專利名稱：一種炎癥和血栓藥物的靶標(biāo),以及針對該靶標(biāo)的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的講，本發(fā)明涉及一種炎癥和血栓藥物的靶標(biāo)，以 及針對該靶標(biāo)的藥物。
背景技術(shù)：
近年來細(xì)胞粘附分子及其研究已成為熱點(diǎn)，對其調(diào)節(jié)細(xì)胞與胞外基質(zhì)間相互作用等 功能，以及在細(xì)胞生長發(fā)育、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、血液凝固、組織修復(fù)和腫瘤轉(zhuǎn)移等 生理和病理過程中的重要作用，也給予高度關(guān)注。
選擇素(selectins)作為細(xì)胞粘附分子中一個家族，包括P-selectin， E-selectin和 L-selectin，其主要功能為介導(dǎo)活化血小板、內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等粘附和相互 作用，并與免疫損傷、炎癥、血栓形成及腫瘤轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。P-選擇素(P-selectin) 是選擇素家族中的一個成員，分子質(zhì)量為140kDa的膜糖蛋白，定位于血小板的ot顆粒和 內(nèi)皮細(xì)胞棒管狀(Weibel-palade)小體內(nèi)。全長由789個氨基酸殘基組成，N末端730 個氨基酸構(gòu)成胞外區(qū)，C末端24個氨基酸組成跨膜區(qū)，此外35個氨基酸組成胞漿短尾。 胞外區(qū)包括1個凝集素樣區(qū)、1個表皮生長因子樣區(qū)(EGF區(qū))和9個被稱為補(bǔ)體調(diào)節(jié) 蛋白的較短重復(fù)序列(SCR區(qū))。其中凝集素樣區(qū)可以結(jié)合某些碳水化合物，是選擇素結(jié) 合配體部位。胞漿區(qū)可能與細(xì)胞骨架相連。P-選擇素識別的是一些寡糖基團(tuán)，主要是唾 液酸化的路易斯寡糖(sialyl Lweisx， sLex，即CD15s)或類似結(jié)構(gòu)分子。
P-選擇素糖蛋白配體l (P-selectin glycoprotein ligand l,PSGL-l, CD 162)是一種具有 同源二聚體結(jié)構(gòu)的跨膜糖蛋白，表達(dá)于幾乎所有白細(xì)胞表面，是迄今為止闡述得最為詳 盡的選擇素配體。PSGL-1與P-選擇素有高度的親和性，同時也是L-選擇素和E-選擇素 的配體。PSGL-1是一個高度唾液酸化的黏蛋白，每個單體的相對分子量為120kDa左右， 其蛋白骨架上帶有1-3個N-連聚糖和數(shù)目眾多的唾液酸化的O-聚糖，唾液酸化(sialylkx) 和O-聚糖(O-glycans)結(jié)構(gòu)對PSGL-1功能發(fā)揮具有重要作用。
血小板和內(nèi)皮細(xì)胞活化后，P-選擇素被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上(Blann AD, Nadar SK， Lip GY Eur Heart. J. 2003; 24: 2166 —2179; McEver RP. Selectins. Curr. Opin. Immunol.1994;6:75-84)。 P-選擇素和其白細(xì)胞上的配體P-選擇素配體PSGL-1相互結(jié)合，起始白細(xì)胞與 內(nèi)皮細(xì)胞或血小板的黏附過程。
盡管白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附作用是構(gòu)成機(jī)體屏障的重要一環(huán)，但白細(xì)胞內(nèi)皮 細(xì)胞的過度黏附是有害的。例如，在缺血/再灌注損傷中，再灌注后細(xì)胞黏附增加會激發(fā) 炎癥滲出加劇，造成比缺血更大的組織和器官損害。血栓的發(fā)生發(fā)展涉及機(jī)體許多復(fù)雜 的病理生理反應(yīng)。血栓形成除與血漿中一些凝血因子有關(guān)外，更與P-選擇素介導(dǎo)的白細(xì) 胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血小板之間的黏附密切相關(guān)(Li N, Hu H， LindqvlstM, etal. Arterioseler Thromb Vase Biol. 2000. 20: 2702 2708)。黏附分子P-選擇素介導(dǎo)的血小板與內(nèi)皮細(xì) 胞間，以及這些細(xì)胞與白細(xì)胞之間的細(xì)胞黏附，是炎癥和血栓形成病理生理過程中的基 本現(xiàn)象和共同過程。通過各種途徑和藥物抑制和調(diào)節(jié)P-選擇素及其介導(dǎo)的細(xì)胞黏附與作 用，已證明可成為炎癥和血栓性疾病的有效防治手段。
抗細(xì)胞黏附最直接的是阻斷受體配體之間的結(jié)合。在靈長類動物的血栓形成模型 中，針對P-選擇素的單克隆抗體加速了血栓的溶解，并且在冠狀動脈內(nèi)皮損傷模型中， 可減少血栓形成和缺血損傷。此外在靜脈血栓形成的大鼠模型中，針對P-選擇素的單克 隆抗體不僅具有有效的抗血栓作用，同時也可減少炎癥細(xì)胞的浸潤。目前抗P-選擇素抗 體可通過導(dǎo)人用于血栓和/或炎癥的定位診斷以及靶向性治療，已成功的使用在前臨床模 型中。針對P-選擇素的抗體及人源化單抗也被研究開發(fā)，如重組可溶性P-選擇素糖蛋白 配體-1和小分子選擇素抑制劑已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，抗人P-選擇素凝集素-表皮生長因子功能 域的單克隆抗體也已經(jīng)申請中國專利(申請?zhí)?00310108522.5)。
由于選擇素均可識別唾液酸化的路易斯糖x (sLex)結(jié)構(gòu)，所以sLex擬似劑因其高 親和力迅速被開發(fā)，如TBC1269,分子量小于1000，作為治療哮喘和銀屑病的候選藥物 己進(jìn)入II期臨床。非碳水化合物分子如OC229648，在體外實(shí)驗(yàn)中較TBC1269有更強(qiáng)的 抑制作用，且成功地應(yīng)用于動物炎癥模型。因此，抗黏附治療將隨著P-選擇素與炎癥和 血栓性疾病的研究深入和闡明，不失為一種防治手段，具有良好的臨床應(yīng)用價值和前景。
在起始黏附過程中，PSGL-1不僅可通過與選擇素間的作用建立白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間 聯(lián)系，同時也可作為信號受體向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號引起白細(xì)胞的活化。P-sdectin結(jié)合 PSGL國1能活化整合素ocm卩2 (Ma YQ， PlowEF， Geng JG. Blood. 2004;104:2549—2556)，但 是該活化通路的具體分子機(jī)制尚不清楚。
整合素是一大類跨膜異二聚體粘附分子，表達(dá)在幾乎所有真核細(xì)胞的表面，在細(xì)胞
間和細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用中起重要作用。整合素中的P2家族常被稱作白細(xì)胞整合素，包括四個成員，由四個不同的a亞單位(aM， aL， ax和otD)和一個共同的P2亞單位構(gòu)成， 其中表達(dá)在中性粒白細(xì)胞上的p2整合素主要是ocmP2 (CDllbCD18, Mac-l)和0^(32 (CDllcCD18, LFA-1)。這兩種整合素能結(jié)合多種配基，包括血纖蛋白原，細(xì)胞間粘附 分子(ICAM-1， CD54)，凝血因子X，補(bǔ)體通路產(chǎn)物C3bi和幾種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。Mac-l 和LFA-1和配體的結(jié)合依賴于白細(xì)胞活化時其對配體親和性的提高和其自身聚集而提高 的親合力，也依賴于貯存于胞內(nèi)的分子向細(xì)胞表面的分布。(32整合素的活化對于炎癥及 血栓性疾病中白細(xì)胞在血管內(nèi)皮表面的粘附起著關(guān)鍵的作用。
研究PSGL-1向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號的通路及其機(jī)制，可以找到新的與炎癥性疾病和血 栓性疾病等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的介質(zhì)和分子靶標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人對P-選擇素與其配基PSGL-1結(jié)合后的信號傳導(dǎo)機(jī)制和體內(nèi)功能進(jìn) 行了研究，研究結(jié)果顯示
1、 磷脂酰肌醇3位激酶(PI3K)參與了該活化過程中的信號通路，PSGL-l結(jié)合P-選擇素后，可使PI3K的p85亞基結(jié)合到PSGL-l的胞內(nèi)區(qū)上，并能增強(qiáng)PI3K的激酶活 性；
2、 Nafl和PSGL-1胞內(nèi)區(qū)結(jié)合后，酪氨酸激酶Src在P-選擇素作用下被活化，進(jìn)而 磷酸化Nafl ，聚集PI3K的p85亞基結(jié)合到Nafl上；
3、 Nafl可作為轉(zhuǎn)接蛋白，連接PSGL-1的胞內(nèi)區(qū)和PI3K的p85亞基。
由于，P-選擇素介導(dǎo)的血小板與內(nèi)皮細(xì)胞間，以及這些細(xì)胞與白細(xì)胞之間的細(xì)胞黏 附，是炎癥和血栓形成病理生理過程中的基本現(xiàn)象和共同過程。通過各種途徑和藥物抑 制和調(diào)節(jié)P-選擇素及其介導(dǎo)的細(xì)胞黏附與作用，已證明可成為炎癥和血栓性疾病的有效 防治手段。同時，抗黏附治療作為一種防治手段，具有良好的臨床應(yīng)用價值和前景。而 且，p2整合素的活化對于炎癥及血栓性疾病中白細(xì)胞在血管內(nèi)皮表面的粘附起著關(guān)鍵的 作用。
因此，本發(fā)明的發(fā)明人根據(jù)上述研究結(jié)果，設(shè)計(jì)了一種能抑制P-選凝素引起的e2 整合素的活化的肽段PSGL-1胞內(nèi)區(qū)肽段，并驗(yàn)證了該肽段的功能，確定該肽段能阻斷 P-選擇素活化P2整合素，從而可進(jìn)一步用于炎癥及血栓性疾病藥物。
本發(fā)明的一個目的在于，提供蛋白Nafl和PSGL-1作為靶標(biāo)用于篩選治療炎癥和/ 或血栓性疾病的藥物以及用作炎癥和/或血栓性疾病藥物的藥物靶標(biāo)的用途。本發(fā)明的另一目的在于，提供蛋白Nafl和/或PSGL-l的一種特異性抗體以及一種含 有蛋白Nafl和/或PSGL-l的特異性抗體的、用于治療炎癥和/或血栓性疾病的藥物。
本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種以蛋白Nafl和/或PSGL-l為藥物靶標(biāo)的、用于 治療炎癥和/或血栓性疾病的藥物。
本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種能阻斷Nafl和PSGL-l的胞內(nèi)區(qū)結(jié)合的肽段以 及上述肽段用于炎癥和/或血栓性疾病藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種源于Nafl第17個外顯子的多肽。
本發(fā)明對P-選擇素與其配基PSGL-1結(jié)合后的信號傳導(dǎo)機(jī)制和體內(nèi)功能進(jìn)行了研究， 針對該信號傳導(dǎo)通路，可以Nafl和/或PSGL-l為靶標(biāo)，開發(fā)用于炎癥及血栓性疾病的藥 物；Nafl或PSGL-1的特異性抗體，以及含有所述特異性抗體的用于炎癥及血栓性疾病 的藥物；提供的肽段Tat-PSGL-l在阻斷Nafl和PSGL-1的結(jié)合的同時，還能減弱白細(xì)胞 的粘附，并能抑制體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，從而為免疫損傷、炎癥、血栓形成及腫瘤轉(zhuǎn)移等疾 病的治療提供新的方法。


圖1顯示Nafla和PSGL-l胞內(nèi)區(qū)在酵母Y190中的相互結(jié)合。其中，圖1A為(3-半 乳糖苷酶報(bào)告基因結(jié)果；圖1B為His報(bào)告基因的結(jié)果。
圖2顯示酵母雙雜交篩選得到NaflcDNA，制備Nafl抗體。
其中，圖2A為Nafl基因的氨基酸序列及構(gòu)建的酵母雙雜交"誘餌"(bait)簡圖； 圖2B為抗Nafl多抗的Western免疫印跡結(jié)果，分別檢測HL-60裂解液、中性粒白細(xì)胞 裂解液和轉(zhuǎn)染pCMV-Nafl的293裂解液，同時用抗c-myc的單抗9E10檢測轉(zhuǎn)染 pCMV-Nafl的293裂解液認(rèn)識同樣大小的條帶，證明該多抗特異識別Nafl 。
