專利名稱：：一種檢測Beta-2微球蛋白的化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種化學發(fā)光免疫分析Beta-2微球蛋白定量測定試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：Beta-2微球蛋白(日2-MG)，是Berggard于1968年率先由腎小管病變患者尿中分離出來的一種低分子量(麗11800)球蛋白，所有有核細胞均能產(chǎn)生，最主要由淋巴細胞產(chǎn)生，廣泛存在于人的血漿，尿以及腦脊液等體液中和有核細胞膜表面，在正常情況下，細胞表面的Beta-2微球蛋白與體液中游離的Beta-2微球蛋白反復(fù)結(jié)合解離，維持一種動態(tài)的平衡狀態(tài)，在某些病理狀態(tài)下，比如肺'癌、腎癌、乳腺癌以及消化系統(tǒng)惡性腫瘤等，這種動態(tài)平衡會被打破，血液中游離的Beta-2微球蛋白水平異常升高，因此，近幾年，Beta-2微球蛋白成為一種重要的腫瘤血清學診斷標志物而被廣泛關(guān)注。目前Beta-2微球蛋白的臨床診斷技術(shù)主要包括放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)、化學發(fā)光(CLIA)等方法，但這些方法都存在不同程度的不足放射免疫是臨床比較常用的方法，優(yōu)點是結(jié)果比較準確，線性范圍較寬，缺點是操作繁瑣，耗時長，且放射性標記物會對操作者產(chǎn)生危害，并且會產(chǎn)生環(huán)境污染，目前已經(jīng)逐漸被其他方法所替代。ELISA存在方法間結(jié)果差異大，線性范圍較窄等缺點?；瘜W發(fā)光免疫分析是繼熒光、放射性同位素和酶免疫分析之后發(fā)展起來的一項新的免疫分析技術(shù)，根據(jù)大量的實驗結(jié)果及臨床應(yīng)用資料，從實用性、穩(wěn)定性、準確性及發(fā)展前景來看，在非放射性標記分析技術(shù)中化學發(fā)光免疫分析處于領(lǐng)先地位，代表了當今世界發(fā)展的方向和潮流，它不僅具有免疫反應(yīng)的特異性，而且具有化學發(fā)光反應(yīng)的高靈敏度(檢測限度可達10(-15)l0(-18)moL/L)?；瘜W發(fā)光免疫分析技術(shù)具有靈敏度高、快速、準確、重復(fù)性好、效期長并安全無毒無污染等優(yōu)點，成為取代放射免疫分析和酶免疫分析技術(shù)的首選?；瘜W發(fā)光酶免疫分析是以酶標記生物活性物質(zhì)(如酶標記的抗原或抗體)進行免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP)，HRP常用的底物為魯米諾(3-氨基鄰苯二甲酰肼，luminol)或其衍生物如異魯米諾(4-氨基鄰苯二甲酰肼)等，魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進行，在過氧化物酶及活性氧的存在下，生成激發(fā)態(tài)中間體，當其回到基態(tài)時發(fā)光，其波長為425nm。發(fā)光強度依賴于酶免疫反應(yīng)物中酶的濃度。基于熒光素與熒光素抗體之間存在特異性的高親和力，使用模式一般有兩種1、使用熒光素標記檢測抗/原體，熒光素抗體標記酶，在雙抗原或雙抗體夾心的基礎(chǔ)上進一步增強反應(yīng)信號，該模式在生物學中逐漸被發(fā)展并應(yīng)用，目前已經(jīng)有商品化試劑可以得到，并且相關(guān)的標記程序也已基本固化，這些條件都大大便利了它的應(yīng)用；2、將熒光素抗體包被固相，將熒光素標記捕獲抗原/抗體，作為捕獲抗體的間接包被方式，這種方式為一些不易直接固相化的抗原/抗體的固相化提供了可能，同時，由于熒光素與熒光素抗體的良好穩(wěn)定性，也為一些直接固相化后性質(zhì)不穩(wěn)定的抗原/抗體擴大了應(yīng)用范圍，但該模式目前應(yīng)用較少，發(fā)展空間很大。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明創(chuàng)造性的將化學發(fā)光免疫分析法與熒光素/熒光素抗體系統(tǒng)應(yīng)用到Beta-2微球蛋白的定量檢測中，既可以保留化學發(fā)光免疫分析法的高靈敏度，又可以利用熒光素/熒光素抗體系統(tǒng)的優(yōu)勢彌補Beta-2微球蛋白不易包被和包被后易失活的缺點。