專利名稱：選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基化合物的可再生型熒光探針及其合成方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基化合物的可再生型熒光探針 及其合成方法和用途。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，體液中某種氨基酸濃度的異常變化也是導(dǎo)致眾多疾病產(chǎn)生的根源，如血液中同型半胱氨酸(Hcy)升高會(huì)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，進(jìn)而 與缺血性心、腦血管疾病密切相關(guān)，目前偵測同型半胱氨酸在血液中濃度的 變化是診斷此類疾病危險(xiǎn)性的一個(gè)獨(dú)立參考因子，因此準(zhǔn)確地檢測體液中同 型半胱氨酸的含量己成為控制疾病發(fā)展的重要因素之一。目前使用的檢測方 法繁瑣且檢測速度較慢，發(fā)展一種方便、靈敏、快速的檢測手段是非常必要 的。目前，生物活性巰基化合物的分析測定一般是利用其還原性及其與某些 有機(jī)試劑發(fā)生反應(yīng)后，用電化學(xué)、分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、催化動(dòng)力學(xué)方 法及熒光方法進(jìn)行分析測定，這些方法操作復(fù)雜、靈敏度不高并且選擇性較 差。光化學(xué)傳感器是近年來迅速發(fā)展起來的一個(gè)新的科學(xué)問題，它的出現(xiàn)顯 然和超分子科學(xué)的進(jìn)展諸如分子組裝、主客體化學(xué)、非共價(jià)相互作用、氫鍵 作用、疏水作用等以及光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)過程、分子內(nèi)共軛的電荷轉(zhuǎn)移化 合物結(jié)構(gòu)及其發(fā)光特性等研究密切相關(guān)，它的發(fā)展也和許多科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域諸 如生物化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥物化學(xué)以及環(huán)境科學(xué)中提出的大量實(shí)際問題密切 相關(guān)。由于上述種種原因，有力的推動(dòng)了光化學(xué)傳感器的研究進(jìn)展。光化學(xué) 傳感器按其信號(hào)檢測方法的不同，主要分為熒光探針(Fluorescent probe)又 稱為熒光化學(xué)傳感器(Fluorescent Chemosensor)和比色化學(xué)傳感器 (Colorimetric Chemosensor)。熒光探針主要是依靠熒光信號(hào)為檢測手段，通常有熒光的增強(qiáng)、猝滅或者發(fā)光波長的移動(dòng)，而比色化學(xué)傳感器主要是借助于 色調(diào)的變化，通過肉眼觀察就可以檢測，方便實(shí)際應(yīng)用。用于對(duì)外來物種進(jìn) 行檢測的熒光探針的設(shè)計(jì)和研究，是近年來受到廣泛關(guān)注的一個(gè)科學(xué)問題。熒光探針的檢測過程主要是通過器件接受體(Receptor)部分對(duì)外來物種(包括 陽離子，陰離子及中性分子等)的選擇性接納，然后經(jīng)不同的作用機(jī)制，如 光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)或能量轉(zhuǎn)移、金屬一配體電荷轉(zhuǎn)移(MLCT)、分子內(nèi)電荷 轉(zhuǎn)移(ICT)，再通過器件的信號(hào)報(bào)告部分給出有關(guān)器件在接納物種過程中的信 息變化。熒光探針由于其有選擇性好、靈敏度高、響應(yīng)時(shí)間快等優(yōu)點(diǎn)，在微 量化學(xué)物種的檢測方面得到了很好的應(yīng)用。香豆素類化合物因其較大的摩爾消光系數(shù)和高的熒光量子產(chǎn)率，已作為 熒光標(biāo)記物在生物技術(shù)方面有一定的應(yīng)用，但把它作為直接用來識(shí)別特定客 體的化學(xué)傳感分子的例子還很少見報(bào)道。在本發(fā)明中，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了基于 香豆素氨基硫脲的衍生物作為選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基化合物的熒光 探針，與前人的工作相比(1， Oleksandr Rusin， Nadia N. St. Luce， Rezik A. Agbaria, Jorge O. Escobedo, Shan Jiang, Isiah M. Warner, Fareed B. Dawan, Kun Lian， and Robert M. Strongin. Visual Detection of Cysteine and Homocysteine. / 為.Cto7. Soc. 2004， 126， 438 439. 