專利名稱：胰島素微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學領域，具體地，本發(fā)明公開了一種胰島素微孔板式 磁顆粒化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。
背景技術：
.胰島素的分子量5700,由兩條氨基酸肽鏈組成。A鏈有21個氨基酸，B鏈有 30個氨基酸。其中A7(Cys)-B7(Cys)、 A20 (Cys)-B19 (Cys)四個半胱氨酸中的巰基 形成兩個二硫鍵，使A、 B兩鏈連接起來。此外A鏈中A6(Cys)與All(Cys)之間也 存在一個二硫鍵?？崭箷r，血漿胰島素濃度是5 15ylU/mL。進餐后血漿胰島素 水平可增加5-10倍。胰島素的生物合成速度受血漿葡萄糖濃度的影響，當血糖 濃度升高時，B細胞中胰島素原含量增加，胰島素合成加速。胰島素主要用來治療 胰島素依賴型糖尿病，而胰島素的檢測主要與C肽、谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)、 胰島素自身抗體(IAA)、胰島素細胞自身抗體(ICA)等項目聯(lián)合檢測用來確診糖 尿病分型、療效觀察等。目前用于檢測胰島素的免疫分析方法主要有放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析、 時間分辨熒光免疫分析、化學發(fā)光免疫分析等。根據(jù)大量的試驗結果及臨床應用 資料，從實用性、穩(wěn)定性、準確性及發(fā)展前景來看，優(yōu)先順序依次為，.化學發(fā)光 免疫分析、時間分辨熒光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。放射免疫分析技術因其使用放射性元素作為標記物，因此對環(huán)境有放射性污 染，并存在靈敏度不高，操作復雜，試劑保存時間短等缺點；酶免疫分析法存在 靈敏度低，信噪比不高，線性范圍窄等方法學制約因素；時間分辨熒光免疫分析 對檢測環(huán)境的要求較高，易受空氣塵埃的干擾；化學發(fā)光免疫分析法是一種較先 進而有效的方法，可使檢測靈敏度達到10—'s摩爾水平，而且檢測范圍可達6個數(shù)量級，其酶標記物穩(wěn)定，可長期使用?；瘜W發(fā)光免疫分析技術因其高靈敏、高特 異、快速、高通量等特點得到越來越廣泛的應用，目前化學發(fā)光主要有酶促底物 化學發(fā)光和標記物直接發(fā)光兩大系列，酶促化學發(fā)光所使用示蹤物一般為堿性磷 酸酶和堿性磷酸酶。而標記物直接發(fā)光分為通過改變溶液酸堿度而發(fā)光的發(fā)光 物質為吖啶酯；通過電極作用的電化學發(fā)光的發(fā)光物質是三聯(lián)吡啶釕。目前微孔板式免疫分析主要有酶聯(lián)免疫分析和化學發(fā)光免疫分析，而微孔板 式化學發(fā)光一般將微孔板作為固相載體，通過抗體的物理吸附作用包被在微孔板 上，也有通過將親和素或鏈親和素包被在微孔板上，然后通過將生物素標記在抗 體上，以親和素-生物素較強的結合能力為橋聯(lián)，間接地將抗體固定到微孔板的方 法。目前磁顆粒在化學發(fā)光的應用上主要采用單個反應杯或反應槽的形式。本發(fā)明采用微孔板式磁顆粒整合了目前兩種技術，主要體現(xiàn)在(l)在微孔 板上使用磁顆粒，利用磁顆粒在相同體積的情況下表面積最大的原理，較目前微 孔板式化學發(fā)光固相物理吸附或用親和素-生物素橋聯(lián)方法包被抗體方式會結合 更多的抗體，這樣就會使反應的靈敏度更高，線性范圍更寬。(2)較目前磁顆粒 在化學發(fā)光的應用上采用單個反應杯或反應槽的形式相比，微孔板的反應模式因 為幾十或幾百個反應微孔在同一塊微孔板上，可以進行同時批量測量，適合大批 量血清篩查(如96孔微孔板， 一次就可以實現(xiàn)96個樣本的測試)。發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種胰島素微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒。