專利名稱：生物培養(yǎng)基中細(xì)胞在線原位計數(shù)的方法和系統(tǒng)的制作方法
生物培養(yǎng)基中細(xì)胞在線原位計數(shù)的方法和系統(tǒng)1發(fā)明介紹本發(fā)明涉及生物培養(yǎng)基中細(xì)胞在線原位計數(shù)的方法。它也涉及實施該方法 的細(xì)胞計數(shù)系統(tǒng)。制藥和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)在生物反應(yīng)器中用重組的動物細(xì)胞產(chǎn)生治療上關(guān)注的 分子。在有效測量反應(yīng)的最佳和良好性能中，生物量是最重要的參數(shù)。目前生 物量的測量對描述生物培養(yǎng)方法的特征是必不可少的，在整個細(xì)胞培養(yǎng)過程中 都要測量該生物量參數(shù)。參照測量是將細(xì)胞用胎盤蘭染色后，通過顯微鏡對細(xì)胞計數(shù)。將細(xì)胞事先與染料(胎盤蘭)接觸，只有允許染料透過的細(xì)胞祐:視為死細(xì)胞。因此計數(shù)活細(xì) 胞(未著色)、死細(xì)胞(胎盤蘭染色)、總數(shù)以及由此推算出活細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比 例(或活力)是可能的。許多供應(yīng)商提供該方法和合并有圖像處理的顯微鏡，以實現(xiàn)這些不同的計 數(shù)。這些解決方案差不多是自動化的，但測量是由反應(yīng)器的取樣完成的。其他離線方法(取樣)用于補(bǔ)充該參照，例如PCV(細(xì)胞壓積)、通過"庫爾特計數(shù)儀"的計數(shù)、通過流式細(xì)胞儀的計數(shù)、干重的測量、DNA量的分析等等。 在生物培養(yǎng)物中，參數(shù)的在線原位測量比取樣測量提供了非常顯著的優(yōu)勢 實時測量、自動化測量、任選地采用調(diào)節(jié)環(huán)路測量、沒有與取樣相關(guān)的污染風(fēng) 險。因此許多供應(yīng)商提供用于生物培養(yǎng)物的在線原位生物體傳感器。這些生物 體傳感器采用光學(xué)或電容方法。光學(xué)方法包括光吸收或衰減的測量，更普遍^^皮稱為濁度。培養(yǎng)基的濁度與 懸液中的生物量相關(guān)。測量的光信號與懸液中粒子的數(shù)量或總細(xì)胞的數(shù)目(活著 的和死亡的)相關(guān)。某些生物體傳感器使用反向散射測量，其中測量的光信號與懸液中粒子的 凄t量和大小相關(guān)。該信號提供生物總量(活的和死的)的信息。也可使用原位顯《鼓鏡技術(shù)，該技術(shù)中所有細(xì)胞(活著的和死亡的)被直接計數(shù)得到總細(xì)胞的數(shù)目。在線測量技術(shù)中，電容測量技術(shù)是最有效和最有吸引力的方法，因為獲得 的信號只與活著的生物體有關(guān)。事實上，只有活細(xì)胞是活躍的、可分裂的或產(chǎn)生目標(biāo)治療分子，這些細(xì)胞是需要首先測量的。該技術(shù)提供了對活細(xì)胞數(shù)量和 大小都敏感的測量。然而，正如上面描述的離線參照測量一樣，在線測量不能既測量細(xì)胞的數(shù) 量(獨立于細(xì)胞大小的變化)，同時又能測量細(xì)胞的大小。2發(fā)明主題本發(fā)明的主題是提出在傳感器中實施的測量生物培養(yǎng)物中生物體的在線原 位計數(shù)方法，所述傳感器能夠測量活細(xì)胞的數(shù)目和大小、總細(xì)胞數(shù)及活細(xì)胞占 細(xì)胞總數(shù)的百分比、或活力。3現(xiàn)有技術(shù)已有的研究成果(Pethig and Kell 1987; Foster and Schwan 1989; Markx and Davey 1999)對揭示生物培養(yǎng)物電容測量的基礎(chǔ)理論提供了有用的參考。在懸液細(xì)胞培養(yǎng)基的介電常數(shù)測量中，特別參考介電常數(shù)和激發(fā)頻率的關(guān)系。細(xì)胞培養(yǎng)基中電容測量首先包括應(yīng)用0.1-20 MHZ的多個激發(fā)頻率，以及 測量在每一頻率的介電常數(shù)。獲得的頻i普包含三種類型的重疊信息 -由于細(xì)胞的P-分布的介電常數(shù) -由于電極極化的介電常數(shù) -電子的寄生介電常數(shù)由靠近電極表面的雙層離子積聚產(chǎn)生的介電常數(shù)的下降被稱為電極極化。 介電常數(shù)的下降是由細(xì)胞膜的極化引起的。介電常數(shù)的下降稱為/3-分布，參考