圖3顯示Nafl和PSGL-1胞內(nèi)區(qū)特異性結(jié)合，以及Nafl和PSGL-1相互結(jié)合的結(jié)合 位點(diǎn)。
其中圖3A為人中性粒細(xì)胞裂解液上清分別和預(yù)載有GST蛋白或融合蛋白 GST-Nafl的谷胱甘肽基質(zhì)(glutathione-s印harose)孵育的結(jié)果；圖3B為結(jié)合在谷胱甘 肽基質(zhì)上的融合蛋白GST-Nafl和GST蛋白洗脫后用考馬斯亮蘭染色定量的結(jié)果；圖3C 為293細(xì)胞共轉(zhuǎn)PSGL-1表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-PSGL-l和帶c-myc tag的Nafl表達(dá)質(zhì)粒 pCMV-Nafl或單轉(zhuǎn)pCMV-Nafl的結(jié)果；圖3D為HL-60細(xì)胞的裂解上清分別用抗PSGL-1 多抗或兔免疫前IgG做免疫共沉淀的結(jié)果；圖3E為HL-60細(xì)胞分別用人IgG或P-Rg刺激的結(jié)果；圖3F為PSGL-1胞內(nèi)區(qū)及缺失突變體的氨基酸序列簡圖；圖3G為293細(xì)胞 共轉(zhuǎn)PSGL-1缺失突變體和Nafl的結(jié)果；圖3H為PSLG-1胞內(nèi)區(qū)點(diǎn)突變示意圖，黑體 氨基酸(R、 N、 Y、 S、 P、 T、 E)被突變?yōu)楸彼?A);圖31為93細(xì)胞共轉(zhuǎn)PSGL-1 缺失突變體和Nafl或PSGL-1野生型和Nafl的結(jié)果；圖3J為NaflC端缺失突變示意圖； 圖3K為NaflC端缺失突變和PSGL-1免疫共沉淀的結(jié)果。 圖4顯示Nafl介導(dǎo)PSGL-1和p85的結(jié)合。
其中，圖4A為293細(xì)胞共轉(zhuǎn)進(jìn)表達(dá)PSGL-1 ,p85和Nafl的載體或?qū)φ湛蛰d體pCMV 的結(jié)果；圖4B為293細(xì)胞共轉(zhuǎn)進(jìn)表達(dá)p85和Nafl的載體或?qū)φ湛蛰d體pCMV的結(jié)果； 圖4C為293細(xì)胞共轉(zhuǎn)進(jìn)表達(dá)p85和NaflY552F、 Nafl的載體或?qū)φ湛蛰d體pCMV的結(jié) 果；圖4D為293細(xì)胞共轉(zhuǎn)進(jìn)表達(dá)PSGL-1， p85和Nafl或NaflY552F的載體或?qū)φ湛?載體pCMV的結(jié)果。
圖5顯示PSGL-l/Nafl/p85在人中性粒細(xì)胞中形成復(fù)合物，P-Rg剌激能活化Src，進(jìn) 而磷酸化Nafl并增強(qiáng)PI3K激酶活性的結(jié)果。
其中，圖5A為人中性粒細(xì)胞分別和對照緩沖液PBS (-)， 10嗎/ml的人IgG (hlgG) 或P-selectinRg (P-Rg)孵育20分鐘后，免疫印跡檢測結(jié)果；圖5B為用人IgG (hlgG) 或P-selectinRg (P-Rg)刺激人中性粒細(xì)胞后，用3B8免疫檢測的結(jié)果；圖5C為抗PSGL-1 多抗或免疫前兔IgG從人中性粒白細(xì)胞的細(xì)胞裂解液上清中免疫共沉淀PI3K，然后用免 疫沉淀物去催化底物磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol， PI)和32P標(biāo)記的ATP，后產(chǎn)物 放射自顯影圖，圖中箭頭標(biāo)記為PIP;圖5D為取斑點(diǎn)強(qiáng)度的相對值，將三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié) 果取平均值的結(jié)果；圖5E為白細(xì)胞和PP2， DMSO室溫孵育、裂解后，用Nafl抗體將Nafl 免疫沉淀后3B8和5C4的免疫檢測結(jié)果；圖5F為白細(xì)胞的處理同5E，其它實(shí)驗(yàn)同圖5A; 圖5G為白細(xì)胞刺激后直接裂解，裂解液分別用Src抗體和抗Src416位酪氨酸磷酸化抗 體免疫檢測的結(jié)果。
圖6顯示P-selectin通過Nafl和p85通路活化ocmP2整合素的結(jié)果。
其中，圖6A為人中性粒白細(xì)胞或HL-60細(xì)胞的粘附細(xì)胞檢測結(jié)果；圖6B為用退火 的Sl和S4電轉(zhuǎn)HL-60細(xì)胞后，抗Nafl多抗免疫印跡檢測結(jié)果；圖6C為轉(zhuǎn)染Sl和S4 的HL-60細(xì)胞的免疫共沉淀檢測PSGL-1和p85的結(jié)合的結(jié)果；圖6D為轉(zhuǎn)染Sl和S4 的HL-60細(xì)胞的細(xì)胞粘附結(jié)果。
圖7顯示突變體NaflY552F阻斷PSGL-1和p85的結(jié)合并阻斷P-選擇素活化aMp2 整合素的信號通路的結(jié)果。其中，圖7A為帶有NaflY552F或LacZ基因的病毒顆粒感染HL-60后，用抗Nafl 抗體免疫檢測的結(jié)果；圖7B為帶有NaflY552F或LacZ基因的病毒顆粒感染HL-60后， 免疫共沉淀檢測PSGL-1和p85的結(jié)合的結(jié)果；圖7C為帶有NaflY552F或LacZ基因的 病毒顆粒感染HL-60后，細(xì)胞粘附檢測結(jié)果。
圖8顯示PSGL-1胞內(nèi)區(qū)Tat融合多肽被細(xì)胞吞噬，并阻斷PSGL-1和Nafl的結(jié)合 的結(jié)果。
其中，圖8A為所構(gòu)建的融合多肽示意圖；圖8B為標(biāo)記FITC的融合多肽用和小鼠 中性粒細(xì)胞孵育后，共聚焦顯微鏡結(jié)果；圖8C和D為將結(jié)合有融合多肽的Ni beads和 人(C)或小鼠(D)中性粒細(xì)胞裂解液孵育，結(jié)合下來的Nafl用Nafl多抗Western免 疫檢測的結(jié)果；圖8E為將融合多肽加到人中性粒白細(xì)胞裂解液中，用Western檢測的結(jié) 果。
圖9為PSGL-1胞內(nèi)區(qū)肽段在體外和體內(nèi)阻斷P-選擇素活化整合素的示意圖。 其中，圖9A為人中性粒白細(xì)胞分別和融合肽段孵育30分鐘后，用hlgG和P-Rg剌 激的粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖9B為用小鼠的中性粒白細(xì)胞和小鼠fibrinogen重復(fù)A的結(jié)果的示 意圖；圖9C為人中性粒白細(xì)胞分別和融合肽段或抗體孵育后，用hlgG和P-Rg刺激的 粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖9D為小鼠預(yù)先被靜脈注射入相關(guān)試劑后，顯微觀察提睪肌上微血管中 的滾動和粘附白細(xì)胞的結(jié)果；圖9E為小鼠預(yù)先被靜脈注射入相關(guān)試劑后，急性腹膜炎實(shí) 驗(yàn)結(jié)果。
圖10為HL-60細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)病毒后，用流式細(xì)胞儀結(jié)合相應(yīng)抗體或P-Rg分別檢測 (XM亞基(A)， PSGL-1 (B)的表達(dá)和P-Rg的結(jié)合(C)的結(jié)果。
圖11為分離小鼠中性粒白細(xì)胞，和肽段孵育后，用流式細(xì)胞儀結(jié)合相應(yīng)抗體或小鼠 P-Rg分別檢測ocM亞基(A)， PSGL-1 (B)的表達(dá)和小鼠P-Rg的結(jié)合(C)的結(jié)果。
圖12為抑制HL-60細(xì)胞內(nèi)源的Nafl表達(dá)不影響細(xì)胞表面的PSGL-1和aM亞基的表 達(dá)以及P-Rg和PSGL-1的結(jié)合的結(jié)果。
其中，圖12A為電轉(zhuǎn)S1或S4的HL-60細(xì)胞用抗otM亞基的抗體44a孵育的結(jié)果， 對照用小鼠IgG;圖12B為用兔IgG做對照，流式細(xì)胞儀測細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度的結(jié)果； 圖12C為用人IgG做對照，將P-Rg和電轉(zhuǎn)后的HL-60細(xì)胞孵育后，用流式細(xì)胞儀測細(xì) 胞表面熒光強(qiáng)度的結(jié)果。
圖13為P-選凝素對P-選凝素敲除小鼠中的深靜脈血栓的作用的示意圖，其中，C57 為直接結(jié)扎C57小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，PKO為直接結(jié)扎P-sdectinKO鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，mP-Rg為P-selectin KO鼠靜脈注射小鼠P-Rg的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，12CA5為P-selectin KO鼠靜脈注射 12CA5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，*表示卩<0.05，"表示pO.Ol。
圖14為體內(nèi)注射Tat-PSGL-l抑制小鼠深靜脈血栓的結(jié)果，其中，分別以體內(nèi)注射 Tat-PSGL-l Mut或生理鹽水的小鼠為對照。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南(第三版)》(J.薩姆布魯克等著，2003)中所述的條件和方法進(jìn)行。
本發(fā)明中使用的材料
人胚腎轉(zhuǎn)化細(xì)胞株293 (CRL-1573)和293T、原髓樣白血病細(xì)胞株HL-60 (CRL-240) 均購自美國組織培養(yǎng)采集中心(ATCC)。以上細(xì)胞株分別用添加10n/。滅活胎牛血清、4mM L-谷氨酰胺、100單位/ml青霉素和100pg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液(293和293T細(xì)胞) 或RPMI-1640培養(yǎng)液(HL-60細(xì)胞)，在37'C下5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
抗人a-Tubulin單抗anti-a-Tubulin (clone B 5-1-2)、人和鼠IgG均購自Sigma公司 (St. Louis, MO)。 KPL-1 (抗PSGL-1單抗)，CBRM1/5 (ocM亞基的阻斷性單抗)，2PH1 (小鼠PSGL-1的阻斷性單抗)，Ml/70 (小鼠Mac-1的阻斷性單抗)，M17/4 (小鼠LFA-1 的阻斷性單抗)，RB40.34 (小鼠P-selectin的阻斷性單抗)和亞型對照抗體購自BD Pharmingen公司(San Diego， CA)。單抗38購自Axxora公司(San Diego, CA)?？筽85 多抗購自Upstate公司(Lake Placid, NY)。 9E10 (抗c-myc單抗)，IB4 (p2亞基的阻斷 性單抗)，OKM1 (aM亞基的非阻斷性單抗)和44a (ocM亞基的阻斷性單抗)均購自美 國組織培養(yǎng)采集中心(ATCC)。人纖維蛋白原購自Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN), pCDNA3.1/Hygro載體購自Invi加gen公司，pCMV-Tag 3B載體購自Stratagene 公司，其它試劑購自Sigma公司。
蛋白12CA5(購自美國組織培養(yǎng)采集中心，ATCC)，為HA單抗，具有與小鼠P-Rg(mP-Rg) 同樣的Fc片段，在實(shí)驗(yàn)中可作為mP-Rg的對照。
人P-選擇素和受體球蛋白融合蛋白(P-selectin Rg ， P-Rg)、 Gl (P-選擇素向白細(xì)胞 粘附的阻斷性單抗)、PSl(P-選擇素向白細(xì)胞粘附的非阻斷性單抗)見文獻(xiàn)(MaL，Raycroft L， Asa D， Anderson DC, Geng J-G. J Biol Chem.1994; 269: 27739-27746; Geng J-GBevilacqua MP, Moore KL, et al. Nature. 1990;343:757-760.);免疫前兔IgG和抗人PSGL-1 肽段兔多抗的制備，釆用文獻(xiàn)(J.G., Raub T丄，Baker C. A.， Sawada G. A., Ma L., and EIhammer A. P. J Ce〃歷o/. 1997; 137: 743-754.)所述的方法；pCEP4F載體見文獻(xiàn)(Zhu X， Mancini M A， Chang K H， Liu C Y， Chen C F， Shan B, Jones D， Yang-Feng T L, Lee W H. Mol Cell Biol. 1995; 15: 5017-5029)。