根據(jù)本發(fā)明胰島素微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其中，所 述試劑盒包括1) 胰島素校準品；2) 胰島素單克隆抗體包被的磁顆粒；3) 堿性磷酸酶ULP)標記的另一株單克隆抗體或多克隆抗體； 4 )微孔板；5) 洗滌液；6) 上述酶所作用的化學發(fā)光底物液。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述反應微孔板為48孔、96孔、256孔不透明 微孔板。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述化學發(fā)光底物液配方為10%的4-甲氧基 -4-(3-磷酰氧基苯)-螺旋-(1,2-二氧雜環(huán)丁烷-3,2'-金剛烷)、0. 05mol/LPH7. 8 Tris-HCL、 0. 02g/L氯化鎂。本發(fā)明的再一 目的是提供一種制備上述試劑盒的制備方法。根據(jù)本發(fā)明胰島素微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒的制備方 法，具體地，制備方法包括a)配制校準品；b)制備胰島素抗體包被磁顆粒；c) 以堿性磷酸酶標記胰島素抗體；d)配制洗滌液；e)配制化學發(fā)光底物液。根據(jù)本發(fā)明所述配制校準品，其中校準品基質的配方為三羥甲基氨基甲垸(Tris) 6. 06g牛血清白蛋白(BSA) 1.5g0. lmol/L、鹽酸(HCL) 3. 45mlProclin300 lml甘藍紅0. lml雙蒸水定容1000ml配制校準品基質液后，用此基質液將胰島素抗原純品稀釋成系列濃度校準品， 每個濃度點，每瓶裝1 ml，凍干保存。其中，所述校準品的胰島素抗原原料純度 應不低于90%。根據(jù)本發(fā)明試劑盒制備方法中胰島素抗體包被磁顆粒的稀釋液配方為三羥甲基氨基甲烷(Tris) 0. lmol/L鹽酸(HCL) 牛血清白蛋白(BSA) 明膠 乙二醇去離子水定容6. 06g 3. 45ml 10g 15g 50ml 1000ml配制完成后，應混勻，放置30分鐘后用肉眼觀察無晶體或沉淀析出，應釆用 電子pH計或中性pH試紙進行檢驗pH應控制在7. 0-8. 0之間，最佳pH為7. 8。然 后分裝到適當體積的聚乙烯塑料瓶中。根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述制備胰島素抗體包被磁顆粒，是將磁顆 粒通過偶聯(lián)羧基和/或氨基中的至少一種活性基團后，與胰島素抗體中的賴氨酸殘 基中裸露氨基反應共價結合的過程，反應結東后用去離子水沖洗3次，2%BSA封閉， 離心去上清液后，用上述磁顆粒稀釋液適當體積溶解，備用。根據(jù)本發(fā)明提到的磁顆粒如果活化的為羧基基團，則與胰島素抗體中的賴氨酸殘基中裸露氨基反應以共價鍵結合的過程；根據(jù)本發(fā)明提到的磁顆粒如果活化的為氨基基團則通過偶聯(lián)劑戊二醛、1-乙 基-3- (3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺三種中的至少一種氨基 基團偶聯(lián)劑與胰島素抗體中的賴氨酸殘基中裸露氨基反應以共價鍵結合的過程。包被磁顆粒的胰島素單克隆抗體應為鼠源或兔源的。包被磁顆粒的胰島素單克隆抗體在使用前應搖勾。根據(jù)本發(fā)明以堿性磷酸酶標記胰島素抗體是采用戊二醛偶聯(lián)法進行標記。 堿性磷酸酶標記胰島素單克隆抗體或多克隆抗體應為鼠源、兔源或羊源的。 根據(jù)本發(fā)明試劑盒制備方法中洗滌液的配方為三羥甲基氨基甲烷(Tris) L212g0. lmol/L鹽酸(HCL) 0. 69mlTween20 0. lml去離子水定容 1000ml根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中免疫反應結東后，磁顆粒以及反應復合物是通 過在微孔板的底部安裝有磁鐵和/或電磁場的至少一種磁場，磁顆粒以及反應復合 物被吸附到微孔板底部后，再洗滌。