專利名稱：：一種聯(lián)合檢測hiv-1+2抗體和p24抗原的磁性免疫層析試紙條及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗領域，特別是涉及一種聯(lián)合檢測HIV-l+2抗體和P24抗原的磁性免疫層析試紙條及其制備方法。
背景技術：
：艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合癥(AcquiredImmureDeficiencySyndrome,AIDS),是由人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)引起的，目前尚不能治愈、病死率高的慢性進行性疾病。聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合發(fā)布報告指出，2006年全球艾滋病病毒攜帶者人數(shù)為3950萬；2006年新增艾滋病感染者430萬；2006年全球有290萬人死于艾滋病。據(jù)中國衛(wèi)生部《中國艾滋病防治聯(lián)合評估報告(2007年)》，到2007年底，我國現(xiàn)存艾滋病病毒感染者和病人約70萬(55萬85萬)人，全人群感染率為0.05%(0.04%—0.07%)。其中艾滋病病人8.5萬(8萬9萬)人；2007年新發(fā)艾滋病病毒感染者5萬(4萬6萬)人，因艾滋病死亡2萬(1.5萬2.5萬)人。以上數(shù)據(jù)表明，艾滋病IH以前所未有的程度威脅著人類的安寧、社會的發(fā)展與穩(wěn)定，我國目前已經進入艾滋病快速感染期，若不及時控制，將出現(xiàn)災難性的后果。但是到目前為止，醫(yī)學界尚無一種有效的治療艾滋病的方法，因此在艾滋病的控制方面，早期診斷及時發(fā)現(xiàn)感染者并控制其進一步傳播就成為艾滋病防治工作的重中之重。根據(jù)艾滋病臨床表現(xiàn)的不同，可將其分為急性感染期、潛伏期、艾滋病前期、典型艾滋病期四個時期。急性感染期的AIDS通常僅表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹、淋巴結腫大、乏力、出汗、惡心、嘔吐、腹瀉、咽炎等輕微癥狀，絕大多數(shù)患者在HIVl/2感染26周后，血清中可出現(xiàn)HIV抗體，可作為早期診斷和疾病篩查的重要指標。急性期癥狀持續(xù)314天后，AIDS出現(xiàn)一個長短不等的(平均210年)的無癥狀潛伏期，HtV病毒持續(xù)繁殖，具有強烈的破壞作用，患者卻無任何臨床癥狀。進行廣泛的篩查，特別是把好輸血關，可大大降低AIDS傳播的幾率。潛伏期之后，疾病繼續(xù)發(fā)展即進入艾滋病前期和典型艾滋病期，感染者由于免疫功能缺陷導致各種感染，病程發(fā)展的后期，感染者出現(xiàn)各種機會性感染和惡性腫瘤，發(fā)生嚴重后果和極高的死亡率。目前的AIDS病原學診斷技術主要包括病毒特異性抗體酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)、化學發(fā)光(CLIA)、免疫層析法(膠體金或乳膠顆粒法)、免疫印跡法(WB)、細胞培養(yǎng)法、PCR法，這些方法都有各自的特點和使用對象。ELISA法是目前臨床血液篩查中普遍使用檢測技術，第三代試劑用于測定病毒抗體，90年代末出現(xiàn)第四代試劑，在檢測抗體的基礎上同時檢測P24抗原，但是ELISA試驗操作程序復雜，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性結果，且靈敏度低，CLIA與ELISA方法類似，只是靈敏度提高了一些，并沒有根本解決ELISA存在的問題，并且二者都存在操作繁瑣，反應時間長的問題，而且都需要酶標儀或發(fā)光儀和洗板機以及溫箱等復雜設備，而且不能單人份檢測，進一步限制了他們在一些基層醫(yī)院、診所的應用。