在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，P-選凝素敲除小鼠(PKO，購自Jackson Laboratory)和 對照C57小鼠(購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心)，其余未具體提及的小鼠則購自中科院上 海實(shí)驗(yàn)動物中心，為SPF級詞養(yǎng)。pllOSD^^，A突變小鼠參見文獻(xiàn)(Okkenhaug K， Bilancio A, Farjot G Priddle H， Sancho S， PeskettE， Pearce ^V， Meek SE， Salpekar A， Waterfield MD, Smith AJ, Vanhaesebroeck B. Science. 2002; 297:1031-4)。
本發(fā)明中采用的的實(shí)驗(yàn)方法具體如下
1、 融合蛋白表達(dá)和抗體制備
參考Amersham Pharmacia Biotech的操作手冊《GST Gene Fusion System》，將酵母雙 雜交獲得的Nafl cDNA片段(編碼394-629位氨基酸)克隆進(jìn)載體pGEX-4T-2 (Amersham Pharmacia Biotech)，制備GST融合蛋白。
用構(gòu)建的GST融合蛋白作為免疫原免疫兔子，以制備抗Nafl的多抗，多抗的特異 性通過免疫印跡真核表達(dá)帶有c-myc-tag的Nafla得到確認(rèn)。
Nafl的特異性抗Y552位酪氨酸磷酸化單抗3B8和對照單抗5C4，通過將特定肽段 免疫小鼠制備，再通過ELISA方法篩選而獲得。
該過程中，所使用的肽段的氨基酸序列如下HLCGAYPYALIPPMPAMVPHH(其中， U為pY，即為磷酸化的酪氨酸)，而對照肽段與U對應(yīng)的氨基酸為未磷酸化的酪氨酸， 其序列如下HLCGAYPYAYPPMPAMVPHH。
2、 GST pull-down實(shí)驗(yàn)
分離人中性粒白細(xì)胞，分離方法參見文獻(xiàn)(Ma YQ，PlowEF，GengJG. Blood. 2004; 104:2549-2556);再將分離得到的人中性粒白細(xì)胞在冰浴的CHAPS裂解液(3%CHAPS， 20mMTris， pH7.4， 150mMNaCl， 0.1%BSA， lmMPMSF， 2ng/ml aprotinin， 2(xg/ml leupeptin， 1嗎/ml pepstaninA)中裂解l小時后，裂解物于12,000g， 4'C離心10分鐘，收
集裂解上清。于4'C條件下，取含有約107個白細(xì)胞的裂解上清，與l(Hil預(yù)載有等量的GST或GST融 合蛋白的glutathione-sepharose beads (Amersham Pharmacia Biotech公司)，共孵育4小時。
孵育后，將glutathione-sepharosebeads用清洗液(0,05% TritonX-100， 20mMTris， pH7.4， 150mMNaCl)清洗3遍后，以非還原lxSDS上樣緩沖液煮沸洗脫，然后通過Western
免疫印跡進(jìn)行檢測。
其中，所用的GST或GST融合蛋白，經(jīng)表達(dá)純化后通過CoomassieBlue染色進(jìn)行定量。
3、 免疫共沉淀和Westem免疫印跡法
293細(xì)胞通過磷酸鈣法(Chen C., and Okayama H.. Mol. Cell. Biol. 1987; 7: 2745-2752) 共轉(zhuǎn)染進(jìn)以下載體pCMV-Nafl載體，編碼PSGL-1野生型或突變型的載體或相應(yīng)的表 達(dá)載體。
轉(zhuǎn)染48小時后，細(xì)胞用冰浴的lxPBS洗滌，并在冰浴的裂解緩沖液(lX TritonX-100， 50mMHEPES， pH7.4， 150tnMNaCl， 0，5mMEGTA， 10%甘油(glycerol), lmMPMSF， 2嗎/ml aprotinin， 2pg/ml leupeptin， lng/ml pepstaninA，)(在有關(guān)磷酸化的實(shí)驗(yàn)中，該裂 解液中另外添加磷酸酶抑制劑10mMNaF和lmMNa3V04)中裂解1小時，再將裂解物 于12,000g， 4 。C離心10分鐘，收集離心上清。上清與相應(yīng)抗體及protein A-sepharose beads (Amersham Pharmacia Biotech公司)，于4'C孵育6-8小時，然后用清洗緩沖液(0.05% TritonX-100, 20mMTris， pH7.4， 150mMNaCl)清洗3遍后，將免疫沉淀復(fù)合物或相應(yīng)的 細(xì)胞裂解液上清與還原性lxSDS上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘，經(jīng)由SDS-PAGE電泳后， 電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用相應(yīng)的一抗和HRP標(biāo)記的二抗去檢測，最后采用ECL化學(xué)發(fā)光 試劑盒(上海普飛生物技術(shù)有限公司)顯色。
4、 激酶活性測定
分離得到的人中性粒白細(xì)胞，在含2X胎牛血清的M199培養(yǎng)基中饑餓2個小時，再 用10嗎/ml的人IgG (hlgG)或P-selectin Rg (P-Rg)在22。C刺激15分鐘后，于裂解液 (配方同方法"免疫共沉淀和Western免疫印跡法"中所述)中裂解細(xì)胞，再用抗PSGL-l 多抗(對照用免疫前兔IgG)免疫共沉淀磷脂酰肌醇3位激酶(PI3Ks)， PI3K激酶的活 性測定參照文獻(xiàn)(Wallasch C., Weiss F.U., Niederfellner G., Jallal B., Issing W., and Ullrich A. EMBO.J. 1995; 14:4267-75)中的方法。5、 siRNA抑制實(shí)驗(yàn)
5.1、 HL-60的siRNA轉(zhuǎn)染
使用Amaxa公司的Nucleofector Device (program T-19)禾口 the Cell Line Specific Nucleofector Kit V (Amaxa, Cologne, Germany)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其中，退火dsRNAi oligonucleotides (購自Ambion, Austin, TX)的轉(zhuǎn)染濃度為lpM，其序列分別為 SI: 5，-GGAGAAUUCCCGGCUGAAGTT-3' /3' -TTCCUCUUAAGGGCCGACUUC-5，； S4: 5，-GCUUUUGGAAGAGUCCCAGTT-3， /3， -CTCGAAAACCUUCUCAGGGUC-5， 其中，S4能抑制內(nèi)源的Nafl表達(dá)，Sl作為對照則不能抑制內(nèi)源的Nafl表達(dá)。 轉(zhuǎn)染24小時后，收集細(xì)胞用于免疫共沉淀和Western免疫印跡、粘附實(shí)驗(yàn)和流式細(xì) 胞分析。
5.2、 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染
使用LIPOFECTAMINE 2000 Reagent(Invitrogen公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其中，退火dsRNAi oligonucleotides的轉(zhuǎn)染濃度為100 nM (其序列同5.1，分別為Sl和S4)。 轉(zhuǎn)染48小時后，收集細(xì)胞用于Western免疫印跡。
6、 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)
人中性粒白細(xì)胞或HL-60細(xì)胞在加或不加化合物(用DMSO作對照)的情況下，用 10ng/mlhlgG或P-Rg刺激，然后將細(xì)胞加到預(yù)先鋪有血纖蛋白原(fibrinogen)的96孔 板中，于37。C， 5xco2培養(yǎng)箱中放置20min。
當(dāng)用抗體抑制時，取10嗎P-Rg先和20嗎的Gl F(ab，)2或者20嗎的PS1 F(ab，)2，在 30m1的pbs緩沖液(IxPBS, lmM CaCl2, 1 mM MgCl2)室溫放置15分鐘，然后加到人 中性粒白細(xì)胞中；或者人中性粒白細(xì)胞預(yù)先和lOpg/ml的44a和其亞形相配抗體9E10孵 育。
當(dāng)用化合物抑制時，人中性粒白細(xì)胞中在用P-Rg刺激前先和0.1% DMSO， 25nM PP2， 150nM渥曼青霉素(Wortmannin)或10pM LY294002在室溫孵育5 min。細(xì)胞粘 附的操作參見文獻(xiàn)(MaYQ， PlowEF， Geng JG. Blood. 2004;104:2549-2556)所述的方法。
7、 流式細(xì)胞儀分析
收集HL-60細(xì)胞或轉(zhuǎn)染后的HL-60細(xì)胞，用lxPBS洗一遍后，重新懸浮于PBS緩 沖液(lxPBS， 0.5%BSA， lmM CaCl2 ， lmM MgCl2)，并加入10嗎/ml的P-Rg或2pg/ml13的相應(yīng)抗體；于4'C孵育1小時后，再用PBS緩沖液洗一遍后，再重新懸浮于PBS緩沖 液，加入2 pg/ml的相應(yīng)FITC標(biāo)記二抗；再于4'C孵育1小時，用PBS緩沖液洗一遍后 收集細(xì)胞重新懸浮于PBS緩沖液中，將細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀分析(BD公司的FACScan )。
8、 TAT融合蛋白表達(dá)與純化
PSGL-1的胞內(nèi)區(qū)以人PSGL-1全長cDNA為模板，以下述引物對作為引物，PCR擴(kuò) 增獲得，其中，所用引物對的序列分別為
5'-CTTATAATAGGATCCCGCCTCTCCCGCAAGGGCC-3'; 5'-TGGACCTGCAAGCTTCTAAGGGAGGAAGCTGTGC-3'; 人PSGL-1全長cDNA如SEQ ID NO: 2所示。
將獲得的PCR產(chǎn)物，用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，并克隆到預(yù)先用BamHI和 HindIII雙酶切了的pET30a ( + )載體(Novagen)中，構(gòu)建的載體用來表達(dá)具有6xHis 的融合PSGL-1胞內(nèi)區(qū)肽段(PSGL-I P)， PSGL-1 P具有如SEQ ID NO: 4所示的氨基 酸序列。
參照產(chǎn)品說明書，使用MutanBEST Kit (TaKaRa〉將Tat序列(YGRKKRRQRRR) 插進(jìn)pET30a (+) -PSGL-l-tail，所用引物對的序列分別為
5'-AGACAGCGACGAAGAGACGACAAGGCCATGGCTGATA-3';
5'-CCGCTTCTTCCTGCCATACACCAGACCAGAAGAATGATGA-3';
所構(gòu)建的載體被用來表達(dá)Tat和6xHis融合的PSGL-1胞內(nèi)區(qū)(Tat-PSGL-1 )， Tat-PSGL-l具有如SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。
Tat和6xHis融合的PSGL-1胞內(nèi)區(qū)突變體(Tat-PSGL-1 Mut)(其中，R345A， N346A， Y347A, P349A為突變位點(diǎn))也是用MutanBEST Kit (TaKaRa)構(gòu)建，所用引物對的序 列分別為
5'陽GCTGCTGCCTCCGCCACCGAGATGGTCTGCATCTCA-3'; 5'國CACGGGGTACATGTGGCCCTTGCGGGAGAGGCG-3'。 Tat-PSGL-l Mut具有具有如SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。
所構(gòu)建載體通過測序驗(yàn)證，以確保構(gòu)建結(jié)果正確。融合多肽的表達(dá)和純化依據(jù)BD公司操作手冊(BD TALON Metal Affinity Resins User Manual)禾卩文獻(xiàn)(Franken K.L., H.S. Hiemstra， K.E. Van Meijgaarden， Y. Subronto, J. Den Hartigh, T.H. Ottenhoff, and J.W. Drijfhout. J.Exp.Med. 2003; 197:63—75)中的方法進(jìn) 行。
采用共聚焦顯微技術(shù)，檢測融合多肽被細(xì)胞吸收情況。分離的小鼠中性粒白細(xì)胞和 FITC標(biāo)記的PSGL-1 P， Tat-PSGL-1或Tat-PSGL-1 Mut在37'C孵育30分鐘后，固定細(xì)胞， 立即用共聚焦顯微鏡分析。
