專利名稱：快速定量分析動物骨骼肌纖維的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及快速定量分析動物骨骼肌纖維的方法。
背景技術：
動物肌肉品質(zhì)實際上是一個復雜而多變的概念，肉質(zhì)涉及到感觀指標(肉色、
大理石紋、口感等)、物理指標(剪切力、失水率、熟肉率)、生化指標(pH值、 肌間脂肪含量、肌苷酸含量、磷脂、肌纖維類型、肌纖維密度、肌纖維面積、肌纖 維直徑等)等多個方面。越來越多的研究表明，嫩度是主導肉質(zhì)的決定因素和最重 要的感官特征，是評定肌肉品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標。
動物骨骼肌肌肉質(zhì)地也是影響嫩度的重要因素之一，不論屠宰活重大小或日齡 早晚，都是肌纖維愈細者肉質(zhì)愈嫩，肌束內(nèi)的肌纖維數(shù)越多，肌纖維越細，相應地 肉品質(zhì)也就越細嫩。有關研究也報道，肌纖維直徑越細，單位肌肉橫斷面積內(nèi)肌纖 維的數(shù)量越多，切斷肌肉所需的剪切力也就越小。肌纖維比例也影響肉的嫩度，肌 纖維可根據(jù)其代謝方式的不同分為紅肌纖維、白肌纖維和中間型纖維。紅肌纖維直 徑較細，單位面積的纖維數(shù)量多，肌紅蛋白含量豐富，代謝和貯存脂肪的能力較強，
含有較多脂類物質(zhì)，主要以有氧氧化形式供能，具有較高的ATP酶活性；白肌纖維
直徑較大，單位面積的數(shù)量較少，含糖原較多，主要以糖原酵解形式供能。因此，
兩種肌纖維可以根據(jù)ATP酶活性、NADH酶活性(Y.0N0，1993)或琥珀酸脫氫酶的活 性區(qū)分開來?？焖偕L的畜禽可能因為過快的生長速度導致肌肉形態(tài)學的改變，較 粗的纖維直徑和糖酵解纖維(白肌纖維)數(shù)目增多，導致較低的蛋白質(zhì)水解潛能， 屠宰后這些特點會引起肌肉較快地變得僵硬，形成顏色蒼白、系水力低、嫩度差的 肉類產(chǎn)品，不利于深加工。
為了在性能測定過程中快速測得肌纖維指標以達到肉質(zhì)評定的目的，必須對肌 纖維進行分型、染色和纖維測量。對肌纖維的分型， 一般都是利用琥珀酸脫氫酶 (SDH)染色，琥珀酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)中的重要的脫氫酶，可以將糖代謝的中 間產(chǎn)物氧化脫氫。硝基藍四唑(NBT)是無色染料，能被還原為藍色甲脂，能促使具 有吞噬、殺菌能力的嗜中性粒細胞糖代謝能力增強。琥珀酸脫氫酶在糖代謝中的脫 掉的氫可以將NBT還原，呈現(xiàn)藍色反應顆粒二甲^，沉淀于胞質(zhì)內(nèi)。因此通過SDH染色，可以根據(jù)不同纖維的琥珀酸脫氫酶的酶活性的高低，還原NBT程度的不同，形
成不同量的藍色顆粒沉積于肌纖維中。這樣，可根據(jù)藍色反應的深淺程度區(qū)分不同
肌纖維類型。紅肌纖維含有較高的琥珀酸脫氫酶活性，顯示藍紫色；白肌纖維琥珀 酸脫氫酶酶活性很低，顯示為不著色或者很淡的著色；而琥珀酸脫氫酶酶活性一般 的肌纖維，著色程度處于這兩者顏色之間，即為中間型纖維。
目前的琥珀酸脫氫酶(SDH)染色技術流程中，在組織與含有硝基藍四唑(NBT) 的染色液反應之前，需要與中性甲醛作用2個小時以上，使組織的形態(tài)固定。染色 之后要經(jīng)歷梯度乙醇脫水，二甲苯透明等一系列過程。