2， Weihua Wang, Oleksandr Rusin， Xiangyang Xu, Kyu Kwang Kim，Jorge O. Escobedo, Sayo O. Fakayode, Kristin A. Fletcher, Mark Lowry,Corin M. Schowalter, Candace M. Lawrence, Frank R. Fronczek，Isiah M. Warner, and Robert M. Strongin. Detection of Homocysteine and Cysteine. / J附.Cta. 2005, 127， 15949 15958.)，其有這樣的優(yōu)點(diǎn) 熒光探針分子對(duì)生物活性巰基化合物有識(shí)別作用時(shí)，使熒光發(fā)射有較大的增 強(qiáng)，而且可進(jìn)一步用于細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基化合物的熒光成像，這為臨床醫(yī) 學(xué)中相關(guān)疾病的診斷提供了參考。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一在于克服現(xiàn)有技術(shù)熒光探針的性能和結(jié)構(gòu)上的不足之 處，提供一種性能優(yōu)良的選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基化合物的熒光探針。本發(fā)明的目的之二是提供選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基化合物的熒光 探針的合成方法。本發(fā)明的目的之三是提供選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基化合物的熒光探針的用途。本發(fā)明的選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基化合物的熒光探針具有式(I)所 示的結(jié)構(gòu)-一x(I)式(I)中的R,、 R2、 R5、 R6分別或者同時(shí)為氫、垸基、取代垸基或芳基； R3， R4分別或者同時(shí)為氫、烷基、取代烷基、芳基或鹵素；X為硝酸根、硫 酸根、高氯酸根、硫氰酸根或鹵素。所述的Rp R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的垸基為l至50個(gè)碳原子的垸基或 3至50個(gè)碳原子的環(huán)烷基。所述的R,、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的取代垸基為芳基取代的1至50 個(gè)碳原子的烷基、co-羥基取代的1至50個(gè)碳原子的垸基、co-羧基取代的1至 50個(gè)碳原子的烷基或co-酯基取代的1至50個(gè)碳原子的烷基。所述的R,、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的芳基為鄰、對(duì)、間位1至50個(gè)碳 原子的烷基苯基，鄰、對(duì)、間位鹵代苯基，鄰、對(duì)、間位1至50個(gè)碳原子取 代或未取代的烷氧基苯基或鄰、對(duì)、間位胺基苯基。所述的R3、 R4、 X中的鹵素為氟、氯、溴或碘。所述的R,、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的1至50個(gè)碳原子的烷基分別或者同 時(shí)選自甲基，乙基，丙基，烯丙基，異丙基，丁基，異丁基，戊基，異戊基， 己基，2—甲基戊基，庚基，2—甲基己基，辛基，2—甲基庚基，壬基，2— 甲基辛基，癸基，2—甲基壬基，十一烷基，十二垸基，十三垸基，十四烷基 及十五垸基中的一種。所述的&、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的3至50個(gè)碳原子的環(huán)垸基分別或者 同時(shí)選自環(huán)丙垸基，環(huán)丁烷基，環(huán)戊烷基，環(huán)己烷基及環(huán)庚烷基中的一種。所述的R,、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的芳基取代的1至50個(gè)碳原子的烷基 分別或者同時(shí)選自芳基甲基，芳基乙基，芳基丙基，芳基烯丙基，芳基異丙 基，芳基丁基，芳基異丁基，芳基戊基，芳基異戊基，芳基己基，2—甲基芳 基戊基，芳基庚基，2—甲基芳基己基，芳基辛基，芳基2—甲基庚基，芳基 壬基，2—甲基芳基辛基，芳基癸基，2—甲基芳基壬基，芳基十一垸基，芳 基十二垸基，芳基十三烷基，芳基十四烷基及芳基十五垸基中的一種。