9、 體內(nèi)顯微實(shí)驗(yàn)
雄性C57 (體重約為25克/只)，靜脈注射PBS或相應(yīng)抗體或蛋白，30分鐘后用 125mg/kg氯胺酮(ketamine)， 12.5mg/kg甲基噻嗪(xylazine)禾a 25嗎/kg硫酸阿托品 (atropine sulfate)麻醉，放于37'C的保溫板上，并將其提睪肌剝出拉開，用別針固定， 然后用倒置顯微鏡(CK40-F200, Olympus)觀察(20x物鏡，10x目鏡)。觀測方法如下
選擇直徑為20—4(Him的微靜脈觀察。將比血液中紅細(xì)胞流動速度慢的滾動的白細(xì) 胞定義為"滾動的白細(xì)胞"，10分鐘內(nèi)觀察視野內(nèi)所有的滾動細(xì)胞數(shù)除以10得到每個老 鼠每分鐘的平均滾動白細(xì)胞數(shù)。
將粘住超過30秒的白細(xì)胞定義為"粘附白細(xì)胞"，計(jì)數(shù)10分鐘內(nèi)在約15(Hirn長度 的血管上粘附的細(xì)胞總數(shù)。
每只老鼠計(jì)數(shù)3 — 5個視野。
10、 小鼠急性腹膜炎模型構(gòu)建
Balb/c小鼠(6—8周，20g體重)用lml 3%巰基乙酸培養(yǎng)基或生理鹽水(模型對照) 腹腔注射小鼠誘導(dǎo)急性腹膜炎，2小時后處死小鼠，然后，按照文獻(xiàn)(YangK.K.,Dorner B.G.， Merkel U., Ryffel B.， Schutt C.， Golenbock D., Freeman M.W., and Jack R.S. mice丄Immunol. 2002, 169: 4475—4480; Ajuebor M.N., Gibbs L., Flower R丄，Das A.M., and PerrettiM. Br.J.Pharmacol. 1998,125:319—326)報(bào)道的方法，計(jì)數(shù)腹腔中滲出的白細(xì)胞總 數(shù)。
在肽段抑制或抗體對照實(shí)驗(yàn)中，在注射巰基乙酸前30分鐘，采用尾靜脈注射方式， 對實(shí)驗(yàn)小鼠注射肽段(30pg/只)或抗體U(Hig/只)，鼠P-Rg (20嗎/只)。實(shí)施例l、酵母雙雜交篩選與人PSGL-1胞內(nèi)區(qū)結(jié)合的細(xì)胞內(nèi)蛋白
參考Clontech公司的操作手冊，將編碼PSGL-1的胞內(nèi)區(qū)334—402位氨基酸(序列
如SEQ ID NO: 3所示)的cDNA片段克隆進(jìn)載體pAS2-l (Clontech公司)，構(gòu)建重組質(zhì)
粒pAS2-l-PSGL-lCT。
以該胞內(nèi)區(qū)與GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白作為誘餌，應(yīng)用Clontech公司的
酵母雙雜交系統(tǒng)(Matchmaker Two-Hybrid System),篩選人的白細(xì)胞cDNA文庫，獲得
與人PSGL-1胞內(nèi)區(qū)結(jié)合的細(xì)胞內(nèi)蛋白。
根據(jù)激活P-半乳糖苷酶報(bào)告基因和His報(bào)告基因的結(jié)果，得到了一些陽性克隆，然 后對上述獲得的這些陽性克隆進(jìn)行測序分析。根據(jù)測序結(jié)果，其中一個克隆具有編碼Nafl 蛋白的部分序列。
又利用酵母Y190的上述報(bào)告基因共轉(zhuǎn)空載體和無關(guān)蛋白作對照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1 所示。
根據(jù)圖1的結(jié)果，Nafl和PSGL-1具有特異作用。 實(shí)施例2、制備Nafl
以Human Leokocyte MATCHMAKER cDNA Library文庫(Clontech)作為模板，以 Nafl forward和Nafl reverse作為引物，通過PCR制備全長Nafl cDNA序列。 引物Nafl forward和Nafl reverse的序列如下
Nafl forward: 5，-TTACGGATCCATGGAAGGGAGAGGACCGTAC-3，； Nafl reverse: 5，- CGCCAAGCTTAAATGACACAATCTGGTCTCACTG-3';
將獲得的PCR產(chǎn)物以BamHI和HindIII雙酶切，然后聯(lián)接到同樣經(jīng)BamHI和HindIII 雙酶切的pCMV-Tag 3B (Stratagene)載體，構(gòu)建成帶c-myc-tag的Nafl真核表達(dá)載體 pCMV-Nafl 。
通過測序，確認(rèn)Nafl cDNA序列沒有發(fā)生突變。
將全長Nafl cDNA序列(序列為SEQIDNO: 1)連接入pCEP4F載體，構(gòu)建成真 核表達(dá)載體pCEP4F-Nafl 。
我們用細(xì)菌表達(dá)了Nafl全長和His-tag融合蛋白，然后，用該蛋白做抗原免疫兔子， 得到了抗Nafl多抗，用該多抗檢測了 HL-60細(xì)胞和轉(zhuǎn)染Nafl (帶c-myc)的293細(xì)胞裂解液，同時用抗c-myc的單抗9E10同時檢測轉(zhuǎn)染Nafl的293細(xì)胞裂解液，結(jié)果如圖2B 所示。
根據(jù)圖2B的結(jié)果，該抗體特異識別轉(zhuǎn)染Nafl， HL-60細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)Nafl，同時用 該多抗檢測人中性粒細(xì)胞裂解液，也能測到人中性粒細(xì)胞表達(dá)Nafl。
我們將克隆到的Nafl在293細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行了表達(dá)，先用抗FLAG抗體將蛋白從細(xì)胞裂 解液中免疫沉淀下來，然后用抗Nafl多抗免疫印跡檢測免疫沉淀得到的蛋白，結(jié)果見圖 2C。
根據(jù)圖2C的結(jié)果，蛋白Nafl能在293細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，在還原條件下，Nafl約為80kDa。
實(shí)施例3、 Nafl的功能
3.1、 Nafl和PSGL-1的結(jié)合位點(diǎn)
3丄1、 Nafl和PSGL-1胞內(nèi)區(qū)的結(jié)合具有特異性
利用含有Nafl序列的GST融合蛋白進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖3A、 3B。根據(jù) 圖3A、 3B的結(jié)果，結(jié)合GST-Nafl的beads能從白細(xì)胞裂解物中將PSGL-1結(jié)合下來， 而對照GST蛋白這不能。
該結(jié)果顯示Nafl和PSGL-1胞內(nèi)區(qū)的結(jié)合具有特異性。 3丄2、 Nafl和PSGL-1胞內(nèi)區(qū)在瞬時表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞中能相互結(jié)合 在293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染表達(dá)PSGL-1和Nafl或只轉(zhuǎn)染表達(dá)Nafl ，用相應(yīng)抗體進(jìn)行免疫 共沉淀試驗(yàn)，其中共轉(zhuǎn)染表達(dá)PSGL-1和Nafl時，使用的抗體為兔IgG、 a-PSGL-l， 只轉(zhuǎn)染表達(dá)Nafl時，使用的抗體為a-PSGL-l、 9E10，結(jié)果如圖3C所示。
根據(jù)圖3C的結(jié)果，用抗PSGL-1的抗體能將Nafl免疫共沉淀下來，而對照抗體則 不能，只轉(zhuǎn)染Nafl的細(xì)胞用抗PSGL-1的抗體和9E10做免疫沉淀作為免疫共沉淀對照， 抗PSGL-1的抗體不能將Nafl從只轉(zhuǎn)染Nafl的細(xì)胞中免疫共沉淀下來。
以上結(jié)果證明Nafl和PSGL-1胞內(nèi)區(qū)在瞬時表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞中能相互結(jié)合。
3丄3、 Nafl和PSGL-1在正常生理狀態(tài)下的相互作用
制備HL-60細(xì)胞裂解提取物，然后將HL-60細(xì)胞裂解提取物分別用抗PSGL-1兔源 多抗和免疫前兔IgG做免疫沉淀并用Western分析，結(jié)果如圖3D所示。
根據(jù)圖3D的結(jié)果，抗PSGL-1多抗能將內(nèi)源的PSGL-1及內(nèi)源的Nafl免疫共沉淀 下來，而對照免疫前兔IgG則不能。進(jìn)一步，在用P-Rg刺激的條件下做免疫共沉淀，結(jié)果如圖3E所示。 根據(jù)圖3E的結(jié)果，Nafl和PSGL-1的結(jié)合不比人IgG對照增強(qiáng)。 上述結(jié)果說明，在正常生理?xiàng)l件下，Nafl和PSGL-l是能相互結(jié)合的。
3丄4、 PSGL-1胞內(nèi)區(qū)與Nafl的結(jié)合的序列
對PSGL-1的胞內(nèi)區(qū)進(jìn)行缺失突變，將PSGL-1胞內(nèi)區(qū)從C端向N端進(jìn)行缺失突變， 共構(gòu)建了五個缺失突變體(Ml， M2， M3， M4, M5)，結(jié)果如圖3F所示。
將這些缺失突變體和Nafl共轉(zhuǎn)染進(jìn)293細(xì)胞，然后進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖 3G所示。
根據(jù)圖3G的結(jié)果，Ml ， M2， M3能將Nafl免疫共沉淀結(jié)合下來，而M4和M5則 不能。
根據(jù)上述結(jié)果，可以推斷出PSGL-1胞內(nèi)區(qū)中345位到351位的RNYSPTE序列，對 PSGL-1和Nafl的結(jié)合是重要的。
3.1.5、 PSGL-1胞內(nèi)區(qū)與Nafl的結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)
進(jìn)一步對該序列進(jìn)行點(diǎn)突變，將345位到351位的七個氨基酸分別突變?yōu)楸彼幔?br> 構(gòu)建了七個點(diǎn)突變體，結(jié)果見圖3H所示。
然后，將點(diǎn)突變體和Nafl共轉(zhuǎn)染進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3I所示。 根據(jù)圖3I結(jié)果，突變體R345A， N346A， Y347A， P349A不能將Nafl免疫共沉淀
結(jié)合下來。
根據(jù)該結(jié)果，PSGL-1胞內(nèi)區(qū)345， 346， 347， 349位的氨基酸是PSGL-1和Nafl結(jié)
合的關(guān)鍵位點(diǎn)。
3丄6、 Nafl上對PSGL-1和Nafl結(jié)合關(guān)鍵的區(qū)段 對Nafl的C端進(jìn)行缺失突變，結(jié)果如圖3J所示。 這些缺失突變和PSGL-1免疫共沉淀的結(jié)果，結(jié)果如圖3K所示。 根據(jù)圖3K的結(jié)果，C3， C4,C5突變體不能被PSGL-1的多抗免疫共沉淀下來，該結(jié) 果顯示第17個外顯子對PSGL-1和Nafl結(jié)合起關(guān)鍵作用。3.2、 Nafl中介導(dǎo)PSGL-1和PI3K的p85亞基的結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域
3.2.1、 體夕卜Nafl介導(dǎo)PSGL-1和PI3K的p85亞基的結(jié)合
在293細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染進(jìn)表達(dá)PSGL-1 ， p85和Nafl的質(zhì)粒載體或相應(yīng)的對照空載 體pCMV， 48小時后裂解細(xì)胞。取細(xì)胞裂解液上清，分別用抗PSGL-1多抗或免疫前兔 IgG免疫共沉淀，沉淀物用抗p85多抗免疫印跡檢測，用KPL-1檢測免疫沉淀下來的 PSGL-1，同時用抗p85多抗免疫印跡檢測細(xì)胞裂解液上清中的p85作為對照，結(jié)果如圖 4A所示。
根據(jù)圖4A結(jié)果，在共轉(zhuǎn)染進(jìn)表達(dá)PSGL-1, p85和Nafl的質(zhì)粒載體的293細(xì)胞中， 抗PSGL-1多抗能將p85免疫沉淀下來，而對照免疫前兔IgG則不能；在轉(zhuǎn)染表達(dá)PSGL-1 ， p85和對照空載體pCMV的293細(xì)胞中，抗PSGL-1多抗則不能將p85免疫沉淀下來； 用KPL-1檢測，抗PSGL-1多抗能將PSGL-1免疫沉淀下來，而對照免疫前兔IgG則不 能。