在對肌纖維分析方面以往的方法大多主觀性太強，其主要體現(xiàn)在顯微拍攝后人 工計數(shù)，或者人為測量纖維橫截面(近似于橢圓)的長軸與短軸在大致估計其面積， 這種方法不但費時費力，而且主觀性強，準確性低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供快速定量分析動物骨骼肌纖維的方法。 本發(fā)明所提供的快速定量分析動物骨骼肌纖維的方法，包括如下步驟
1) 取離體動物的骨骼肌，制成冰凍切片；
2) 對步驟l)中的冰凍切片進行琥珀酸脫氫酶染色；
3) 對步驟2)染色后的切片拍照，保存圖片，然后用計算機圖像處理分析軟件 對圖片進行定量分析。
其中，所述方法中的琥珀酸脫氫酶染色包括如下步驟
a) 將所述冰凍切片在琥珀酸脫氫酶染色液中，37X:孵育40min;
b) 將步驟a)中染色后的切片在10%中性甲醛中固定10min;
c) 將步驟b)中固定后的切片用梯度濃度(75%、 85%、 95%和100%)的乙醇逐 級脫水；
d) 用體積比為l: 2至2: 1的乙醇和二甲苯混合液透明步驟c)中乙醇脫水后 的切片；
e) 用100%二甲苯透明經(jīng)過步驟(1)處理的切片。
所述方法中，采用Image Pro-plus 5. 02版本軟件對所述圖片進行定量分析。 上述動物具體可為雞。
本發(fā)明所述的方法可在畜或禽的肉質(zhì)鑒定中應用。 所述禽具體可為雞。本發(fā)明的快速定量分析動物骨骼肌纖維的方法，首先采取液氮冷凍處理骨骼肌 樣品，液氮冷凍處理一方面能保持肌肉內(nèi)部完整的原始形態(tài)，令其不會因時間、受 力等因素而變形從而影響測定，另一方面避免使肌肉內(nèi)部的水分流失，導致肌肉萎 縮，同時避免肌肉內(nèi)部的水分成核形成冰晶，冰晶對肌纖維形態(tài)破壞較大，直接影 響肌纖維直徑和密度的測量；然后采用冰凍切片技術制備切片，冰凍切片技術能保 持組織原始形態(tài)，切片上肌纖維的測定指標幾乎與其在動物體內(nèi)的指標相同，另外 冰凍切片速度快，組織在切片時受力小，利于后期的定量分析，并且采用統(tǒng)一標準 的連續(xù)切片，使切片之間具有很高的相似性，利于大量的樣本統(tǒng)計和彼此間的相關 分析；再次采用改進的琥珀酸脫氫酶染色方法對切片進行染色，目前的琥珀酸脫氫 酶(SDH)染色技術流程中，在染色之前，切片需要長時間的甲醛固定，染色時間 較長，而改進的琥珀酸脫氫酶染色方法將原來長達2個小時的染色前固定這一步驟 改為染色后的固定，并且將其時間控制在10分鐘以內(nèi)，另外與含有硝基藍四唑(NBT) 的染色液反應著色這一步的時間也由原來的1個多小時縮短到現(xiàn)在的40分鐘，并 且在染色之后的梯度乙醇脫水這一步驟中，去掉50%和60%這兩個梯度對于整體效 果并無影響，這樣在整體染色效果不變的情況下染色時間大大縮短，并且對染色效 果并無影響；最后，在染色后采用ImagePro-Plus軟件定量分析圖片，這一方法取 代了繁瑣的人工手動測量，使得測量速度大大提高，同時也避免了人工操作所帶來 的誤差，利用加載了新的宏命令的軟件，可以在一次操作中完成一張切片圖像的肌 纖維的分類、計數(shù)、直徑、面積和密度等多個指標的分析，分析后得到數(shù)據(jù)，可以 與剪切力、失水率等常規(guī)肉質(zhì)指標相結合分析，使肉質(zhì)評定數(shù)據(jù)更加完整準確。