所述的R^ R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的"-羥基取代的1至50個(gè)碳原子的 烷基分別或者同時(shí)選自"-羥基甲基，"-羥基乙基，co-羥基丙基，"-羥基異 丙基，"-羥基丁基，"-羥基異丁基，"-羥基戊基，"-羥基異戊基，"-羥基 己基，"-羥基-2_甲基戊基，"-羥基庚基，"-羥基-2_甲基己基，"-羥基 辛基，"-羥基庚基，羥基壬基，"-羥基-2_甲基辛基，"-羥基癸基， 羥基-2—"-羥基甲基壬基，co-羥基十一垸基，"-羥基十二烷基，"-羥基十 三烷基，"-羥基十四烷基及"-羥基十五烷基中的一種。所述的R^ R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的"-羧基取代的1至50個(gè)碳原子的 垸基分別或者同時(shí)選自w-羧基甲基，"-羧基乙基，co-羧基丙基，"-羧基異丙基，CO-羧基丁基，"-羧基異丁基，03-羧基戊基，"-羧基異戊基，CO-羧基己基，"-羧基-2_甲基戊基，"-羧基庚基，"-羧基-2—甲基己基，"-羧基 辛基，"-羧基庚基，"-羧基壬基，co-羧基-2—甲基辛基，"-羧基癸基，co-羧基-2—"-羧基甲基壬基，"-羧基十一垸基，"-羧基十二烷基，co-羧基十 三垸基，"-羧基十四垸基及"-羧基十五垸基中的一種。所述的R!、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的to-酯基取代的1至50個(gè)碳原子的 烷基分別或者同時(shí)選自"-酯基甲基，"-酯基乙基，"-酯基丙基，co-酯基異 丙基，"-酯基丁基，"-酯基異丁基，"-酯基戊基，co-酯基異戊基，O)-酯基 己基，"-酯基-2_甲基戊基，co-酯基庚基，"-酯基-2—甲基己基，"-酯基 辛基，"-酯基庚基，"-酯基壬基，"-酯基-2_甲基辛基，co-酯基癸基，"-酯基-2—"-酯基甲基壬基，"-酯基十一垸基，"-酯基十二烷基，"-酯基十 三烷基，"-酯基十四烷基及"-酯基十五垸基中的一種。所述的R,、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的鄰、對(duì)、間位1至50個(gè)碳原子的垸 基苯基分別或者同時(shí)是鄰、對(duì)、間位取代甲基芐基，鄰、對(duì)、間位取代乙基 芐基，鄰、對(duì)、間位取代丙基芐基或鄰、對(duì)、間位取代異丙基節(jié)基。所述的R,、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的鄰、對(duì)、間位鹵代苯基分別或者同 時(shí)是鄰、對(duì)、間位氟代芐基，鄰、對(duì)、間位氯代芐基，鄰、對(duì)、間位溴代芐 基或鄰、對(duì)、間位碘代節(jié)基。所述的Rh R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的鄰、對(duì)、間位1至50個(gè)碳原子取代 的垸氧基苯基分別或者同時(shí)是鄰、對(duì)、間位取代甲氧芐基，鄰、對(duì)、間位取 代乙氧基芐基或鄰、對(duì)、間位取代丙氧基芐基。本發(fā)明的選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基化合物的可再生型熒光探針的 合成方法，包括以下步驟1) 將帶有Rp R2， R3、 R4和R5取代基的香豆素-3—羰基化合物溶于干 燥的有機(jī)溶劑中，回流攪拌下緩慢滴加溶于有機(jī)溶劑中的帶有R6取代基的硫 代氨基脲，其中帶有Rp R2， R3、 R4和R5取代基的香豆素-3—羰基化合物與 帶有R6取代基的硫代氨基脲的摩爾比是1: 1 4;攪拌反應(yīng)1 4小時(shí)后過濾， 除去有機(jī)溶劑，真空干燥后得配體；2) 將步驟1)得到的配體溶于干燥的有機(jī)溶劑中，緩慢滴加溶于有機(jī)溶劑中的HgX2 (x為NCv、 so42-、 cio4-、 scN-或r， cr， Br、 r)，其中配體與HgX2的摩爾比是l: 1 2;回流攪拌反應(yīng)4 16小時(shí)后得橙色固體沉淀， 過濾后真空干燥固體得到橙色晶體，即本發(fā)明式(I)的熒光探針。所述的取代基R^ R2、 R3、 R4、 R5、 R^、 X的定義同上述發(fā)明內(nèi)容中所述。所述的有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、三氯甲垸、二甲基亞砜、N,N-二甲基甲 酰胺、1， 2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯及甲苯等中的一 種以上。本發(fā)明的選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基化合物的可再生型熒光探針可 用于生物體系中生物活性巰基化合物的檢測，生物活細(xì)胞和活組織內(nèi)的生物 活性巰基化合物的分析檢測和熒光成像檢測，以及臨床醫(yī)學(xué)上病變組織中生 物活性巰基化合物的檢測。本發(fā)明提供了一種以香豆素為母體、用于選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰 基化合物的可再生型熒光探針。該熒光探針對(duì)還原型谷胱甘肽，半胱氨酸，乙酰半胱氨酸，高胱氨酸，谷胱甘肽等生物活性巰基化合物有很好的選擇性， 其它氨基酸，蛋白質(zhì)和酶對(duì)檢測沒有影響，溶液的熒光強(qiáng)度與生物活性巰基化合物的濃度在lxlO—6M到Ixl0—5M的范圍內(nèi)有一定的線性關(guān)系，表現(xiàn)出了 良好的實(shí)際應(yīng)用性；該系列熒光探針分子結(jié)構(gòu)簡單，合成方法簡單且效率高， 易推廣于實(shí)際檢測。