圖1。P-分布本身可由三個參數(shù)來描述國P-分布振幅，As-特征頻率fc,-Cole-Cole系數(shù)ot。由P-分布產(chǎn)生的介電常數(shù)包含懸浮細(xì)胞的信息，例如細(xì)胞數(shù)、平均半徑、 細(xì)胞的膜容量Cm、以及細(xì)胞質(zhì)的傳導(dǎo)性，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。 為了提取電容測量的細(xì)胞信息，最常用的方法包括兩步處理- 校正在測得的介電常數(shù)頻i普中去除電極極化和電子寄生介電常數(shù)，以 獲得P-分布的頻i普。- 從校正的(3-分布中提取細(xì)胞的半徑和數(shù)目。 這兩步中存在幾個方法變量對于第一歩- 基于0-分布對總介電常數(shù)貢獻(xiàn)小(通常<500 kHz)的低頻區(qū)介電常數(shù)的測 量校正極化。[Cannizzaro 2003， Asami 1995]。這些方法基于在低頻率時 P-分布不變的假設(shè)。對大細(xì)胞而言，這種，￡設(shè)不再有效，該方法引入了校正誤差。畫 Bordi [Bordi 2001]提出確定該類型電極極化貢獻(xiàn)的總方法Cp =尸x /-pp，其中尸指極化的振幅，/指頻率，并且1</7/7^2。該方法不依賴于 與測得頻率范圍有關(guān)的p-分布形成的任何假設(shè)，且使通過等效電路的非 線性擬合確定尸和成為可能。Bordi使用的模型是包括介電常數(shù)測量 中三個貢獻(xiàn)的復(fù)合模型 -由于細(xì)胞的p-分布產(chǎn)生的貢獻(xiàn) -由于電才及極化產(chǎn)生的貢獻(xiàn)，以及 -由于電子噪音產(chǎn)生的貢獻(xiàn)。 該方法需要同時得到測量的介電常數(shù)的實部(電導(dǎo))和復(fù)部(電容)。Bordi使 用的頻率范圍極為廣泛(幾個kHz到幾百個MHz)。這個頻率范圍遠(yuǎn)超出目前在 工業(yè)生物培養(yǎng)應(yīng)用中使用的頻率范圍。而且，該范圍需要使用頂級實驗室的全 阻抗儀，其價格和非工業(yè)特征在工業(yè)生物培養(yǎng)應(yīng)用中是受限制的。 對于第二步，有三種方法一種方法包括直接從電容頻諉中提取細(xì)胞數(shù)目和半徑。該方法依賴于諸如 主要成分分析(PCA)、以及偏最小二乘法(PLS) [Cannizzaro 2003]的統(tǒng)計學(xué)方法。這種方法直接用于校正的或總的介電常數(shù)頻譜，但將電容測量的細(xì)胞直徑 依賴的高度非線性特征考慮在內(nèi)對該方法而言是困難的。實施這些統(tǒng)計方法是 費力的，因為它需要所謂"校準(zhǔn)"步驟的生物培養(yǎng)物的預(yù)先步驟，其中電容測量與細(xì)胞數(shù)目及半徑的離線測量是可比的。必須獲得校準(zhǔn)培養(yǎng)物以使所有范圍的細(xì)胞半徑和能被測量的細(xì)胞數(shù)范圍被 該校準(zhǔn)培養(yǎng)物完全包括。該校準(zhǔn)培養(yǎng)物是特異性針對一種細(xì)胞類型、以及特定 培養(yǎng)條件的。這兩個因素的一個發(fā)生變化，就需要新的校準(zhǔn)。這是推廣該方法及使其應(yīng)用于工業(yè)的主要障礙。這類方法暗示需要與細(xì)胞類型一樣多的校準(zhǔn)，其作為一種在線計數(shù)的工業(yè) 方法是難于實施的。另一種方法包括通過擬合提取參數(shù)。Cole/Cole型實驗式模型用于描述(3-分布。然后，通過非線性擬合提取描述p-分布的三個參數(shù)As、 fc和a。該擬 合用于低頻型極化校正后的數(shù)據(jù)[Yardley & al 2000]。實施該擬合是特別關(guān)鍵的 步驟，因為由Cole/Cole參數(shù)相關(guān)模型的非線性和不穩(wěn)定特征導(dǎo)致估計參數(shù)是 不準(zhǔn)確的。通常該擬合通過遺傳算法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[Nicholson 1996]、"模擬退火" 處理[Lising 1996]或Levenberg-Marquardt [Davey 1992, Davey 1993]型來完成。由于這些順序串聯(lián)，極化校正誤差引起參數(shù)As、 fc和a的誤差，特別是在 測量大細(xì)胞大小時。這些方法應(yīng)用于大范圍生物培養(yǎng)時，沒有一種是完全可靠 的。這些參數(shù)經(jīng)過計算可用于估計細(xì)胞的數(shù)目和大小。該計算是基于所謂的 Pauly-Schwan的球形細(xì)胞分布模型，下面會給出其詳細(xì)資料。最經(jīng)常的是，為 了估計細(xì)胞的大小和數(shù)目，細(xì)胞的膜容量Cm和細(xì)胞質(zhì)的電導(dǎo)率必須是已知的 參數(shù)。這些參數(shù)可由電旋轉(zhuǎn)型離線測量來估計[Archner, 1999]。另外一種方法已由[Asami 1995]提出，該方法使用代數(shù)公式，使得用預(yù)先 確定的激發(fā)頻率測量的電導(dǎo)和電容來評估特征頻率fc成為可能。這種方法的缺 點是該測定依賴于應(yīng)用頻率(2階依賴)，這就需要使用的全阻抗儀的頻率校準(zhǔn)， 而且根據(jù)Asimi的推薦，應(yīng)用的頻率必須與fc接近。而且，這種方法需要培養(yǎng)起點(1=0)的校準(zhǔn)。這是假設(shè)膜容量和細(xì)胞內(nèi)的電 導(dǎo)在發(fā)酵過程中不改變。4發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在工業(yè)可利用性和考慮極化誤差方面矯正由現(xiàn)有技術(shù)計數(shù) 方法造成的缺陷。