通過本發(fā)明的快速定量分析動物骨骼肌纖維的方法， 一方面，可快速得到詳細 的肌纖維特性分型和測量記錄，這些數(shù)據(jù)可以更詳細、準確地描述肌纖維特性，反 映肉質(zhì)的優(yōu)劣水平，從而客觀地對測定樣品的肌肉品質(zhì)作出評價，以指導品種的繼 代選育和雜交利用。另一方面，避免隨機誤差。本發(fā)明的快速定量分析動物骨骼肌 纖維的方法，解決了快速制片和自動分析兩大關鍵問題，使得肌纖維數(shù)據(jù)的獲得更 為簡便。紅肌纖維豐富就意味著肌纖維更纖細，它也更有利于保持肌纖維內(nèi)的水分， 使肌肉更為細膩多汁。因此，本發(fā)明的快速定量分析動物骨骼肌纖維的方法可以從 肌纖維分類的角度篩選肉質(zhì)優(yōu)良的個體。


圖1為肌纖維的分型標準RF:紅肌纖維，MF:中間型，WF:白肌纖維 圖2為肌纖維類型的劃分 a:白肌纖維，b:紅肌纖維
圖3為魯西斗雞和清遠麻雞不同類型胸淺肌組織類型百分比
圖4為RMW型的魯西斗雞和清遠麻雞的胸淺肌肌纖維類型比例 圖5為RMW型的魯西斗雞和清遠麻雞的胸淺肌肌纖維直徑 圖6為不同類型的魯西斗雞和清遠麻雞的體重
1:所有魯西斗雞的體重；2:所有清遠麻雞的體重；3:所有魯西斗雞和清遠 麻雞中的母雞的體重；4:所有魯西斗雞和清遠麻雞中的公雞的體重；5:所有魯西 斗雞和清遠麻雞中RMW型雞的體重；6:所有魯西斗雞和清遠麻雞中麗型雞的體重； 7:所有魯西斗雞和清遠麻雞中W型雞的體重。
圖7為不同類型的魯西斗雞和清遠麻雞的胸淺肌組織的剪切力
1:所有魯西斗雞的胸淺肌組織的剪切力；2:所有清遠麻雞的胸淺肌組織的剪 切力；3:所有魯西斗雞和清遠麻雞中RMW型雞的胸淺肌組織的剪切力；4:所有魯 西斗雞和清遠麻雞中MW型雞的胸淺肌組織的剪切力；5:所有魯西斗雞和清遠麻雞 中沐型雞的胸淺肌組織的剪切力。
圖8為不同類型的魯西斗雞和清遠麻雞的胸淺肌組織的失水率
1:所有魯西斗雞的胸淺肌組織的失水率；2:所有清遠麻雞的胸淺肌組織的失 水率；3:所有魯西斗雞和清遠麻雞中RMW型雞的胸淺肌組織的失水率；4:所有魯 西斗雞和清遠麻雞中麗型雞的胸淺肌組織的失水率；5:所有魯西斗雞和清遠麻雞 中W型雞的胸淺肌組織的失水率。
具體實施例方式
實施例l、定量分析骨骼肌肌纖維
一、定量分析魯西斗雞和清遠麻雞的骨骼肌肌纖維
魯西斗雞是一種中國的土著雞種，屬玩賞型，但是體型高達魁梧，體質(zhì)健壯， 體軀長，胸腿肌發(fā)達，肌肉形態(tài)較有特點，清遠麻雞是一種中國的土著雞種，以其 體型小、皮下和肌間脂肪發(fā)達、皮薄骨軟而著名，現(xiàn)在已經(jīng)成為我國活雞出口的小 型肉用名產(chǎn)雞之一。
選取處于生長曲線拐點處(210至260日齡)的魯西斗雞10只，8母2公，清 遠麻雞19只，13母6公，上述實驗用雞的飼養(yǎng)管理條件完全一致。分別定量分析魯西斗雞和清遠麻雞的骨骼肌肌纖維。實驗方法如下
1) 取樣
魯西斗雞和清遠麻雞停飼24個小時(飲用水正常供應)后口腔放血屠宰；將 屠宰放血后的魯西斗雞和清遠麻雞浸入冷水中，充分打濕羽毛，然后瀝水放在手術 臺上，噴撒雙氧水于禽體，沿龍骨突剪開皮膚，在左側胸淺肌上1/3處沿肌纖維反 向，采集2cmX0. 5cmX0. 5cm長方體肌肉塊，液氮浸泡保存。
2) 制備冰凍切片