圖l.本發(fā)明實(shí)施例1的熒光探針(I-1)對(duì)細(xì)胞內(nèi)物種Ser(絲氨酸)，Met(蛋 氨酸)，Lys (賴氨酸)，Arg (精氨酸)，Gly (甘氨酸)，Glu (谷氨酸)，Asp (天門冬氨酸)，Phe (苯丙氨酸)，His (組氨酸)，Pro (脯氨酸)，Cys (半 胱氨酸)，AMP (單磷酸腺苷)，ATP (三磷酸腺苷)，Mantose (甘露糖)，BSA(牛血清白蛋白)，Glucose (葡萄糖)的選擇性識(shí)別；其中圖la是熒光探針與細(xì)胞內(nèi)物種作用的熒光光譜；從熒光曲線(圖中上方) 可看出，熒光探針(I-l)對(duì)Cys (半胱氨酸)有很專一的識(shí)別效果；從熒光曲線(圖中下方)可看出，對(duì)其他細(xì)胞內(nèi)物種，(從上到下依次為Ser(絲氨酸)， Met (蛋氨酸)，Lys (賴氨酸)，Arg (精氨酸)，Gly (甘氨酸)，Glu (谷氨酸)， Asp (天門冬氨酸)，Phe (苯丙氨酸)，His (組氨酸)，Pro (脯氨酸)，AMP (單磷酸腺苷)，ATP (三磷酸腺苷)，Mantose (甘露糖)，BSA (牛血清白蛋 白)，Glucose (葡萄糖))無識(shí)別效果；圖lb是在520nm處熒光探針(I-l)對(duì)細(xì)胞內(nèi)物種作用后的熒光強(qiáng)度柱形圖。圖2a.本發(fā)明實(shí)施例1中熒光探針(I-l)在對(duì)生物巰基化合物識(shí)別后的熒光 探針(I-1 )循環(huán)次數(shù)與熒光強(qiáng)度的關(guān)系。圖2b.本發(fā)明實(shí)施例1中熒光探針(I-1)在對(duì)生物巰基化合物識(shí)別后的可再 生性照片。圖3.本發(fā)明實(shí)施例1中熒光探針(I-1)的熒光強(qiáng)度對(duì)生物活性巰基化合物 半胱氨酸濃度的線性關(guān)系(小圖為擬合得到的線性相關(guān))。圖4a、圖4b.本發(fā)明實(shí)施例1中熒光探針(I-1)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生物活性巰基化 合物成像照片；其中圖4a是明場下的HepG2細(xì)胞；圖4b是在加入熒光探針 10分鐘后的HepG2細(xì)胞熒光成像圖，細(xì)胞呈現(xiàn)出很強(qiáng)的熒光發(fā)射。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1將5.4 g 7—N,N-二甲基香豆素-3-醛溶于10ml干燥的二甲基甲酰胺(DMF) 中，在回流下緩慢滴加4g硫代氨基脲溶于100ml乙醇的溶液。攪拌3小時(shí) 后過濾，除去二甲基甲酰胺和乙醇，真空干燥后得配體。然后將5g配體溶于 10ml干燥的二甲基亞砜(DMSO)中，緩慢滴加3gHgCl2溶于100ml乙腈 的溶液。攪拌回流3小時(shí)，得到橙色塊狀晶體即熒光探針(I-1)。 EI-MS,m/e, 561.1 [M+l]+.入abmax/nm = 470nm， 0=0.033。將熒光探針(I-1)分別加入到各種細(xì)胞內(nèi)物種中，由圖la， lb可看出熒 光探針(I-l)對(duì)Cys (半胱氨酸)有很專一的識(shí)別效果。熒光探針對(duì)生物活性巰基化合物Cys (半胱氨酸)的選擇性識(shí)別見圖2a 及圖2b (從圖2a上來看，在熒光探針(I-1)中橫坐標(biāo)1交替加入生物巰基化 合物(橫坐標(biāo)2， 4， 6， 8， 10)和HgCl2 (橫坐標(biāo)3， 5， 7， 9)可導(dǎo)致熒光 發(fā)生交替的"開-關(guān)"變化，在照片圖2b中也可以體現(xiàn)出交替加入生物巰基 化合物和HgCl2后溶液熒光的"開-關(guān)"變化。熒光探針(1-1)的熒光強(qiáng)度對(duì)生物活性巰基化合物半胱氨酸濃度的線性 關(guān)系見圖3 (小圖為擬合得到的線性相關(guān))。熒光探針(I-1)能對(duì)細(xì)胞內(nèi)的生物活性巰基化合物進(jìn)行細(xì)胞成像，見圖4a 及圖4b;其中圖4a是明場下的H印G2細(xì)胞；圖4b是在加入熒光探針10分鐘 后的H印G2細(xì)胞熒光成像圖，細(xì)胞呈現(xiàn)出很強(qiáng)的熒光發(fā)射。將5.6 g 7—N,N-二烯丙基-4-甲基香豆素-3-醛溶于10ml干燥的二甲基亞 砜(DMSO)中，在回流下緩慢滴加5g硫代氨基脲溶于100ml乙醇的溶液。