綜上，在本發(fā)明的研究過程中，本發(fā)明的發(fā)明人首先對所用的原材料進行了 篩選實驗和質量檢定，包括包被抗體的活性、磁顆粒的吸附性能和變異大小、ALP 的活性、化學發(fā)光底物的發(fā)光強度及發(fā)光持續(xù)時間等。對于ALP的標記可以有不 同的方法，通過反復探索和對比實驗最終找到了簡便、產率高、成本低、質量可 靠的標記方法。8本發(fā)明公開了基于上述摸索試驗得到的各種試劑配方，包括化學發(fā)光底物液配方、校準品的基質配方、洗滌液的配方、胰島素抗體包被磁顆粒的稀釋液配 方。進一步，公開了堿性磷酸酶標記胰島素抗體的制備過程和胰島素抗體包被磁 顆粒的制備過程。利用本發(fā)明方法進行檢測，靈敏度高，特異性強，檢測范圍寬，操作簡單， 無放射性污染，試劑盒成本低，臨床適用性強，更適用于我國臨床檢測及篩查實 驗室。


圖1為實施例4所制備的試劑盒中的校準品線性圖(雙對數(shù)標準曲線)。 圖2為實施例9中本發(fā)明的試劑盒同國外試劑盒(MONOBIND公司CLIA試劑盒) 臨床血樣測值比對的相關曲線。
具體實施方式
實施例1胰島素抗體磁顆粒的制備根據(jù)本發(fā)明試劑盒制備方法中胰島素抗體包被磁顆粒的稀釋液配方進行配制三羥甲基氨基甲烷(Tris) 6. 06g0. lmol/L鹽酸(HCL) 3. 45ml牛血清白蛋白(BSA) 10g明膠 15g乙二醇 50ml去離子水定容 1000ml配制完成后，應混勻，放置30分鐘后用肉眼觀察無晶體或沉淀析出，應采用 電子pH計或中性pH試紙進行檢驗pH應控制在7. 0-8. 0之間，最佳pH為7. 8。然 后分裝到適當體積的聚乙烯塑料瓶中。當粒徑為1 2jam磁顆粒表面附有氨基基團時，將此磁顆粒在堿性條件下用 1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺進行活化，室溫攪拌，混勾3小時后， 加磁場，靜置20 25min，倒出上清，用pH值為7.4的0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液將 磁顆粒進行懸浮，濃度為50 100g/L;每毫升懸浮液中加入胰島素單克隆抗體20 50 pg，在4'C下攪拌過夜后，反應結東后加電磁場，用去離子水沖洗3次，2%BSA 封閉，離心去上清液后，用磁顆粒稀釋液適當體積溶解，備用。實施例2胰島素試劑盒中洗滌液的制備根據(jù)本發(fā)明試劑盒制備方法中洗滌液的配方進行配制三羥甲基氨基甲烷(Tris) L212g0. lmol/L鹽酸(HCL) 0. 69mlTween20 0. lml去離子水定容 1000ml配制完成后，應混勾，放置30分鐘后用肉眼觀察無晶體或沉淀析出，應采用 電子pH計或中性pH試紙進行檢驗pH應控制在7. 0-8. 0之間，最佳pH為7. 8。然后分裝洗滌液到適當規(guī)格的聚乙烯塑料瓶中。實施例3胰島素微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒發(fā)光底物液的制備按照化學發(fā)光底物液配方三羥甲基氨基甲烷(Tris) 6. 06g0. lmol/L鹽酸(HCL)3. 45ml4-甲氧基-4-(3-磷酰氧基苯)-螺旋-(1， 2-二氧雜環(huán)丁烷-3， 2'-金剛烷)氯化鎂 雙蒸水定容 配制完成后用聚乙烯塑料瓶，每瓶分裝10m1.100ml 0. 02g 1000ml實施例4'素校準品的制備根據(jù)本發(fā)明校準品的基質液配方三羥甲基氨基甲垸(Tris)牛血清白蛋白(BSA)0. lmol/L鹽酸(HCL)Proclin300甘藍紅雙蒸水6. 06g 1.5g 3. 45ml lml 0. lml 1000ml配制校準品基質液，用此基質液將胰島素抗原純品(>90%)稀釋成校準品， 濃度分別為1.5|aIU/ml、 5|nIU/ml、 15)nIU/ml、 50nIU/ml、 150juIU/ml,另加 基質液0pIU/m1,共6瓶，每瓶裝l ml,凍干保存。實施例5胰島素抗體磁顆粒和堿性磷酸酶標記的胰島素抗體的濃度選定標準釆用方陣法將胰島素抗體磁顆粒和堿性磷酸酶標記抗體以不同稀釋度進行配比，以最高信噪比大于1500,最低信噪比大于5為基準，優(yōu)化選擇成本最低的配 比關系。
