖液沖洗3遍。細月包與含生物素(Pierce， Illinois, USA)標i己的4元 角蛋白8+18+19單克隆抗體(Abcam， UK, 1 jug/ml)及羅丹明(Pierce, Illinois, USA)標記的抗CD45單克隆抗體(Abeam, UK, 1 pg/ml)混 合液(由磷酸鹽緩沖液稀釋而成)在室溫孵育30分鐘。載玻片用 磷酸鹽緩沖液沖洗3遍后，與含石咸性磷酸酶標記的抗生物素單抗 (Sigma， Missouri, USA, 1嗎/ml)及過氧化物酶(Pierce, Illinois, USA) 標記的抗羅丹明單抗(Abcam， UK， 1 )ag/ml)混合液(由石粦酸鹽鄉(xiāng)爰沖液 稀釋而成)室溫孵育30分鐘。載玻片用磷酸鹽緩沖液沖洗3遍后， 用Vector Laboraories (California, USA)出產(chǎn)的紅色速染細月包核i式劑 盒，石成性磷酸酶及過氧化物酶底物試劑盒進行顯色反應(yīng)。染色結(jié)果 見附圖。
參見附圖1,通過本發(fā)明中的實驗方法對乳腺癌病人外周血中 的循環(huán)肺瘤細胞進行富集后，再用基于免疫組化的三色染色法進行 染色。圖中所示為普通光學(xué)顯樣"竟下觀察到的循環(huán)腫瘤細月包。大細 胞乳腺癌細胞(tumor cell),其角蛋白染成藍色，細胞核為粉紅色； 小細胞白細胞(WBC)，其表面CD45被染成棕色。實施例3 .染色體熒光原位雜交法檢測循環(huán)腫瘤細胞
將富集的肺瘤細胞作為標本置于載玻片上。染色后的標本用2 0毫克/毫升的RNA酶處理1小日于后，使用SSC緩沖液漂洗玻 片。標本用無水乙醇脫水IO分鐘后，加熱到70。C持續(xù)5分鐘變性。 標本再用無水乙醇脫水10分鐘，并于45°C與纟笨針雜交孵育過4支。 標本用S S C》爰沖液洗滌后，用熒光顯微4彭現(xiàn)察。該標本可以是經(jīng) 實例2中的方法染色后的富集胂瘤細胞，進^f亍染色體熒光原^立雜交 的目的是進一步確定基于免疫組化的三色染色4企測腫瘤細月包的真 實性。為了便于快速診斷，標本亦可不經(jīng)抗體染色，而直4妄進4亍染 色體熒光原位雜交。染色體熒光原位雜交的結(jié)果見附圖2。細月包的 染色體顯示為紅色和綠色。從紅色或綠色的H目可以判斷是否染色 體發(fā)生變異，是否為腫瘤細胞。
實施例4 .檢測循環(huán)腫瘤細胞應(yīng)用于臨床快速評估抗腫瘤化療 藥物的療^U5Ut瘤Jj良的監(jiān)測
目前臨床上評估化療藥物的療效的常用方法是每3個月為病人 做一次CT檢查。如此長的時間間隔對與那些化療效果不佳的病人 所造成的傷害是致命性的。而每1-2周進行的檢測循環(huán)腫瘤細胞則 在化療開始2-4周后即可為醫(yī)生才是供準確的評估lt據(jù)。循環(huán)腫瘤細 胞數(shù)目的降低意味著化療藥物的有效性。反之，如果循環(huán)腫瘤細胞 數(shù)目沒有明顯的改變甚至增高，則意味著病人需接受不同的化療藥 物治療。
腫瘤復(fù)發(fā)意p未著原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶的腫瘤又進入了活^夭期。此時 病人血中的循環(huán)肺瘤纟田月包數(shù)目會明顯升高。對經(jīng)過治療后出院的腫 瘤病人進行長期的循環(huán)胂瘤細胞的跟蹤觀察(一般為每3個月檢查 一次)，可以為早期判斷腫瘤是否復(fù)發(fā)提供非常用力的證據(jù)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當明了 ，上述優(yōu)選實施例只是對本發(fā)明的 具體說明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。