8使用生物培養(yǎng)基中細(xì)胞的在線原位的計數(shù)方法實現(xiàn)該目的，所述方法包括下面的步驟- 以在預(yù)先確定的測量頻率內(nèi)變化的不同頻率多次測量所述培養(yǎng)基電容或 多次測量所述培養(yǎng)基電導(dǎo)，- 從所述電容測量中提取由所述培養(yǎng)基的(3-分布引起的介電常數(shù)變化 的信息，以及- 處理所述的介電常數(shù)變化的信息，以提供關(guān)于所述培養(yǎng)基的細(xì)胞計數(shù) 的信息。所述方法基于通過幾個頻率的介電測定和電導(dǎo)測定使得估計細(xì)胞平均大小 和細(xì)胞計數(shù)成為可能的方法。與統(tǒng)計方法不同，本發(fā)明的計數(shù)方法相當(dāng)于以意料之外的方式將Cole/Cole 型實驗式模型與Pauly-Schwan型模型結(jié)合描述球形細(xì)胞的分布。本發(fā)明的主要優(yōu)勢在于它在所有環(huán)境的測量條件下，對所有類型生物細(xì)胞 測量的精確度和可靠性。與Bordi方法不同，電子和極化相關(guān)的系統(tǒng)誤差經(jīng)受 預(yù)處理，隨后該預(yù)處理筒化P-分布參數(shù)的解析。在有利的版本中，本發(fā)明的計數(shù)方法還包括稱為校準(zhǔn)培養(yǎng)物的所述細(xì)胞培 養(yǎng)物的預(yù)先校準(zhǔn)步驟，該校準(zhǔn)步驟包括-(i)以預(yù)先確定的頻率，至少一次多個測量所述校準(zhǔn)培養(yǎng)物的介電常數(shù)。-(ii)處理所述介電常數(shù)的測量，以計算確定計數(shù)信息的因子。因此本發(fā)明方法的另一優(yōu)勢在于該實施方法不需要預(yù)先知道細(xì)胞膜容量 Cm和其胞質(zhì)電導(dǎo)率。而對每一類型的培養(yǎng)，它使用僅需要校準(zhǔn)培養(yǎng)物幾個特 定點(在下面描述的優(yōu)選實施方案中是一個到三個)的自校準(zhǔn)程序。該自校準(zhǔn)包 括這些點與獨立測量的細(xì)胞大小和數(shù)目的相關(guān)性。在本發(fā)明的計數(shù)活細(xì)胞方法框架內(nèi)，獲得稱為校準(zhǔn)培養(yǎng)物的預(yù)先培養(yǎng)物。 測量預(yù)先培養(yǎng)物中多個頻率下幾個介電常數(shù)頻i普(在優(yōu)選實施方案中是一個到 三個)和吸光率以確定-因子^或常數(shù)(a、 b、 c)，其使得用臨界頻率fc測量來確定后續(xù)培養(yǎng)物中 的半徑成為可能，-因子^或常數(shù)(d、 e、 f)，其使得用As或A(7以及臨界頻率fc測量來確定后 續(xù)培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)目成為可能，-因子K',其4吏得用吸光率的測量來確定后續(xù)培養(yǎng)物中總細(xì)胞數(shù)目成為可 能。后續(xù)培養(yǎng)物中的細(xì)胞總數(shù)和活細(xì)胞數(shù)目的測量將用于確定細(xì)胞活力。 常數(shù)5。"或a、 b、 c、 d、 e、 f對應(yīng)于下面描述的兩個優(yōu)選實施方案。 完成活細(xì)胞數(shù)目和大小的評估需要兩步1. 確定P-分布的參數(shù)電容分布振幅As或電導(dǎo)分布振幅Acj;特征頻率fc， 以及可選的Cole-Cole系數(shù)a。2. 從這些參數(shù)中評估活細(xì)胞的大小和數(shù)目依照本發(fā)明的另一方面，提出生物培養(yǎng)基中細(xì)胞在線原位計數(shù)系統(tǒng)，依照 本發(fā)明的方法實施，該系統(tǒng)包4舌-以在預(yù)先確定的測量頻率范圍內(nèi)變化的不同頻率，測量所述培養(yǎng)基電容 的裝置，-從所述電容測量中提取由于所述培養(yǎng)基中的(3-分布引起的介電常數(shù)變化的信息的裝置，以及 -處理所述介電常數(shù)變化的信息的裝置，以提供所述培養(yǎng)基中計數(shù)細(xì)胞的信息。本發(fā)明的計數(shù)系統(tǒng)還有利地包括實施稱為校準(zhǔn)培養(yǎng)物的所述細(xì)胞培養(yǎng)物校 準(zhǔn)的裝置，其包括-(i)以預(yù)先確定的頻率實施所述校準(zhǔn)培養(yǎng)的介電常數(shù)測量的裝置， -(ii)處理所述介電常數(shù)測量的裝置，以計算確定計數(shù)信息的因子。5.本發(fā)明的詳細(xì)i兌明在審查非限定性實施方案的詳細(xì)描述和附圖時，本發(fā)明的其他優(yōu)勢和特征 將會變得明顯，其中- 附圖1以作為頻率函數(shù)的介電常數(shù)和電導(dǎo)率變化的形式顯示已知的P-分 布現(xiàn)象；- 附圖2是本發(fā)明計數(shù)細(xì)胞系統(tǒng)的方框圖； 國圖3顯示本發(fā)明計數(shù)細(xì)胞方法的步驟；- 圖4顯示了作為時間函數(shù)的培養(yǎng)基中活細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)及介電常數(shù)的 變化；- 圖5顯示了作為時間函數(shù)的培養(yǎng)基中活細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)及介電常數(shù)變 量的變化；- 圖6顯示作為時間函數(shù)的活細(xì)胞和總細(xì)胞的各自數(shù)目變化及吸光率的變 化；以及- 圖7顯示作為時間函數(shù)的培養(yǎng)基中細(xì)胞平均半徑的變化。 