專利名稱：一種集成微流控傳感芯片及其對(duì)微流體進(jìn)行檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種集樣品過(guò)濾、分離 和免標(biāo)記傳感檢測(cè)于一體微流控傳感芯片和分析方法。
背景技術(shù)：
微流控芯片(microfluidic chip)是20世紀(jì)90年代在微電子機(jī)械系統(tǒng) (MEMS)技術(shù)、生命科學(xué)、分析科學(xué)以及信息科學(xué)等多學(xué)科交叉、多技術(shù) 融合的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的生化分析技術(shù)。與傳統(tǒng)的生化分析 技術(shù)相比，微流控芯片具有體積小、試劑消耗少、分析速度快、分析過(guò) 程自動(dòng)化、易于集成化以及高通量等許多優(yōu)點(diǎn)。它在疾病診斷、公共安 全、航天航空、高通量藥物篩選等諸多領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前 己經(jīng)成為分析學(xué)科領(lǐng)域最活躍的研究前沿，代表著未來(lái)生化分析儀器走 向微型化、集成化、個(gè)性化和家用化的發(fā)展方向。在不遠(yuǎn)的將來(lái)，患者 只要取一滴血、 一滴尿，甚至一點(diǎn)唾液放在微流控芯片上就可以直接進(jìn) 行疾病診斷，使患者足不出戶就可以完成就醫(yī)的全過(guò)程。
盡管如此，微流控芯片的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程并沒(méi)有人們預(yù)想的那么迅速， 制約其產(chǎn)業(yè)化的瓶頸技術(shù)之一是它的檢測(cè)技術(shù)。激光誘導(dǎo)熒光法
(laser-induced fluorescence, LIF)是當(dāng)前微流控芯片檢測(cè)中應(yīng)用最廣、靈敏 度最高的檢測(cè)方法，但是該檢測(cè)裝置存在體積大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、通用性差 (僅僅適用于少量能被熒光染料標(biāo)記的生物樣品的檢測(cè))等問(wèn)題，無(wú)法 滿足微流控芯片檢測(cè)的家用化和便攜化要求。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，為了解決現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是基于表面等 離子體諧振(SPR)原理的免標(biāo)記傳感檢測(cè)技術(shù)，是一種無(wú)需標(biāo)記、靈敏 度高、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的新型生化分析技術(shù)，為此，本發(fā)明提出一種集成化
4的微流控傳感芯片及對(duì)微流體進(jìn)行檢測(cè)的方法，通過(guò)MEMS技術(shù)將樣品
過(guò)濾、分離和免標(biāo)記傳感檢測(cè)等功能單元集成到一個(gè)芯片上，可實(shí)現(xiàn)對(duì) 復(fù)雜生物樣品如尿液、血液、唾液等體液的連續(xù)、快速、高靈敏度的檢
為達(dá)成所述目的，本發(fā)明提出一種集成微流控傳感芯片，由剛性聚 合物基底、聚二甲基硅氧垸流通層以及表面等離子體諧振傳感片組成， 表面等離子體諧振傳感片與剛性聚合物基底上的聚二甲基硅氧烷流通層 形成可逆密封，并將其聚二甲基硅氧烷流通層固接在表面等離子體諧振 傳感檢測(cè)系統(tǒng)的棱鏡上。
為達(dá)成所述目的，本發(fā)明提出一種利用微流控傳感芯片對(duì)微流體進(jìn) 行檢測(cè)的方法，將被測(cè)樣品從樣品入口泵入微流控傳感芯片，被測(cè)樣品 流經(jīng)過(guò)濾通道的微過(guò)濾柱陣列，被測(cè)樣品中體積大的細(xì)胞和顆粒物進(jìn)入
樣品的廢液通道，從廢液出口直接排除；被測(cè)樣品通過(guò)過(guò)濾微柱陣列間 隙分離后進(jìn)入微流控傳感芯片的檢測(cè)通道，當(dāng)被測(cè)樣品流經(jīng)檢測(cè)通道的 表面等離子體諧振傳感片時(shí)，被測(cè)樣品中的被檢測(cè)的生物分子與表面等 離子體諧振傳感片上經(jīng)過(guò)表面修飾、固定的生物分子發(fā)生反應(yīng)，并在表 面等離子體諧振傳感片上形成特異性結(jié)合，表面等離子體諧振傳感片上 發(fā)生的特異性反應(yīng)被表面等離子體諧振傳感檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完 的分析樣品從廢液出口直接排出。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提出的集樣品過(guò)濾、分離、檢測(cè)于一體