根據(jù)需要可以對其進行多種 改進，組合，亞組合以及變換，所有的改進，組合，亞組合、變換 以及等效替換都落入在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種從生物體液樣本中富集稀有細胞的整合方法，包括a)通過離心去除血漿蛋白，b)可選加入紅細胞裂解液進行紅細胞裂解以去除紅細胞，c)加免疫微球或免疫吸附劑進行孵育，d)進行基于獨特的細胞分離介質(zhì)的密度離心，用于分離所述稀有細胞與去除紅細胞后的剩余紅細胞及結(jié)合于所述免疫微球上的白細胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，從人或動物收集的所述生 物體液標本包括但并不局限于以下來源外周循環(huán)血，臍帶血， 尿液，精液，骨髓，羊水，脊髓及胸腔積液，腹水，痰液，處 理過并/或勻漿化的人或動物組織，培養(yǎng)的人或動物細月包。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述免疫微球由特異性識 別白細胞標示物的抗體與微球表面進行共價或非共價偶聯(lián)而 形成，所述孩"求的表面經(jīng)過或沒有經(jīng)過4匕學(xué)處理以適于與蛋白 質(zhì)相偶聯(lián)，所述樣支球的直徑介于10納米-100纟效米，所述樣史 球包含或部分包含任何一種下列成〗分二氧化硅，右旋糖普， 瓊脂糖，或交聯(lián)葡聚糖。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，用于制備所述免疫微球的 微球為磁性或非磁性的。
5. 4艮據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述免疫吸附劑是將任何 經(jīng)過或沒有經(jīng)過化學(xué)處理的適宜結(jié)合蛋白的固體表面，如石圭玻璃片，與配體或特異的單克隆或多克隆抗體包^T抗白細月包表面標示物，如CD45的抗體，進^f于共1"介或非共〗介偶聯(lián)而制備而成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述獨特的細胞分離介質(zhì) 在20。C溫度下比重范圍介于1.07256-1.07638克/毫升，所述 細胞分離介質(zhì)包含下列任何一種或任意兩種或兩種以上的試 劑成份聚乙烯吡咯烷包被的膠質(zhì)二氧化硅；多聚糖加泛影酸 鈉或其衍生物；由蔗糖和表氯醇組成的非離子聚合物；或任何 一種含糖的溶液，如右旋糖苷或蔗糖；》典化小分子化合物(如 甲泛影酰胺)；或任意蛋白溶液，所述細胞分離介質(zhì)的比重可 用任何滲透壓介于280-320 mOsm/kg H20， pH 6.8-7.8的緩沖 液在20。C溫度下調(diào)制在1.07256-1.07638克/毫升范圍內(nèi)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，還包括，將通過基于所述 細胞分離介質(zhì)的離心得到的沉積細胞以上的所有上清液全部收集。
8. 4艮據(jù)4又利要求1所述的方法，其中，所述稀有細月包是指其在采 集的生物體液沖羊本內(nèi)的所有有核細月包中的占有比例小于 0.1%,它們包括循環(huán)腫瘤細胞，循環(huán)內(nèi)皮細胞，胂瘤干細胞， 干細月包，及某些免疫細胞，其中所述循環(huán)肺瘤細月包來自于具有 或不具有上皮來源的任何實體瘤，如黑色素瘤等。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法富集的稀有細胞在以 下方面的應(yīng)用在通過免疫熒光或免疫組化加熒光或普通光學(xué) 顯微鏡或可見光掃描儀對所述富集的稀有細胞的計數(shù)；PCR; 流式細胞儀才企測；基因表達i普分析；蛋白表達鐠分析；酶學(xué)測 定；腫瘤病人體外化療藥物的篩選；有關(guān)腫瘤病人化療方案的 制定與指導(dǎo)化療的進行；對腫瘤病人體內(nèi)的腫瘤細胞使用化療 藥物及/或一種或多種治療肺瘤抗體效果的評估；體內(nèi)或體外培養(yǎng)所述富集的稀有細胞；在所述富集的稀有細胞上鑒定及確 認現(xiàn)有的或新發(fā)現(xiàn)的腫瘤細胞表面或細胞內(nèi)的標示物；所述富 集的稀有細胞應(yīng)用于臨床治療；監(jiān)測腫瘤病人的腫瘤復(fù)發(fā)；開 發(fā)新的治療腫瘤的藥物；作為腫瘤診斷的輔助手段；健康人群 體才企；以及基于循環(huán)內(nèi)皮細胞的有關(guān)心臟病的it斷與治療。