現(xiàn)在描述在實施本發(fā)明計數(shù)方法過程中進(jìn)行的不同階段的參數(shù)測定。;.l描述來自Cole/Cole參數(shù)的活細(xì)胞數(shù)評估 依照第一個Pauly-Schwan方程式<formula>formula see original document page 11</formula>細(xì)胞數(shù)目的增加或細(xì)胞大小的改變影響生物量和介電常數(shù)信號的振幅，其中△s:介電常數(shù)(Fm")， p-分布的振幅 r:細(xì)胞半徑(m) P:細(xì)胞的體積分?jǐn)?shù)(生物量)<formula>formula see original document page 11</formula> Nv:活細(xì)胞的密度(m,,F 、CM:每單位表面積的膜容量、m'該結(jié)果就是當(dāng)體積分?jǐn)?shù)P(生物量)保持不變時，較高的細(xì)胞半徑r有增加As 振幅的效應(yīng)。特征頻率fc由第二個Pauly-Schwan方程式定義<formula>formula see original document page 11</formula>其中(7C:細(xì)胞質(zhì)的傳導(dǎo)率dm:培養(yǎng)基的傳導(dǎo)率——V cm 乂因此該臨界頻率fc是細(xì)胞大小(r)、細(xì)胞狀態(tài)以及細(xì)胞膜Cm特性的函數(shù)。/3-分布是由每個單獨細(xì)胞產(chǎn)生的所有小]8-分布的總和。Cole-Cole參數(shù)a表 示在臨界頻率fc時小^-分布的分布狀態(tài)。兩個Pauly-Schwan方程式描述了作為四個細(xì)胞參數(shù)r、 Wv、 (7M、 (Jc的函 數(shù)的兩個/3-分布參數(shù)。在經(jīng)常遇到的生物培養(yǎng)條件下，可以假設(shè)兩個假定-膜容量Cm是溫度和培養(yǎng)基電導(dǎo)率的已知函數(shù)，誦細(xì)胞內(nèi)電導(dǎo)率cri是溫度和培養(yǎng)基電導(dǎo)率的已知函數(shù)。cM=g(r,dOT) (4)(5)將這兩個方程式(4)和(5)與第二個Pauly-Schwan方程式(3)合并，得到下式: 1 1r.x'2宂g(r，cj附)2cjw+l<I>M)6)方程式(6)可以重新寫成如下的簡化形式: 1,'二A(r,ff附)x丁， (7)1.x-將第一個Pauly-Schwan方程式(l)、體積分?jǐn)?shù)方程式(2)與兩個方程式(4)和 (5)合并，就得出了活細(xì)胞的數(shù)目二^^ 3(2g微+l2(r，a鵬)、 丁^ ， "I 2a,(r"柳)方程式(8)可以重新寫成如下的簡化形式(8)(9)12其中~(j>M)=l^g(r,o3<formula>formula see original document page 13</formula>活細(xì)胞的數(shù)目也被表示為電導(dǎo)差值A(chǔ)(J和頻率fc的函數(shù)。事實上，既然A(7^27T求/c*As, (9)， Nv可以如下的不同方式計算 乂, =^"'2(I (Acjx/c3) (10)通過預(yù)先準(zhǔn)備的培養(yǎng)物和活細(xì)胞數(shù)目對策相關(guān)性(例如上面引用的參考方 法)確定函數(shù)kl和k2后，As和fc或Ao和fc的確定可直接和在線測量活細(xì)胞 的數(shù)目，這一點通過合并方程式(7)和(9)、或(7)和(10)被建立?；谠撃康模瘮?shù)W和W只可被限定為n進(jìn)制函數(shù)k,.的加權(quán)和。 S(7^附)二 2>xa(I (11)"1，.…符通過將(7)和(9)、或(7)和(10)給出的結(jié)果與由線性回歸方法得到的離線測量 至少n結(jié)果相聯(lián)系，用校準(zhǔn)培養(yǎng)物確定系數(shù)c,和4。一旦完成校準(zhǔn)，即一旦確定系數(shù)c,和《，就可用公式(7)、 (9)、 (11)、 (12)、 或者/>式(7)、 (10)、 (11)、 (12)通過培養(yǎng)基中電容測量、溫度和電導(dǎo)原位估計活 細(xì)胞的數(shù)目和大小。如果細(xì)胞的膜容量Cm和細(xì)胞質(zhì)的電導(dǎo)率(Tc已知，在原位測量中用方程式 (7.a)和(9.a)代替(11)、 (12)，就不需要參照培養(yǎng)物。Cole/Cole參數(shù)a可選地提供細(xì)胞大小圍繞由(7)估計的均值分布的定性信 息。使用實驗式使得a與平均半徑r和大小分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差聯(lián)系起來成為可能?，F(xiàn)在描述校準(zhǔn)步驟的優(yōu)選實施方案。1.在一個實施方案中，可從對多數(shù)培養(yǎng)物而言，兩函數(shù)A:/和^不完全依 賴于培養(yǎng)基的溫度和電導(dǎo)率這一實驗證實的事實出發(fā)。