另外，現(xiàn)有的化學發(fā)光免疫分析試劑為封閉式全自動化學發(fā)光測量系統(tǒng)，需要昂貴的全自動化學發(fā)光測量儀，從而限制了推廣使用，無法廣泛地應(yīng)用于臨床診斷和科研工作。本發(fā)明的試劑盒采用微孔板化學發(fā)光免疫分析技術(shù)，既可應(yīng)用于開放式的半自動化學發(fā)光測量儀，也可用于全自動的測量系統(tǒng)，可實現(xiàn)大批量快檢測，使用成本低，更易推廣應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種熒光素/熒光素抗體技術(shù)結(jié)合化學發(fā)光免疫分析法定量檢測血中Beta-2微球蛋白的試劑盒，本發(fā)明的另一目的是提供上述試劑盒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明所述的化學發(fā)光免疫分析法定量檢測血液中Beta-2微球蛋白的試劑盒包括1、包被熒光素抗體的固相載體2、熒光素標記的捕獲抗體3、酶標記的檢測抗體4、上述酶作用所需的發(fā)光底物5、Beta-2微球蛋白系列標準品，及6、濃縮洗滌液具體的，本發(fā)明的試劑盒制備過程包括A、固相載體的制備選用高純度、高親和力熒光素抗體，使用包被緩沖液稀釋到一定濃度后，以一定的量包被固相載體，之后使用封閉液進行封閉，晾干，加入干燥劑后用鋁箔袋密封即可。B、捕獲抗體的熒光素標記選擇高純度高親和力的Beta-2微球蛋白捕獲抗體使用熒光素標記緩沖液透析后，加入一定量的高質(zhì)量商品化熒光素試劑，反應(yīng)一定時間后，再次使用熒光素標記緩沖液進行透析，加入等體積甘油，-20°C保存?zhèn)溆?。C、檢測抗體的酶標記選取高純度高親和力且與選定捕獲抗體嚴格配對的Beta-2微球蛋白檢測抗體，使用酶標緩沖液進行透析，加入一定量已活化的酶，避光反應(yīng)一定時間后，使用飽和硫酸銨溶液沉淀，離心，將沉淀使用磷酸緩沖液復(fù)溶后，加入等體積甘油，-2(TC備用。D、熒光素標記捕獲抗體與酶標檢測抗體的混合試劑盒組裝前將熒光素標記好的捕獲抗體和酶標記好的檢測抗體使用酶稀釋液按比例稀釋后按照所需量分裝即可。E、發(fā)光底物的制備基于1000mL所述化學發(fā)光底物A液，包括1.7716g魯米諾、0.051g4-羥基聯(lián)苯、0.012g4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、.4.9g硼砂，其pH值為8.010.0，配制好后按照所需量分裝即可；基于lOOOmL所述化學發(fā)光底物B液，包括0.329g過氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP0412H20、8.74gNaH2P042H20，其pH值為7.07.6，配制好后按照所需量分裝即可。F、Beta-2微球蛋白系列標準品配制選用商品化高純度Beta-2微球蛋白，使用國家標準品對照測定確定其濃度后，使用小牛血清進行系列稀釋S6:8.0ug/ml，S5:4.0ug/ml，S4:2.0iig/ml，S3:1.0ug/ml，S2:0.5yg/ml，Sl:0.2ug/ml，SO:0小牛血清。G、濃縮洗滌液的配制基于lOOOmL所述濃縮洗滌液，包括4gNaH2P042H20、58gNa2HP0412H20、175.32gNaCl、10mlTween-20、lmlProclin-300，其pH值為7.0-7.6，配制好后按所需兩分裝即可。H、組裝成成品試劑盒。其中，所述步驟A中，所用固相載體為96孔板或塑料管，所用包被緩沖液為pH9.6的碳酸緩沖液或pH7.2的磷酸鹽緩沖液或pH4.7的檸檬酸緩沖液；濃度為1-5yg/ml;包被量為100-200U包被條件為4'C過夜或室溫6小時；封閉量為150-250ul/孔；封閉條件為37'C2小時或室溫4小時。優(yōu)選的方案為96孔板，碳酸鹽緩沖液稀釋為2.5yg/ml,200u1/L，4'C過夜包被，250ul/孔37°C2小時封閉。