啟動Leica CM1900冰凍切片機，設置切片室溫度一25t:，冰凍頭溫度為一20 °C，切片厚度為10um，預冷lh;將樣品從液氮中取出，放入到冰凍切片室中平衡 0.5 h;取出樣品，修剪成厚0.5cm的組織薄片，在預冷的冰凍頭上滴一滴OCT冰 凍切片包埋劑，迅速將組織粘上，順時針沿組織的邊緣涂抹OCT冰凍切片包埋劑直 到完全覆蓋為止，靜置直至OCT冰凍切片包埋劑全部變?yōu)榘咨粚⒈鶅鲱^連同組織 一起固定在冰凍頭架上，旋緊螺絲，放下展片板，緩慢旋轉(zhuǎn)手柄，直到切到組織樣， 一旦有完整的組織切片出現(xiàn)，迅速用處理過的載玻片粘去組織切片，標記好，放入 切片室中預冷的載玻片盒中。
3) 琥珀酸脫氫酶(SDH)染色
染色前l(fā)h，將事先配好的染色液放入到37"C培養(yǎng)箱中預熱；染色液的組分如 下0. 2M琥珀酸鈉溶液100ml， 0. 2M NaH2P04 6 . 5ml， 0. 2M Na2HP04 43 . 5ml, 0. 1%石肖 基藍四唑(NBT)200ml，去離子水50ml;從載玻片盒中取出粘有組織切片的載玻片， 室溫下，自然涼干至切片發(fā)白；將載玻片放入到預熱的染色液中，37'C孵育40min; 取出載玻片后，在去離子水中緩慢沖洗30s，放入到10^中性甲醛中固定10min; 固定后的切片再用去離子水緩慢沖洗30s，然后使用梯度濃度(75%、 85%、 95%和 100%)的乙醇逐級脫水；再用體積比為2: 1-1: 2的乙醇、二甲苯混合液過渡透明 脫水后的切片；最后用100%二甲苯透明組織切片，甘油明膠封片。
4) 觀察與拍照
靜置2h后，在Olympus BX51研究級生物學正置顯微鏡，目鏡IOX，物鏡10X下 觀察染色切片，拍攝目標區(qū)域，選擇顯微鏡自帶拍攝軟件中"Show Scale (顯示標 尺)" 一項，這時圖片右下角出現(xiàn)長度為500微米的標尺，保存。
5) 計算機分析圖片
冰凍切片圖片的分析處理均采用Image Pro-plus 5. 02版本軟件完成。Image-Pro Plus (IPP)軟件是Media Cybernetics公司著名的圖像處理分析 軟件，支持圖像采集，增強，標定，彩色圖像處理，計數(shù)，測量，分析，圖像標注， 圖像數(shù)據(jù)庫，報表生成器，宏紀錄，VBA宏編程進行功能擴展，全面的Internet支 持。同時，支持用[++,￥1)等擴展專對自己應用的特定功能。支持各種輸入源，各 種圖像格式，特別支持大尺寸圖像.特有熒光，材料分析模塊，以及顯微鏡控制模 塊(用于自動顯微鏡控制)，適用于生物醫(yī)學，生命科學，工業(yè)應用等多個領域的 圖像分析和處理。
Image-Pro Plus 5. 02可以運行于Microsoft Windows 32位操作系統(tǒng)Windows 2000 (service pack 4)， and Windows XP Professional (service pack l及 以后版本)。
按照軟件要求，將Image-Pro Plus安裝在電腦的"C: \IpWin5\"目錄下；"個 性化設置文件"(主要是標尺設置和自定義宏命令)安裝在"D: \根目錄下。