近幾年國內外出現(xiàn)了以膠體金或乳膠顆粒為代表的快速檢測試紙條，但是由于結果是肉眼目視觀察，容易受觀察者主觀判斷的影響，靈敏度低，結果準確度也不高，而且還不能用P24抗原的檢測，檢測窗口期較長。免疫印跡法(WB)是目前臨床艾滋檢測的確認方法，結果準確可靠，但是其技術難度大，目前全世界也只有屈指可數(shù)的幾家公司可以生產，高昂的使用成本使得它目前僅用于可疑標本的確認，而很少用于篩選。細胞培養(yǎng)法和PCR方法，都需要很高的試驗工作環(huán)境和條件(無菌操作間，超凈工作臺)和大量的儀器設備(培養(yǎng)箱，離心機，PCR儀等)，并且操作極其復雜，需要受過嚴格專業(yè)訓練的人員操作，，且試驗周期很長，不適合用于臨床檢測用。磁性免疫層析(MgneticImmunoChromatographicTest,MICT)是近年來出現(xiàn)的的一種新一代單人份快速定量檢測技術。是以超順磁性顆粒(superPMPs)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的標記物(膠體金，乳膠顆粒等)來進行免疫層析，通過檢測結合在超順磁性納米微粒上的生化物質來提供對生物樣品的定量檢測數(shù)據(jù)。通過檢測測量磁場強度來表達標記在樣品區(qū)域的量，采用標記的免疫復合物-磁場強度的標準曲線，從而達到定量的目的。該技術與傳統(tǒng)技術相比具有下述優(yōu)勢1)分析靈敏度比各類目測快速診斷法靈敏10-IOO倍；2)分析速度可在15秒內測量到多達6個分析位點的數(shù)據(jù)；3)線形范圍在1-104的濃度范圍內呈線性；4)所用磁性檢測儀器采用固相元件，微型化設計自成一體，獨立運行，體積小，操作簡便；5)超順磁性納米微粒由聚合物包被，不會隨時間而衰變；獨立的快速診斷色譜卡(MARCassette)可直接插入MAR檢測儀，為目前許多快速臨床診斷試劑的整合提供了廣泛的開發(fā)空間；而且還避免了操作過程中人員或儀器可能發(fā)生的交叉污染，提高了分析和過程的安全性。該技術繼承了傳統(tǒng)免疫層析法(膠體金，乳膠顆粒等)簡便快速，單人份操作的優(yōu)點，又彌補了傳統(tǒng)免疫層析技術靈敏度低，只能定性，不能定量的缺點，代表了當今即時檢驗(PointofCareTest,P0CT)技術發(fā)展的方向和潮流，一經問世，發(fā)展迅速，目前已經成為替代傳統(tǒng)免疫層析技術的首選。目前常用的標記磁顆粒為超順磁顆粒(superPMPs)，沒有外加磁場的情況下不具有任何磁性，只有在外加磁場作用下才會表現(xiàn)出磁性，商品化超順磁顆粒都經過表面修飾，大大方便了標記過程，標記簡便，重復性好。生物素-親和素系統(tǒng)(BAS)是一種廣泛應用的技術，將親和素包被固相，將生物素標記抗原或抗體，利用生物素親和素之間極高的親和力以及一個親和素結合四個生物素的特性，可以極大的提高反應的靈敏度，經過幾十年的發(fā)展，目前親和素和生物素都出現(xiàn)了大量衍生物，可以根據(jù)不同的需要選用，標記方法也很簡便，大大增加了他們的易用性。將生物素親和素系統(tǒng)引入磁性免疫層析中，在極大地提高了檢測方法的靈敏度的同時，又提供了一種極好的通用技術平臺，在規(guī)模化生產中減少了標記步驟，增加了工藝的通用性，減少了可變因素。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的即是將磁性免疫層析技術與生物素親和素系統(tǒng)聯(lián)合應用在HIV免疫分析中。