10. —種對富集的稀有細胞進4亍;險測的方法，包括基于免疫組化的 染色與免疫熒光相結(jié)合，或基于免疫組化的雙色、三色、或多 色染色，以及利用焚光或普通光學(xué)顯孩"竟或基于顯孩"竟原理的 掃描儀進行觀察鑒定。
11. 才艮據(jù)4又利要求10的方法，還包括染色體熒光原位雜交。
12. 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中，所述雙色染色是指對所 述稀有細月包的標示物如一種或多種角蛋白，以及白細月包的標示 物如CD45分別進4亍染色，所述稀有細月包和所述白細月包一皮染成 不同的顏色；所述三色染色是指在所述雙色染色的基礎(chǔ)上對所 述稀有細胞的細月包核進4亍另外一種顏色的染色，或?qū)λ鱿∮?細月包的其他標示物進4亍第三種顏色的染色，所述染色包4舌將特 異性識別所述稀有細胞標示物的 一抗單克隆或多克隆抗體以 及特異性識別所述白細月包的一抗單克隆或多克隆抗體與所述 富集的稀有細胞進行孵育。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述特異性識別所述稀 有細月包標示物的一4元單克隆或多克隆4元體以及所述特異性識 別所述白細胞標示物的一抗單克隆或多克隆抗體分別與不同 的小分子相共價偶聯(lián)，所述小分子選自以下物質(zhì)羅丹明、生 物素、異羥基洋地黃戒、AlexaFluor系列分子、FITC、及Texas Red,以及類4以物質(zhì)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，還包括聯(lián)合使用免疫熒光染色 與基于免疫組化的染色及可見光下的7見察，所述免疫熒光用于 檢測所述富集的稀有細胞，而所述基于免疫組化的染色則用于 白細月包染色。
15. 4艮據(jù)一又利要求10所述的方法，所述稀有細胞或其它細胞既可 直接被共價或非共價偶聯(lián)于任意適宜固體表面的抗體所捕獲， 也可通過沖艮據(jù)斥又利要求1 ~8中4壬一項所述的方法所富集。
16. —種對富集的稀有細胞進行檢測的方法，包括進行染色體熒光 原位雜交，以及利用熒光或普通光學(xué)顯樣"竟或基于顯孩"竟原理 的掃描儀進行觀察鑒定。
17. —種用于乂人生物體液中富集稀有細月包的試劑盒，包括紅細胞裂 解液，免疫微球或者免疫吸附劑，以及細胞分離介質(zhì)。
18. —種用于檢測富集的稀有細胞的試劑盒，包括特異性識別所述 稀有細胞標示物的共價偶聯(lián)了小分子的一抗單克隆或多克隆 抗體，可識別所述小分子的偶聯(lián)了酶的二抗單克隆或多克隆抗 體以及所述酶的相應(yīng)底物。
19. 一種用于從生物體液樣本中富集稀有細胞的自動化系統(tǒng)，包括 用于自動去除血漿蛋白的離心機，用于自動加入紅細胞裂解液 的裝置，用于自動加入免疫微球或免疫吸附劑的裝置，用于自 動加入一種細胞分離介質(zhì)的裝置，密度離心裝置以及自動收集 上清的裝置。
20. —種對富集的稀有細胞進行檢測的自動化系統(tǒng)，包括基于免疫 組化的雙色或多色染色的裝置，普通光學(xué)顯樣"竟或基于顯孩t鏡 原理的自動掃描裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從生物體液樣本中富集與檢測稀有細胞的整合方法，該富集方法包括a)通過離心去除血漿蛋白，b)可選加入紅細胞裂解液進行紅細胞裂解以去除紅細胞，c)加免疫微球或免疫吸附劑進行孵育，d)進行基于獨特的細胞分離介質(zhì)的密度離心，用于分離循環(huán)稀有細胞與去除紅細胞后的剩余紅細胞及結(jié)合于所述免疫微球上的白細胞。根據(jù)本發(fā)明對富集的稀有細胞進行檢測的方法包括進行基于免疫組化的染色與免疫熒光相結(jié)合，或基于免疫組化的雙色、三色、或多色染色，以及利用熒光或普通光學(xué)顯微鏡或基于顯微鏡原理的掃描儀進行觀察鑒定。該新穎獨特的富集與染色方法已被證明成本低，且能快速高效及高特異性地富集并定量檢測血中的稀有細胞。
文檔編號G01N1/40GK101587043SQ200810097889
公開日2009年11月25日 申請日期2008年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月20日
發(fā)明者平 林 申請人:平 林