的微流控傳感芯片，本發(fā)明將MEMS技術(shù)與生物傳感技術(shù)結(jié)合起來(lái)，以 免標(biāo)記、高靈敏度的SPR生物傳感檢測(cè)技術(shù)為基礎(chǔ)，發(fā)展了一種集樣品 預(yù)處理、分離和檢測(cè)于一體的集成化微流控傳感芯片，實(shí)現(xiàn)了對(duì)被測(cè)生 物樣品的快速、實(shí)時(shí)、定量分析。該芯片具有集成度高、免標(biāo)記、分析 速度快、靈敏度高、試樣消耗少等優(yōu)點(diǎn)，與便攜式SPR傳感器結(jié)合起來(lái)， 可以發(fā)展成為面向臨床床邊診斷(Point ofcare， POCT)的便攜式診斷系統(tǒng)。 可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的新型生化分析技術(shù)，在疾病診斷、藥物篩選、食品安全等 領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，適用于對(duì)成分復(fù)雜的血樣、尿液、唾液等體液的 快速、免標(biāo)記檢測(cè)。


圖1為本發(fā)明的集成微流控傳感芯片示意圖。 主要元件說(shuō)明
(1)為剛性聚合物基底， (2)為聚二甲基硅氧烷流通層，
(3)為表面等離子體諧振傳感片，(4)和(41)為樣品入口，
(5)為過(guò)濾通道， (6)為過(guò)濾通道中的過(guò)濾微柱陣列，
(7)為傳感檢測(cè)通道， (8)為廢液通道，
(9)和(91)為廢液出口。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明技術(shù)方案中所涉及的各個(gè)細(xì)節(jié)問(wèn)題。 應(yīng)指出的是，所描述的實(shí)施例僅旨在便于對(duì)本發(fā)明的理解，而對(duì)其不起 任何限定作用。
本發(fā)明提出的基于MEMS技術(shù)加工制造的集成微流控傳感芯片，主 要由剛性聚合物基底l、聚二甲基硅氧烷(PDMS)流通層2以及表面等 離子體諧振(SPR)傳感片3等三部分組成，其中剛性聚合物基底1包括 樣品入口 4和廢液出口 9，在剛性聚合物基底1兩對(duì)角端部分別設(shè)有樣品 入口 4和廢液出口 9;聚二甲基硅氧烷流通層2包括本體上具有樣品入口 41和廢液出口 91，樣品入口 41和廢液出口 91與剛性聚合物基底1的樣 品入口 4和廢液出口 9相對(duì)應(yīng)放置，過(guò)濾通道5的一端部與樣品入口 41 連接，傳感檢測(cè)通道7以及廢液通道8的一端分別與過(guò)濾通道5的另一 端部連接，傳感檢測(cè)通道7和廢液通道8的另一端分別與廢液出口 91連 接。其中過(guò)濾通道5中有過(guò)濾微柱陣列6，且過(guò)濾微柱陣列6的微柱排列 方向與過(guò)濾通道5軸向平行。當(dāng)被測(cè)樣品從樣品入口 4進(jìn)入過(guò)濾通道5 時(shí)，只有通過(guò)過(guò)濾微柱陣列6間隙的被測(cè)樣品才能進(jìn)入樣品傳感檢測(cè)通 道7，當(dāng)檢測(cè)被測(cè)樣品從表面等離子體諧振傳感片3表面流過(guò)時(shí)，待檢測(cè) 的被測(cè)樣品目標(biāo)物質(zhì)與固定在表面等離子體諧振傳感片3上的生物分子 發(fā)生特異性結(jié)合，反應(yīng)信號(hào)通過(guò)表面等離子體諧振傳感片3實(shí)時(shí)讀取， 檢測(cè)后的樣品從廢液出口 9排出，而未通過(guò)過(guò)濾微柱陣列6間隙進(jìn)入傳 感檢測(cè)通道7的樣品直接通過(guò)廢液通道8從廢液出口 9排出。傳感檢測(cè)通道7的流通路徑短于與廢液通道8的流通路徑或傳感檢 測(cè)通道7的流通截面大于廢液通道8的流通截面，使得傳感檢測(cè)通道7 的流動(dòng)阻力小于或等于廢液通道8的流動(dòng)阻力，如傳感檢測(cè)通道7的流 通截面為1.5mmX0.7mm,而廢液通道8的流通截面為0.6mmX0.7mm。
