專利名稱：同型半胱氨酸-葉酸免疫膠體金層析聯(lián)合檢測(cè)卡及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用膠體金免疫層析技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)血液中同型半胱氨酸一葉酸水平的檢 測(cè)卡及其制備方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
同型半胱氨酸(homocystdne， Hcy)是人體內(nèi)蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物，同時(shí)參與了體內(nèi) 轉(zhuǎn)硫化作用途徑。Hcy通過(guò)B12在5-甲基四氫葉酸存在下經(jīng)葉酸循環(huán)重新甲基化為蛋氨酸， 隨后產(chǎn)生的5,10-二甲基四氫葉酸被甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)還原成5-甲基四氫葉酸。 Hcy也能被甘氨酸三甲內(nèi)鹽重甲基化為蛋氨酸。重甲基化在肝臟及腎臟中完成，蛋氨酸循 環(huán)中，食物中蛋氨酸轉(zhuǎn)化為S-腺苷甲硫氨酸(SAM)， SAM以作為甲基轉(zhuǎn)移酶甲基組供體的 底物，在甲基轉(zhuǎn)移酶作用下產(chǎn)生唯一產(chǎn)物S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)， SAH經(jīng)SAH水解酶 水解為Hcy及腺苷。如因各種原因引起血Hcy濃度升高，可發(fā)生Hcy尿癥或高Hcy血癥，并對(duì)動(dòng)脈血管造 成傷害。研究認(rèn)為Hcy是一新的血管系統(tǒng)疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，與心血管疾病、腦梗塞、 外周血管性疾病有關(guān)，也與葉酸或維生素B12、 B6的缺乏相關(guān)。六十年代末，McCully從 病理上發(fā)現(xiàn)高胱氨酸尿癥和胱硫醚尿癥患者早期即可發(fā)生全身動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成， 七十年代初他又通過(guò)動(dòng)物模型證實(shí)同型半胱氨酸血中蓄積可導(dǎo)致類似血管損害，八十年代 人們提出高同型半胱氨酸血癥是動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，尤其是冠狀 動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗塞的危險(xiǎn)指標(biāo)，它的濃度升高程度與疾病的危險(xiǎn)性成正比，被譽(yù)為 "心臟新殺手"。目前不少研究表明高HCY是腦血管疾病危險(xiǎn)因素指標(biāo)，是缺血性腦血管 病、腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，高Hcy和腦卒中疾病發(fā)生密切相關(guān)。葉酸(Folate)是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，生化特性相近的化合物統(tǒng)稱，是由喋啶、對(duì)氨基 苯甲酸和1個(gè)或多個(gè)谷氨酸結(jié)合而成，其與維B12—起用以合成肌體必須的DNA，缺乏會(huì) 導(dǎo)致巨幼紅細(xì)胞貧血；婦女孕前或妊娠早期缺乏葉酸是神經(jīng)管畸形發(fā)生的重要病因之一； 同時(shí)，葉酸與同型半胱氨酸代謝關(guān)系密切，葉酸缺乏可使同型半胱氨酸向蛋氨酸轉(zhuǎn)化 出現(xiàn)障礙，進(jìn)而導(dǎo)致同型半胱氨酸血癥，從而導(dǎo)致心血管發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，故檢測(cè)葉酸 水平對(duì)預(yù)防心血管疾病的發(fā)生亦具有重要的生物學(xué)意義。