在批量圖片處理前，選取形態(tài)保持完整、染色較好的肌纖維圖片作為模板圖片， 然后根據(jù)軟件自身的標尺和圖片采集時的標尺大小調(diào)整，使得兩個標尺代表的長度 一致，隨后設定IPP的灰度值，使之符合要求。其它圖片均以此標準進行目標纖維 的捕捉和相關參數(shù)的統(tǒng)計分析。在選定的圖片里面，設定好測定的參數(shù)——面積 (Area)、平均直徑(Diamet er—mean)、平均灰度值(Density—mean)、 累禾只 灰度值(I0D)。在肌束內(nèi)隨機選擇具有代表性的紅肌纖維和白肌纖維，用IPP分 析其灰度值，此時會測定出一個紅肌纖維和白肌纖維的灰度值的范圍，選取紅肌纖 維范圍的下限和白肌纖維的上限作為三種肌纖維類型的評定界限，位于兩個界限值 之間的肌纖維類型，判定為中間型纖維，如圖l所示。
具體操作步驟如下
1. 打開軟件
雙擊"Image-Pro Plus"，打開進入界面，點擊左上角的file按鍵，打開一 張肌纖維輪廓清晰的圖片；
2. 更改光密度值
在組化染色中，肌纖維類型之間的鑒別是通過肌纖維染色程度的深淺程度不同 而區(qū)分的，表現(xiàn)在IPP中，就是intensity (光密度值)的不同。在IPP軟件中， 默認的intensity格式，代表的是灰度值，即顏色越深值越小，顏色越淺值越大。 這顯然與目標不符，而實際上測量的染色程度是光密度值，染色越深，光密度值越大。
具體操作如下點擊"measure-〉calibration-Mntensity，，，然后在窗口中 點"new"按鈕，再點一下"std optical density"，此時可以看到窗口中的直線 變成了反向的曲線，再點最上方的"system"按鈕，使得以后所有的操作都是按照 統(tǒng)一標準來操作，最后點擊"close"關閉窗口。
3、 校正標尺
軟件中的標尺和實際拍攝圖片中的標尺往往不一致，為了統(tǒng)一兩者之間的尺 度，需要在IPP里面校正標尺，使得軟件和拍攝圖片的尺度一致。具體操作是點 擊"measure-Calibration-〉spatial"，在彈出的標尺標定菜單中，然后點擊"new"， 在最上方的"name"項下的"spatial cal 0"處點一下，改成英文字符"500ura"， 在"UNIT"項下填入"um"，給"um"下方的"Convert when change unit"選項 打勾。隨后點擊"pixels/unit"框里的"image"，彈出"scaling"對話框，同 時在標尺圖片左上角顯出一個標尺，將鼠標移到這個標尺的橫杠上，點一下左鍵， 光標就立即變成小手，拖動光標到圖片的標尺處，用左鍵拖動軟件標尺的兩端使之 與圖片上標尺的兩端對齊。如照片是在10倍物鏡、IO倍目鏡條件下拍攝，拍攝單 位填寫"500"，點擊"OK"關閉"scaling"窗口，回到"spatial calibration" 窗口，點擊"close"結束。若標尺作的不對，可以直接點擊"delete";
4、 肌纖維參數(shù)的選定
根據(jù)需要，選定常用的測量參數(shù)，其中，常用的參數(shù)有"Area" 、 "Density (mean) ，， 、 "Diameter (mean) ，， 、 "I0D(Integrated Optical Density)，，。 測量肌纖維的目的是測量其表觀指標，所以選擇前三者參數(shù)指標。具體操作步驟 點"measure-〉count/size-〉measure-〉select measure"，點擊目標參數(shù)，選定參 數(shù)，點擊"OK"，回到"count/size"界面，完成參數(shù)選擇。
5、 目標區(qū)域(A0I)選擇