通過線性函數(shù)類型能非常近似的得到這兩個函數(shù)和 i2(r，^) = 6f + exr+/xcrw 。 由在經(jīng)驗層面(T， (V)的三次參照培養(yǎng)物實驗的最小值、以及隨后通過實施與活細(xì)胞數(shù)目對策的關(guān)聯(lián)(例如上文引用的參照方法)確定系數(shù)a、 b、 c、 d、 e、 2.在對應(yīng)于函數(shù)A:/和^較不準(zhǔn)確、但更適于校準(zhǔn)的計算的另一實施方案 接近和參照培養(yǎng)基的單次測量足以描述常數(shù)^ i和^2的特征，并將其與活細(xì)胞數(shù)目 的對策聯(lián)系起來(例如上文引用的參照方法)。在本優(yōu)選實施方案的情形下，溫 度和電導(dǎo)測量不是必須的。5.2測量譜中Cole/Cole參數(shù)確定的說明為確定活細(xì)胞計數(shù)必需的p-分布參數(shù)提出兩個可選的方法 通過擬合方法確定參數(shù)a、 fc、 As分兩步完成該確定-通過減法校正電子的寄生介電常數(shù)和電極的系統(tǒng)極化；依照該方法通過減法校正電子的寄生電導(dǎo)。 -校正由電極剩余極化產(chǎn)生的介電常數(shù)，以及通過擬合確定Cole/Cole參數(shù)本身。首先，如下式減去由電子產(chǎn)生的介電常數(shù)和電導(dǎo)^抓(/，aJ^皿(/，eU-浐(/,(U (13) cr匿CO二(j腿C0 —C/)(14)。在無細(xì)胞培養(yǎng)基中用探針測量介電常數(shù)^"(/)和電導(dǎo)(J"^(/)，低頻時的電導(dǎo) (Jm與有細(xì)胞培養(yǎng)基測量過程中是一致的。與[Bordi2001]不同，該校正使得在測 量的介電常數(shù)中消除由于電子產(chǎn)生的寄生介電常數(shù)成為可能。隨后多個頻率("下測量的校正介電常數(shù)通過Cole/Cole模型擬合，其隨著 任意的極化期增加= ——l+n ;r/2)-+ ￡ +APx/, (15.a)<formula>formula see original document page 15</formula>要確定的五個參數(shù)是 a: Cole/Cole參數(shù)， △s:介電常數(shù)分布的振幅， /c:特征頻率， AP:剩余極化的振幅，￡*:基線，當(dāng)頻率趨向無窮大時電容的極限。 另外兩個參數(shù)是 A(7:電導(dǎo)分布的振幅， (J7:基線，低頻電導(dǎo) p; 是所謂極化能力的常量。該常數(shù)值(包括1至2之間)對每個探針是特異的 (特別依賴于電極形狀和孔隙率)，其特征是只針對一次性探針。通過試圖將模型(15.a)和校正數(shù)據(jù)(13)之間的加權(quán)"最小平方，，差的函數(shù)最 小化，在處理器內(nèi)進(jìn)行擬合計算引入權(quán)重系數(shù)w(/)，作為激發(fā)頻率的函數(shù)，以補(bǔ)償電子噪音行為的差異。 在該方法的優(yōu)選實施方案中，使用帶有預(yù)處理的有限存儲基于Quasi-Newton、 Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno (BFGS)型算法的變量的算法用于最小化j。出于限定所述參數(shù)在它們的有效范圍內(nèi)l<a^2、 As^0、 /c〉0的目的， 本發(fā)明框架內(nèi)引入的變量是對標(biāo)準(zhǔn)BFGS算法的修正。依照生物培養(yǎng)物的類型，可在該算法中加入涉及Cole/Cole才莫型參數(shù)的其 他限制，以使其更為穩(wěn)定。在該方法的另 一個變化中，將依照Cole/Cole分布模型(15.b)的介電常數(shù)實 部與(15.a)中的虛部結(jié)合，以形成復(fù)合介電常數(shù)模型用于擬合?；谛Ｕ碾妼?dǎo)和電容測量(13)和(14)擬合該模型。將A(7和&加入擬合參 數(shù)的列表。該組合增加了確定Cole/Cole參數(shù)的精確度。通過代數(shù)方法確定參數(shù)a、 fc、 AffPLS型或線性回歸的統(tǒng)計方法存在如下缺陷(i)為描述P-分布，需要應(yīng)用 大頻率范圍，以及(ii)使用計算量大的算法。這使整合進(jìn)電子芯片的任務(wù)變得困 難。代數(shù)方法有極易置入完整電路的優(yōu)勢，因為在計算能力方面及頻率使用方 面它要求不是很高。它不使用線性回歸，不需要測量頻率的最小數(shù)。由細(xì)胞行為物理模型的代數(shù)解析確定參數(shù)a、 fc、 A(T。本領(lǐng)域的現(xiàn)狀促使使用電容光i普學(xué)確定特征參數(shù)a、 fc、 A(T。目前，電導(dǎo) 也受到該分布的影響。該方法包括將電導(dǎo)和電容的(3分布模型合并，以用代數(shù)方法確定特征參數(shù) a、 fc、 Ao"。該方法優(yōu)選地/人a = 0時的簡化的Pauly和Schwan />式開始<formula>formula see original document page 16</formula>(16)<formula>formula see original document page 16</formula>(17)A<r = 2ar*/c*A^ (18) 因此通過合并公式(16)、 (17)和(18)得到特征頻率fc<formula>formula see original document page 16</formula>(19)