熒光探針(I-1)的結(jié)構(gòu)實(shí)施例2攪拌3小時(shí)后過濾，除去二甲基亞砜和乙醇，真空干燥后得配體。然后將5g 配體溶于10 ml干燥的二甲基亞砜中，緩慢滴加4gHgCl2溶于100 ml乙腈的 溶液。攪拌回流3小時(shí)，得到橙色塊狀晶體即熒光探針(I-2)。 EI畫MS， m/e, 621.1 [M+l]+.入abmax/nm = 467nm, 0=0.032。<image>image see original document page 13</image>熒光探針(I-2)的結(jié)構(gòu)實(shí)施例3將6 g 7—N,N-二乙基香豆素-3-醛溶于10ml干燥的乙腈中，在回流下緩 慢滴加4 g 1-苯基硫代氨基脲溶于100 ml乙醇的溶液，攪拌3小時(shí)后過濾， 除去乙腈和乙醇，真空干燥后得配體。然后將5g配體溶于10ml干燥的二甲 基亞砜中，緩慢滴加4gHgCl2溶于100ml丙酮的溶液。攪拌回流3小時(shí)，得 到橙色塊狀晶體即熒光探針(I-3)。EI-MS， m/e， 666.1 [M+l]+.入abmax/nm = 468nm, 0>=0.031 。<image>image see original document page 13</image>熒光探針(I-3)的結(jié)構(gòu)實(shí)施例4將5.6g7—N,N-二 (2—甲基庚基)-4-甲氧基香豆素-3-醛溶于10ml干燥 的二甲基甲酰胺中，在回流下緩慢滴加5 g 1-苯基硫代氨基脲溶于100 ml乙醇的溶液，攪拌3小時(shí)后過濾，除去二甲基甲酰胺和乙醇，真空干燥后得配體。-然后將5 g配體溶于10 ml干燥的二甲基甲酰胺中，緩慢滴加4 g HgCl2溶于 100ml乙腈的溶液。攪拌回流3小時(shí)，得到橙色無定形固體即熒光探針(I-4)。 EI-MS, m/e, 864.3 [M+l]+.入ab max/nm = 466nm, <D=0.031 。熒光探針(I-4)的結(jié)構(gòu)實(shí)施例5將6g7—N,N-二 ("-甲酯基辛基)香豆素-3-醛溶于10ml干燥的三氯甲 垸中，在回流下緩慢滴加4g 1-丙基硫代氨基脲溶于100 ml乙醇的溶液，攪拌 3小時(shí)后過濾，除去三氯甲垸和乙醇，真空干燥后得配體。然后將6.4g配體 溶于10ml干燥的三氯甲垸中，緩慢滴加4gHgCl2溶于100ml丙酮的溶液。 攪拌回流3小時(shí)，得到橙色油狀液體即熒光探針(I-5)。 EI國MS， m/e, 958.2 [M+l]+.入ab max/nm = 467nm， <D=0.031 。熒光探針(I-5)的結(jié)構(gòu)實(shí)施例6將5 g 7—N，N-二庚基-4-溴6-乙基香豆素-3-醛溶于10ml干燥的丙酮中， 在回流下緩慢滴加5 g 1-丙基硫代氨基脲溶于100 ml乙醇的溶液，攪拌4小時(shí)后過濾，除去丙酮和乙醇，真空干燥后得配體。然后將6.5 g配體溶于10 ml干 燥的二氯甲垸中，緩慢滴加4 g HgCl2溶于100 ml乙腈的溶液。攪拌回流4小 時(shí)，得到橙色固體即熒光探針(I-6)。 EI-MS， m/e， 880.2 [M+l〗+.入ab max/nm = 472nm, <D=0.028 。
實(shí)施例7
將5.8g7—N,N-二 ("-羥基丁基)香豆素-3-醛溶于10ml干燥的三 烷中，在回流下緩慢滴加4 g 1-丙基硫代氨基脲溶于100 ml乙醇的溶液，攪拌 3小時(shí)后過濾，除去三氯甲烷和乙醇，真空干燥后得配體。然后將5.8g配體 溶于10ml干燥的丙酮中，緩慢滴加6gHgCV溶于100 ml乙腈的溶液。攪拌 回流3小時(shí)，得到橙色油狀液體即熒光探針(I-7)。
EI-MS, m/e, 720.1 [M+l]十.入abmax/nm = 465nm, O>=0.034
熒光探針(I-7)的結(jié)構(gòu)
實(shí)施例8
將5.8g7—N,N-二 ("-羥基丁基)香豆素-3-甲基酮溶于10ml干燥的乙 腈中，在回流下緩慢滴加4g 1-丙基硫代氨基脲溶于100 ml乙醇的溶液，攪拌3小時(shí)后過濾，除去乙腈和乙醇，真空干燥后得配體。然后將5.8g配體溶于 10ml干燥的二甲基甲酰胺中，緩慢滴加6gHgBr2溶于100ml丙酮的溶液。 攪拌回流3小時(shí)，得到橙色固體即熒光探針(I-8)。 EI畫MS， m/e, 822.1 [M+l]+.入abmax/nm = 465 nm, <D=0.021 。
將7g7—N,N-二 (對(duì)氯芐基)香豆素-3-醛溶于10ml干燥的二甲基甲酰 胺中，在回流下緩慢滴加8 g 1-丙基硫代氨基脲溶于100 ml乙醇的溶液，攪拌 3小時(shí)后過濾，除去二甲基甲酰胺和乙醇，真空干燥后得配體。然后將6.5 g 配體溶于10 ml干燥的乙腈中，緩慢滴加6 g HgCl2溶于100 ml丙酮的溶液。 攪拌回流3小時(shí)，得到橙色晶體即熒光探針(I-9)。 EI-MS, m/e, 824.1 [M+l]+.入abmax/nm = 459 nm, 0=0.029。
實(shí)施例10