所述步驟B中，熒光素標記用緩沖液為磷酸鹽緩沖液或碳酸緩沖液，加入熒光素的量為15-50wg/mg抗體，反應(yīng)時間為1-4小時，優(yōu)選的方案為20mM117.2的磷酸緩沖液，加入熒光素與抗體的質(zhì)量比30ug/mg，反應(yīng)時間2小時，加入等體積甘油，-2(TC保存。所述步驟C中，選用的酶為堿性磷酸酶(AP)或辣根過氧化物酶(HRP)，標記緩沖液為磷酸緩沖液(AP)或碳酸緩沖液(HRP)，AP所用的偶聯(lián)劑可以為碳二亞胺(EDC)或戊二醛，HRP所用的活化劑為高碘酸鈉，優(yōu)選的方案為改良高碘酸鈉法HRP標記，標記后加入等體積甘油，-20°<:保存?zhèn)溆?。、所屬步驟D中，熒光素標記捕獲抗體的稀釋度可以是1:2,000-1:8,000，酶標記檢測抗體的稀釋度可以是1:5,000-1:20,000，所用的酶稀釋液為20mMPBS，pH7.4，1-4%BSA，1-3%蔗糖，0.1-1.0%明膠，0.05-0.1%食品紅，0.05-0.2%生物防腐劑。優(yōu)選的，我們選用的熒光素標記捕獲抗體的稀釋度為1:5,000，酶標記檢測抗體的稀釋度為1:10,000，所用酶稀釋液為20mMPBS，pH7.4，1.5%BSA，2.5%蔗糖，0.5%明膠，0.4%食品紅，0.1%生物防腐劑，分裝量為12ml/瓶。所屬步驟E中，底物A液和底物B液的分裝量均選擇6ml/瓶。本發(fā)明的試劑盒具有化學發(fā)光免疫分析法的高靈敏度特性，又大幅度降低了成本，與國外的化學發(fā)光檢測系統(tǒng)相比價格低廉且不需要昂貴的全自動化學發(fā)光測量儀，為臨床Beta-2微球蛋白的檢測提供了一種新的檢測方法。本發(fā)明的試劑盒采用了熒光素/熒光素抗體系統(tǒng)，有效彌補了Beta-2微球蛋白不易包被和包被后易失活的缺點，從而降低了試劑盒規(guī)?；a(chǎn)的難度，靈敏度高，特異性強，穩(wěn)定性好，線性范圍寬，實驗成本低，可更有效地檢測Beta-2微球蛋白。圖1200份正常人血清測值統(tǒng)計結(jié)果圖2與臨床定值標本相關(guān)性比較結(jié)果具體實施例方式實施例一制備本發(fā)明的Beta-2微球蛋白化學發(fā)光定量免疫分析測定試劑本實施例的制備方法包括以下步驟1、固相微孔板的制備選用高純度、高親和力熒光素抗體，使用20mM碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋為2.5ug/ml，200ul/孔，4'C過夜包被，甩干液體，250ul/孔加入封閉液，37'C2小時封閉，甩干液體，室溫靜置24小時徹底干燥發(fā)光板，用鋁鉑袋封口包裝，完成熒光素抗體包被的預(yù)包被發(fā)光板的制備。2、捕獲抗體的熒光素標記選擇高純度高親和力的Beta-2微球蛋白捕獲抗體使用20mM磷酸緩沖液(pH7.4)4'C透析4小時后，按照30pg/mg的量加入高質(zhì)量商品化熒光素試劑，反應(yīng)2小時后，再次使用20mM磷酸緩沖液(pH7.4)進行4'C透析2小時，轉(zhuǎn)入玻璃瓶中，加入等體積甘油，-20"保存?zhèn)溆谩?、檢測抗體的酶標記選取2ml濃度為2mg/ml的高純度高親和力且與選定捕獲抗體嚴格配對的Beta-2微球蛋白檢測抗體，使用2000ml酶標緩沖液進行4T:透析3小時，加入lmg己活化的酶，避光反應(yīng)2小時后，使用飽和硫酸銨溶液沉淀，4X:離心30分鐘，將沉淀使用10ml磷酸緩沖液復(fù)溶后，加入等體積甘油，-20°0備用。4、標記抗體液的混合試劑盒組裝前將熒光素標記好的捕獲抗體和酶標記好的檢測抗體分別使用酶稀釋液按1:2500和1:5000的比例稀釋后等體積混合，按照llml/瓶量分裝即可。5、發(fā)光底物的制備基于1000mL所述化學發(fā)光底物A液，包括1.7716g魯米諾、0.051g4-羥基聯(lián)苯、0.012g4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值為8.010.0，配制好后按照6ml/瓶的量分裝即可；基于1000mL所述化學發(fā)光底物B液，包括0.329g過氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP0412H20、8.74gNaH2P042H20，其pH值為7.07.6，配制好后按照6ml/瓶的量分裝即可。