將鏈親和素共價偶聯(lián)于超順磁顆粒上，將生物素化HIV1+2抗原和生物素化P24抗體與之混合之后作為檢測流動相，將HIV1+2抗原和P24抗體分別包被于硝酸纖維素膜上制成抗體檢測線和抗原檢測線作為捕獲固相，按照常規(guī)免疫層析法的原理進行標本的檢測，結合簡便易行的磁性檢測儀進行檢測，在實現(xiàn)高靈敏度檢測的同時又能大大縮短檢測的窗口期，可以避免前述幾種檢測方法的不足，又綜合了前述幾種方法的優(yōu)勢可以單人份檢測，也可以批量檢測，并且可以即時給出定量結果，測量儀器簡單可靠，操作簡便，方便實用。為達到上述的目的，本發(fā)明的技術方案如下本發(fā)明的檢測HIV-l+2抗體和P24抗原的磁性免疫層析試紙條是將包被膜、結合了HIV-1+2抗原及P24抗體的磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊、依次相互交錯2mm地粘貼在底板上，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜而制成，其中所述的包被膜上預包被有HIVl+2抗原的HIV-1+2抗體檢測線和P24抗體的HIVP24抗原檢測線，以及生物素化牛血清白蛋白的質控線。選用的底板為透明塑料底板，包被膜為35mm寬度的硝酸纖維素膜，選用的吸水墊為纖維素膜，磁顆粒墊為玻璃纖維墊，樣品墊為經過樣品墊處理液預處理的纖維素膜。所述的樣品墊處理液是含有1%-5%酪蛋白(casein)和0.1%_1%的聚乙烯醇(PVP)，以及0.01-0.2%吐溫-20(Tween-20)的0.02M，pH7.0-7.6的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)。檢測HIV-1+2抗體和P24抗原的磁性免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟A、抗原的處理選用商品化HIV-1+2重組抗原(CTK公司HIVfusionantigengpl20-41-36，cat:A3641);對20mM，pH7.0-7.6的PBS4'C透析過夜;B、抗體的處理選用商品化高效價P24配對單抗(天健公司，cat:210-1011,210-1012);20raM，pH7.0-7.6的PBS4。C透析過夜；C、磁顆粒的制備選用直徑為100-300nm的超順磁顆粒，使用碳二亞胺(EDC)和琥珀酰亞胺(NHS)共價偶聯(lián)的方式將鏈親和素標記到磁顆粒上，選用預活化生物素進行HIV-l+2抗原/P24抗體的標記，將標記好的生物素化抗原/抗體以1:2-1:10的比例(體積比)與鏈親和素化磁顆?；旌?，確保鏈親和素化磁顆粒過量；D、將制備好的磁顆粒使用定量噴液裝置以25u1/cm-50y1/cm的量噴涂于磁顆粒墊上；E、包被膜的制備使用包被緩沖液分別將HIV-l+2包被抗原和P24包被抗體以及生物素化BSA稀釋到0.5-2呢/m的濃度，使用定量噴液裝置分別將三者以0.5_1.Ocm的間隔于硝酸纖維素膜上，晾干后于封閉液中浸泡10分鐘后于25-35'C烘干8小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆?；F、樣品墊的處理將樣品墊放入樣品墊處理溶液中浸泡處理1小時后取出25-35°C烘干8小時；G、試紙條的組裝在透明塑料底板上依次相互交錯2mm貼上包被膜、磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜，得到試紙板，根據(jù)要求寬度切割即得到試紙條。所述的歩驟C包括以下三歩1)鏈親和素化磁顆粒的制備使用含有0.l%Tween-20的50mM,pH4.5-5.0的醋酸鈉緩沖液洗滌磁顆粒，加入EDC和NHS使二者終濃度均為20mrao1，室溫反應1小時，使用含有0.l%Tween-20的50mM,pH4.5-5.0的醋酸鈉緩沖液充分洗滌磁顆粒后加入鏈親和素使鏈親和素與磁顆粒的分子比例為5:1(摩爾比)，室溫反應3小時，加入含有0.5%BSA的0.02M，pH7.0-7.6的PBS室溫封閉30分鐘，洗滌磁顆粒，使用含有1%PVP，l%Casein，0.5%Tween-20，5%蔗糖的50mMpH8.2-9.0的硼酸保存緩沖液復溶磁顆粒，4'C保存?zhèn)溆茫?)