將5.8 g 7—N,N-二 (對(duì)甲氧芐基)-4-乙氧基香豆素-3-醛溶于10ml干燥 的乙腈中，在回流下緩慢滴加4 g 1-丙基硫代氨基脲溶于100 ml乙醇的溶液， 攪拌3小時(shí)后過濾，除去乙腈和乙醇，真空干燥后得配體。然后將5.8g配體
熒光探針(I-8)的結(jié)構(gòu)
實(shí)施例9
熒光探針(I-9)的結(jié)構(gòu)溶于10ml干燥的二甲基甲酰胺中，緩慢滴加6gHgBr2溶于100 ml乙腈的溶 液。攪拌回流3小時(shí)，得到橙色固體即熒光探針(I-IO)。 EI-MS， m/e， 929.3 [M+l]+.入abmax/nm = 457nrn, 0=0.021 。
hhCO
熒光探針(I-10)的結(jié)構(gòu)
實(shí)施例11
將5.8g7—N,N-二 (對(duì)氯芐基)-4-乙氧基-5-溴香豆素-3-醛溶于10ml干 燥的二甲基甲酰胺中，在回流下緩慢滴加4 g硫代氨基脲溶于100 ml乙醇的 溶液，攪拌3小時(shí)后過濾，除去二甲基甲酰胺和乙醇，真空干燥后得配體。 然后將5.8 g配體溶于10 ml干燥的二甲基甲酰胺中，緩慢滴加6 g HgB&溶 于100ml乙腈的溶液。攪拌回流3小時(shí)，得到橙色固體即熒光探針(I-ll)。 EI-MS, m/e, 1019.3 [M+l]+,入abmax/nm = 455nm， 0=0.021 。
熒光探針(I-11)的結(jié)構(gòu)
實(shí)施例12
將5.8 g 7—N,N-二芐基-4-甲氧基香豆素-3-醛溶于10ml干燥的二甲基甲 酰胺中，在回流下緩慢滴加4 g硫代氨基脲溶于100 ml乙醇的溶液，攪拌3小時(shí)后過濾，除去二甲基甲酰胺和乙醇，真空干燥后得配體。然后將5.8 g 配體溶于10ml干燥的甲苯中，緩慢滴加6gHgBf2溶于100ml乙腈的溶液。 攪拌回流3小時(shí)，得到橙色固體即熒光探針(1-12)。 EI-MS, m/e， 831.6 [M+l]+.入abmax/nm = 457nm, 0=0.024。
熒光探針(I-12)的結(jié)構(gòu)
實(shí)施例13
將6.1 g 7—N,N-二芐基-4-甲氧基香豆素-3-甲基酮溶于10ml干燥的乙腈 中，在回流下緩慢滴加4 g硫代氨基脲溶于100 ml乙醇的溶液，攪拌3小時(shí) 后過濾，除去乙腈和乙醇，真空干燥后得配體。然后將6g配體溶于10ml干 燥的甲苯中，緩慢滴加6gHgCl2溶于100ml乙腈的溶液。攪拌回流3小時(shí)， 得到橙色固體即熒光探針(I-13)。
EI-MS, m/e， 800.2 [M+l]+.入ab max/nm = 458nrn, 0=0.028 。
熒光探針(I-13)的結(jié)構(gòu)
實(shí)施例14
將5.8 g 7—N，N-二芐基-4-氯香豆素-3-甲基酮溶于10ml干燥的二甲基亞 砜中，在回流下緩慢滴加5 g硫代氨基脲溶于100 ml乙醇的溶液，攪拌3小 時(shí)后過濾，除去二甲基亞砜和乙醇，真空干燥后得配體。然后將7g配體溶于10ml干燥的二甲基亞砜中，緩慢滴加6gHgBr2溶于100ml乙腈的溶液。攪 拌回流3小時(shí)，得到橙色固體即熒光探針(1-14)。 EI-MS, m/e, 849.9 [M+l]+.入ab max/nm = 455nm， O>=0.025 。
熒光探針(I-14)的結(jié)構(gòu)
實(shí)施例15
將7g7—N，N-二 (間氟芐基)-4-甲氧基香豆素-3-醛溶于10ml干燥的二 甲基亞砜中，在回流下緩慢滴加4 g 1-丙基硫代氨基脲溶于100 ml乙醇的溶 液，攪拌3小時(shí)后過濾，除去二甲基亞砜和乙醇，真空干燥后得配體。然后 將5.8 g配體溶于10 ml干燥的二甲基亞砜中，緩慢滴加6 g Hg(SCN)2溶于100 ml乙腈的溶液。攪拌回流3小時(shí)，得到橙色固體即熒光探針(1-15)。 EI-MS, m/e, 884.6 [M+l]+.入abmax/nm = 459nm， 0=0.030。
熒光探針(I-15)的結(jié)構(gòu)
應(yīng)當(dāng)理解，所附權(quán)利要求概括了本發(fā)明的范圍，在本發(fā)明構(gòu)思的引導(dǎo)下， 本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)意識(shí)到，對(duì)本發(fā)明的各實(shí)施例方案所進(jìn)行的一定的改變， 都將被本發(fā)明的權(quán)利要求書的精神和范圍所覆蓋。
權(quán)利要求