另一方面，293細(xì)胞共轉(zhuǎn)染進(jìn)表達(dá)p85和Nafl的質(zhì)粒載體或相應(yīng)的對照空載體 pCMV，細(xì)胞裂解液上清用9E10或?qū)φ招∈驣gG做免疫共沉淀，免疫沉淀物分別用抗P85 多抗和9E10檢測，結(jié)果如圖4B所示。
根據(jù)圖4B的結(jié)果，9E10能將p85免疫沉淀下來，而對照小鼠IgG則不能。同時， 在共轉(zhuǎn)染進(jìn)表達(dá)p85和對照空載體pCMV的293細(xì)胞中，9E10則不能將p85免疫沉淀下 來。用9E10在9E10的免疫沉淀物中能檢測到Nafl,而對照小鼠IgG則不能將Nafl免 疫沉淀下來。細(xì)胞裂解液上清直接用抗p85多抗檢測p85的表達(dá)作為對照，各組間結(jié)果 無明顯差別。
以上結(jié)果直接證明了 Nafl能作為轉(zhuǎn)接蛋白，介導(dǎo)PSGL-1和PI3K的p85亞基的結(jié)合。
3.2.2、 Nafl中與p85的結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域
將Nafl第552位的酪氨酸(Y)突變?yōu)镕 (苯丙氨酸)，構(gòu)建Nafl的突變體，命名 為麵Y552F。
將該突變體和p85共轉(zhuǎn)染進(jìn)293，用免疫共沉淀去檢測，結(jié)果如圖4C所示。 根據(jù)圖4C的結(jié)果，Nafl第552位的突變使Nafl失去了和p85結(jié)合的能力。 再將突變體NaflY552F、 p85、 PSGL-1共轉(zhuǎn)染進(jìn)293細(xì)胞，用抗PSGL-1多抗去免 疫印跡檢測，結(jié)果見圖4D。根據(jù)圖4D的結(jié)果，第552位的突變使Nafl失去了作為轉(zhuǎn)接蛋白介導(dǎo)PSGL-1和p85 結(jié)合的能力。
NaflY552F突變體阻止了 552位Y的磷酸化，因而該位點(diǎn)的磷酸化對于Nafl與p85 的結(jié)合是關(guān)鍵的。
3.3、人的中性粒細(xì)胞中，Nafl第552位的酪氨酸磷酸化，誘導(dǎo)PSGL-1和PI3K的 p85的結(jié)合
3.3.1、 在人的中性粒細(xì)胞中，Nafl介導(dǎo)PSGL-1和p85的結(jié)合 分離人中性粒細(xì)胞后，分別將人中性粒細(xì)胞和對照緩沖液PBS (-) ，1(Vg/ml的人IgG
(hlgG)或P-selectinRg (P-Rg)在37。C孵育20分鐘，用細(xì)胞裂解液裂解。取細(xì)胞裂 解上清，用抗PSGL-1多抗免疫共沉淀，沉淀物用抗p85多抗免疫印跡檢測，結(jié)果見圖 5A。
根據(jù)圖5A的結(jié)果，p85只有從P-Rg刺激后的中性粒細(xì)胞中才能免疫共沉淀下來(從 圖中可看出結(jié)合下來的p85量不多，這和p85和細(xì)胞中很多蛋白都結(jié)合相一致)，而從加 PBS或人IgG的中性粒細(xì)胞中不能被免疫共沉淀下來?？筆SGL-1多抗免疫沉淀下來的 PSGL-1作為對照可以被KPL-1免疫印跡檢測到，細(xì)胞裂解上清直接用抗p85多抗免疫 印跡檢測作為對照。
在使用原髓樣白血病細(xì)胞株HL-60重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)時，能完全重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作為P-selectin配體的PSGL-l，和P-Rg結(jié)合后，傳遞活化信號 到細(xì)胞內(nèi)將PI3K的p85亞基聚集并結(jié)合到其胞內(nèi)區(qū)，也就是說P-selectin能在人中性粒 細(xì)胞中觸發(fā)PSGL-l/Nafl/p85復(fù)合物的形成，即在人的中性粒細(xì)胞中，Nafl作為轉(zhuǎn)接蛋 白介導(dǎo)PSGL-1和p85的結(jié)合。
3.3.2、 Nafl第552位的酪氨酸磷酸化，誘導(dǎo)PSGL-1和p85的結(jié)合 采用與實(shí)施例3.3.1相同的條件，分別用人IgG (hlgG)或P-selectin Rg (P-Rg)刺
激人中性粒細(xì)胞，再將細(xì)胞直接用還原性上樣緩沖液煮沸5分鐘，然后分別使用針對Nafl 第552酪氨酸磷酸化的特異性單抗3B8和對照單抗5C4進(jìn)行免疫檢測，結(jié)果如圖5B所 示。
根據(jù)圖5B的結(jié)果，Nafl第552位的酪氨酸磷酸化明顯增強(qiáng)。將人中性粒白細(xì)胞用人IgG或P-Rg刺激20分鐘后，用抗PSGL-1多抗或免疫前兔 IgG從細(xì)胞裂解液上清中去免疫共沉淀PI3K，然后去測免疫沉淀物的激酶活性，結(jié)果如 圖5C所示。
根據(jù)圖5C的結(jié)果，當(dāng)P-Rg刺激時，用抗PSGL-1多抗免疫沉淀下來的沉淀物的激 酶活性比用人IgG刺激時增強(qiáng)，即P-selectin能增強(qiáng)人中性粒白細(xì)胞中PI3K激酶的活性。
圖5D為根據(jù)圖5C的結(jié)果取三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均，標(biāo)準(zhǔn)偏差也同時標(biāo)出(用t-test 檢驗(yàn)，其中*表示p〈0.05)。
用Src激酶的特異抑制劑PP2先和細(xì)胞室溫孵育15分鐘，再用P-Rg刺激中性粒白 細(xì)胞10分鐘，對照用其溶劑DMSO，然后用Nafl的抗體將Nafl免疫沉淀下來。用抗 Nafl第552酪氨酸磷酸化的特異單抗3B8免疫檢測，同一張膜再用對照抗體5C4免疫檢 測，結(jié)果如圖5E所示。
根據(jù)圖5E的結(jié)果，PP2能抑制Nafl第552位酪氨酸的磷酸化。
白細(xì)胞同上處理，細(xì)胞裂解后，用抗PSGL-1多抗免疫共沉淀，沉淀物用抗p85多 抗免疫印跡檢測，結(jié)果如圖5F所示。
根據(jù)圖5F的結(jié)果，當(dāng)使用PP2抑制Nafl第552位酪氨酸的磷酸化時，同時也能抑 制P-selectin誘導(dǎo)的PSGL-1和p85亞基的結(jié)合。
白細(xì)胞刺激后直接裂解，裂解液分別用Src抗體和抗Src416位酪氨酸磷酸化抗體免 疫檢測(能識別中性粒白細(xì)胞中的Hck， Lyn的416酪氨酸磷酸化)，結(jié)果如圖5G所示。
根據(jù)圖5G的結(jié)果，P-Rg刺激能活化Src激酶。
上述實(shí)施例3.3中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人的中性粒細(xì)胞中，Nafl第552位的酪氨酸磷 酸化，誘導(dǎo)PSGL-1和PI3K的p85的結(jié)合。
實(shí)施例4、 P-selectin結(jié)合PSGL-l，通過Nafl活化p85，進(jìn)而活化otMP2整合素 4.1 、 PI3K參與從P- selectin到06[^2活化的信號通路
將P-Rg預(yù)先和GlF (ab') 2 (Gl是P-selectin向白細(xì)胞粘附的阻斷性單體)或PS1 F (ab，) 2 (PSl是P-selectin向白細(xì)胞粘附的非阻斷性單抗)在PBS緩沖液(lxPBS,lmM CaCl2, lmMMgCl2)室溫孵育15分鐘后，進(jìn)行細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)。
根據(jù)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Gl能中和P-selectinRg誘導(dǎo)的活化(白細(xì)胞的粘附增強(qiáng))， 而PSl則對P-sdectinRg誘導(dǎo)的活化沒影響，說明該活化是P-sdectinRg和PSGL-l結(jié)合特異 引導(dǎo)的。將人中性粒細(xì)胞預(yù)先和44a (44a是P2亞基的粘附阻斷性單抗)或9E10 (作為44a的亞 型對照抗體)在PBS緩沖液(lxPBS, lmMCaCl2, 1 mMMgCl2)室溫孵育15分鐘后，進(jìn) 行細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)。
根據(jù)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果，44a能阻斷人中性粒白細(xì)胞向固化的血纖蛋白原粘附的增
強(qiáng)，而9E10沒影響，證明(XMP2在該過程中具有特異性。
當(dāng)細(xì)胞預(yù)先和PI3K的特異性抑制劑wortmannin， LY294002和PP2孵育時，P-Rg誘導(dǎo) 的人中性粒白細(xì)胞向固化的血纖蛋白原的粘附增強(qiáng)被抑制，對照DMSO沒影響，說明PI3K 參與從P- sdectin到aMp2活化的信號通路。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6A所示。
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，P-selectinRg能增加人中性粒白細(xì)胞或HL-60向固化的血纖蛋白 原(fibrinogen)的粘附，而對照人IgG則不能。
4.2、 Nafl參與P-選擇素活化(XMP2整合素的信號通路
在HL-60細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染Sl和S4后，用相應(yīng)抗體對Nafl、 PSGL-1、 aM、 p85 和tubulin進(jìn)行免疫印跡檢測，結(jié)果如圖6B所示。
根據(jù)圖6B結(jié)果，當(dāng)內(nèi)源的Nafl表達(dá)被抑制下去時，PSGL-1， p85, ocM的表達(dá)不受 影響。
再用流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖12所示。
根據(jù)圖12結(jié)果，在內(nèi)源的Nafl表達(dá)被抑制下去時，HL-60細(xì)胞表面的PSGL-1和 ocM亞基的表達(dá)以及P-Rg和PSGL-l的結(jié)合不受影響。
同時，用Sl和S4在293T細(xì)胞中也得到了和在HL-60中同樣的抑制結(jié)果，結(jié)果如 圖6B所示。
在內(nèi)源的Nafl表達(dá)被抑制下去時，用免疫共沉淀檢測了 PSGL-1和p85亞基的結(jié)合 情況，結(jié)果如圖6C所示。
根據(jù)圖6C的結(jié)果，當(dāng)內(nèi)源的Nafl表達(dá)被抑制下去時，在P-Rg的刺激條件下，PSGL-1 和p85亞基的結(jié)合和對照相比明顯減弱，和圖4A的結(jié)果相一致，說明Nafl在PSGL-1 和p85亞基的結(jié)合中起轉(zhuǎn)接蛋白的作用。
在HL-60細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染Sl和S4，再分別不刺激、P-Rg刺激和hlgG刺激的情況 下，進(jìn)行細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖6D所示。根據(jù)圖6D的結(jié)果，當(dāng)HL-60細(xì)胞中的內(nèi)源性Nafl被轉(zhuǎn)染S4抑制下去時，P-Rg刺
激不能活化0CmP2，而轉(zhuǎn)染對照S1的細(xì)胞則不受影響。
將S4和Nafl表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HL-60后，再進(jìn)行細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果顯示，相對于單轉(zhuǎn)S4抑制Nafl后，粘附細(xì)胞數(shù)有一定程度的恢復(fù)增加。 綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出了以下結(jié)論Nafl作為轉(zhuǎn)接蛋白介導(dǎo)PSGL-1和p85亞基的
結(jié)合，傳遞了從PSGL-1到p85的細(xì)胞內(nèi)活化信號，在P-選擇素活化ocMP2整合素的信號
通路中起重要作用。
實(shí)施例5、 Nafl第552位酪氨酸的磷酸化對其傳遞P-選擇素活化aM(32整合素的信號 起關(guān)鍵作用
參考操作手冊，使用ViraPower lentiviral expression systems (invi加gen公司)，將突 變體NaflY552F構(gòu)建成病毒顆粒，同時構(gòu)建帶LacZ基因的病毒顆粒做為對照。將帶 Nafl Y552F的病毒顆粒感染HL-60細(xì)胞，并檢測了其表達(dá)，結(jié)果如圖7A所示。
根據(jù)圖7A的結(jié)果，PSGL-1， p85,ctM的表達(dá)不受NaflY552F過表達(dá)的影響。
并用流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖10所示。