生物素化HIV-1+2抗原和P24抗體的制備將HIV-1+2抗原和P24抗體對0.02M，pH7.0-7.6的PBS4'C透析過夜，調整濃度為2mg/ml，將預活化生物素使用二甲基亞砜(DMSO)溶解，終濃度為50mM，以20:1的分子比例向抗原或抗體溶液中加入所需量的生物素溶液，室溫反應l小時，對0.02MPBS4'C透析過夜，加入等體積甘油后-2(TC保存?zhèn)溆茫?)生物素化抗原/抗體與鏈親和素化磁顆粒的混合，以0.5ul/mg磁顆粒的量向鏈親和素化磁顆粒溶液中加入生物素化HIV-1+2抗原，以0.25ii1/mg磁顆粒的量加入生物素化P24抗體，充分混勻后使用保存緩沖液以l:5-1:20的比例(體積比)將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用。所述的步驟D中，磁顆粒的噴涂方法是將制備好的磁顆粒使用定量噴膜裝置以50ul/cm的量均勻噴涂于玻璃纖維上，冷凍干燥后加入干燥劑封存?zhèn)溆?。所述的步驟E中，包被膜的制備方法是用包被緩沖液(0.02MPB，pH7.0-7.6)將HIV-1+2抗原和P24抗體稀釋為0.5mg/ml，生物素化BSA稀釋為lmg/ral，使用定量噴膜裝置以1u1/cm的量將三者以0.6cm的間隔噴印于硝酸纖維素膜上，室溫晾干30分鐘后于封閉液中浸泡10分鐘后于25-35。C烘干8小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆?。與現(xiàn)有快速檢測試紙條相比較，本發(fā)明具有以下優(yōu)點1)通過對試紙條的改進，首次將HIV1+2抗體和P24抗體聯(lián)合引入試紙條中，實現(xiàn)了抗原抗體聯(lián)檢，縮短了HIV檢測的窗口期，并且可以大致判斷出感染者的感染階段，為進一步的診療提供依據(jù)。2)通過在磁顆粒上引入生物素-親和素系統(tǒng)，使得試紙條的制備過程大大簡化，適合大規(guī)模生產。3)運用磁性檢測儀來進行結果的判讀，依據(jù)檢測線與質控線的磁性檢測值比值來進行陰陽性判斷，降低了主觀性，結果準確、可靠。本發(fā)明操作簡便，適合大規(guī)模生產，檢測所需的便攜式設備也己經上市，因此能廣泛用于醫(yī)院、血站、防疫站、體檢等大批量使用單位以及一些采血現(xiàn)場、農村和基層診所等小批量或單人份使用的單位使用。對于HIV的初篩定性診斷有著積極的意義。圖1為本發(fā)明聯(lián)合檢測HIV-1+2抗體和P24抗原的磁性免疫層析試紙條結構示意圖。為進一步說明本發(fā)明聯(lián)合檢測HIV-1+2抗體和P24抗原的磁性免疫層析試紙條及其制備方法，特舉以下的實施例進行說明，該實施例是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。具體實施方式本發(fā)明所述的聯(lián)合檢測血液中HIV-l+2抗體和P24抗原的磁性免疫層析試紙條，如圖1所示，該試紙條是在底板l)上依次相互交錯2mm地粘貼上包被膜2)、結合了HIV-l+2抗原及P24抗體的磁顆粒墊3)、樣品墊4)、吸水墊5)，并在上層覆蓋透明塑料密封膜6)組裝而成的試紙條，包被膜2)上預包被有HIV-l+2抗體檢測線Tl及HIVP24抗原檢測線T2和質控線C。在具體實施例中，所采用MV1+2抗原對為商品化抗原，HIVP24抗體對為商品化單抗。