Hcy檢測(cè)目前主要采用的技術(shù)方法有高效液相(HPLC)方法、熒光偏振免疫檢測(cè) (FPLA)方法、酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)和化學(xué)發(fā)光法等。目前葉酸的檢測(cè)方法主要有微4生物法、同位素放射免疫法，此外還有氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)、色譜分析法、離子捕獲法、克隆酶供體免疫測(cè)定法(CEDIA)、酶聯(lián)配體吸附試驗(yàn)(ELLSA)和化學(xué)發(fā)光受體實(shí)驗(yàn)等。高效液相 (HPLC)方法操作比較復(fù)雜，試驗(yàn)耗時(shí)比較長(zhǎng)，且試驗(yàn)數(shù)據(jù)變異比較大。熒光偏振免疫檢 測(cè)(FPLA)方法檢測(cè)費(fèi)時(shí)，須配備專用全自動(dòng)熒光分析儀器，設(shè)備昂貴，不宜普及。酶聯(lián)免 疫技術(shù)(ELISA)大部分操作為手工操作，比較耗時(shí)，定量檢測(cè)需配備儀器，必須有專門的 實(shí)驗(yàn)室?；瘜W(xué)發(fā)光法，檢測(cè)時(shí)間在2小時(shí)以上，且價(jià)格昂貴。以上方法均不適于在基層檢驗(yàn) 場(chǎng)所應(yīng)用。免疫膠體金層析技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏和特異性好，用于同型半胱氨酸和葉 酸的快速檢測(cè)，有益于同型半胱氨酸和葉酸基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢測(cè)的普及，此項(xiàng)技術(shù)雖然是一種 較為成熟的技術(shù)，但對(duì)不同的抗原抗體系統(tǒng)的應(yīng)用有差異，包括原料來(lái)源，試劑配制，生產(chǎn) 工藝等都不同，需進(jìn)行新的設(shè)計(jì)和試驗(yàn)。目前國(guó)內(nèi)外均未查到有用于聯(lián)合檢測(cè)同型半胱氨酸 一葉酸的免疫膠體金層析快速診斷聯(lián)合檢測(cè)卡，包括文獻(xiàn)報(bào)道和發(fā)明專利。 發(fā)明內(nèi)容為克服現(xiàn)有同型半胱氨酸與葉酸檢測(cè)技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)同型半胱 氨酸一葉酸的聯(lián)合檢測(cè)卡。本發(fā)明根據(jù)膠體金免疫層析技術(shù)特點(diǎn)和抗原抗體系統(tǒng)特點(diǎn)，設(shè) 計(jì)新的原材料，試劑和工藝流程，應(yīng)用本發(fā)明提供的聯(lián)合檢測(cè)卡檢測(cè)同型半胱氨酸一葉酸 水平，具有簡(jiǎn)單，快速，靈敏和特異性好等特點(diǎn)，15分鐘以內(nèi)出結(jié)果，并且價(jià)格低，適用 于基層檢測(cè)和臨床初篩。本發(fā)明所述聯(lián)合檢測(cè)卡是由底板(1)上依次接合吸水墊(2)、特定包被的硝酸纖維膜 (3)、涂覆膠體金標(biāo)記特異抗體的玻璃纖維膠體金結(jié)合墊(4)、樣品墊(5)而組成的條形 物；所述玻璃纖維膠體金結(jié)合墊涂覆膠體金標(biāo)記特異抗體為S腺苷同型半胱氨酸單克隆抗 體和葉酸單克隆抗體。檢測(cè)樣品經(jīng)過(guò)樣品墊和結(jié)合墊再經(jīng)層析作用在NC膜上出現(xiàn)捕獲線 和質(zhì)控線，用肉眼判斷結(jié)果。在NC膜上僅僅出現(xiàn)一條質(zhì)控線，結(jié)果為陽(yáng)性，在NC膜上同 時(shí)出現(xiàn)捕獲線和質(zhì)控線，結(jié)果為陰性，不出現(xiàn)線條表示試紙條或測(cè)試卡失效。15分鐘內(nèi)出 結(jié)果。本發(fā)明所述聯(lián)合檢測(cè)卡吸水墊為一種濾紙，包括吸水紙和濾油紙，切成要求大小直接 使用。貼在底板的末端，起吸水作用。本發(fā)明所述聯(lián)合檢測(cè)卡上特定包被的NC膜是一種專門用于膠體金試紙條的材料，由 一層濾膜和膠膜組成，成巻筒裝，NC膜上噴3條線，分別為2條捕獲線和1條質(zhì)控線，捕 獲線(6)噴涂的是S腺苷同型半胱氨酸-牛血清白蛋白抗原，捕獲線(7)噴涂的是葉酸-牛血清白蛋白抗原，質(zhì)控線(8)噴涂的是兔抗小鼠二抗；NC膜貼在底板的中間，兩端分 別與結(jié)合墊和吸水墊連接。