根據(jù)圖10的結(jié)果，當(dāng)NaflY552F過表達(dá)時，HL-60細(xì)胞表面的PSGL-1和ctM亞基 的表達(dá)以及P-Rg和PSGL-1的結(jié)合不受影響。
當(dāng)在HL-60細(xì)胞中過表達(dá)NaflY552F時，用免疫共沉淀檢測了 PSGL-1和p85的結(jié) 合情況，結(jié)果如圖7B所示。
根據(jù)圖7B的結(jié)果，過表達(dá)的NaflY552F，能阻斷PSGL-1和p85的結(jié)合。該結(jié)果說 明，突變體NaflYS5SF具有顯性失活(dominant-negative)作用。
再用細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)NaflY552F的HL-60細(xì)胞上ocmP2整合素的活化情況， 結(jié)果如圖7C所示。
根據(jù)圖7C的結(jié)構(gòu)，過表達(dá)NaflY552F的細(xì)胞，P-Rg刺激不能增加細(xì)胞向鋪有 fibrinogen的板上的粘附，過表達(dá)LacZ基因的HL-60細(xì)胞和正常細(xì)胞一樣。該結(jié)果說明， 過表達(dá)NaflY552F時，阻斷了 P-選擇素活化aM(32整合素的信號通路。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明突變體NaflY552F能阻斷&選擇素活化0^(32整合素的信號通路， Nafl第552位酪氨酸的磷酸化在該通路中起關(guān)鍵作用。綜合實(shí)施例l-5的結(jié)果，揭示了一條新的信號通路P-選凝素結(jié)合PSGL-1引起02 整合素的活化。PSGL-1向胞內(nèi)傳遞信號依賴其胞內(nèi)區(qū)和Nafl的組成性結(jié)合，P-選凝素 結(jié)合其配體PSGL-1后活化Src激酶，Src激酶磷酸化Nafl YPPM結(jié)構(gòu)域上第552位的酪 氨酸，磷酸化后的YPPM結(jié)構(gòu)域能結(jié)合PI3K的p85亞基，通過PI3K最終從內(nèi)到外傳遞 信號使整合素ocm(32和aU32使處于活化狀態(tài)。
由于，P-選擇素介導(dǎo)的血小板與內(nèi)皮細(xì)胞間，以及這些細(xì)胞與白細(xì)胞之間的細(xì)胞黏 附，是炎癥和血栓形成病理生理過程中的基本現(xiàn)象和共同過程。通過各種途徑和藥物抑 制和調(diào)節(jié)P-選擇素及其介導(dǎo)的細(xì)胞黏附與作用，已證明可成為炎癥和血栓性疾病的有效 防治手段。同時，抗黏附治療不失為一種防治手段，具有良好的臨床應(yīng)用價值和前景。 而且，(i2整合素的活化對于炎癥及血栓性疾病中白細(xì)胞在血管內(nèi)皮表面的粘附起著關(guān)鍵 的作用。因此，根據(jù)實(shí)施例l一5的結(jié)果，可將蛋白Nafl和PSGL-1作為靶標(biāo)用于篩選 治療炎癥和/或血栓性疾病的藥物以及用作炎癥和/或血栓性疾病藥物的藥物耙標(biāo)，篩選特 異性抗體以及含有蛋白Nafl和/或PSGL-1的特異性抗體的、用于治療炎癥和/或血栓性 疾病的藥物，和以蛋白Nafl和/或PSGL-l為藥物靶標(biāo)的、用于治療炎癥和/或血栓性疾 病的藥物。
針對Nafl和域PSGL-1設(shè)計(jì)肽段阻斷此信號通路，很可能可以抑制P-選凝素引起的 P2整合素的活化。以下實(shí)驗(yàn)即對該設(shè)想進(jìn)行了驗(yàn)證。
實(shí)施例6、 PSGL-1胞內(nèi)區(qū)肽段的構(gòu)建和表達(dá)
表達(dá)并純化了 PSGL-1胞內(nèi)區(qū)的6xHis融合多肽(PSGL-1 P)，帶有HIV病毒Tat序 列的胞內(nèi)區(qū)融合多肽(Tat-PSGL-1)和帶有R345A，N346A,Y347A,P349A突變的胞內(nèi)區(qū) 融合多肽(Tat-PSGL-1 Mut)，上述多肽的示意圖見圖8A。
將上述多肽標(biāo)記FITC，然后和分離的小鼠中性粒白細(xì)胞孵育，用共聚交顯微鏡觀察， 結(jié)果如圖8B所示。
根據(jù)圖8B的結(jié)果，細(xì)胞能將帶有Tat序列的融合多肽吞進(jìn)細(xì)胞。
再用上述多肽分別結(jié)合人和小鼠中性粒白細(xì)胞裂解液中的Nafl，結(jié)果如圖8C， 8D， 8E所示。
根據(jù)圖8C， 8D的結(jié)果，PSGL-1 P和Tat-PSGL-l能將Nafl結(jié)合下來，而突變體 Tat-PSGL-l Mut則不能。根據(jù)圖8E的結(jié)果，和Tat-PSGL-l Mut相比，PSGL-1 P和 Tat-PSGL-l還能競爭白細(xì)胞裂解液中內(nèi)源性的PSGL-1和Naf 1的結(jié)合。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，表達(dá)的融合多肽Tat-PSGL-l具有進(jìn)入細(xì)胞并結(jié)合Nafl的功能。實(shí)施例7、 PSGL-1胞內(nèi)區(qū)肽段能在體外阻斷P-選擇素活化(32整合素
將上述肽段(PSGL-1 P、 Tat-PSGL-l和Tat-PSGL-l Mut)和分離的白細(xì)胞預(yù)先孵育， 然后進(jìn)行細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖9A所示。
根據(jù)圖9A的結(jié)果，Tat-PSGL-l能明顯抑制P-Rg誘導(dǎo)的人中性粒白細(xì)胞向fibrinogen 板上的粘附，而PSGL-1 P因不能進(jìn)細(xì)胞而沒有抑制作用，Tat-PSGL-l Mut雖然能進(jìn)細(xì) 胞，但不能阻斷內(nèi)源PSGL-1和Nafl的結(jié)合而沒有抑制作用。
在小鼠中性粒白細(xì)胞和小鼠fibrinogen的板上重復(fù)了上述實(shí)驗(yàn)，均獲得了同樣的結(jié) 果，如圖9B所示。
做為對照，多肽和細(xì)胞的孵育并不影響小鼠中性粒白細(xì)胞表面PSGL-1和otM亞基的 表達(dá)以及鼠P-Rg和PSGL-l的結(jié)合，結(jié)果如圖11A， B， C所示。
根據(jù)圖11A， B， C的結(jié)果，P-Rg刺激能增強(qiáng)人中性粒白細(xì)胞向ICAM-l板的粘附， 而這種增強(qiáng)能被p2亞基的阻斷抗體IB4完全阻斷，ocm和(^的阻斷抗體CBRM1/5和38 都只能部分阻斷，當(dāng)兩種抗體共同作用時，才能完全阻斷，而抗體亞型對照沒有任何影 響。以上結(jié)果說明，P-Rg對(xm(32和aU32這兩種整合素都能活化。
Tat-PSGL-l能完全抑制P-Rg誘導(dǎo)的人中性粒白細(xì)胞向ICAM-1板上的粘附，而對照 PSGL-1 P和Tat-PSGL-l Mut則沒有影響，以上結(jié)果如圖9C所示。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示PSGL-l信號通路對(XMp2和ocU32的活化都起作用。
實(shí)施例8、 PSGL-1胞內(nèi)區(qū)肽段能在體內(nèi)阻斷P-選擇素活化(32整合素
將PSGL-1胞內(nèi)區(qū)融合多肽預(yù)先靜脈注射入小鼠體內(nèi)，30分鐘后觀察因手術(shù)引起的
白細(xì)胞在血管壁上的滾動和粘附，以(xm和aL的阻斷抗體Ml/70和M17/4作為對照，結(jié)
果如圖9D所示。
根據(jù)圖9D的結(jié)果，和對照小鼠相比，融合多肽不影響白細(xì)胞的滾動，而Tat-PSGL-l 能明顯減少血管壁上粘附的白細(xì)胞數(shù)，PSGL-1 P和突變體Tat-PSGL-l Mut則不影響粘 附的白細(xì)胞。ocm和ocl的阻斷抗體M1/70和M17/4不影響白細(xì)胞滾動，對粘附有一定影 響，兩者結(jié)合抑制效果較明顯，小鼠P-selectin的阻斷性單抗RB40.34對滾動和粘附都有 明顯抑制作用，亞型對照抗體則沒有作用。
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，手術(shù)造成的白細(xì)胞的滾動和粘附是依賴于P-selectin的，而且除 可介導(dǎo)白細(xì)胞滾動的功能外，PSGL-l還可以介導(dǎo)信號通路，從而活化整合素，因而在體 內(nèi)具有重要功能。^Mii、在小鼠急性腹膜炎模型中PSGL-1胞內(nèi)區(qū)肽段能在體內(nèi)阻斷P-選擇素活化
P2整合素
進(jìn)行小鼠急性腹膜炎模型實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖9E所示。
根據(jù)圖9E的結(jié)果，在小鼠急性腹膜炎模型中，相對于對照PSGL-1 P以及突變體 Tat-PSGL-l Mut ， Tat-PSGL-l能明顯減少白細(xì)胞向腹腔的浸潤，作為對照，M1/70和 M17/4共同注射和RB40.34也能明顯減少白細(xì)胞的浸潤，亞型對照抗體則沒有作用。 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，白細(xì)胞向腹腔的浸潤依賴ocM， ocL和P-selectin。 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過肽段Tat-PSGL-l特異性地抑制PSGL-1和Naf 1的結(jié)合，從 而阻斷PSGL-1介導(dǎo)的整合素的活化，可以在體內(nèi)抑制炎癥反應(yīng)。
實(shí)施例10、 P-選凝素恢復(fù)P-選凝素敲除小鼠中的深靜脈血栓
分別結(jié)扎P-選凝素敲除小鼠和對照C57小鼠，以造深靜脈血栓，2天后檢測血栓長 度和重量，并根據(jù)血栓的質(zhì)量長度比作圖，結(jié)果如圖13所示。
根據(jù)圖13的結(jié)果，P-選凝素敲除小鼠中誘導(dǎo)出的深靜脈血栓要比對照小鼠C57輕。
然后，將小鼠P-Rg和對照蛋白12CA5分別以靜脈注射的方式注射進(jìn)P-選凝素敲除 小鼠體內(nèi)，然后結(jié)扎小鼠下腔靜脈，以造深靜脈血栓，2天后檢測血栓長度和重量，并根 據(jù)血栓的質(zhì)量長度比作圖，結(jié)果如圖13所示。
根據(jù)圖13的結(jié)果，向P-選凝素敲除小鼠中靜脈注射mP-Rg后，小鼠的深靜脈血栓 得以恢復(fù)，而注射對照蛋白12CA5則沒有恢復(fù)作用。
上述結(jié)果說明，P-selectin在深靜脈血栓中起重要作用，有可能針對其信號通路抑制 深靜脈血栓。
實(shí)施例U、阻斷性多肽抑制小鼠深靜脈血栓
將多肽Tat-PSGL-l和突變多肽Tat-PSGL-l Mut分別以靜脈注射的方式注射進(jìn)小鼠體 內(nèi)，然后結(jié)扎小鼠下腔靜脈，以造深靜脈血栓，2天后檢測血栓長度和重量，同時，以注 射生理鹽水的小鼠作為對照，并根據(jù)血栓的質(zhì)量長度比作圖，結(jié)果如圖14所示。
圖14的結(jié)果表明，體內(nèi)注射肽段Tat-PSGL-l能明顯抑制小鼠的深靜脈血栓，而多 肽Tat-PSGL-l Mut對小鼠的深靜脈血栓沒有抑制作用。綜合實(shí)施例6—10的結(jié)果，阻斷PSGL-1和Nafl結(jié)合后，在體內(nèi)和體外都能阻斷 P-selectin所誘導(dǎo)的整合素活化，同時，在體內(nèi)也能減弱炎癥反應(yīng)，并能抑制深靜脈血栓 的生成。這條信號通路具有重要的生理功能。該信號通路中的關(guān)鍵性蛋白，如PSGL-1 和Nafl，可作為篩選針對這條信號通路拮抗劑的靶標(biāo)，從而研制獲得炎癥和/或血栓性疾 病的藥物。
另夕卜，Nafl上第17個外顯子對PSGL-1和Nafl的結(jié)合起關(guān)鍵作用，因此，對于本 領(lǐng)域的工作人員來說，針對該外顯子設(shè)計(jì)阻斷蛋白是顯而易見的，例如，在Nafl的594-626 位的氨基酸的基礎(chǔ)上加上一個來自HIV病毒轉(zhuǎn)錄反式作用子的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列(HIVTat)， 因此也是本發(fā)明所要求保護(hù)的。序列表
<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
<120> —種炎癥和血栓藥物的靶標(biāo)，以及針對該耙標(biāo)的藥物
<130> P5081028
<160> 6
< 170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 2801
<212> DNA
<213> Human
<400> 1
agtgagccga ggagccttca tagggacagc cgcccctggt gcacacaccc tcgtattctc 60
ctgcccttcc ccagccaggc gggcaccacg gcaggggctg agctaccctc atggaaggga 120