A0I是Image-Pro Plus中最有用、最重要的概念，這也是Image-Pro Plus使 用過程中的關鍵操作。肌纖維的橫截面積并不是理想的圓形，而是各種不規(guī)則的閉 合圖形。為了更加真實地再現(xiàn)肌纖維的實際參數(shù)，本方法中可以借助界面最上方的 的"Irregular"工具〕^K來完成。具體操作步驟如下點擊界面上方的，會出 現(xiàn)一個工具條，點擊"Trace"尋跡工具，在右側的"Auto"前打勾，同時將"Speed" 的值調(diào)整為"1"(慢速可以隨時修正尋跡方向)。這個工具的標題叫Magic wand。將鼠標移至圖中一個肌纖維的內(nèi)膜，光標就變 成魔棒了，在一個位置左鍵點一下，就選中了這個位置及其周圍灰度相似的區(qū)域。 這里"相似"的定量范圍由Range的值來決定。較大的range值為較大的灰度范圍， 點一下能選中一大片區(qū)域。較小的range值則為較小的灰度范圍。在一個區(qū)域上多 點幾下，就能選中這個區(qū)域的整個邊界了。最后點一下右鍵，就確定了一個不規(guī)則 形狀的選定區(qū)域。smooth值是用來平滑區(qū)域邊界的。 一般不需要平滑，因此默認值 為零。選中一個區(qū)域后如果還要在同一張圖片上再選另一個區(qū)域，不能直接點選， 要先點擊一下工具欄上的Multiple A0I按紐，再點擊add，接下去就可以到另一個 選擇區(qū)域點選。選好一個新的區(qū)域后再回去點Multiple A0I—add確認，再繼續(xù)下 一個，直到選取完所有的AOI。最后在圖片上任一處點一下右鍵結束選擇操作。結 束后如果又想再增加選擇區(qū)域，只要再點一下"new A0I"按紐，就可以調(diào)出工具 條繼續(xù)增加選擇區(qū)域。如果肌纖維輪廓不是太清晰，可將"Auto"前的對勾去掉， 手動輔助選擇AOI。
6、自定義宏
"宏"實際上不過是把一連串的操作組合到一個操作的有效工具，可有效的客 觀的保證判斷多張圖片之間的一致性。操作的前提是，在所有待處理照片中，選擇 一張具有形態(tài)保持完整、染色較好的典型圖片，進行仔細的選色及分析測量。得到 滿意的結果后，就可以按照這個既定的操作程式進行宏的編制了。
編制宏操作前的準備把"count/size"窗口中各項選擇完成后，包括各種參 數(shù)選擇，點擊file菜單中的"save setting"保存到另一個磁盤分區(qū)，命名為英 文名。打開"statistics"窗口，獲取測量值后，點"file"菜單中的"DDE Option" 窗口，設置一下測量數(shù)據(jù)傳往Excel的規(guī)則。在DDEOption窗口中從上到下，在 "Append next date set to the bottom"前打勾。設定了 "DDE option"后，不 要關閉"statistics"窗口，打開一個空白"Excel"表格。
錄制宏打開一張典型的照片，打開"count/size"窗口，還有空著的 "statistics"窗口，點擊"Macro-〉Record Macro"，就調(diào)出來錄制宏的開始窗口。
錄制宏的步驟點"Count/size"窗口的"file-load settings"，從彈出的 文件夾選在菜單中調(diào)出剛才保存的"count設定文件"，點擊"Count"，計數(shù)，統(tǒng) 計數(shù)據(jù)會馬上顯示在"Statistics"窗口中，點擊"Statistics"窗口中的"file-DDE to Excel"，點"Sh叩recording"結束錄制宏。為了精準，以后每個肌纖維進行尋跡后，都可以使用宏快捷鍵，將測定數(shù)據(jù)保存在一個文件夾內(nèi)。 7.肌纖維類型的區(qū)分