6、Beta-2微球蛋白系列標準品配制選用商品化高純度Beta-2微球蛋白，使用國家標準品對照測定確定其濃度后，使用小牛血清進行系列稀釋S6:8.0ug/ml，S5:4.0Pg/ml，S4:2.0ug/ml，S3:1.0ug/ml,S2:0.5ug/ml，Sl:0.2ug/ml，SO:0小牛血清，0.5ml/瓶分裝即可。7、濃縮洗滌液的配制基于1000mL所述濃縮洗滌液，包括4gNaH2P04'2H20、58gNa2HP0412H20、175.32gNaCl、10mlTween-20、lmlProclin-300，其pH值為7.0-7.6，配制好后按所需兩分裝即可。8、以每個試劑盒一塊包被板，一瓶標記抗體液，發(fā)光底物A液、B液各一瓶，濃縮洗滌液一瓶，標準品一套，說明書一份，封板膜一張的要求將上述各組分組裝成試劑盒。實施例二除了標記抗體液的混合試劑盒組裝前將熒光素標記好的捕獲抗體和酶標記好的檢測抗體分別使用酶稀釋液按1:2000和1:5000的比例稀釋后等體積混合。其他步驟同實施例一。實施例三除了標記抗體液的混合試劑盒組裝前將熒光素標記好的捕獲抗體和酶標記好的檢測抗體分別使用酶稀釋液按1:2000和l:20000的比例稀釋后等體積混合。其他步驟同實施例一。實施例四除了標記抗體液的混合試劑盒組裝前將熒光素標記好的捕獲抗體和酶標記好的檢測抗體分別使用酶稀釋液按1:8000和1:5000的比例稀釋后等體積混合。其他步驟同實施例一。實施例五除了標記抗體液的混合試劑盒組裝前將熒光素標記好的捕獲抗體和酶標記好的檢測抗體分別使用酶稀釋液按1:8000和l:20000的比例稀釋后等體積混合。其他步驟同實施例一。實施例六本發(fā)明的試劑盒的使用方法1、加樣從包裝盒中取出各個組分，室溫平衡30分鐘，撕開鋁箔帶包裝，將包被板置于平整桌面上，用微量移液器依次吸取25n1標準品各點或各樣本血清加入包被板上各孔內(nèi)，再以100ul/孔的量加入標記抗體液，振蕩混勻，置37'C水浴反應(yīng)1小時。2、洗滌以20mmolPBS，pH7.2，0.05%Tween-20的緩沖液洗滌包被板五遍后，拍干。3、加底物取5ml底物A液和5ml底物B液，混勻后立即迅速加入包被板各孔內(nèi)，振蕩混勻后，室溫避光反應(yīng)5分鐘。4、測量將包被板置于化學發(fā)光測量儀內(nèi)進行測量，讀數(shù)，以標準品濃度及測量值繪制標準曲線，將各樣本測量值代入標準曲線，計算各樣本試劑濃度。實施例七本發(fā)明的實際盒檢測臨床標本的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表1:正常人血清樣品200份測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求1.一種化學發(fā)光免疫分析法定量檢測血液中Beta-2微球蛋白的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)預(yù)包被的通用固相載體；2)熒光素標記的捕獲抗體；3)酶標記的檢測抗體；4)上述酶作用所需的發(fā)光底物；以及5)Beta-2微球蛋白系列標準品。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的預(yù)包被物為熒光素抗體；所述的固相載體為微孔板和塑料管；所述酶為辣根過氧化物酶。3、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物的發(fā)光劑為魯米諾、異魯米諾。4、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物包括A液和B液，其中，基于lOOOmL所述化學發(fā)光底物A液，包括1.7716g魯米諾、0.051g4-羥基聯(lián)苯、0.012g4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值為8.010.0;基于1000mL所述化學發(fā)光底物B液，包括0.329g過氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP0412H20、8.74gNaH2P042H20，其pH值為7.07,6。