本發(fā)明所述聯(lián)合檢測(cè)卡上結(jié)合墊為玻璃纖維紙，用含聚乙烯醇的硼酸緩沖液浸泡處理 后，37'C干燥過(guò)夜，噴涂上膠體金標(biāo)記的SAH單克隆抗體和葉酸單克隆抗體，再冷凍干燥， 結(jié)合墊上與樣品墊銜接，下與NC膜銜接。本發(fā)明所述聯(lián)合檢測(cè)卡樣品墊為玻璃纖維紙，用含聚乙烯醇的硼酸緩沖液浸泡處理， 緩沖液PH為7.2，浸泡處理后，37'C千燥過(guò)夜，在試劑條中起過(guò)濾樣品的作用，位于結(jié)合 墊上，貼在底板上。本發(fā)明還提供上述聯(lián)合檢測(cè)卡在制備同型半胱氨酸一葉酸診斷試紙條中的應(yīng)用，診斷 試紙條還包括標(biāo)識(shí)條，此標(biāo)識(shí)條為兩個(gè)帶有標(biāo)識(shí)的不干膠紙，分別粘貼在試紙條的兩端， 帶有箭頭端是貼在樣品墊和結(jié)合墊上，由此端浸入待測(cè)樣品，靠另一端的吸水墊的吸水作 用，使樣品經(jīng)過(guò)NC膜。本發(fā)明還提供上述聯(lián)合檢測(cè)卡在制備同型半胱氨酸一葉酸測(cè)試卡中的應(yīng)用，測(cè)試卡還 包括塑料卡，此塑料卡是一個(gè)用塑料特制的卡，由背板、蓋板組成，背板與蓋板可嵌合在 一起，背板主要有一個(gè)放試紙條的槽和與蓋板結(jié)合的卡齒，蓋板主要包括一個(gè)檢測(cè)窗、一 個(gè)加樣窗以及與背板結(jié)合的卡齒，檢測(cè)窗旁邊分別印有T1、 T2和C字樣，Tl表示捕獲線 (6)的位置，T2表示捕獲線(7)的位置，C表示質(zhì)控線(8)的位置，檢測(cè)窗是觀察結(jié)果 的窗口，加樣窗是滴加樣品的位置。此塑料卡起保護(hù)試紙條的作用，并且更美觀，減少污 染和保護(hù)操作者的安全。本發(fā)明所述試紙條的制備方法，包括如下步驟1) SAH-BSA抗原、Folate-BSA抗原的制備a) 將BSA、 SAH和偶聯(lián)劑于反應(yīng)液中室溫反應(yīng)，凝膠層析分離偶聯(lián)物，透析，濃縮， 制成免疫抗原和包被抗原；b) 將BSA、 Folate和偶聯(lián)劑于反應(yīng)液中室溫反應(yīng)，凝膠層析分離偶聯(lián)物，透析，濃縮， 制成免疫抗原和包被抗原；2) SAH單抗、Folate單抗的制備a) 以合成的SAH-BSA偶聯(lián)物免疫Balb/c小白鼠，經(jīng)多次基礎(chǔ)免疫及加強(qiáng)免疫后，取小 鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞，利用PEG細(xì)胞融合技術(shù)制備SAHmAb，腹水?dāng)U增，分 離純化；b) 以合成的Folate-BSA偶聯(lián)物免疫Balb/c小白鼠，經(jīng)多次基礎(chǔ)免疫及加強(qiáng)免疫后，取 小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞，利用PEG細(xì)胞融合技術(shù)制備FolatemAb，腹水?dāng)U增， 分離純化；3) 膠體金的制備a) 量取一定量的洗液于潔凈的燒瓶中，煮沸5分鐘，再換一次酸洗液，煮沸5分鐘；b) 量取一定量的超純水于該燒瓶中，煮沸5分鐘，再換一次超純水，煮沸5分鐘；C)棄去超純水，稱取適量三蒸水于該燒瓶中，加熱至沸騰，加入適量1%氯金酸，加熱 至沸騰；d)攪拌下加入6 10毫升2%檸檬酸三鈉，沸騰5-10分鐘；4) 膠體金探針標(biāo)記各自將SAH單克隆抗體、Folate單克隆分別用NaCl透析過(guò)夜，離心 除去蛋白沉淀；取膠體金100毫升，調(diào)節(jié)膠體金溶液PH值9.0，各自攪拌加入l毫升稀釋 的SAH單克隆抗體、Folate單克隆抗體，再分別緩慢加入1毫升10%BSA充分混勻，攪拌， 離心棄上清，加入工作液溶解；5) 制備檢測(cè)同型半胱氨酸的膠體金免疫試紙條先將玻璃纖維膜放入質(zhì)量百分比濃度為1% 的牛血清白蛋白、質(zhì)量百分比濃度為1%的Triton X-100的磷酸鹽緩沖液中封閉30min， 37 'C烘干，再將玻璃纖維膜分別浸泡于標(biāo)記SAH單克隆抗體、Folate單克隆抗體的膠體金探 針中，真空千燥，將制備好的試劑條板上NC膜用噴膜機(jī)分別噴上捕獲抗原(SAH-BSA偶 聯(lián)抗原)、捕獲抗原(Folate-BSA偶聯(lián)物)和質(zhì)控抗體(兔抗Balb/c球蛋白抗體)，噴完后 37t:干燥過(guò)夜；將吸水墊、已包被的硝酸纖維膜、玻璃纖維膠體金結(jié)合墊、樣品墊依次粘 于底板上，裁成細(xì)條，即成一種檢測(cè)同型半胱氨酸的膠體金免疫試紙條。