gaggaccgta ccggatctac gaccctgggg gcagcgtgcc ctcaggagag gcatccgcetg 180
cttttgagcg cctagtgaag gagaattccc ggctgaagga aaaaeitgcaa gggataaaga 240
tgttagggga gcttttggaa gagtccc卿tggaagcgac caggctccgg cagaaggcag 300
aggagctagt gaaggacaac gagctgctcc caccaccttc tccctccttg ggctccttcg 360
accccctggc tgagctcaca ggaaaggact caaatgtcac agcatctccc acagcccctg 420
catgccccag tgacaagcca gcaccagtcc agaagcctcc atccagtggc acctcctctg 480
aatttgaagt ggtcactcct gaggagcaga attcaccaga gagcagcagc catgccaatg 540
cgatggcgct gggccccctg ccccgtgagg acggcaacct gatgctgcac ctgcagcgcc 600
tggagaccac gctgagtgtg tgtgccgagg agccggacca cggccagctc ttcacccacc 660
tgggccgcat ggccctggag ttcaaccgac tggcatccaa ggtgcacaag aatgagcagc 720
gcacctccat tctgcagacc ctgtgtgagc agcttcggaa ggagaacgag gctctgaagg 780
ccaagttgga taagggcctg gaacagcggg atcaggctgc cgagaggctg cgggaggaaa 840atttggagct c犯g犯gttg ttgatgagca atggcaacaa agagggtgcg tctgggcggc 900
caggctcacc gaagatggaa gggacaggca agaaggcagt ggctggacag cagcaggcta 960
gtgtgacggc鄉(xiāng)taaggtc cc卿ggtgg tggccUggg cgcagccgag a卿aggtga 1020
agatgctgga gcagc已gcgc agtgagctgc tggaagtg幼caagcagtgg gaccagcatt 1080
tccggtccat gaagcagcag tatgagcaga agatcactga gctgcgtcag aagctggctg 1140
atttgcag犯gcaggtgact gacctggagg ccgagcggga gcagaagcag cgtgactttg 1200
accgcaagct cctcctggcc aagtccaaga ttgaaatgga ggagaccgac aaggagcagc 1260
tgacagcaga ggccaaggag ctgcgccaaa aggtcaagta cctgcaggat cagctgagcc 1320
csctcacccg acagcgtgag taccagga朋3ggsgatcca gcggctc犯c犯ggccctgg 1380
aggaagcact gagcatccaa accccgccat catctccacc aacagcattt gggagcccag 1440
33ggagcagg ggccctccta aggaaacagg agctggtcac gcagaatgag ttgctgaaac 1500
agcaggtg犯gatcttcgag gaggacttcc agagggagcg cagtgatcgt gagcgcatgei 1560
atgaggagaa ggaagagctg犯gaagcaag tggagaagct gcaggcccag gtcaccctgt 1620
caaatgccca gctaaaagca ttcaaagatg aggagaaggc aagagaagcc ctcagacagc 1680
agaagaggaa agcaaaggcc tcaggagagc gttaccatgt ggagccccac ccagaacatc 1740
tctgcggggc ctacccctac gcctacccgc ccatgccagc catggtgcca caccatggct 1800
tcgaggactg gtcccagatc cgctaccccc ctccccccat ggccatggag cacccgcccc 1860
cactccccaa ctcgcgcctc ttccatctgc cggaatacac ctggcgtcta ccctgtggag 1920
gggttcgaaa tcc犯atcag agctcccaag tgatggaccc tcccacagcc aggcctacag 1980
aaccagagtc tccaaaaaat gaccgtgagg ggcctcagtg agaccagatt gtgtcatttg 2040
gctccacctt catcttgcag agccagctga tctcagattg ccaag犯act ag朋gccact 2100
tgcacggtgt ggcc卿gcc tcagctggat g卿ggctga gatgggtggc cagcttgtat 2160accagtccct gaactgagct gtttacagga ctggggaggc tccacccaga aggctttcat 2220
ttgtactctg ctgggagtga ctgggaaaaa ctccttccct gctgctgagt ggagagaggc 2280
ctcatccggc tttgacccac catccgttgc agaagcctcc aggagcagca atcctaagag 2340
tgggaggcag ccaagacccc cttccttcaa aacctcccgg aagtggtttc aggccctcta 2400
gttgccatga ccaatttgtg tgtgtgttta atttttgctt caagctctgt agcaggacct 2460
gccccacgca cacccctacc cctctgtgag gagctgtggg aagtgtgggt ttgtctccag 2520
aacagaagag犯tgatggat attctggctc tggggccctc tccaccacca ctcacagtag 2580
ccttgctgaa gccatcacag atgggagaag gccatgccag ccacgtccgc cgaggggcgc 2640
cagcctgaag ctgccaggcc ctgaggttca gaccctggac cccatagctg gaggcctgtg 2700
gtgccagaag cccagattag ggtggctgtc catccctgga tagctatttg cacgaatcat 2760
ggacataa3t cc犯gttgsa g犯g犯犯aa a犯a犯a^朋a 2801
〈210〉 2 〈211〉 2550 〈212〉 DNA 〈213〉 H腿n
〈400〉 2
acacacagcc attgggggtt gctcggatcc gggactgccg cagggggtgc cacagcagtg 60
cctggcagcg tgggctggga ccttgtcact犯agcagaga agccacttct tctgggccca 120
cgaggcagct gtcccatgct ctgctgagca cggtggtgcc atgcctctgc aactcctcct 180
gttgctgatc ctactgggcc ctggcaacag cttgcagctg tgggacacct gggcagatga 240
agccgagaaa gccttgggtc ccctgcttgc ccgggaccgg agacaggcca ccgaatatga 300
gtacctagett tatgeitttcc tgccagaaac ggagcctcca gaaatgctga ggaacagcac 360
tgacaccact cctctgactg ggcctgg犯c ccctgagtct accactgtgg agcctgctgc 420
a鄉(xiāng)cgttct actggcctgg atgcaggagg ggcagtcaca gagctg織a cggagctggc ■caacatgggg aacctgtcca cggattcagc agctatggag atacagacca ctcaaccagc 540
agccacggag gcacagacca ctccactggc agccacagag gcacagacaa ctcgactgac 600
ggccacggag gcacagacca ctccactggc agccacagag gcacagacca ctccaccagc 660
agccacggaa gcacagscca ctc犯cccac aggcctggag gcacagaccs ctgcaccagc 720
agccatggag gcacsgacca ctgcaccagc sgccatggaa gcacagacca ctccaccagc 780
agccatggag gcacagacca ctcaaaccac agccatggag gcacagacca ctgcaccaga 840
agccacggag gcacageicca ctc犯cccac agccacggag gcacagacca ctccactggc 900
agccatggag gccctgtcca cagaacccag tgccacagag gccctgtcca tggaacctac %0
taccaa犯ga ggtctgttcs tacccttttc tgtgtcctct gttactcaca agggcattcc 1020
catggcagcc agcaatttgt ccgtcaacta cccagtgggg gccccagacc acatctctgt 1080
gaagcagtgc ctgctggcca tcctaatctt ggcgctggtg gccactatct tcttcgtgtg 1140
cactgtggtg ctggcggtcc gcctctcccg caagggccac atgtaccccg tgcgtaatta 1200
ctcccccacc gagatggtct gcatctcatc cctgttgcct gatgggggtg aggggccctc 1260
tgccacagcc aatgggggcc tgtcc犯ggc caagsgcccg ggcctgacgc cagagcccag 1320
ggaggaccgt gagggggatg acctcaccct gcacagcttc ctcccttagc tcactctgcc 1380
atctgttttg gcaagacccc acctccacgg gctctcctgg gccacccctg agtgcccaga 1440
ccccattcca cagctctggg cttcctcgga gacccctggg gatggggatc ttcagggaag 1500
g犯ctctggc cacccaaaca ggacaagagc agcctggggc caagcagacg ggcaagtgga 1560
gccacctctt tcctccctcc gcggatgaag cccagccaca tttcagccga ggtccaaggc 1620
aggaggccat ttacttgaga cagattctct cctttttcct gtcccccatc ttctctgggt 1680
ccctctaaca tctcccatgg ctctccccgc ttctcctggt cactggagtc tcctccccat 1740
gtacccaagg aagatggagc tcccccatcc cacacgcact gcactgccat tgtcttttgg 1800ttgccatggt caccaaacag gaagtggaca ttctaaggga ggagtactga agagtgacgg 1860
acttctgagg ctgtttcctg ctgctcctct gacttggggc agcttgggtc ttcttgggca 1920
cctctctggg aaaacccagg gtgaggttca gcctgtgagg gctgggatgg gtttcgtggg 1980
cccaagggca gacctttctt tgggactgtg tggaccaagg agcttccatc tagtgacaag 2040
tgacccccag ctatcgcctc ttgccttccc ctgtggccac tttccagggt ggactctgtc 2100
ttgttcactg cagtatccca actgcaggtc cagtgcaggc aataaatatg tgatggacaa 2160
acgatagcgg aatccttcaa ggtttcaagg ctgtctcctt caggcagcct tcccggaatt 2220.