利用雙抗原夾心檢測HIV抗體和雙抗體夾心檢測P24抗原的原理檢測標本，當待測標本中含有HIVP24抗原時，抗原會先和磁顆粒上結合的抗體結合，隨著層析作用的進行，結合物向前移動到達P24抗體包被線T2處，抗原會再次和包被抗體結合形成雙抗體夾心復合物而聚集在T2處，同理，標本中含有HIVl+2抗體時，也會在HIVl+2抗原包被線Tl處形成雙抗原夾心復合物聚集。另外，未結合生物素化抗體或抗原的鏈親和素標記磁顆粒會繼續(xù)前行到達質控線C時，生物素化BSA會與鏈親和素標記磁顆粒結合從而在C線處同樣出現(xiàn)磁顆粒聚集。整個反應在30分鐘內進行完全，一般反應十五分鐘后即可使用磁性免疫層析儀器讀卡，Tl線，T2線以及C線都會產生相應的磁性信號值，計算T1/C和/或T2/C的比值，根據(jù)預設的界限比值即可判定結果的陰陽性。整個讀卡、計算、與預設界限值比對的過程已經完全程序化，磁性檢測儀會直接給出陰陽性結果。本發(fā)明所述的聯(lián)合檢測血液中HIV-l+2抗體和P24抗原的磁性免疫層析試紙條的制備方法見以下實例實施例1聯(lián)合檢測血液中HIV-1+2抗體和P24抗原的磁性免疫層析試紙條及試紙盒的制備方法本實施例的試紙條及試紙盒的制備方法包括以下步驟A、抗原和抗體的制備選用商品化的HIV1+2重組抗原和P24單抗，對20mM，pH7.2(pH7.0-7.6均適用)的PBS，4。C透析過夜備用。包被緩沖液的配制0.02MpH7.2的磷酸緩沖液(PBS)為包被緩沖液，0.22ym微孔濾膜過濾除菌后置4'C保存?zhèn)溆茫行趦芍?。封閉液的配制含0.5%BSA的0.02MpH7.2(pH7.0-7.6均適用)的磷酸鹽緩沖液(PBS)，0.22ym微孔濾膜過濾除菌后置于4"C保存?zhèn)溆?，有效期一周。包被膜的制備用包被緩沖液(0.02MPH7.2(pH7.0-7.6均適用)的PB)將HIV-l+2抗原和P24抗體稀釋為0.5mg/ml，生物素化BSA稀釋為lmg/ml，使用定量噴膜裝置以1u1/cm的量將三者以0.6cm的間隔均勻噴印于3.5cm寬度硝酸纖維素膜上，室溫晾干30分鐘后于封閉液(含有0.5%BSA的0.02MpH7.2(pH7.0-7.6均適用)的PBS，)中浸泡10分鐘后于25-35'C烘干8小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆?。C、磁顆粒的制備醋酸鈉緩沖液的配制用雙蒸水和醋酸鈉及冰醋酸配制pH值為4.7(pH4.5-5.0均適用)，濃度為50mM的醋酸緩沖液，加入Tween-20至終濃度為0.1%，0.22um微孔濾膜過濾除菌后4'C保存?zhèn)溆茫行趦芍?。硼酸保存緩沖液的配制用雙蒸水，硼酸和硼砂配制pH為8.5(pH8.2-9.0均適用)，終濃度為50mM的硼酸緩沖液，加入PVP，Casine，Tween-20，蔗糖，終濃度分別為1%，1%，0.5%，5%,0.22ym微孔濾膜過濾除菌后4"C保存?zhèn)溆?，有效期一周。鏈親和素化磁顆粒的制備使用含有0.l%Tween-20的50mMpH4.7(pH4.5-5.0均適用)醋酸鈉緩沖液洗滌磁顆粒，加入EDC和NHS使二者終濃度均為20mmol，室溫反應1小時，充分洗滌磁顆粒后加入鏈親和素使鏈親和素與磁顆粒的分子比例為5:l(摩爾比)，室溫反應3小時，加入含有0.5腿SA的0.02MpH7.2(pH7.0-7.6均適用)的PBS，室溫封閉30分鐘，洗滌磁顆粒，使用含有1%PVP，l%Casein，0.5%Tween-20，5%蔗糖的50mmolpH8.5(pH8.2-9.0均適用)的硼酸保存緩沖液復溶磁顆粒，4。C保存?zhèn)溆?。生物素化HIV-1+2抗原和P24抗體的制備將HIV-1+2抗原和P24抗體對0.02MpH7.2(pH7.0-7.6均適用)的PBS4'C透析過夜，調整濃度為2mg/rta，將預活化生物素使用匿S0溶解，終濃度為50mM，以20:1的分子比例向抗原或抗體溶液中加入所需量的生物素溶液，室溫反應1小時，對0.02MpH7.2(pH7.0-7.6均適用)的PBS4。