其中只有最少的兩個頻率，因此確定頻率fc是可能的。 方程式(16)、 (17)和(18)的合并結(jié)果并不僅限于這種形式，可被修正到使用 幾個頻率。同樣顯而易見的是，相對于所有其他已知的方法，fc的這種確定方法獨立 于懸浮培養(yǎng)基的所有其他參數(shù)半徑r、膜容量Cm、細(xì)胞內(nèi)電導(dǎo)率、生物量P、 培養(yǎng)基的電導(dǎo)率。特征頻率fc的確定也獨立于選擇的頻率。結(jié)果就是，與只使用電容光譜學(xué) 的方法不同，應(yīng)用的頻率fl和f2的精確度并不重要。該方法有隨使用的阻抗 計的頻率校正分布的優(yōu)勢。而且，計算特征頻率fc的相應(yīng)數(shù)學(xué)關(guān)系非常容易在完整的電路中執(zhí)行。 現(xiàn)在描述確定電導(dǎo)A(T變化的實用才莫型。從使用方程式(17)開始，以不同 的方式由代數(shù)方法獲得該變化。如果與A(7相比，(Tl是可忽略的，可以使用單一的測量頻率。更為常見的情形是，使用最少兩個頻率，通過代^t法確定A(T。 現(xiàn)在描述在本發(fā)明計數(shù)方法的框架內(nèi)確定細(xì)胞活力的實用模型。 如上文描述的，光吸收或衰減的測量(更普遍稱為濁度)與懸液中的生物量 相關(guān)。測量的光信號與懸液粒子量或總細(xì)胞數(shù)(活的和死的)相關(guān)。用預(yù)先培養(yǎng)確定K'和確定總細(xì)胞數(shù)對策的相關(guān)性(例如上文引用的參考方 法)后，吸光率的確定是總細(xì)胞數(shù)的直接在線測量。 通過下面的公式確定細(xì)胞活力用后續(xù)培養(yǎng)中總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞數(shù)的測量來確定細(xì)胞活力。 參考上面提及的附圖，現(xiàn)在描述本發(fā)明計數(shù)方法的實施例，同時還有實施 該方法的計H系統(tǒng)。參考圖2，計數(shù)細(xì)胞的系統(tǒng)S包括 -浸入發(fā)酵槽2內(nèi)部的細(xì)胞懸液中的電容電極1裝置， -電子調(diào)控器3，包括例如浮橋，以期產(chǎn)生可變激發(fā)頻率及產(chǎn)生電容信號， 國處理器5，用于從隨著頻率函數(shù)變化的電容信號中提財關(guān)培養(yǎng)基(3-分 布的信息、特別是臨界頻率fc、介電常數(shù)變量As,以提供活細(xì)胞數(shù)的 在線測量及可選的這些細(xì)胞的平均半徑， -光學(xué)單元4，用來測量培養(yǎng)基的吸光率。參考圖3,在實踐中，以軟件的形式實施本發(fā)明計數(shù)方法，處理諸如電容吸光率K' * Nt 其中 Nt=總細(xì)胞數(shù)Nv * 100/Nt=細(xì)胞活力和吸光率的物理變量。運行該軟件處理隨頻率函數(shù)變化的吸光率和電容測量值，以產(chǎn)生培養(yǎng)基中|3-分布的特征參凄t 。 圖4-7顯示了實驗結(jié)果。當(dāng)然，本發(fā)明并不限于剛剛描述過的實例。對這些實例所做的眾多修正都 不超出本發(fā)明的范圍。因而電容和(或)電導(dǎo)信號來源于裝有頻率掃描儀和連接浸入生物培養(yǎng)基的 傳感器的任一類型的阻抗測量裝置(阻抗測量)。術(shù)語"阻抗測量"包括-基于要被測量樣本的V/I比率確定的各種測量阻抗的方法，其中一些在 由Hewlett Packard出片反的書H" "Impedance Measurement Handbook(阻^t 測量手冊)"中描述過。畫諸如技術(shù)人員在采用本申請名稱的文件WOO 179828中公開的零點法，國共振方法，以及更為普遍的，-使確定傳感器浸入的生物培養(yǎng)基的電導(dǎo)和電容成為可能的任何方法。參考文獻(xiàn)[1] John E. Yardley， Robert Todd, David J. Nicholson, John Barrett, Douglas B. Kell，polarisation on dielectric spectra (基線偽差和電核i U匕對介電i普的影響的4交正)， Bioelectrochemistry 51(2000) 53—65.[2] David J. Nicholson, Douglas B. Kell, Christopher L. Davey, Deconvolution of the dielectric spectra of microbial cell suspensions using multivariate calibration and artificial neural networks (用多變量校準(zhǔn)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)微生物細(xì)胞懸液的 介電i普反褶積)，Bioelectrochemistry and Bioenergetics 39 (1996) 185-193.