上述膠體金制備過(guò)程中，優(yōu)選三蒸水200毫升，氯金酸10毫升，檸檬酸三鈉7.5毫升。 上述膠體金探針標(biāo)記過(guò)程中，優(yōu)選加入10%BSA后，再加入1毫升10%PEG20000充 分混勻，離心棄上清，加入工作液溶解。本發(fā)明的有益效果應(yīng)用本發(fā)明提供的聯(lián)合檢測(cè)卡可同時(shí)檢測(cè)人體內(nèi)同型半胱氨酸一 葉酸水平，成本低廉，操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏，且特異性好，不需要特殊檢測(cè)儀器設(shè)備， 因此可廣泛應(yīng)用于各級(jí)醫(yī)療檢驗(yàn)場(chǎng)所，尤其是基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)，包括鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院等均可開展。 本發(fā)明有益于同型半胱氨酸和葉酸檢測(cè)的普及，進(jìn)而對(duì)于心腦血管事件發(fā)生的預(yù)防有極為 重要的意義。


圖l為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖1:底板；2:吸水墊；3:特定包被的硝酸纖維膜；4:結(jié)合墊；5:樣品墊；6:捕獲線；7:捕獲線；8:質(zhì)控線。圖2為本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果示意圖a: Hey—Folate同時(shí)陰性；b: Hcy陰性，F(xiàn)olate陽(yáng)性；c: Hcy陽(yáng)性，F(xiàn)olate陰性；d: Hcy —Folate同時(shí)陽(yáng)性；e:無(wú)效；6: Hcy捕獲線；7: Folate捕獲線；8:質(zhì)控線。 圖3為本發(fā)明的試紙條外觀示意圖a:樣本墊；b:結(jié)合墊；6: Hcy捕獲線；7: Folate捕獲線；8:質(zhì)控線；C:試紙條名稱圖4為本發(fā)明的測(cè)試卡外觀示意圖a:加樣窗；b:檢測(cè)窗；C: ID標(biāo)識(shí)區(qū)；Tl: Hcy捕獲線；T2: Folate捕獲線；C:質(zhì)控線。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作出的本 領(lǐng)域等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 實(shí)施例1:以同型半胱氨酸一葉酸膠體金免疫聯(lián)合檢測(cè)試紙條制備方法為例，闡述膠體金免疫試紙 條的制備方法，它包括如下步驟1、 SAH-BSA抗原、Folate-BSA抗原的制備a) 取適量BSA和SAH分別溶于15mlPBS錐形瓶中，各自磁力攪拌器攪拌10分鐘， 將SAH溶液加入BSA溶液中，邊加邊攪拌，再加入25%戊二醛，反應(yīng)5小時(shí)，凝膠層析 分離偶聯(lián)物，于PBS內(nèi)透析24h，濃縮。b) 取適量BSA和Folate分別溶于15mlPBS錐形瓶中，各自磁力攪拌器攪拌10分鐘， 將Folate溶液加入BSA溶液中，邊加邊攪拌，再加入25%戊二醛，反應(yīng)5小時(shí)，凝膠層析 分離偶聯(lián)物，于PBS內(nèi)透析24h，濃縮。2、 SAH單抗制備a) 以SAH-BSA偶聯(lián)物免疫Balb/c小鼠，經(jīng)多次基礎(chǔ)免疫及加強(qiáng)免疫后，取小鼠脾細(xì)胞， 將脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞，利用PEG細(xì)胞融合技術(shù)制備SAHmAb。