專利名稱：差動共焦拉曼光譜測試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于顯微光譜成像技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種"圖譜合一"的高空間分 辨光譜測試成像方法，其可用于各類樣品的微區(qū)光譜分辨測試等。
背景技術(shù)：
激光共焦拉曼光譜技術(shù)通過入射激光引起分子(或晶格)產(chǎn)生振動而損 失(或獲得)部分能量，使散射光頻率發(fā)生變化，通過對散射光進行分析， 來探知分子的組分、結(jié)構(gòu)及相對含量等，激光共焦拉曼光譜技術(shù)亦被稱之為 分子探針技術(shù)。
激光共焦拉曼光譜測試技術(shù)作為一種極其重要的材料結(jié)構(gòu)測量與分析的 基本技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于物理、化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、 石油化工、地質(zhì)、藥物、食品、刑偵和珠寶等領(lǐng)域，可進行未知物的無損傷 鑒定和深度剖析光譜分析，同時，還可以進行樣品掃描和低溫分析、材料的 光致發(fā)光研究等。目前，商用的激光共焦拉曼光譜測試儀器主要有英國
REN1SHAW等生產(chǎn)。
現(xiàn)有的共焦拉曼光譜測試儀的原理如圖1所示，激發(fā)光束透過偏振分光 鏡(2)、四分之一波片(3)、聚焦物鏡(4)后，聚焦在被測樣品(7)上， 激發(fā)出載有樣品光譜特性的拉曼散射光；移動被測樣品(7)，使對應(yīng)被測樣 品不同區(qū)域的拉曼散射光再次通過四分之一波片(3)并被偏振分光鏡(2) 反射，利用位于針孔11后面的光譜檢測系統(tǒng)16測得載有被測樣品光譜信息 的拉曼散射光譜。
共焦拉曼光譜系統(tǒng)的激發(fā)光斑位置無法保證處在物鏡焦點位置，實際激 發(fā)光斑遠(yuǎn)大于物鏡聚焦光焦斑，其結(jié)果制約了可探測區(qū)域的微小化，限制了 共焦拉曼光譜儀器的微區(qū)光譜探測能力，使共焦拉曼光譜測試技術(shù)無法用于 更精細(xì)的微區(qū)光譜特性測試與分析場合。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服上述已有技術(shù)的不足，提供一種具有很強微區(qū)光 譜探測能力的差動共焦拉曼光譜測試方法，來實現(xiàn)樣品的精細(xì)微區(qū)光譜成像 檢測，其結(jié)果為樣品微區(qū)三維尺度及光譜特性分析提供依據(jù)。該技術(shù)在生物 醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、生物物理、生物化學(xué)、材料、工業(yè)精密檢測等技術(shù)領(lǐng)域具 有極其重要的應(yīng)用前景，是國際光譜測試領(lǐng)域亟待解決的難題。
差動共焦顯微技術(shù)在前期的授權(quán)專利ZL 2004100063596 (發(fā)明人趙維 謙等)中，以題為"具有高空間分辨能力的差動共焦掃描檢測方法"已公開， 本發(fā)明中該己有技術(shù)不再詳述。
本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明是首先通過差動共焦技術(shù)精確捕捉激發(fā)光束聚焦焦點位置，然后 探測對應(yīng)該位置的拉曼光譜，改善共焦拉曼光譜儀器的微區(qū)光譜探測能力。
采用特定設(shè)計的光瞳濾波器，對差動共焦拉曼光譜儀器的光瞳函數(shù)進行 掩膜修正，銳化愛里斑主瓣，進一步改善差動共焦拉曼光譜系統(tǒng)的微區(qū)光譜 探測能力。