C透析過夜，加入等體積甘油后-2(TC保存?zhèn)溆?。生物素化抗?抗體與鏈親和素化磁顆粒的混合以0.5y1/mg的量向鏈親和素化磁顆粒溶液中加入生物素化HIV-l+2抗原，以0.25w1/mg磁顆粒的比例加入生物素化P24抗體，充分混勻后使用保存緩沖液以1:5比例將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用。D、磁顆粒的噴涂與凍干使用BioDot噴膜儀的專用噴頭將處理好的磁顆粒以50ii1/cm的量均勻噴涂于0.8cm寬度玻璃纖維墊上，過夜冷凍干燥，加入干燥劑封存?zhèn)溆?，E、樣品墊的處理將1.8cm寬度樣品墊放入樣品墊處理溶液中浸泡處理1小時后取出25-35'C烘干8小時。樣品墊處理液是含有l(wèi)%_5%Casein和0.1%-1%的PVA以及0.01-0.2%Tween_20的0.02MpH7.2(pH7.0-7.6均適用)的PBS溶液。F、試紙條的組裝及切割下述所有操作都必須在濕度小于20%，溫度20-25。C的房間內進行。試紙板的組裝使用BioDotLM5000型組裝儀按照要求將3.5cm寬的包被膜，2.5cm寬的吸水紙，0.8cm寬的磁顆粒墊，1.8cm寬的樣品墊組裝于9.8cm寬度透明塑料底板上，貼上上層透明塑料蓋板，組裝成試紙板。試紙條的裁切使用BioDotCM4000型切條機將組裝好的試紙板切成0.5cm寬的成品試紙條。G、試紙卡的組裝將本發(fā)明所述的切割好的單人份試紙條置于塑料底卡上的卡槽內，蓋上上蓋，使用壓卡機將上下兩片塑料卡壓緊，確保整個試紙條處于繃緊狀態(tài)。加入干燥劑室溫封存?zhèn)溆谩、確定該批次的二維碼信息品名HIV1+2&P24磁性檢測卡批次試紙卡的組裝日期，格式為年/月/日，XXXX/XX/XX陰陽性判讀標準的確定取100份確認HIVl+2抗體陽性標本(強弱均有)、50份確認HIVP24抗原陽性標本(強弱均有)，500份隨機標本使用該批次試紙卡檢測，使用磁性檢測儀檢測結果，計算每個檢測卡的T1/C值，T2/C值，使用統(tǒng)計學方法計算均值和標準差，確定T1/C<0.1且T2/C〈0.05為陰性。T1/C〉0.2,或T2/C〉0.1為陽性，二者之間為灰區(qū)。I、二維碼的打印粘貼將上述二維碼信息輸入二維碼打印機內并打印，將二維碼粘貼于試紙卡的特定位置，使用二維碼粘貼位置檢測器隨機抽檢2%確保二維碼粘貼無誤。J、成品包裝將貼好二維碼的單人份試紙卡與一包干燥劑密封于鋁箔袋內，100人份為一個包裝置于一個包裝盒內，一盒一份說明書和1瓶10ml裝層析緩沖液，即制成試紙盒，該試紙盒于室溫避光保存，保質期為18個月。層析緩沖液配方為l%Tween-20，0.5%TritonX-100，1%NP-40，0.05%NaN3，20mmolpH7.2(pH7.0-7.6均適用)的PBS，。實施例2除了；鏈親和素化磁顆粒的制備的歩驟中鏈親和素使鏈親和素與磁顆粒的比例為1:2。其它步驟同實施例1，實施例3除了鏈親和素化磁顆粒的制備的歩驟中鏈親和素使鏈親和素與磁顆粒的比例為1:10。其它步驟同實施例1。實施例4除了生物素化抗原/抗體與鏈親和素化磁顆粒的混合歩驟中充分混勻后使用保存緩沖液以l:IO的比例將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用，其它步驟同實施例l。實施例5除了生物素化抗原/抗體與鏈親和素化磁顆粒的混合步驟中充分混勻后使用保存緩沖液以l:20的比例將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用，其它步驟同實施例l。實施例6本發(fā)明的檢測卡的使用方法.1、加樣從包裝盒中取出單人份的檢測卡，撕開鋁箔帶包裝，將試紙卡置于平整桌面上，用微量移液器取50pl樣本血清加入卡上的加樣孔內，再加入50nl層析緩沖液，等待反應進行15分鐘。