將雜交瘤細(xì)胞注入小 鼠腹腔，制備腹水，用層析法純化單克隆抗體。b) 以Folate-BSA偶聯(lián)物免疫Balb/c小鼠，經(jīng)多次基礎(chǔ)免疫及加強(qiáng)免疫后，取小鼠脾細(xì)胞， 將脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞，利用PEG細(xì)胞融合技術(shù)制備FolatemAb。將雜交瘤細(xì)胞注入小 鼠腹腔，制備腹水，用層析法純化單克隆抗體。3、 膠體金的制備量取一定量的洗液于潔凈的250ml三角燒瓶中，煮沸5分鐘，再換一次酸洗液，煮沸5 分鐘；量取一定量的超純水于該燒瓶中，煮沸5分鐘，再換一次超純水，煮沸5分鐘；棄 去超純水，稱取200ml超純水于該燒瓶中，加熱至沸騰，加入1%氯金酸10ml，邊煮邊攪 拌，加熱至沸騰；攪拌下加入2%檸檬酸三鈉10ml，沸水下快速攪拌，直到氯金酸溶液的 顏色慢慢穩(wěn)定，呈紅色后，繼續(xù)沸騰7分鐘，制成小顆粒膠體金。4、 膠體金探針標(biāo)記a)將SAH單克隆抗體用0.005mol/L NaCl透析過(guò)夜，離心除去蛋白沉淀。取膠體金 100毫升，調(diào)節(jié)膠體金溶液PH值9.0，攪拌加入1毫升稀釋的SAH單克隆抗體，再加入l 毫升10。/。BSA充分混勻，緩慢加入，攪拌15分鐘，離心，條件4。C 13000g/min， 40分鐘;棄上清，加入工作液100毫升溶解；儲(chǔ)存條件4'C保存。b)將Folate單克隆抗體用0.005mol/LNaCl透析過(guò)夜，離心除去蛋白沉淀。取膠體金 100毫升，調(diào)節(jié)膠體金溶液PH值9.0，攪拌加入1毫升稀釋的Folate單克隆抗體，再加入1 毫升10y。BSA充分混勻，緩慢加入，攪拌15分鐘，離心，條件4。C 13000g/min， 40分鐘； 棄上清，加入工作液100毫升溶解；儲(chǔ)存條件4t:保存。5、制備檢測(cè)同型半胱氨酸一葉酸的膠體金免疫聯(lián)合檢測(cè)試紙條先將玻璃纖維膜放入質(zhì)量百分比濃度為1%的牛血清白蛋白、質(zhì)量百分比濃度為1%的TritonX-100的磷酸鹽緩沖液中封閉30min， 37'C烘千，再將玻璃纖維膜浸泡于標(biāo)記SAH單克隆抗體和Folate單克隆抗體的膠體金探針中，真空干燥。將制備好的試劑條板上NC膜用噴膜機(jī)分別噴上捕獲抗原(SAH-BSA偶聯(lián)抗原)、捕獲抗原(Folate-BSA偶聯(lián)抗原)和質(zhì)控抗體(兔抗Balb/c球蛋白抗體)。噴完后37'C干燥過(guò)夜。將吸水墊、己包被的硝酸纖維膜、玻璃纖維膠體金結(jié)合墊、樣品墊依次粘于底板上，裁成細(xì)條，即成一種檢測(cè)同型半胱氨酸一葉酸的膠體金免疫聯(lián)合檢測(cè)試紙條。 實(shí)施例2:同型半胱氨酸一葉酸膠體金免疫聯(lián)合檢測(cè)試紙條制備方法，它包括如下步驟 SAH-BSA抗原、Folate-BSA抗原、SAH單抗及Folate單抗為實(shí)施例1制備。1、 膠體金的制備量取一定量的洗液于潔凈的250ml三角燒瓶中，煮沸5分鐘，再換一次酸洗液，煮沸5 分鐘；量取一定量的超純水于該燒瓶中，煮沸5分鐘，再換一次超純水，煮沸5分鐘；棄 去超純水，稱取200ml超純水于該燒瓶中，加熱至沸騰，加入P/。氯金酸10ml，邊煮邊攪 拌，加熱至沸騰；攪拌下加入2%檸檬酸三鈉7,5ml，沸水下快速攪拌，直到氯金酸溶液的 顏色慢慢穩(wěn)定，呈紅色后，繼續(xù)沸騰9分鐘，制成中等大小的膠體金顆粒。2、 膠體金探針標(biāo)記a) 將SAH單克隆抗體用0.005mol/L NaCl透析過(guò)夜，離心除去蛋白沉淀。取膠體金 100毫升，調(diào)節(jié)膠體金溶液PH值9.0，攪拌加入1毫升稀釋的SAH單克隆抗體，再加入1 毫升IO細(xì)SA充分混勻，再加入1毫升10%PEG20000充分混勻，緩慢加入，攪拌15分鐘， 離心，條件4。C 13000g/min， 40分鐘；棄上清，加入工作液100毫升溶解；儲(chǔ)存條件4 'C保存。b) 將Folate單克隆抗體用0.005mol/LNaCl透析過(guò)夜，離心除去蛋白沉淀。