本發(fā)明中，剛性聚合物基底1的材料可以是有機(jī)玻璃(PMMA)、 聚碳酸酯(PC)等具有一定剛性特征的高分子聚合材料。
本發(fā)明中，聚二甲基硅氧垸流通層2中過(guò)濾微柱陣列6包括許多與 過(guò)濾通道5軸向平行排列的過(guò)濾微柱，每一個(gè)過(guò)濾微柱的截面是長(zhǎng)方形、 正方形、菱形或圓形等，過(guò)濾微柱的尺寸在幾微米到幾百微米之間，過(guò) 濾微柱與過(guò)濾微柱之間的間隙可以在幾百納米到幾十微米之間。
本發(fā)明中，利用微流控傳感芯片對(duì)被測(cè)生物樣品的流通檢測(cè)模式可 以是靜態(tài)檢測(cè)也可以是動(dòng)態(tài)檢測(cè)，即流動(dòng)注射檢測(cè)。
本發(fā)明中，利用微流控傳感芯片對(duì)被測(cè)生物樣品的檢測(cè)方法可以采 用直接檢測(cè)法、競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)法以及抑制檢測(cè)法等。
使用本發(fā)明的微流控傳感芯片，微流體進(jìn)行分析檢測(cè)的方法如下
將含有被測(cè)樣品如尿液、血液等在微泵的驅(qū)動(dòng)下從樣品入口 4進(jìn)入 微流控傳感芯片，當(dāng)被測(cè)樣品流經(jīng)過(guò)濾通道5的微過(guò)濾柱陣列6時(shí)，細(xì) 胞等體積大的顆粒物因不能通過(guò)過(guò)濾微柱陣列6的間隙而進(jìn)入樣品廢液 通道8，從廢液出口 9直接排除。而通過(guò)了過(guò)濾微柱陣列6間隙分離后的 樣品進(jìn)入傳感檢測(cè)通道7，當(dāng)被測(cè)樣品流經(jīng)傳感檢測(cè)通道7的表面等離子 體諧振傳感片3時(shí)，被測(cè)樣品中的被檢測(cè)的生物分子與表面等離子體諧 振傳感片3上經(jīng)過(guò)表面修飾、固定的特定生物分子發(fā)生反應(yīng)，并在表面 等離子體諧振傳感片3上形成特異性結(jié)合，表面等離子體諧振傳感片3 上發(fā)生的特異性反應(yīng)被表面等離子體諧振傳感檢測(cè)系統(tǒng)(是本發(fā)明之外 的)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完的分析樣品從廢液出口9直接排出。
上述方法中，被測(cè)樣品可以是尿液、血液、唾液和汗液等生物液體， 樣品中被測(cè)樣品的濃度控制為0.1 ng/mL-100|ig/mL。
上述方法中，被測(cè)樣品的流速為0.1-100|iL/min。
上述方法中，利用微流控傳感芯片在表面等離子體諧振(SPR)傳感 檢測(cè)系統(tǒng)上，對(duì)被測(cè)樣品檢測(cè)可以是直接檢測(cè)法、競(jìng)爭(zhēng)法、抑制法等。實(shí)施例利用該微流控傳感芯片檢測(cè)尿液中的微量白蛋白(HSA)。如 圖1所示，微流控傳感芯片的剛性聚合物基底1采用有機(jī)玻璃加工而成
22mm(長(zhǎng))X22mm(寬)X 15mm(高)有機(jī)玻璃支撐基底。表面等離子體諧振 傳感片3是通過(guò)利用磁控濺射技術(shù)在20mmX20mm,厚度為170Pm的蓋玻 片上沉積一層大約2nm的鉻，然后再沉積一層50nm的金制作而成，本 實(shí)驗(yàn)采用競(jìng)爭(zhēng)免疫法進(jìn)行檢測(cè)，主要實(shí)驗(yàn)步驟如下
1、 本發(fā)明的芯片羧甲基葡聚糖修飾首先用5X10—3mol/L的 ll-mercapto-1-undecanol溶液浸泡表面等離子體諧振傳感片3過(guò)液，提 高金膜表面的親水性，然后將傳感芯片3放入0. 6mol/L表氯醇溶液(溶 劑為按1:1比例混合的0. lmol/L NaOH和diglyme)中25。C下反應(yīng)4hr。 取出芯片后徹底水洗、乙醇洗，再水洗，吹干芯片后將0.2g/mL葡聚糖 堿性溶液(溶劑為1.0mol/L Na0H溶液)滴在芯片的金膜一面上，25。C下 反應(yīng)20h。去離子水清洗后將芯片浸沒(méi)在lmol/L溴乙酸溶液(溶劑為 0.2mol/L的NaOH)中進(jìn)行羧甲基修飾。25。C下反應(yīng)16hr后取出，去離子 水清洗芯片，放入HBS緩沖液(0.01mol/L HEPES (C8H18N204S， 238.3)， 0. 15mol/L NaCl(58.44)， 0.05%Tween 20 (1227.54)， pH7.4)中，4°C 冷藏保存即可。