選擇3~5張典型的圖片，依據(jù)組化圖譜限定紅肌纖維和白肌纖維，并使用IPP
軟件對其光密度值進行測定，隨后將白肌纖維和紅肌纖維的光密度值按照從小到大
的順序排列，假定白肌纖維的光密度值最小值為L,最大值為IW2;紅肌纖維的光密 度值的最小值Iw，最大值是IR2。在此，人為地認為三種肌纖維的光密度值分別為 白肌纖維〈IW2，中間型纖維L IR1，紅肌纖維〉IR,，所有的肌纖維的數(shù)據(jù)匯總后， 根據(jù)如上規(guī)則，進行對比，分析出肌纖維類型。
在本實驗中，白肌纖維的光密度值最小值為O. 1483最大值為0.1821;紅肌纖 維的光密度值的最小值0. 2644，最大值是0. 4735。 〈0. 1821的為白肌纖維， 0. 1821~0. 2644的為中間型纖維，〉0. 2644的為紅肌纖維。
實驗重復3次，每一次重復的圖片上選取3個視野，計算平均值。
在單一組織的肌纖維分型上，又將骨骼肌組織劃分為三個類型RMW (混合有 紅肌纖維、中間型纖維和白肌纖維的骨骼肌纖維組成類型)、MW (混合有中間型纖 維和白肌纖維的骨骼肌纖維組成類型)、W (完全由白肌纖維構成的骨骼肌纖維組 成類型)，如圖2所示。進一步分析得到各種肌纖維的平均灰度值、平均直徑、肌 束內(nèi)的肌纖維數(shù)目、每種類型肌纖維的數(shù)目以及所占的比例等等。所采集的定量化 描述的測定數(shù)據(jù)用于Duncan多重比較分析。
二、定量分析魯西斗雞和清遠麻雞的骨骼肌肌纖維的結果
1)三種類型肌纖維在不同骨骼肌組織中的分布
從切片染色觀察和平均灰度值測定兩個方面分析表明，SDH染色可以用來成功 地將骨骼肌中的肌纖維分為三種類型。又根據(jù)每個研究對象所含纖維類型的情況， 將骨骼肌分成三種類型，即l)RMW型含有紅肌纖維、中間型纖維和白肌纖維； 2)MW型含有中間型纖維和白肌纖維；3)W型只含有白肌纖維。
魯西斗雞和清遠麻雞中不同胸淺肌組織類型的百分比(不同胸淺肌組織類型的
百分比=各個肌纖維類型的雞的只數(shù)/測試雞的只數(shù)，如RMW型百分比-RMW型雞的只 數(shù)/測試雞總數(shù))的分析結果表明，在魯西斗雞和清遠麻雞中都出現(xiàn)了胸淺肌中含 有不同比例的紅肌纖維和中間型肌纖維的個體，擁有不同類型胸淺肌的個體在魯西 斗雞和清遠麻雞兩個品種中的分布比例見圖3，在檢測樣本中魯西斗雞有30%的個 體為RMW型，而在清遠麻雞中，只有1例出現(xiàn)了RMW型胸淺肌，接近95%的清遠麻雞均為單純含有白肌纖維的W型個體。
魯西斗雞和清遠麻雞中的RMW型的胸淺肌也表現(xiàn)出了明顯的差異。 總體來講，雖然清遠麻雞和魯西斗雞中都有個體的胸淺肌被定義為RMW類型， 但二者在肌纖維類型比例(肌纖維類型比例-各個肌纖維的數(shù)目/R麗類型雞的肌纖 維的總數(shù)，)上仍然有所不同(圖4)。清遠麻雞的白肌纖維比例髙，中間型纖維 的比例低，而二者的紅肌纖維比例差異不明顯。魯西斗雞的肌纖維直徑總體大于清 遠麻雞，但不論對于哪個雞種來說，同一部位的紅肌纖維直徑總是明顯小于白肌纖 維直徑，而中間型纖維的直徑則介于二者之間，但更接近于白肌纖維，如圖5所示。 2)生長性狀及胸淺肌肉質(zhì)性狀的分析