2、測量及結果輸出將MICT檢測儀預先開機，將檢測卡插入檢測儀的插卡口，運行儀器，儀器會自動讀取卡上的二維碼信息并進行測量，即時打印測量結果，陰陽性結果會在打印結果中顯示。實施例7本發(fā)明的檢測卡檢測臨床標本檢測及檢測結果表l:正常人標本檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表2:HIV-l+2抗體陽性標本檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>P:陽性；N:陰性表5:臨床檢測結果分析<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>本發(fā)明的試紙卡與進口HIV1+2膠體金試劑進行了對比試驗，結果在特異性和靈敏度方面均遠遠好于膠體金試劑，尤其對于p24抗原陽性標本，本發(fā)明的試紙卡顯示了膠體金試紙無法比擬的優(yōu)勢，提高了剪除率并縮短了檢出窗口期，為早期感染HIV的檢測提供了良好的方法。權利要求1、一種聯(lián)合檢測HIV-1+2抗體和P24抗原的磁性免疫層析試紙條，其特征在于該試紙條是將包被膜、結合了HIV-1+2抗原及P24抗體的磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊依次相互交錯2mm地粘貼在底板上，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜組裝而成，其中所述的包被膜上預包被有HIV-1+2抗體檢測線及HIVP24抗原檢測線和質控線。2、根據(jù)權利要求1所述的聯(lián)合檢測1+2抗體和P24抗原的磁性免疫層析試紙條，其特征在于所述的樣品墊是經過樣品墊處理液預處理的纖維素膜，所述的樣品墊處理液是含有1%-5%酪蛋白和0.1%_1%的聚乙烯醇，以及0.01_0.2%吐溫-20的0.02M，pH7.0-7.6的磷酸鹽緩沖溶液。3、根據(jù)權利要求1所述的聯(lián)合檢測HIV-1+2抗體和P24抗原的磁性免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于包括以下步驟A、抗原的制備選用基因工程技術制備的商品化HIV-l+2重組配對抗原，對20mM，PH7.0-7.6的PBS4'C透析過夜;B、抗體的制備選用商品化的高效價P24配對單抗，對20mMpH7.0-7.6的PBS4'C透析過夜；C、磁顆粒的制備選用直徑為100-300nm的超順磁顆粒，使用碳二亞胺和琥珀酰亞胺共價偶聯(lián)的方式將鏈親和素標記到磁顆粒上，選用預活化生物素進行HIV-1+2抗原/P24抗體的標記，將標記好的生物素化抗原/抗體以1:2-1:IO的比例(體積比)與鏈親和素化磁顆粒混合，確保鏈親和素化磁顆粒過量；D、將制備好的磁顆粒使用定量噴液裝置以25y1/cni-50u1/cm的量噴涂于磁顆粒墊上；E、包被膜的制備使用0.02mM,pH7.0-7.6的PBS，分別將HIV-l+2包被抗原和P24包被抗體以及生物素化牛血清白蛋白稀釋到0.5-2mg/ml的濃度，使用定量噴液裝置分別將二者以0.5-1.Ocm的間隔噴印于硝酸纖維素膜上，晾干后于封閉液中浸泡10分鐘后于25-35'C烘干8小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆茫籉、樣品墊的處理將樣品墊放入樣品墊處理溶液中浸泡處理1小時后取出25-35°C烘干8小時；G、試紙條的組裝在透明塑料底板上依次相互交錯2mm貼上包被膜、磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜得到試紙板，根據(jù)要求的寬度切割即得到試紙條。