1.一種選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基化合物的熒光探針，其特征是，該選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基化合物的熒光探針具有式(I)所示的結(jié)構(gòu)式(I)中的R1、R2、R5、R6分別或者同時(shí)為氫、烷基、取代烷基或芳基；R3，R4分別或者同時(shí)為氫、烷基、取代烷基、芳基或鹵素；X為硝酸根、硫酸根、高氯酸根、硫氰酸根或鹵素。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基化合物的熒光 探針，其特征是所述的Rp R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的垸基為l至50個(gè)碳 原子的烷基或3至50個(gè)碳原子的環(huán)垸基；所述的R,、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的取代烷基為芳基取代的1至50 個(gè)碳原子的垸基、co-羥基取代的1至50個(gè)碳原子的烷基、co-羧基取代的1至 50個(gè)碳原子的垸基或co-酯基取代的1至50個(gè)碳原子的烷基；所述的Ri、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的芳基為鄰、對(duì)、間位1至50個(gè)碳 原子的垸基苯基，鄰、對(duì)、間位鹵代苯基，鄰、對(duì)、間位1至50個(gè)碳原子取 代或未取代的垸氧基苯基或鄰、對(duì)、間位胺基苯基；所述的R3、 R4、 X中的鹵素為氟、氯、溴或碘。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基化合物的熒光 探針，其特征是所述的R,、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的l至50個(gè)碳原子的烷 基分別或者同時(shí)選自甲基，乙基，丙基，烯丙基，異丙基，丁基，異丁基， 戊基，異戊基，己基，2—甲基戊基，庚基，2—甲基己基，辛基，2—甲基庚 基，壬基，2—甲基辛基，癸基，2—甲基壬基，十一垸基，十二烷基，十三 烷基，十四烷基及十五烷基中的一種；所述的&、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的3至50個(gè)碳原子的環(huán)垸基分別或者同時(shí)選自環(huán)丙垸基，環(huán)丁垸基，環(huán)戊烷基，環(huán)己烷基及環(huán)庚烷基中的一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基化合物的熒光 探針，其特征是所述的&、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的芳基取代的1至50 個(gè)碳原子的垸基分別或者同時(shí)選自芳基甲基，芳基乙基，芳基丙基，芳基烯 丙基，芳基異丙基，芳基丁基，芳基異丁基，芳基戊基，芳基異戊基，芳基 己基，2—甲基芳基戊基，芳基庚基，2—甲基芳基己基，芳基辛基，芳基2— 甲基庚基，芳基壬基，2—甲基芳基辛基，芳基癸基，2—甲基芳基壬基，芳 基十一烷基，芳基十二垸基，芳基十三垸基，芳基十四垸基及芳基十五烷基 中的一種；所述的R,、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的"-羥基取代的1至50個(gè)碳原子的 垸基分別或者同時(shí)選自"-羥基甲基，"-羥基乙基，"-羥基丙基，"-羥基異 丙基，co-羥基丁基，w-羥基異丁基，"-羥基戊基，w-羥基異戊基，"-羥基 己基，"-羥基-2—甲基戊基，co-羥基庚基，"-羥基-2_甲基己基，"-羥基 辛基，w-羥基庚基，"-羥基壬基，co-羥基-2—甲基辛基，"-羥基癸基，"-羥基-2—co-羥基甲基壬基，"-羥基十一烷基，"-羥基十二垸基，"-羥基十三烷基，CO-羥基十四垸基及W-羥基十五烷基中的一種；所述的&、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的"-羧基取代的1至50個(gè)碳原子的 烷基分別或者同時(shí)選自"-羧基甲基，"-羧基乙基，"-羧基丙基，"-羧基異 丙基，"-羧基丁基，"-羧基異丁基，"-羧基戊基，w-羧基異戊基，co-羧基 己基，"-羧基-2—甲基戊基，"-羧基庚基，"-羧基-2—甲基己基，co-羧基 辛基，"-羧基庚基，"-羧基壬基，"-羧基-2—甲基辛基，co-羧基癸基，"-羧基-2—"-羧基甲基壬基，"-羧基十一烷基，"-羧基十二烷基，"-羧基十 三烷基，w-羧基十四垸基及co-羧基十五垸基中的一種；所述的R,、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的"-酯基取代的1至50個(gè)碳原子的 垸基分別或者同時(shí)選自"-酯基甲基，co-酯基乙基，"-酯基丙基，"-酯基異 丙基，"-酯基丁基，"-酯基異丁基，"-酯基戊基，"-酯基異戊基，"-酯基 己基，"-酯基-2—甲基戊基，"-酯基庚基，co-酯基-2—甲基己基，"-酯基 辛基，"-酯基庚基，"-酯基壬基，"-酯基-2—甲基辛基，"-酯基癸基，co-酯基-2—o)-酯基甲基壬基，co-酯基十一烷基，co-酯基十二烷基，co-酯基十 三垸基，"-酯基十四垸基及"-酯基十五烷基中的一種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基化合物的熒光探針，其特征是所述的Ri、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的鄰、對(duì)、間位1至50 