取膠體金 100毫升，調(diào)節(jié)膠體金溶液PH值9.0，攪拌加入l毫升稀釋的Folate單克隆抗體，再加入1 毫升10%BSA充分混勻，再加入1毫升10%PEG20000充分混勻，緩慢加入，攪拌15分鐘， 離心，條件4'C 13000g/niin， 40分鐘；棄上清，加入工作液100毫升溶解；儲(chǔ)存條件4'C保存。3、制備檢測(cè)同型半胱氨酸一葉酸的膠體金免疫聯(lián)合檢測(cè)試紙條先將玻璃纖維膜放入質(zhì)量百分比濃度為1%的牛血清白蛋白、質(zhì)量百分比濃度為0.5%的Triton X-100的磷酸鹽緩沖液中封閉30min， 37。C烘干，再將玻璃纖維膜浸泡于標(biāo)記SAH單克隆抗體和Folate單克隆抗體的膠體金探針中，真空干燥。將制備好的試劑條板上NC膜用噴膜機(jī)分別噴上捕獲抗原(SAH-BSA偶聯(lián)抗原)、捕獲抗原(Folate-BSA偶聯(lián)抗原)和質(zhì)控抗體(兔抗Balb/c球蛋白抗體)。噴完后37'C干燥過(guò)夜。將吸水墊、已包被的硝酸纖維膜、玻璃纖維膠體金結(jié)合墊、樣品墊依次粘于底板上，裁成細(xì)條，即成一種檢測(cè)同型半胱氨酸一葉酸的膠體金免疫聯(lián)合檢測(cè)試紙條。 實(shí)施例3:同型半胱氨酸一葉酸膠體金免疫聯(lián)合檢測(cè)試紙條制備方法，它包括如下步驟 SAH-BSA抗原、Folate-BSA、 SAH單抗及Folate單抗為實(shí)施例1制備。1、 膠體金的制備量取一定量的洗液于潔凈的250ml三角燒瓶中，煮沸5分鐘，再換一次酸洗液，煮沸5 分鐘；量取一定量的超純水于該燒瓶中，煮沸5分鐘，再換一次超純水，煮沸5分鐘；棄 去超純水，稱取200ml超純水于該燒瓶中，加熱至沸騰，加入1%氯金酸10ml,邊煮邊攪 拌，加熱至沸騰；攪拌下加入2%檸檬酸三鈉6.6ml，沸水下快速攪拌，直到氯金酸溶液的 顏色慢慢穩(wěn)定，呈紅色后，繼續(xù)沸騰9分鐘，制成較大的膠體金顆粒。2、 膠體金探針標(biāo)記a) 將SAH單克隆抗體用0.005mol/L NaCl透析過(guò)夜，離心除去蛋白沉淀。取膠體金 100毫升，調(diào)節(jié)膠體金溶液PH值9.0，攪拌加入1毫升稀釋的SAH單克隆抗體，再加入1 毫升10%BSA充分混勻，再加入1毫升10%Casein充分混勻，緩慢加入，攪拌15分鐘，離 心，條件4。C 13000g/min， 40分鐘；棄上清，加入工作液100毫升溶解；儲(chǔ)存條件4'C 保存。b) 將Folate單克隆抗體用0.005mol/L NaCl透析過(guò)夜，離心除去蛋白沉淀。取膠體金 100毫升，調(diào)節(jié)膠體金溶液PH值9.0，攪拌加入1毫升稀釋的Folate單克隆抗體，再加入1 毫升10。/。BSA充分混勻，再加入1毫升1(WCasein充分混勻，緩慢加入，攪拌15分鐘，離 心，條件4。C 13000g/min， 40分鐘；棄上清，加入工作液100毫升溶解；儲(chǔ)存條件4°C 保存。3、 制備檢測(cè)同型半胱氨酸一葉酸的膠體金免疫聯(lián)合檢測(cè)試紙條先將玻璃纖維膜放入質(zhì)量百分比濃度為1%的牛血清白蛋白、質(zhì)量百分比濃度為0.5%10的Triton X-100的磷酸鹽緩沖液中封閉30min， 37"C烘干，再將玻璃纖維膜浸泡于標(biāo)記SAH 單克隆抗體和Folate單克隆抗體的膠體金探針中，真空干燥。將制備好的試劑條板上NC 膜用噴膜機(jī)分別噴上捕獲抗原(SAH-BSA偶聯(lián)抗原)、捕獲抗原(Folate-BSA偶聯(lián)抗原) 和質(zhì)控抗體(兔抗Balb/c球蛋白抗體)。噴完后37'C干燥過(guò)夜。將吸水墊、己包被的硝酸纖 維膜、玻璃纖維膠體金結(jié)合墊、樣品墊依次粘于底板上，裁成細(xì)條，即成一種檢測(cè)同型半 胱氨酸一葉酸的膠體金免疫聯(lián)合檢測(cè)試紙條。 實(shí)施例4:同型半胱氨酸一葉酸的膠體金免疫診斷聯(lián)合檢測(cè)試紙條制備方法，它包括如下步驟 將兩個(gè)帶有標(biāo)識(shí)的不干膠紙(標(biāo)識(shí)條)分別粘貼在實(shí)施例2中所制備試紙條的兩端，帶有箭頭端是貼在樣品墊和結(jié)合墊上，由此端浸入待測(cè)樣品，靠另一端的吸水墊的吸水作用，使樣品經(jīng)過(guò)NC膜。