4、根據(jù)權利要求3所述的聯(lián)合檢測HIV-1+2抗體和P24抗原的磁性免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于所述的步驟C包括以下三步1)鏈親和素化磁顆粒的制備使用含有0.l訂ween-20的50mM,pH4.5-5.0的醋酸鈉緩沖液洗滌磁顆粒，加入碳二亞胺和琥珀酰亞胺使二者終濃度均為20mmol/L,室溫反應1小時，使用含有0.l%Tween-20的50mM，pH4.5-5.0的醋酸鈉緩沖液充分洗滌磁顆粒后加入鏈親和素使鏈親和素與磁顆粒的分子比例為5:1(摩爾比)，室溫反應3小時，加入含有0.5%BSA的0.02M,pH7.0-7.6的PBS室溫封閉30分鐘，使用含有0.l%Tween-20的50mM,pH4.5-5.0的醋酸鈉緩沖液洗滌磁顆粒，然后使用含有1%PVP，l%casein，0.5%Tween-20，5%蔗糖的50mM,pH8.2-9.0的硼酸保存緩沖液復溶磁顆粒，4'C保存?zhèn)溆茫?)生物素化HIV-1+2抗原和P24抗體的制備將HIV-l+2抗原和P24抗體對0.02M,pH7.0-7.6的PBS4'C透析過夜，調整濃度為2mg/ml，將預活化生物素使用二甲基亞砜溶解，終濃度為50mM，以20:1的分子比例向抗原或抗體溶液中加入所需量的生物素溶液，室溫反應1小時，對0.02M，pH7.0-7.6的PBS4。C透析過夜，加入等體積甘油后-2(TC保存?zhèn)溆茫?)生物素化抗原/抗體與鏈親和素化磁顆粒的混合，以0.5ul/mg磁顆粒的量向鏈親和素化磁顆粒溶液中加入生物素化HIV-1+2抗原，以0.25u1/mg磁顆粒的量加入生物素化P24抗體，充分混勻后使用保存緩沖液以1:5-1:20的比例(體積比)將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用。5、根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的步驟D中，磁顆粒的噴涂方法是將制備好的磁顆粒使用定量噴膜裝置以50"1/cm的量均勻噴涂于玻璃纖維上，冷凍干燥后加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?、根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述的步驟E中，包被膜的制備方法是用包被緩沖液將HIV-1+2抗原和P24抗體稀釋為0.5mg/ml，生物素化BSA稀釋為lmg/ml，使用定量噴膜裝置以lul/cra的量將三者以0.6cm的間隔噴印于硝酸纖維素膜上，室溫晾干30分鐘后于封閉液中浸泡10分鐘后于25-35"C烘干8小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩Ｈ恼景l(fā)明涉及一種聯(lián)合檢測血液中HIV-1+2抗體和P24抗原的磁性免疫層析試紙條及其制備方法。該試紙條是將包被膜、結合了HIV-1+2抗原及P24抗體的磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊依次相互交錯2mm地粘貼在底板上、然后在上層覆蓋透明塑料密封膜組裝而成的。包被膜上預包被有HIV-1+2抗體檢測線及HIVP24抗原檢測線和質控線，本發(fā)明將磁性免疫層析技術和生物素親和素系統(tǒng)引入到HIV-1+2抗體和P24抗原聯(lián)合檢測中，大大提高了檢測靈敏度和結果準確度，縮短了檢測窗口期，降低了操作人員的勞動強度。文檔編號G01N33/558GK101566631SQ20081010482公開日2009年10月28日申請日期2008年4月24日優(yōu)先權日2008年4月24日發(fā)明者于尚永,唐寶軍,姚洪濤,宋勝利,應希堂,胡國茂,鄭金來申請人:北京科美東雅生物技術有限公司