5、一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟1)制備通用固相載體；2)標記捕獲抗體的熒光素；3)檢測抗體的酶標記；4)熒光素標記捕獲抗體與酶標檢測抗體的混合及分裝；5)發(fā)光底物的制備及分裝；6)Beta-2微球蛋白系列標準品配制及分裝；7)組裝成成品試劑盒。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的步驟l)中，通用固相載體的制備方法是選用高純度、高親和力熒光素抗體，使用包被緩沖液稀釋到一定濃度后，以一定的量包被固相載體，之后使用封閉液進行封閉，晾干，加入干燥劑后用鋁箔袋真空密封即可。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的步驟2)中，捕獲抗體的熒光素標記方法是選擇高純度高親和力的Beta-2微球蛋白捕獲抗體使用熒光素標記緩沖液透析后，加入一定量的高質(zhì)量商品化熒光素試劑，反應(yīng)一定時間后，再次使用熒光素標記緩沖液進行透析，加入等體積甘油，-20°(:保存?zhèn)溆谩?、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的步驟3)中，檢測抗體的酶標記方法是選取高純度高親和力且與選定捕獲抗體嚴格配對的Beta-2微球蛋白檢測抗體，使用酶標緩沖液進行透析，加入一定量已活化的酶，避光反應(yīng)一定時間后，使用飽和硫酸銨溶液沉淀，離心，將沉淀使用磷酸緩沖液復(fù)溶后，加入等體積甘油，-20'0備用。9、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的步驟4)中，熒光素標記捕獲抗體與酶標檢測抗體的混合及分裝方法是試劑盒組裝前將熒光素標記好的捕獲抗體和酶標記好的檢測抗體使用酶稀釋液按比例稀釋后按照所需量分裝即可。10、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的步驟5)中，發(fā)光底物的制備方法是基于1000mL所述化學發(fā)光底物A液，包括1.7716g魯米諾、0.051g4-羥基聯(lián)苯、0.012g4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值為8.010.0,配制好后按照所需量分裝即可；基于1000mL所述化學發(fā)光底物B液，包括0.329g過氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP04'12H20、8.74gNaH2P04'2H20，其pH值為7.07.6，配制好后按照所需量分裝即可。11、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的步驟6)中，Beta-2微球蛋白系列標準品配制選用商品化高純度Beta-2微球蛋白，使用國家標準品對照測定確定其濃度后，使用小牛血清進行系列稀釋S6:8.0yg/ml,S5:4.0ng/ml，S4:2.0ug/ml，S3:1.0"g/ml，S2:0.5ug/ml，SI:0.2ug/ml，SO:0小牛血清。全文摘要本發(fā)明公開了一種化學發(fā)光免疫分析法定量檢測血液中Beta-2微球蛋白的試劑盒及其制備方法。本發(fā)明所述的化學發(fā)光免疫分析法Beta-2微球蛋白定量試劑盒包括包被熒光素抗體的固相載體；熒光素標記的捕獲抗體和酶標記的檢測抗體混合物；上述酶作用所需的發(fā)光底物，及Beta-2微球蛋白系列標準品。本發(fā)明的試劑盒既可應(yīng)用于開放式的半自動化學發(fā)光測量儀，也可用于全自動的測量系統(tǒng)，可實現(xiàn)大批量快檢測，使用成本低，更易推廣應(yīng)用。文檔編號G01N33/68GK101368970SQ200810105419公開日2009年2月18日申請日期2008年4月29日優(yōu)先權(quán)日2008年4月29日發(fā)明者于尚永,姚洪濤,宋勝利,應(yīng)希堂,胡國茂,鄭金來申請人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司