[3] C. L Davey, H. M. Davey and D. B. Kell (1992) On the dielectric properties of cell suspensions at high volume fractions (關(guān)于高體積分?jǐn)?shù)細(xì)月包懸液的介電性能). Bioelectrochemistry and Bioenergetics 28 pp:319-330.[4] Christopher L. Davey, Gerard H, Mark and Douglas B. Kell。 (1993). On the dielectric method of monitoring cellular Viability (關(guān)于監(jiān)觀'J細(xì)月包活力的介電方法). Pure &App/. Chern., Vol. 65, NO. 9， pp.: 1921-1926.1993.[5] Steffen Archer, Hywel Morgan, and Frazer J. Rixon, Electrorotation Studies of Baby Hamster Kidney Fibroblasts Infected with Herpes Simplex Virus Type 1 (1型 單純皰滲病毒感染幼倉鼠腎成纖維細(xì)胞的電旋轉(zhuǎn)研究)，Biophysical Journal Volume 76 May 1999 2833 - 2842.[6] Christopher Cannizzaro， Raphael Gu"gerli, Ian Marison， Urs von Stockar， On-Line Biomass Monitoring of CHO Perfusion Culture With Scanning Dielectric Spectroscopy (用掃描介電波譜技術(shù)在線監(jiān)測CHO灌注培養(yǎng)生物量)，24 September 2003 in Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com).[7] Koji Asami, Takeshi Yonezawa, Dielectric analysis of yeast cell growth (酵母細(xì) 胞生長的介電分析)，Biochimica and Biophysica Acta 1245 (1995) 99-105.[8] F. Bordi, C. Cametti, T. Gili， Reduction of the contribution of electrode polarization effects in the radiowave electric measurements of highly conductive biological cell suspensions (電核J及化效應(yīng)在高導(dǎo)電生物細(xì)J包懸液的無線電波電 測量中的貢獻(xiàn)降低).Bioelectrochemistry 54 (2001)， 53-61.19
權(quán)利要求
1.生物培養(yǎng)基中在線原位細(xì)胞計數(shù)的方法，包括下列步驟-以在預(yù)先確定的測量頻率范圍內(nèi)變化的不同頻率，多次測量所述培養(yǎng)基的電容或多次測量所述培養(yǎng)基的電導(dǎo)，-從所述電容測量中提取由所述培養(yǎng)基的β-分布引起的介電常數(shù)變化的信息，以及-處理所述的介電常數(shù)變化的信息，以提供關(guān)于所述培養(yǎng)基中細(xì)胞計數(shù)的信息。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中還包括稱為校準(zhǔn)培養(yǎng)物的所述細(xì)胞 的培養(yǎng)物的預(yù)先校準(zhǔn)步驟，所述校準(zhǔn)步驟包括-(i)以預(yù)先確定的頻率對所述校準(zhǔn)培養(yǎng)物的介電常數(shù)進(jìn)行至少一 次多個測量，-(ii)處理所述介電常數(shù)的測量值，以計算確定計數(shù)信息的因子。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述預(yù)先校準(zhǔn)步驟還包括所述 介電常數(shù)測量與離線測量之間的相關(guān)性的運算，使得校準(zhǔn)培養(yǎng)物生物體總量 的測量能夠作為參照使用。
4. 如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述提取由P-分布引起介電 常數(shù)變化的信息的步驟包括從如下三個參數(shù)中的至少一個確定所述/3-分布 的描述參數(shù)介電常數(shù)變量As、電導(dǎo)變量A(J、臨界頻率fc和參數(shù)a。