采用，將胰島素抗體磁顆粒以1/1000、 1/2000、 1/4000、 1/8000、 1/16000、 1/32000、 1/64000、 1/128000的不同稀釋度，與堿性磷酸酶標記抗體1/1000、 1/2000、 1/4000、 1/8000、 1/16000、 1/32000、 1/64000、 1/128000的不同稀釋度 進行方陣法，兩組比例交叉配比，發(fā)現(xiàn)滿足最高信噪比大于1200,最低信噪比大 于5的組合中，將胰島素抗體磁顆粒以1/8000和堿性磷酸酶標記抗體1/32000的 配比比例所用成本最低。故選擇這個合適的配比比例。
實施例6胰島素微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒半成品及成品
組成
上述步驟所得產品分裝即為半成品。抽出三份經過特異性、精密性、靈敏度 及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成胰島素微孔板式磁顆粒化學發(fā)光免疫分析測定試劑 盒，組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。
實施例7本發(fā)明的試劑盒的使用方法
一、 樣品前處理
取人的空腹及口服75g葡萄糖lh、 2h、 3h晨血清樣品，3000rpm離心15min, 取上層液50 m 1進行分析。
二、 檢測方法
使用本試劑盒進行實驗前，需先取出堿性磷酸酶標記的胰島素抗體、校準品/ 待測樣品、胰島素抗體磁顆粒、發(fā)光底物液和洗滌液，在室溫放置15-30分鐘， 使它們平衡到室溫；之后，將恒溫溫箱或者水浴鍋調至37'C;準備好合適的微量 加樣器及對應吸頭并且檢查化學發(fā)光儀是否正常工作。
使用本試劑盒實驗的具體操作步驟如下
12首先，根據(jù)試驗需求設計好分布圖，然后向微孔中加入50|U1血清樣品或系 列校準品溶液，校準品每孔加Om IU/ml、 1.5pIU/ml、 5juIU/ml、 15nIU/ml、 50
juIU/ml、 150jj iu/ml各50|n 1，再加入胰島素抗體包被的磁顆粒溶液100 y 1 ，加 入堿性磷酸酶標記胰島素抗體50p 1， 37。C振蕩反應30min。之后，將微孔板置于 帶有磁分離器的微孔板洗板機上洗滌5次。將化學發(fā)光底物液每孔加入200 pl, 充分混勻，暗處放置30min,而后在化學發(fā)光測量儀上依序測量各孔的發(fā)光強度
ULU )。以校準品濃度的Log值為橫坐標，RLU的Log值為縱坐標繪出標準曲線(雙 對數(shù)曲線)，以各待測血清RLU值在標準曲線上查出該血清的胰島素的濃度，見附 圖l,其中，縱坐標為發(fā)光強度，橫坐標為胰島素濃度(單位為plU/ml),相關系 數(shù)r = 0. 9996， Log ( Y ) =1. 0308Log ( X ) +3. 5684。
實施例8本發(fā)明的試劑盒的方法學檢定
按照本領域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對通過實施例1~6中制備成的試劑盒進 行檢定，結果如下
1) 準確性
試劑盒校準品與國家標準品同時測定，兩條劑量-反應曲線不顯著偏離平行。 以國家標準品為對照品，試劑盒校準品的實測值與標示值之比應在0.90-1.10的 范圍內。
2) 劑量-反應曲線的線性
用雙對數(shù)數(shù)學模型擬合，在1.5fJU/ml -150 fJU/ml濃度范圍內，劑量-反應 曲線相關系數(shù)(r)的絕對值應不低于0.9900
3) 精密性
CV(%)應小于15. 0%(n = 10)
4) 最低檢出量 應不高于0. 5tJU/ml5) 質控血清測定值 各質控測值應在質控范圍內。
6) 特異性
與胰島素原交叉反應率應小于1. 5% 與C肽的交叉反應率應小于0. 2%
7) 穩(wěn)定性
將試劑盒37'C放置7天，測定結果應符合上述1) 5)項要求。 實施例9本發(fā)明的試劑盒同國外試劑盒臨床血樣測值比對