軸向分辨力的提高可通過差動共焦光路布置及差動探測來進行，這樣便 可實現(xiàn)樣品微區(qū)三維尺度及光譜特性的高信噪比檢測。
實現(xiàn)本方法的裝置包括激光器(1)、偏振分光鏡(2)、 1/4波片(3)、物 鏡(4)、聚光鏡(8、 10)、針孔(11、 12)，探測器(13、 14)、分光鏡(5、 6)、被測樣品(7)、三維工作臺(9)、聚焦信號差動相減處理單元(15)、光 譜檢測系統(tǒng)(16)、計算機處理系統(tǒng)(17)、光瞳濾波器(18)、濾光片(19)、 擴束器(20);所述的光瞳濾波器可以是位相型濾波器、振幅型濾波器和振幅 位相混合型濾波器；其連接關(guān)系可根據(jù)本發(fā)明方法中的光路走向確定。
該方法的具體步驟如下
1) 使可激發(fā)出樣品拉曼光譜的激發(fā)光束透過偏振分光鏡(2)、四分之一 波片(3)、聚焦物鏡(4)后，聚焦在被測樣品(7)上，并激發(fā)出載有樣品 光譜特性的拉曼散射光；
2) 移動被測樣品(7)，使激發(fā)光及對應(yīng)被測樣品不同區(qū)域的拉曼散射光 再次通過四分之一波片(3)并被偏振分光鏡(2)反射，利用兩分光鏡(5，6)分光將偏振分光鏡(2)反射的激發(fā)光和拉曼光譜分別進行分光；
3) 利用差動共焦顯微系統(tǒng)的兩個探測器(13、 14)，分別探測分光鏡(5) 透射的光束，測得反映被測樣品凸凹變化的強度響應(yīng)A(v,"，-^)和/bO,"，+^)，
并將/a(V,"，-Mm)和/ B(V，M，+Ww)差動相減，得差動共焦強度響應(yīng)/(V，W)，其中，V 為橫向歸一化光學(xué)坐標(biāo)，W為軸向歸一化光學(xué)坐標(biāo)，"M為針孔軸向歸一化光
學(xué)偏移量；
4) 利用光譜檢測系統(tǒng)(16)檢測分光鏡(5)反射的光束，測得載有被 測樣品光譜信息的拉曼散射光譜/(義)，其中義為波長；
5) 使被測樣品沿x、少向掃描，物鏡(4)沿z向掃描，利用步驟3)和 步驟4)所示的方法，測得對應(yīng)物鏡聚焦點位置附近的一組z'個包含位置信
息/(v，w)和光譜信息/(;i)的序列測量信息R(;i)，/,(v，w";
6) 禾U用可分辨區(qū)域a,對應(yīng)的位置信息力(，)，找出對應(yīng)cj,區(qū)域的光譜信 息/,(;i)值，再依據(jù)v與橫向位置坐標(biāo)(;c,少)的關(guān)系以及"與軸向位置坐標(biāo)z
的關(guān)系，重構(gòu)反映被測物微區(qū)CT,三維尺度和光譜特性的信息/,Oc,，乂.,z,,
7) 對應(yīng)最小可分辨區(qū)域C7^的三維尺度和光譜特性可由下式確定
/CTmin (x， >;， z， ;i) = /,(x, y, z，義)I),0，/fl(v, ,+
8) 優(yōu)化光瞳濾波器(18)參數(shù)，壓縮激發(fā)聚焦光斑的尺寸，顯著提高微 區(qū)光譜探測能力。
本發(fā)明檢測方法具有以下特點及良好效果
本發(fā)明由于融合了差動共焦顯微術(shù)的高精度物鏡聚焦點位置捕獲能力， 可使共焦拉曼光譜顯微鏡探測到精確對應(yīng)最小激發(fā)聚焦光斑區(qū)域的樣品光譜 特性，大幅提高現(xiàn)有共焦拉曼光譜顯微鏡的微區(qū)光譜探測能力，這是區(qū)別于
現(xiàn)有技術(shù)的創(chuàng)新點之一；
由于融合了光瞳濾波式差動共焦顯微術(shù)的高空間分辨特性，既改善了共 焦拉曼光譜顯微鏡的微區(qū)幾何位置檢測能力，又改善了環(huán)境抗干擾能力、線 性和離焦特性等，顯著提高了共焦拉曼光譜顯微鏡的微區(qū)幾何尺寸探測能力， 這是區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的創(chuàng)新點之二；