2、 本發(fā)明的芯片安裝將修飾了羧甲基葡聚糖的表面等離子體諧振 傳感片3的鍍金面與有機(jī)玻璃基底1上的聚二甲基硅氧烷流通層2形成 可逆密封，其未鍍金面通過(guò)香柏油安裝在本發(fā)明之外的表面等離子體諧 振(SPR)傳感檢測(cè)系統(tǒng)的棱鏡上；
3、 本發(fā)明的芯片活化通入PBS緩沖液,待基線穩(wěn)定后，將在通入 等體積新鮮混合的EDC (0.4mol/L)和NHS (0. lmol/L)溶液對(duì)傳感芯片 3進(jìn)行活化，流速為1(HiL/min。 5min后PBS清洗；
4、 在線固定在pH值為4.6醋酸緩沖液中通入濃度為8(Hig/mL的 人血清白蛋白(HSA)，實(shí)現(xiàn)HSA在表面等離子體諧振傳感片3表面的 在線固定；
5、 滅活用lmol/L的乙醇胺溶液對(duì)本發(fā)明的芯片進(jìn)行滅活處理，5 min后用PBS緩沖液清洗至基線穩(wěn)定；
6、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)試與繪制配置不同濃度梯度的HSA溶液，與一定
8量的抗HSA抗體混合反應(yīng)，形成標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用上述標(biāo)準(zhǔn)溶液依次通過(guò) 本發(fā)明的芯片，測(cè)試出SPR標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)曲線；
7、 真實(shí)被測(cè)樣品分析尿液用PBS緩沖液稀釋100倍，并與一定量
的抗HSA抗體進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為IO分鐘左右。然后，通過(guò)微泵將 稀釋的被測(cè)樣品尿液從樣品入口 4過(guò)濾通道5，被測(cè)樣品尿液在過(guò)濾通道 5中發(fā)生分離，通過(guò)過(guò)濾微柱陣列間隙的尿液進(jìn)入傳感檢測(cè)通道7，與表 面等離子體諧振傳感片3上固定的HAS發(fā)生特異性結(jié)合。
8、 本發(fā)明的芯片再生本發(fā)明的芯片再生時(shí)，通入0.1MNaOH對(duì)其 進(jìn)行再生處理，本發(fā)明的芯片可以反復(fù)多次使用。
以上所述，僅為本發(fā)明中的具體實(shí)施方式
，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并 不局限于此，任何熟悉該技術(shù)的人在本發(fā)明所揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可理 解想到的變換或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的包含范圍之內(nèi)，因此，本發(fā) 明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
9
權(quán)利要求
1、一種集成微流控傳感芯片，其特征在于，由剛性聚合物基底(1)、聚二甲基硅氧烷流通層(2)以及表面等離子體諧振傳感片(3)組成，表面等離子體諧振傳感片(3)的鍍金面與剛性聚合物基底(1)上永久性粘接的聚二甲基硅氧烷流通層(2)形成可逆密封，其未鍍金面通過(guò)香柏油貼在表面等離子體諧振傳感檢測(cè)系統(tǒng)的棱鏡上。
2、 根據(jù)權(quán)利要求書l所述的芯片，其特征在于，在剛性聚合物基底 (1)兩對(duì)角端部分別設(shè)有樣品入口 (4)和廢液出口 (9)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求書1或2所述的芯片，其特征在于，剛性聚合物基 底(1)的材質(zhì)是有機(jī)玻璃或聚碳酸酯或剛性高分子聚合材料。
4、 根據(jù)權(quán)利要求書l所述的芯片，其特征在于，在聚二甲基硅氧烷 流通層(2)本體上具有樣品入口 (41)和廢液出口 (91)，樣品入口 (41) 和廢液出口 (91)與剛性聚合物基底(1)樣品入口 (4)和廢液出口 (9) 相對(duì)應(yīng)，過(guò)濾通道(5)的一端部與樣品入口 (41)連接，傳感檢測(cè)通道(7)以及廢液通道(8)的一端分別與過(guò)濾通道(5)的另一端部連接， 傳感檢測(cè)通道(7)和廢液通道(8)的另一端分別與廢液出口 (91)連 接。
5、 根據(jù)權(quán)利要求書4所述的芯片，其特征在于，傳感檢測(cè)通道(7) 的流通路徑短于廢液通道(8)的流通路徑或傳感檢測(cè)通道(7)的流通截面 大于廢液通道(8)的流通截面，使得傳感檢測(cè)通道(7)的流動(dòng)阻力小 于或等于廢液通道(8)的流動(dòng)阻力。