用本發(fā)明的試劑盒和M0N0BIND公司的試劑盒對50份正常人(經過傳染病四 項HBsAg、 HIV、 HCV、 TP、肝功能、血常規(guī)、尿常規(guī)、血糖檢測正常)血清樣品同 時進行檢測。其檢測結果見附圖2，以本發(fā)明方法測定的血樣胰島素濃度結果為縱 坐標，以M0N0BIND測定的濃度結果為橫坐標作回歸分析，相關方程為Y = 0. 9655X+0. 8806，相關系數(shù)r =0. 9830。經統(tǒng)計學處理結果表明，本發(fā)明方法同國 外試劑盒臨床血樣測值相關性良好。
權利要求
1、胰島素微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)胰島素校準品；2)胰島素單克隆抗體包被的磁顆粒；3)堿性磷酸酶(ALP)標記的另一株單克隆抗體或多克隆抗體；4)微孔板；5)洗滌液；6)上述酶所作用的化學發(fā)光底物液。
2、 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述微孔板為48孔、96孔、 256孔不透明微孔板。
3、 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物液配方為10% 的4-甲氧基-4-(3-磷酰氧基苯)-螺旋-(1,2-二氧雜環(huán)丁烷-3,2'-金剛烷)、 0. 05mol/L PH 7. 8 Tris-HCL、 0. 02g/L氯化鎂。
4、 胰島素微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒的制備方法，其特征 在于制備方法包括a)配制校準品；b)制備胰島素抗體包被磁顆粒；c)以堿性 磷酸酶標記胰島素抗體；d)配制洗滌液；e)配制化學發(fā)光底物液。
5、 如權利要求4所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述配制校準品的 基質配方為含1,5 g/L BSA, 0, l%Proclin300 , 0. 05mol/L PH 7.8 Tris-HCL, 0. 01%甘藍紅。
6、 如權利要求4所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述以胰島素抗體 包被磁顆粒，是將磁顆粒通過偶聯(lián)羧基和/或氨基中的至少一種活性基團后，與胰 島素抗體中的賴氨酸殘基中裸露氨基反應共價結合的過程，反應結東后用去離子 水沖洗3次，2。/。BSA封閉，離心去上清液后，用磁顆粒稀釋液溶解，備用。
7、 如權利要求6所述試劑盒的制備方法，其特征在于，所述用,顆粒稀釋液 溶解，稀釋液配方為0. 05mol/L PH 7.8 Tris-HCL, 1.5%明膠、1仰SA, 5%乙二 醇。
8、 如權利要求4所述的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述以堿性磷酸酶 標記胰島素抗體采用戊二醛偶聯(lián)法進行標記。
9、如權利要求4所述的試劑盒制備方法，其特征在于，所述配制洗滌液，配 方為0. Olmol/L PH 7.8 Tris—HCL, 0, 01訂ween20。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胰島素微孔板式磁顆?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。根據(jù)本發(fā)明試劑盒包括1)胰島素校準品；2)胰島素單克隆抗體包被的磁顆粒；3)堿性磷酸酶(ALP)標記的另一株單克隆抗體或多克隆抗體；4)微孔板；5)洗滌液；6)上述酶所作用的化學發(fā)光底物液。根據(jù)本發(fā)明制備上述試劑盒的制備方法包括a)配制校準品；b)制備胰島素抗體包被磁顆粒；c)以堿性磷酸酶標記胰島素抗體；d)配制洗滌液；e)配制化學發(fā)光底物液。本發(fā)明試劑盒可以進行同時批量測量，適合大批量臨床血清篩查。
文檔編號G01N33/74GK101545912SQ20081010266
公開日2009年9月30日 申請日期2008年3月25日 優(yōu)先權日2008年3月25日
發(fā)明者于尚永, 唐寶軍, 宋勝利, 應希堂, 王宏銳, 胡國茂, 鄭金來 申請人:北京科美東雅生物技術有限公司