通過選擇測量信息"(;ix/,(v,^中不同的/,化")值，實現(xiàn)不同光斑大小區(qū)
域的光譜探測，既可實現(xiàn)較大區(qū)域的光譜平均測量，又可實現(xiàn)較小區(qū)域的微區(qū)單點光譜測量，這是區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的創(chuàng)新點之三。 本發(fā)明檢測方法具有如下特點
1) 使共焦拉曼光譜顯微鏡的微區(qū)光譜探測能力顯著提高；
2) 使共焦拉曼光譜顯微鏡的微區(qū)幾何尺度探測能力顯著提高；
3) 測量系統(tǒng)具有絕對跟蹤零點和雙極性跟蹤特性，可實現(xiàn)幾何尺度絕 對測量；
4) 改善了共焦拉曼光譜顯微鏡的離焦特性。
圖1為共焦拉曼光譜成像方法示意圖2為差動共焦拉曼光譜成像方法示意圖3為差動共焦拉曼光譜成像裝置。
其中，l-激光器，2-偏振分光鏡(PBS)， 3-l/4波片，4-物鏡，8、 10-聚光鏡，11、 12-針孔，13、 14-探測器，5、 6-分光鏡，7-被測樣品，9 -三維 工作臺，15-聚焦信號差動相減處理單元，16-光譜檢測系統(tǒng)，17-計算機處理 系統(tǒng)，18-光瞳濾波器，19-濾光片，20-擴束器。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
如圖3所示，激光器1發(fā)出的經(jīng)擴束器20擴束后的光束，經(jīng)過光瞳濾波 器18 (振幅型光瞳濾波器)透過偏振分光鏡2后變?yōu)槠穹较蚱叫杏诩埫娴?/7光，該p光透過l/4波片3后被物鏡4聚焦在被測樣品7，并激發(fā)出樣品的 拉曼散射光。部分激光光束反回透過1/4波片3變?yōu)槠穹较虼怪庇诩埫娴膕 光，偏振分光鏡2反射s光到分光鏡5，拉曼散射光亦與激光光束一起被偏振 分光鏡2反射到達(dá)分光鏡5。
分光鏡5首先將測量光束分為兩束，經(jīng)分光鏡5反射的測量光束，經(jīng)過 濾光片19濾除激光瑞利散射光，使拉曼散射光進入光譜檢測系統(tǒng)16進行光 譜探測。經(jīng)分光鏡5透射的光再次被分光鏡6分為兩束，經(jīng)分光鏡6反射的測量 光束被聚光鏡10聚焦，進入距聚光鏡10焦點后距離為M位置的針孔12，后 被探測器13接收；經(jīng)分光鏡6透射的測量光束被聚光鏡8聚焦，進入距聚光 鏡8焦點前距離為M的針孔11，繼而被針孔11后的探測器14接收。
當(dāng)工作臺9對被測樣品7進行軸向(軸向歸一化光學(xué)坐標(biāo)設(shè)為w)和橫 向(橫向歸一化光學(xué)坐標(biāo)設(shè)為v)掃描時，光譜檢測系統(tǒng)16探測到的光譜信 號為/(入)a為波長)，探測器13探測到的信號為/乂v，w,-"M)，探測器14探測
到的信號為/"V,w，+wm)，差動相減處理單元15將/乂V，w,^M)減/5(V,"，+Wm)，得
差動信號/(v，w)。
將/(入)、/乂V，"，-"M)、 /"V，W，+WM)和/(V，W)信號給計算機17，計算機依據(jù)下 式進行處理得光學(xué)坐標(biāo)表示的信號
<formula>formula see original document page 8</formula> (1)
根據(jù)軸向歸一化光學(xué)坐標(biāo)"與軸向位移坐標(biāo)z之間的關(guān)系，以及橫向歸 一化光學(xué)坐標(biāo)V與橫向位移坐標(biāo)(X，"之間的關(guān)系，計算機17處理得到
乙，"J，z，義)-A"，y，z，義) (2) 重構(gòu)出反應(yīng)被測物微區(qū)三維尺度和光譜特性的信息/^(x，;^，A),即實現(xiàn)