6、 根據(jù)權(quán)利要求書4所述的芯片，其特征在于，在過(guò)濾通道(5) 中設(shè)有過(guò)濾微柱陣列(6)，且過(guò)濾微柱陣列(6)微柱的排列方向與過(guò) 濾通道(5)軸向平行，只有通過(guò)過(guò)濾微柱陣列(6)間隙的樣品才能進(jìn)入傳 感檢測(cè)通道(7)，未能通過(guò)的樣品直接進(jìn)入廢液通道(8)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求書l所述的芯片，其特征在于，過(guò)濾微柱陣列(6) 包括多個(gè)過(guò)濾微柱，每一個(gè)過(guò)濾微柱的截面是長(zhǎng)方形、正方形、菱形或 圓形，過(guò)濾微柱間的間隙在幾百納米到幾十微米之間。
8、 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的芯片，其特征在于，表面等離子體諧振傳感片(3)是固定有生物分子的表面等離子體諧振傳感片與聚二甲基硅 氧垸流通層(2)形成可逆密封。
9、 一種利用集成微流控傳感芯片對(duì)微流體進(jìn)行檢測(cè)的方法，其特征在于將被測(cè)樣品從樣品入口泵入微流控傳感芯片，被測(cè)樣品流經(jīng)過(guò)濾通 道的微過(guò)濾柱陣列，被測(cè)樣品中體積大的細(xì)胞和顆粒物進(jìn)入樣品的廢液 通道，從廢液出口直接排除；被測(cè)樣品通過(guò)過(guò)濾微柱陣列間隙分離后進(jìn)入微流控傳感芯片的檢測(cè)通道，當(dāng)被測(cè)樣品流經(jīng)檢測(cè)通道的表面等離子 體諧振傳感片時(shí)，被測(cè)樣品中的被檢測(cè)的生物分子與表面等離子體諧振 傳感片上經(jīng)過(guò)表面修飾、固定的生物分子發(fā)生反應(yīng)，并在表面等離子體 諧振傳感片上形成特異性結(jié)合，表面等離子體諧振傳感片上發(fā)生的特異 性反應(yīng)被表面等離子體諧振傳感檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完的分析樣品 從廢液出口直接排出。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述檢測(cè)的方法，其特征在于所述被測(cè)物樣品是尿液、血液、唾液、汗液、生物液體和污染水質(zhì)，樣品中被測(cè)物的濃度控制為0.1ng/mL-100pg/mL，樣品的流速為0.1-100pL/min。
全文摘要
本發(fā)明一種集成微流控傳感芯片及對(duì)微流體進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括剛性聚合物基底、聚二甲基硅氧烷流通層和表面等離子體諧振傳感片，被測(cè)樣品流經(jīng)聚二甲基硅氧烷流通層的過(guò)濾通道的過(guò)濾微柱進(jìn)行過(guò)濾分離，未通過(guò)過(guò)濾微柱的被測(cè)樣品進(jìn)入廢液通道并從廢液出口排除。通過(guò)過(guò)濾微柱分離后的被測(cè)樣品進(jìn)入芯片的傳感檢測(cè)通道與表面等離子體諧振傳感片上的特定生物分子發(fā)生反應(yīng)，通過(guò)表面等離子體諧振傳感片對(duì)芯片上發(fā)生的生化反應(yīng)進(jìn)行免標(biāo)記、實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。本發(fā)明集樣品過(guò)濾預(yù)處理、分離和免標(biāo)記傳感檢測(cè)于一體，具有集成度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏度高、無(wú)需標(biāo)記、樣品消耗少特點(diǎn)。本發(fā)明適合于血液、尿液、唾液等成分復(fù)雜的體液的臨床診斷分析。
文檔編號(hào)G01N35/00GK101650370SQ20081011832
公開日2010年2月17日 申請(qǐng)日期2008年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月13日
發(fā)明者劉長(zhǎng)春, 崔大付, 興 陳 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院電子學(xué)研究所