ctccatccct cagtgcagga tgggggctgg tcctcagctg tctgccctca gcccctggcc 2280
ccccaggaag cctctttcat gggctgttag gttgacttca gttttgcctc ttggacaaca 2340
gggggtcttg tacatccttg ggtgaccagg aaaagttcag gctatggggg gccaaaggga 2400
gggctgcccc ttccccacca gtgaccactt tattccactt cctccattac ccagttttgg 2460
cccacagagt ttggtccccc ccaaacctcg gaccaatatc cctctaaaca tcaatctatc 2520
CtCCtgtt肪8g3aa3犯aa 2550
<210> 3
〈211〉 69
〈212〉 PRT
〈213〉 Human
〈400〉 3
Arg Leu Ser Arg Lys Gly His Met Tyr Pro Val Arg Asn Tyr Ser Pro 15 10 15
Thr Glu Met Val Cys lie Ser Ser Leu Leu Pro Asp Gly Gly Glu Gly 20 25 30
Pro Ser Ala Thr Ala Asn Gly Gly Leu Ser Lys Ala Lys Ser Pro Gly 35 40 45
Leu Thr Pro Glu Pro Arg Glu Asp Arg Glu Gly Asp Asp Leu Thr Leu 50 55 60His Ser Phe Leu Pro 65
〈210〉 4
<211〉 119
〈212〉 PRT
〈213〉 Human
〈400〉 4
Met His His His His 1 5
Gly Met Lys Glu Thr 20
Ser Pro Asp Leu Gly 35
Gly Ser Arg Leu Ser 50
Ser Pro Thr Glu Met 65
Glu Gly Pro Ser Ala 85
Pro Gly Leu Thr Pro 100
Thr Leu His Ser Phe 115
〈210〉 5
<211> 102
〈212〉 PRT
〈213> Human
<400> 5
Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Tyr Gly Arg Lys 15 10 15
His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser 10 15
Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gin His Met Asp 25 30
Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp lie 40 45
Arg Lys Gly His Met Tyr Pro Val Arg Asn Tyr 55 60
Val Cys lie Ser Ser Leu Leu Pro Asp Gly Gly 70 75 80
Thr Ala Asn Gly Gly Leu Ser Lys Ala Lys Ser 90 95
Glu Pro Arg Glu Asp Arg Glu Gly Asp Asp Leu 105 110
Leu ProLys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp lie Gly 20 25 30
Ser Arg Leu Ser Arg Lys Gly His Met Tyr Pro Val Arg Asn Tyr Ser 35 40 45
Pro Thr Glu Met Val Cys lie Ser Ser Leu Leu Pro Asp Gly Gly Glu
50
55 60
Gly Pro Ser Ala Thr Ala Asn Gly Gly Leu Ser Lys Ala Lys Ser Pro
65
70 75 80
Gly Leu Thr Pro Glu Pro Arg Glu Asp Arg Glu Gly Asp Asp Leu Thr 85 90 95
Leu His Ser Phe Leu Pro 100
〈210〉 〈211〉 <212> <213>
6
102 PRT Hum抑
〈400〉 6
Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Tyr Gly Arg Lys 15 10 15
Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp lie Gly 20 25 30
Ser Arg Leu Ser Arg Lys Gly His Met Tyr Pro Val Ala Ala Ala Ser 35 40 45
Ala Thr Glu Met Val Cys lie Ser Ser Leu Leu Pro A印Gly Gly Glu 50 55 60
Gly Pro Ser Ala Thr Ala Asn Gly Gly Leu Ser Lys Ala Lys Ser Pro 65 70 75 80
Gly Leu Thr Pro Glu Pro Arg Glu Asp Arg Glu Gly Asp Asp Leu Thr 85 90 95
Leu His Ser Phe Leu Pro 100
權(quán)利要求
1、蛋白Naf1的應(yīng)用，其特征在于，作為靶標(biāo)用于篩選治療炎癥和/或血栓性疾病的藥物。
2、 蛋白Nafl的應(yīng)用，其特征在于，用作炎癥和/或血栓性疾病藥物的藥物耙標(biāo)。
3、 蛋白PSGL-1的應(yīng)用，其特征在于，作為耙標(biāo)用于篩選治療炎癥和/或血栓性疾病 的藥物。
4、 蛋白PSGL-1的應(yīng)用，其特征在于，用作炎癥和/或血栓性疾病藥物的藥物耙標(biāo)。
5、 如權(quán)利要求1一4中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物阻斷磷脂酰肌醇3 位激酶PI3K的p85亞基結(jié)合到PSGL-1的胞內(nèi)區(qū)。
6、 如權(quán)利要求l一4中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物阻斷Nafl上第552 位的酪氨酸的磷酸化。
7、 如權(quán)利要求l一4中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物阻斷Nafl和PSGL-1 的胞內(nèi)區(qū)結(jié)合。
8、 一種蛋白Nafl的特異性抗體。
9、 一種治療炎癥和/或血栓性疾病的藥物，其特征在于，所述藥物含有如權(quán)利要求8 所述的抗體。
10、 一種蛋白PSGL-1的特異性抗體。
11、 一種治療炎癥和/或血栓性疾病的藥物，其特征在于，所述藥物含有如權(quán)利要求 IO所述的抗體。
12、 一種治療炎癥和/或血栓性疾病的藥物，其特征在于，所述藥物以蛋白Nafl為 藥物耙標(biāo)。
13、 一種治療炎癥和/或血栓性疾病的藥物，其特征在于，所述藥物以蛋白PSGL-1 為藥物耙標(biāo)。
14、 一種能阻斷Nafl和PSGL-l的胞內(nèi)區(qū)結(jié)合的肽段，其特征在于，所述肽段具有 SEQIDNO: 3所示的氨基酸序列。
15、 如權(quán)利要求14所述的肽段，其特征在于，所述肽段在體內(nèi)進(jìn)一步阻斷P-選擇素所誘導(dǎo)的整合素e2的活化。
16、 如權(quán)利要求14或15所述的肽段，其特征在于，所述肽段在體內(nèi)抑制P-選擇素 及其介導(dǎo)的細(xì)胞黏附與作用。
17、 如權(quán)利要求14一16中任一項(xiàng)所述的肽段用于制備治療炎癥和/或血栓性疾病的 藥物的應(yīng)用。
18、 如權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的肽段阻斷Nafl和PSGL-1胞 內(nèi)區(qū)的結(jié)合。
19、 如權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的肽段在體內(nèi)進(jìn)一步阻斷P-選擇 素所誘導(dǎo)的整合素P 2的活化。
20、 如權(quán)利要求17—19中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述肽段抑制P-選擇素 及其介導(dǎo)的細(xì)胞黏附與作用。
21、 一種源于Nafl第17個外顯子的肽段，其特征在于，所述肽段包含SEQIDNO: 1上594-626位氨基酸序列。
22、 如權(quán)利要求21所述的肽段，其特征在于，所述肽段還可以包含轉(zhuǎn)導(dǎo)序列。
23、 如權(quán)利要求22所述的肽段，其特征在于，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)序列為為HIVTat。
24、 如權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)所述的肽段，其特征在于，所述肽段阻斷PSGL-1和 Nafl的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明提供了蛋白Naf1和/或PSGL-1作為靶標(biāo)用于篩選治療炎癥和/或血栓性疾病的藥物以及用作炎癥和/或血栓性疾病藥物的藥物靶標(biāo)的用途，蛋白Naf1和/或PSGL-1的一種特異性抗體以及含有蛋白Naf1和/或PSGL-1的特異性抗體的藥物，以及以蛋白Naf1和/或PSGL-1為藥物靶標(biāo)的、用于治療炎癥和/或血栓性疾病的藥物，還提供了一種能阻斷Naf1和PSGL-1的胞內(nèi)區(qū)結(jié)合的肽段以及上述肽段用于炎癥和/或血栓性疾病藥物的應(yīng)用。本發(fā)明提供的肽段能減弱白細(xì)胞的粘附，并能抑制體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，同時，也為免疫損傷、炎癥、血栓形成及腫瘤轉(zhuǎn)移等疾病的治療提供新的方法。
文檔編號G01N33/15GK101315385SQ200810098830
公開日2008年12月3日 申請日期2008年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月29日
發(fā)明者雷 張, 濤 徐, 徐維麗, 王盡淘, 王海波, 耿建國, 銘 陳 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院