了微區(qū)幾何尺寸(X，h z)和光譜參數(shù)/(;i)的高精度檢測。
以上結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作了說明，但這些說明不能被理 解為限制了本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的保護范圍由隨附的權(quán)利要求書限定，任 何在本發(fā)明權(quán)利要求基礎(chǔ)上進行的改動都是本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種差動共焦拉曼光譜測試方法，實現(xiàn)本方法的裝置包括激光器(1)、偏振分光鏡(2)、1/4波片(3)、物鏡(4)、聚光鏡(8、10)、針孔(11、12)，探測器(13、14)、分光鏡(5、6)、被測樣品(7)、三維工作臺(9)、聚焦信號差動相減處理單元(15)、光譜檢測系統(tǒng)(16)、計算機處理系統(tǒng)(17)、光瞳濾波器(18)、濾光片(19)、擴束器(20)，其特征在于首先通過差動共焦技術(shù)精確捕捉激發(fā)光束聚焦焦點位置，然后探測對應(yīng)該位置的拉曼光譜；采用特定設(shè)計的光瞳濾波器，對差動共焦拉曼光譜儀器的光瞳函數(shù)進行掩膜修正，銳化愛里斑主瓣，進一步改善差動共焦拉曼光譜系統(tǒng)的微區(qū)光譜探測能力；通過差動共焦光路布置及差動探測來提高軸向分辨力，實現(xiàn)樣品微區(qū)三維尺度及光譜特性的高信噪比檢測；該方法的具體實現(xiàn)步驟如下1)使可激發(fā)出樣品拉曼光譜的激發(fā)光束透過偏振分光鏡(2)、四分之一波片(3)、聚焦物鏡(4)后，聚焦在被測樣品(7)上，并激發(fā)出載有樣品光譜特性的拉曼散射光；2)移動被測樣品(7)，使激發(fā)光及對應(yīng)被測樣品不同區(qū)域的拉曼散射光再次通過四分之一波片(3)并被偏振分光鏡(2)反射，利用兩分光鏡(5、6)分光將偏振分光鏡(2)反射的激發(fā)光和拉曼光譜分別進行分光；3)利用差動共焦顯微系統(tǒng)的兩個探測器(13、14)，分別探測分光鏡(5)透射的光束，測得反映被測樣品凸凹變化的強度響應(yīng)IA(v，u，-uM)和IB(v，u，+uM)，并將IA(v，u，-uM)和IB(v，u，+uM)差動相減，得差動共焦強度響應(yīng)I(v，u)，其中，v為橫向歸一化光學(xué)坐標(biāo)，u為軸向歸一化光學(xué)坐標(biāo)，uM為針孔軸向歸一化光學(xué)偏移量；4)利用光譜檢測系統(tǒng)(16)檢測分光鏡(5)反射的光束，測得載有被測樣品光譜信息的拉曼散射光譜I(λ)，其中λ為波長；5)使被測樣品沿x、y向掃描，物鏡(4)沿z向掃描，利用步驟3)和步驟4)所示的方法，測得對應(yīng)物鏡聚焦點位置附近的一組i個包含位置信息I(v，u)和光譜信息I(λ)的序列測量信息{Ii(λ)，Ii(v，u)}；6)利用可分辨區(qū)域σi對應(yīng)的位置信息Ii(v，u)，找出對應(yīng)σi區(qū)域的光譜信息Ii(λ)值，再依據(jù)v與橫向位置坐標(biāo)(x，y)的關(guān)系以及u與軸向位置坐標(biāo)z的關(guān)系，重構(gòu)反映被測物微區(qū)σi三維尺度和光譜特性的信息Ii(xi，yi，zi，λi)；即實現(xiàn)了微區(qū)幾何尺寸(x，y，z)和光譜參數(shù)I(λ)的高精度檢測；7)對應(yīng)最小可分辨區(qū)域σmin的三維尺度和光譜特性可由下式確定<maths id="math0001" num="0001" ><math><![CDATA[ <mrow><msub> <mi>I</mi> <msub><mi>σ</mi><mi>min</mi> </msub></msub><mrow> <mo>(</mo> <mi>x</mi> <mo>,</mo> <mi>y</mi> <mo>,</mo> <mi>z</mi> <mo>,</mo> <mi>λ</mi> <mo>)</mo></mrow><mo>=</mo><msub> <mi>I</mi> <mi>i</mi></msub><mrow> <mo>(</mo> <mi>x</mi> <mo>,</mo> <mi>y</mi> <mo>,</mo> <mi>z</mi> <mo>,</mo> <mi>λ</mi> <mo>)</mo></mrow><msub> <mo>|</mo> <mrow><msub> <mi>I</mi> <mi>i</mi></msub><mrow> <mo>(</mo> <mi>v</mi> <mo>,</mo> <mi>u</mi> <mo>)</mo></mrow><mo>=</mo><mn>0</mn><mo>,</mo><msub> <mi>I</mi> <mi>A</mi></msub><mrow> <mo>(</mo> <mi>v</mi> <mo>,</mo> <mi>u</mi> <mo>,</mo> <mo>-</mo> <msub><mi>u</mi><mi>M</mi> </msub> <mo>)</mo></mrow><mo>≠</mo><mn>0</mn><mo>,</mo><msub> <mi>I</mi> <mi>B</mi></msub><mrow> <mo>(</mo> <mi>v</mi> <mo>,</mo> <mi>u</mi> <mo>,</mo> <mo>+</mo> <msub><mi>u</mi><mi>M</mi> </msub> <mo>)</mo></mrow><mo>≠</mo><mn>0</mn> </mrow></msub> </mrow>]]></math></maths>8)優(yōu)化光瞳濾波器(18)參數(shù)，壓縮激發(fā)聚焦光斑的尺寸，提高微區(qū)光譜探測能力。
2.如權(quán)利要求1所述的光瞳濾波器，其特征在于可以是位相型 濾波器、振幅型濾波器或振幅位相混合型濾波器。
全文摘要
本發(fā)明屬于顯微光譜成像技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種差動共焦拉曼光譜測試方法。該方法融合差動共焦檢測方法和拉曼光譜檢測方法技術(shù)特點，構(gòu)成一種可實現(xiàn)樣品微區(qū)光譜檢測的測試方法，通過差動共焦技術(shù)精確捕捉激發(fā)光束聚焦焦點位置，探測對應(yīng)位置的拉曼光譜，同時采用設(shè)計的光瞳濾波器，銳化差動共焦拉曼光譜系統(tǒng)的愛里斑主瓣，改善其微區(qū)拉曼光譜探測能力，精確獲取包括微區(qū)樣品光譜信息和位置信息的微區(qū)空間光譜信息。本發(fā)明顯著提高了共焦拉曼光譜顯微鏡的微區(qū)光譜探測能力；具有絕對跟蹤零點和雙極性跟蹤特性，實現(xiàn)幾何尺度絕對測量；可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、生物物理、生物化學(xué)、材料、工業(yè)精密檢測等技術(shù)領(lǐng)域，進行微區(qū)幾何位置和光譜特性的高精度檢測，具有極其重要的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N21/63GK101290293SQ20081011560
公開日2008年10月22日 申請日期2008年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日
發(fā)明者周桃庚, 趙維謙, 邱麗榮, 郭俊杰 申請人:北京理工大學(xué)