即成一種檢測(cè)同型半胱氨酸一葉酸的膠體金免疫診斷聯(lián)合檢測(cè)試紙條，見圖3。實(shí)施例5:同型半胱氨酸一葉酸的膠體金免疫珍斷聯(lián)合檢測(cè)卡制備方法，它包括如下步驟將實(shí)施例2中所制備試紙條放入塑料卡背板試紙條槽中，與上片嵌合，即成一種檢測(cè)同 型半胱氨酸一葉酸的膠體金免疫診斷聯(lián)合檢測(cè)卡，見圖4。此塑料卡是一個(gè)用塑料特制的卡，由背板、蓋板組成，背板和蓋板片可嵌合在一起，背板主要有一個(gè)放試紙條的槽和與蓋板結(jié)合的卡齒，蓋板主要包括一個(gè)檢測(cè)窗(見圖4b)、 一個(gè)加樣窗(見圖4a)以及與背板結(jié)合的 卡齒，檢測(cè)窗旁邊分別印有T1、 T2和C字樣，Tl表示捕獲線(6)的位置，T2表示捕獲線 (7)的位置，C表示質(zhì)控線(8)的位置，檢測(cè)窗是觀察結(jié)果的窗口，加樣窗是滴加樣品的 位置。實(shí)施例6:同型半胱氨酸一葉酸免疫膠體金層析聯(lián)合檢測(cè)試紙條使用方法如圖l， 2所示，將試紙條樣品墊5插入待測(cè)樣品中，浸潤(rùn)后取出，水平放置，約10 15分鐘后，在NC膜3上同時(shí)出現(xiàn)捕獲線6、捕獲線7和質(zhì)控線8，見圖2a，結(jié)果為Hcy—Folate同時(shí)陰性；在NC膜3上同時(shí)出現(xiàn)捕獲線6和質(zhì)控線8，見圖2b，結(jié)果為Hcy陰性而Folate陽(yáng)性；在NC膜3上同時(shí)出現(xiàn)捕獲線7和質(zhì)控線8，見圖2c，結(jié)果為Hcy陽(yáng)性而Folate陰性；在NC膜3上僅僅出現(xiàn)一條質(zhì)控線8，見圖2d，結(jié)果為Hcy—Folate同時(shí)陽(yáng)性；在NC膜3上不出現(xiàn)線條，見圖2e，表示試紙條失效。試紙條檢測(cè)靈敏度為lumo1/1。 實(shí)施例7:同型半胱氨酸一葉酸免疫膠體金層析聯(lián)合檢測(cè)卡使用方法微升 80微升，水平放置，約10 )5 分鐘后，在檢測(cè)窗b中同時(shí)出現(xiàn)捕獲線Tl、捕獲線T2和質(zhì)控線C，結(jié)果為Hey—Folate同 時(shí)陰性；在檢測(cè)窗b中同時(shí)出現(xiàn)捕獲線Tl和質(zhì)控線C，結(jié)果為Hcy陰性而Folate陽(yáng)性；在 檢測(cè)窗b中同時(shí)出現(xiàn)捕獲線T2和質(zhì)控線C，結(jié)果為Hcy陽(yáng)性而Folate陰性；在檢測(cè)窗b中 僅僅出現(xiàn)一條質(zhì)控線C，結(jié)果為Hcy—Folate同時(shí)陽(yáng)性；在檢測(cè)窗b中不出現(xiàn)線條，表示檢 測(cè)卡失效。檢測(cè)卡檢測(cè)靈敏度為lumo1/1。
權(quán)利要求
1、一種同型半胱氨酸-葉酸免疫膠體金層析聯(lián)合檢測(cè)卡，在長(zhǎng)條扁平薄殼狀的檢測(cè)卡外殼中有試紙條，檢測(cè)卡外殼表面有檢測(cè)窗和加樣窗，其特征在于所述試紙條是由底板(1)上的依次接合吸水墊(2)、特定包被的硝酸纖維膜(3)、硝酸纖維膜上有捕獲線(6)、捕獲線(7)和質(zhì)控線(8)，涂覆膠體金標(biāo)記特異抗體的玻璃纖維膠體金結(jié)合墊(4)、樣品墊(5)而組成的條形物；所述玻璃纖維膠體金結(jié)合墊(4)涂覆膠體金標(biāo)記特異抗體為S腺苷同型半胱氨酸單克隆抗體和葉酸單克隆抗體。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述聯(lián)合檢測(cè)卡，其特征在于所述吸水墊(2)為一種濾紙，包括吸水 紙和濾油紙；吸水墊貼在底板的末端。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述聯(lián)合檢測(cè)卡，其特征在于所述特定包被的硝酸纖維膜(3)由一層濾膜和膠膜組成，NC膜上噴涂捕獲線(6)——S腺苷同型半胱氨酸-牛血清白蛋白抗原、 捕獲線(7)——葉酸-牛血清白蛋白和質(zhì)控線(8)——兔抗小鼠二抗；硝酸纖維膜貼在底板的中間，兩端分別與結(jié)合墊和吸水墊連接。