5. 如前述任一權(quán)利要求或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述預(yù)先校準(zhǔn) 步驟旨在確定對應(yīng)于所述培養(yǎng)基中細(xì)胞的半徑r和所述p-分布的臨界頻率fc 的乘積的函數(shù)k。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中還包括從所述臨界頻率fc的確定中 提供所述培養(yǎng)基中細(xì)胞的平均半徑的在線測量的步驟。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中還包括從所述在線確定的細(xì)胞平均 半徑中確定所述培養(yǎng)基中活細(xì)胞的數(shù)目。
8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中還包括直接離線測量所述平均半徑 的步驟、以及所述直接測量和所述從臨界頻率fc在線確定中獲得的所述平 均半徑的在線間接測量之間的相關(guān)性的步驟。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中通過顯微鏡法完成所述平均半徑的 直接離線測量。
10. 如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中還包括依照如下公式確定活 細(xì)胞數(shù)或生物量Nv = K * As * fc4 。
11. 如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中還包括依照如下公式確定活 細(xì)胞數(shù)或生物量Nv = K * Aff * fc3 / 2tt 。
12. 如權(quán)利要求10、 11和2中任一權(quán)利要求所述的方法，其中安排所 述預(yù)先校準(zhǔn)步驟以確定所述函數(shù)K。
13. 如前述任一權(quán)利要求或權(quán)利要求3所述的方法，其中安排能夠測量 所述校準(zhǔn)培養(yǎng)物中生物體總量的光學(xué)測量以提供光學(xué)信號，例如吸光率K' * Nt 其中Nt=總細(xì)胞數(shù)。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中安排所述校準(zhǔn)步驟以確定所述系 數(shù)K'。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中還包括所述總細(xì)胞數(shù)Nt的直接在 線測量，所述測量從能夠測量所述被測生物體總量的光學(xué)信號和在所述預(yù)先 培養(yǎng)步驟中確定的所述系數(shù)K '開始。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中還包括依照如下公式提供細(xì)胞活 力的信息Nv* 100/Nt=細(xì)月包活力 。
17. 如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述測量頻率的范圍為 0.1-20 MHz。
18. 實施如前述任一權(quán)利要求所述方法的生物培養(yǎng)基中細(xì)胞的在線原 位計數(shù)的系統(tǒng)，包括-以在預(yù)先確定的測量頻率范圍內(nèi)變化的不同頻率測量所述培養(yǎng)基電容的 裝置，-從所述電容測量中提取由所述培養(yǎng)基的(3-分布引起的介電常數(shù)變化信息 的裝置，以及-處理所述介電常數(shù)變化信息的裝置，以提供所述培養(yǎng)基中細(xì)胞計數(shù)信息。
19. 如權(quán)利要求18所述的系統(tǒng)，其中還包括完成所謂校準(zhǔn)培養(yǎng)物的所 述細(xì)胞培養(yǎng)物的校準(zhǔn)的裝置，包括-(i)以預(yù)先確定的頻率完成所述校準(zhǔn)培養(yǎng)物的介電常數(shù)測量的裝置，以及 -(ii)處理所述安排的介電常數(shù)測量以計算確定計數(shù)信息因子的裝置。
20. 如權(quán)利要求18或19所述的系統(tǒng)，其中還包括實現(xiàn)培養(yǎng)基中細(xì)胞平均半徑的直接離線測量的裝置，以及 實現(xiàn)所述直接測量與從在線測定所述培養(yǎng)基臨界頻率fc獲得的所述平 均半徑的間接在線測量之間的相關(guān)性的裝置。
21. 如權(quán)利要求20所述的系統(tǒng)，其中還包括作為直接離線測量所述平 均半徑的裝置的顯微鏡設(shè)備。
全文摘要
生物培養(yǎng)基中細(xì)胞在線原位計數(shù)方法，包括下述步驟以在預(yù)先確定的測量頻率范圍內(nèi)變化的不同頻率，多次測量所述培養(yǎng)基的電容或多次測量所述培養(yǎng)基的電導(dǎo)；從所述電容測量中提取由所述培養(yǎng)基中β-分布引起的介電常數(shù)變化的信息；以及處理作為頻率函數(shù)的介電常數(shù)變量的信息的變化，以提供關(guān)于所述培養(yǎng)基細(xì)胞計數(shù)的信息。
文檔編號G01N27/02GK101324501SQ200810111278
公開日2008年12月17日 申請日期2008年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月15日
發(fā)明者布魯諾·羅隆, 弗雷德里克·奧薩特, 杰夫里·埃斯特本 申請人:納米技術(shù)公司