本實驗所用的兩個雞種，在胸淺肌取材時間都選取了生長曲線拐點處所對應的 生長階段。兩個品種在體重上稍有差別，但是差別不顯著。將三種不同胸肌組織類 型個體進行比較，可以看出，RMW型個體生長較慢，體重較輕，MW型和W型個體體 重依次提高，如圖6所示。脛骨長結果也類似體重結果，RMW型個體的脛骨長顯著 小于MW型個體的脛骨長(P〈0. 05)。
剪切力和系水力(失水率)是反映肉質(zhì)好壞的最常用指標。從剪切力的角度來 看，魯西斗雞與清遠麻雞的差異不顯著，同一品種內(nèi)三種類型胸淺肌之間的差異也 不顯著，如圖7所示。失水率方面，兩個品種的差異不顯著，但是IMW型胸淺肌的 失水率明顯低于其他類型，如圖8所示。說明紅肌纖維的存在對保持肌肉水分有一 定幫助，從而可以使肌肉更加鮮嫩多汁。
權利要求
1. 一種定量分析動物骨骼肌纖維的方法，包括如下步驟1)取離體動物的骨骼肌，制成冰凍切片；2)對步驟1)中的冰凍切片進行琥珀酸脫氫酶染色；3)對步驟2)染色后的切片拍照，保存圖片，然后用計算機圖像處理分析軟件對圖片進行定量分析。
2、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中的琥珀酸脫氫酶染色 包括如下步驟a) 將所述冰凍切片在琥珀酸脫氫酶染色液中，37'C孵育40min;b) 將步驟a)中染色后的切片在10%中性甲醛中固定10min;c) 將步驟b)中固定后的切片用75%、 85%、 95%和100%梯度濃度的乙醇逐級脫水;d) 用體積比為l: 2至2: 1的乙醇和二甲苯混合液透明步驟c)中乙醇脫水后白， 切片；e) 用100X二甲苯透明經(jīng)過步驟d)處理的切片。
3、 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述計算機圖像處理分析軟 件為Image Pro-plus 5. 02版本軟件。
4、 根據(jù)權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述動物為雞。
5、 權利要求1至4中任一所述的方法在畜或禽的肉質(zhì)鑒定中的應用。
6、 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述禽為雞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速定量分析動物骨骼肌纖維的方法。該方法包括如下步驟1)取離體動物的骨骼肌，制成冰凍切片；2)對步驟1)中的冰凍切片進行琥珀酸脫氫酶染色；3)對步驟2)染色后的切片拍照，保存圖片，然后用計算機圖像處理分析軟件對圖片進行定量分析。所述琥珀酸脫氫酶染色在目前的琥珀酸脫氫酶染色技術上進行了改進。所述計算機圖像處理分析軟件為Image Pro-plus 5.02版本軟件。本發(fā)明的快速定量分析動物骨骼肌纖維的方法可以從肌纖維分類的角度篩選肉質(zhì)優(yōu)良的個體。
文檔編號G01N1/30GK101285828SQ200810113830
公開日2008年10月15日 申請日期2008年5月30日 優(yōu)先權日2008年5月30日
發(fā)明者寧中華, 寧 李, 昊 秦, 連正興, 鄧學梅, 強 高 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學