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述聯(lián)合檢測(cè)卡，其特征在于所述結(jié)合墊(4)為玻璃纖維紙，用含聚乙烯醇的硼酸緩沖液浸泡處理后，37'C干燥過(guò)夜，噴涂上膠體金標(biāo)記的SAH單克隆抗體 和葉酸單克隆抗體，再冷凍干燥，結(jié)合墊上與樣品墊銜接，下與硝酸纖維膜銜接。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述聯(lián)合檢測(cè)卡，其特征在于所述樣品墊(5)為玻璃纖維紙，用含聚 乙烯醇的硼酸緩沖液浸泡，緩沖液PH為7.2，浸泡處理后，37。C干燥過(guò)夜；樣品墊位于 結(jié)合墊上。
6、 如權(quán)利要求1所述的聯(lián)合檢測(cè)卡在制備同型半胱氨酸一葉酸聯(lián)合診斷試紙條中的用途，其特征在于診斷試紙條還包括標(biāo)識(shí)條，此標(biāo)識(shí)條為兩個(gè)帶有標(biāo)識(shí)的不干膠紙，分別粘貼在試紙條的兩端，帶有箭頭端是貼在樣品墊和結(jié)合墊上，由此端浸入待測(cè)樣品，靠另一端的 吸水墊的吸水作用，使樣品經(jīng)過(guò)硝酸纖維膜。
7、 如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于測(cè)試卡還包括塑料卡，此塑料卡是一個(gè)用塑料特制的卡，由背板、蓋板組成，背板與蓋板可嵌合在一起，背板主要有一個(gè)放試紙條的槽和 與蓋板結(jié)合的卡齒，蓋板主要包括一個(gè)檢測(cè)窗、 一個(gè)加樣窗以及與背板結(jié)合的卡齒，檢測(cè)窗旁邊分別印有T1、 T2和C字樣，Tl表示捕獲線(6)的位置，T2表示捕獲線(7)的 位置，C表示質(zhì)控線(8)的位置，檢測(cè)窗是觀察結(jié)果的窗口，加樣窗是滴加樣品的位置。 特定包被的硝酸纖維膜(NC膜)(3)正對(duì)檢測(cè)窗，樣品墊(5)正對(duì)加樣窗。
8、 一種檢測(cè)同型半胱氨酸一葉酸免疫膠體金層析聯(lián)合檢測(cè)卡的制備方法，包括如下步驟1) S腺苷同型半胱氨酸-牛血清白蛋白抗原、葉酸-牛血清白蛋白抗原的制備；2) S腺苷同型半胱氨酸單抗、葉酸單抗的制備；3) 膠體金的制備；4) 膠體金探針標(biāo)記；5) 制備檢測(cè)同型半胱氨酸的膠體金免疫試紙條。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述制備方法，其特征在于3)步中所述三蒸水為200毫升，所述氯金 酸為10毫升，所述檸檬酸三鈉為7.5毫升。
10、 根據(jù)權(quán)利要求8所述制備方法，其特征在于4)步中所述加入10。/。BSA后，再加入 1毫升10%PEG20000充分混勻，離心棄上清，加入工作液溶解。
全文摘要
本發(fā)明提供一種同型半胱氨酸-葉酸免疫膠體金層析聯(lián)合檢測(cè)卡及其制備方法。它是在檢測(cè)卡外殼中按照試紙條，外殼表面有檢測(cè)窗和加樣窗。該試紙條是由底板(1)上的依次接合吸水墊(2)、特定包被的硝酸纖維膜(NC膜)(3)、NC膜上有捕獲線(6)捕獲線(7)和質(zhì)控線(8)，涂覆膠體金標(biāo)記特異抗體的玻璃纖維膠體金結(jié)合墊(4)、樣品墊(5)而組成的條形物；所述玻璃纖維膠體金結(jié)合墊(4)涂覆膠體金標(biāo)記特異抗體為S腺苷同型半胱氨酸(SAH)單克隆抗體和葉酸(Folate)單克隆抗體。應(yīng)用本發(fā)明所提供的聯(lián)合檢測(cè)卡檢測(cè)人血清中同型半胱氨酸和葉酸水平，具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏和特異性好等特點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101592666SQ200810114209
公開日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2008年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日
發(fā)明者多 于, 徐希平, 燕 王, 謝愛武 申請(qǐng)人:北京華安佛醫(yī)藥研究中心有限公司;深圳奧薩醫(yī)藥有限公司