個(gè)碳原子的垸基苯基分別或者同時(shí)是鄰、對(duì)、間位取代甲基芐基，鄰、對(duì)、 間位取代乙基芐基，鄰、對(duì)、間位取代丙基芐基或鄰、對(duì)、間位取代異丙基 芐基；所述的Rt、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6中的鄰、對(duì)、間位鹵代苯基分別或者同 時(shí)是鄰、對(duì)、間位氟代芐基，鄰、對(duì)、間位氯代芐基，鄰、對(duì)、間位溴代芐 基或鄰、對(duì)、間位碘代芐基；所述的R,、 R2、 R3、 R4、 R5、 &中的鄰、對(duì)、間位l至50個(gè)碳原子取代 的烷氧基苯基分別或者同時(shí)是鄰、對(duì)、間位取代甲氧芐基，鄰、對(duì)、間位取 代乙氧基芐基或鄰、對(duì)、間位取代丙氧基芐基。
6.—種根據(jù)權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基 化合物的可再生型熒光探針的合成方法，包括以下步驟1) 將帶有Ri， R2， R3、 R4和R5取代基的香豆素-3—羰基化合物溶于干 燥的有機(jī)溶劑中，回流攪拌下緩慢滴加溶于有機(jī)溶劑中的帶有R6取代基的硫 代氨基脲，其中帶有Ri， R2， R3、 R4和R5取代基的香豆素-3—羰基化合物與 帶有R6取代基的硫代氨基脲的摩爾比是1: 1 4;攪拌反應(yīng)后過濾，除去有 機(jī)溶劑，真空干燥后得配體；2) 將步驟1)得到的配體溶于干燥的有機(jī)溶劑中，緩慢滴加溶于有機(jī)溶 劑中的HgX2，其中配體與HgX2的摩爾比是1: 1 2;回流攪拌反應(yīng)后得固體沉淀，過濾后真空干燥固體得到式(I)的熒光探針；<formula>formula see original document page 4</formula>所述的取代基R,、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 X的定義同權(quán)利要求1 5任一 項(xiàng)所述。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是步驟l)所述的攪拌反應(yīng)時(shí)間是1 4小時(shí)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是步驟2)所述的回流攪拌反應(yīng) 時(shí)間是4 16小時(shí)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是所述的有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、 三氯甲垸、二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、1， 2-二氯乙垸、甲醇、乙醇、 乙醚、乙腈、丙酮、苯及甲苯中的一種以上。
10. —種根據(jù)權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰 基化合物的可再生型熒光探針的用途，其特征是所述的選擇性檢測細(xì)胞內(nèi) 生物活性巰基化合物的可再生型熒光探針用于生物體系中生物活性巰基化合 物的檢測，生物活細(xì)胞和活組織內(nèi)的生物活性巰基化合物的分析檢測和熒光 成像檢測，以及臨床醫(yī)學(xué)上病變組織中生物活性巰基化合物的檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及選擇性檢測細(xì)胞內(nèi)生物活性巰基化合物的可再生型熒光探針及其合成方法和用途。將帶有R₁，R₂，R₃、R₄和R₅取代基的香豆素-3-羰基化合物溶于干燥的有機(jī)溶劑中，回流攪拌下緩慢滴加溶于有機(jī)溶劑中的帶有R₆取代基的硫代氨基脲；攪拌反應(yīng)后過濾，除去有機(jī)溶劑，真空干燥后得配體；將得到的配體溶于干燥的有機(jī)溶劑中，緩慢滴加溶于有機(jī)溶劑中的HgX₂；回流攪拌反應(yīng)后得固體沉淀，過濾后真空干燥固體得到式(I)的熒光探針。該熒光探針可用于生物體系中生物活性巰基化合物的檢測，生物活細(xì)胞和活組織內(nèi)的生物活性巰基化合物的分析檢測和熒光成像檢測，以及臨床醫(yī)學(xué)上病變組織中生物活性巰基化合物的檢測。
文檔編號(hào)G01N33/52GK101597297SQ20081011441
公開日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2008年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月2日
發(fā)明者吳加勝, 張洪艷, 汪鵬飛, 盛瑞隆 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所